Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция кальпонином взаимодействия миозина из гладкой мышцы и актина

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция кальпонином взаимодействия миозина из гладкой мышцы и актина"

Р Г Б ОД

На правах рукописи УДК 577.353.2

О Ц ЯК 12Н0

А В Р О В Л Станислава Викторовна

РЕГУЛЯЦИЯ КАЛЬПОШШОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИОЗИНА ИЗ ГЛАДКОЙ МЫШЦЫ И АКТИНА

03.00.25

Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ю.С.Боровиков Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.А.Кроленко Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Г.А.Наследов Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург

Защита состоится "¿!3" 199$ года в /3 ч. на заседании

Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан "/¿)п

1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Л.Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Белки актин и миозин присутствуют во всех эукариотических клетках и составляют одну из систем, ответственных за преобразование химической энергии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в механическую энергию направленного движения. В частности, взаимодействие актина и миозина лежит в основе мышечного сокращения.

В мышечных клетках актомиозиновая система активируется в ответ на повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме. Сокращение гладкой мышцы запускается обратимым фосфорилированием ре-гуляторных легких цепей миозина (Л1_Ьо), которое катализируется Са2+-кальмодулин-зависимой специфической киназой. Предполагается, что взаимодействие актина и миозина в гладких мышцах дополнительно модулируется белками, ассоциированными с актиновыми фи-ламентами, в частности, кальпонином (Winder, Walsh, 1993). Этот специфичный для гладких мышц белок способен ингибировать АТФазную активность актомиозина, причем взаимодействие с Са2+-связывающими белками или фосфорилирование кальпонина устраняют его ингибирутощий эффект (Abe et al., 1990; Winder, Walsli, 1990).

Молекулярный механизм регуляторного действия кальпонина изучен недостаточно. Остается неизвестным, какой эффект оказывает кальпонин в сочетании с фосфорилированием ЛЦ20 на изменения кон-формации миозина из гладких мышц и актина, сопряженные с генерацией силы.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании молекулярных механизмов регуляции кальпонином взаимодействия Ф-актина с миозином из гладких мышц методом поляризационной микрофлуориметрии. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Выявить конформационные изменения Ф-актина, вызываемые связыванием с кальпонином в отсутствие и в присутствии тропомиозина;

2. Изучить конформационные изменения Ф-актина, происходящие при его связывании в отсутствие АТФ с головками миозина из гладких мышц, содержащими фосфорилированные и дефосфорили-рованные ЛЦда, в присутствии и в отсутствие ионов Са2+;

3. Исследовать влияние кальпонина на вышеуказанные структурные перестройки Ф-актина в отсутствие и в присутствии тропомиозина;

4. Изучить влияние кальпонина на ориентацию и подвижность головки миозина из скелетных мышц, связанной с Ф-актином в отсутствие АТФ и Са2+.

Научная новизна полученных результатов. В работе впервые показано, что при взаимодействии миозина из гладких мышц и актина в отсутствие АТФ фосфорнлирование ЛЦ20 обусловливает "включение" мономеров актина, то есть конформационные изменения, сопровождающие выход продуктов гидролиза нуклеотида из активного центра, формирование сильного связывания между актином и миозином и генерацию силы. Дефосфорилирование ЛЦ20 определяет "выключение" мономеров актина, то есть конформационные изменения, сопровождающие гидролиз нуклеотида и соответствующие слабому связыванию актина с миозином, непосредственно не сопряженному с генерацией силы.

Получены приоритетные данные о том, что ионы Са2+ модулируют взаимодействие актина и миозина из гладких мышц, усиливая эффект фосфорилирования и ослабляя эффект дефосфорилирования ЛЦ20 на конформационные изменения Ф-актина.

Впервые установлено, что капьпонин, связываясь с актином, кооперативно изменяет конформацию последнего и тем самым блокирует формирование сильного связывания между актином и головками миозина с фосфорилированными ЛЦ20.

Теоретическое значение работы. Впервые исследован структурный аспект модуляции кальпонином взаимодействия актина и миозина, а именно влияние кальпонина на изменения конформации Ф-актина, сопровождающие его взаимодействие с миозином из гладких мышц. Полученные данные свидетельствуют о том, что модуляция кальпонином взаимодействия актина и миозина сводится к ингиби-рованию "включения" мономеров актина и - в результате - к блокированию перехода актомиозинового комплекса к сильной форме связывания. Таким образом вскрыт молекулярный механизм, лежащий в основе описанных в литературе физиологических эффектов кальпонина. Результаты, представленные в работе, следует учитывать при изучении особенностей регуляции взаимодействия актина и миозина, обеспечивающих характерные функциональные свойства гладкой мускулатуры.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994), ХХШ Европейской мышечной конференции (Бохум, 1994), ХЬ биофизическом конгрессе (Балтимор, 1996) и на межлабораторных научных семинарах в Институте цитологии РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 162 ссылки на научные публикации. Диссертация изложена на 125 страницах, включая 17 рисунков и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Работа проводилась на моделях мышечных волокон - так называемых "теневых" волокнах, - которые получали в результате полной экстракции миозина и тропонин-тропомиозинового комплекса из одиночных глицеринизированных волокон поясничной мышцы кролика (Borovikov, Gusev, 1983). "Теневые" волокна на 8090% состояли из актина и содержали следовые количества белков Z-линии, в основном а-актинина. В ходе экспериментов Ф-актин "теневых" волокон связывали в отсутствие АТФ с тяжелым меромиозином, содержащим фосфорилированные и дефосфорилированные ШЬо, кальпонином и тропомиозином из гладких мышц, а также с модифицированными субфрагментами 1 из скелетных мышц. Молярное отношение тяжелого меромиозина, калытонина, тропомиозина и субфрагментов 1 к актину в реконструированных волокнах находилось в пределах 1:10 (±2), 1:2,5 (±0,5), 1:7(±2), 1:5(±2), соответственно.

Получение белков. Тяжелый меромиозин с фосфорилированными регуляторными легкими цепями (фТММ) получали химотриптическим расщеплением миозина из гладких мышц с полностью фосфорилированными ЛЦгп (Sellers et al., 1981). Тяжелый меромиозин с дефосфо-рилировашшми регуляторными легкими цепями (дфТММ) получали в результате инкубации фТММ с экзогенной фосфатазой легких цепей миозина (Seilers et al., 1981). Миозин, служивший источником фТММ и дфТММ, выделяли из мускульных желудков цыплят и фосфорилиро-вали согласно методике, описанной Чако и соавторами (Chacko et al., 1977; Chacko, 1981). Уровень фосфорилирования лц20, как показал электрофорез в ПААГ в присутствии 8 М мочевины (Perrie, Репу, 1970), находился в пределах 95-97% для фТММ и 1-3% для дфТММ.

Кальпонин и тропомиозин были выделены из куриных мускульных желудков (Takahashi et al., 1986; Chacko, 1981).

Субфрагмент 1 (Cl), лишенный регуляторных легких цепей (ДТНБ-цепей), получали химотриптическим расщеплением миозина (Weeds, Taylor, 1975), приготовленного согласно процедуре Иванова и

Юрьева из поперечно-полосатых мышц кролика (Иванов, Юрьев, 1961). Тиольные группы SH1 и SH2 в составе С1 модифицировали реагентами NEM и pPDM (Reisler, 1982; Nagashima, Asakura, 1982; Chalovich et al., 1983) и использовали для моделирования сильной (NEM-C1) и слабой (pPDM-Cl) форм связывания с актином "теневых" волокон. В отдельной серии экспериментов группу SH1 субфрагмента 1 модифицировали флуоресцентным красителем 1,5-IAEDANS (Borejdo, Putnam, 1977).

Определение концентрации белков и электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводили по стандартным методикам (Itzhaki, Gill, 1964; Laemmli, 1970).

Метод поляризационной микрофлуориметрии применялся для изучения изменений, возникающих в структуре Ф-актина при связывании с кальпонином и тропомиозином, при образовании комплексов с NEM-C1 и pPDM-Cl, при взаимодействии с фТММ и дфТММ из гладких мышц, а также для оценки изменений в ориентации и подвижности головок миозина в составе актомиозинового комплекса, вызываемых связыванием Ф-актина с кальпонином. При изучении конформа-ционных изменений Ф-актина использовали флуоресцентный зонд родаминил-фаллоидин, специфически связывавшийся с Ф-актином "теневых" волокон. Для получения информации об ориентации и подвижности головок миозина в составе актомиозинового комплекса С1, которым декорировали Ф-актин "теневых" волокон, модифицировали флуоресцентным красителем 1,5-IAEDANS. О происходящих структурных перестройках судили по изменениям параметров поляризованной флуоресценции соответствующего красителя, которые измеряли с помощью поляризационного микрофлуориметра (Иоффе и др., 1974): для родаминил-фаллоидина - до и после присоединения к Ф-актину каждого из экзогенных белков, для 1,5-IAEDANS - до и после связывания кальпонина с Ф-актином, декорированным С1. Флуоресценцию родаминил-фаллоидина и 1,5-IAEDANS возбуждали поляризованным светом с длиной волны 489±5 и 365+5 нм, соответственно, и регистрировали в диапазоне 500-600 и 480-550 нм, соответственно. Измеряли значения четырех составляющих интенсивности поляризованного света флуоресценции (ц/ц, ц/i, J.ъ ±/ц), где значки слева от I обозначают параллельное (I |) или перпендикулярное (-L) расположение оси волокна относительно плоскости поляризации возбуждающего света, а те же значки справа от I - расположение оси волокна относительно плоскости поляризации света флуоресценции зондов. На основании этих данных рассчитывали степени поляризации флуоресценции (Р) при

ориентации волокна параллельно (Рн) и перпендикулярно (Pj_) плоскости поляризации возбуждающего света. Используя разработанную ранее математическую модель (Kakol et al„ 1987), определяли величины углов между осью Ф-актина и осциллятором поглощения (Фа), осью Ф-актина и осциллятором излучения (Фе), значение половины угла отклонения оси Ф-актина от оси волокна (©1/2) и относительное количество хаотически расположенных флуорофоров (N). Изменения указанных углов и величины N свидетельствуют об изменении ориентации и подвижности флуоресцентных зондов вследствие перестроек структуры белка (Nowak et al., 1991).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поляризованная флуоресценция, создаваемая молекулами родаминил-фаллоидина, связанными с Ф-актином "теневого" волокна, характеризовалась значительной анизотропией: степень поляризации флуоресценции родаминил-фаллоидина имела высокое положительное значение при ориентации волокна параллельно плоскости поляризации возбуждающего света (Рп = 0,510 ±0,003) и высокое отрицательное значение при ориентации волокна перпендикулярно этой плоскости (Pi = -0,422±0,002). Как установлено ранее, ярко выраженная анизотропия поляризованной флуоресценции является показателем того, что молекулы флуорофора расположены в "теневом" волокне упорядоченно и связаны с Ф-актином специфично и жестко (Yanagida, Oosawa, 1978).

Влияние связывания кальпонина и тропомиозина с Ф-актином "теневых" мышечных волокон на конформацию Ф-актина. Взаимодействие кальпонина с Ф-актином сопровождалось увеличением углов Фи и 0|/2 по сравнению с исходными величинами, равными 39,0±0,!° и 13,4±0,2°, соответственно (рис. 1). Так как в этом и во всех ниже описанных экспериментах величина угла Фл менялась в том же направлении, что и величина угла Ф( , данные о динамике величины Фд не приводятся. Изменения углов Фе и ©1/2 нарастали по мере включения в тонкие нити возрастающих количеств кальпонина и достигали максимального уровня, когда молярное отношение связанного кальпонина к Ф-актину становилось равным 1:7. Дальнейшее насыщение кальпони-ном Ф-актина до соотношения 1 молекула кальпонина на два мономера Ф-актина не приводило к изменению углов Фе и ©1/2, величины которых оставались в пределах 40,7+0,1° и 14,5+0,2°, соответственно (указанные величины рассчитаны при молярном отношении кальпони-

41,5

40,5

е

А

37,5

1 2

3 4

а

О

Рис. 1. Влияние связывания кальпонина и тропомиозина с Ф-актином на параметры поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоиди-на. Показаны величины углов Ф[; (А) и 0щ (Б), определенные для Ф-актина (1) и Ф-актина, связанного с кальпонином (2), тропомиози-ном (3), тропомиозином и кальпонином (4). Каждая величина является средним значением, полученным из 75 измерений, выполненных не менее чем на 15 волокнах. Вертикальными черточками обозначены 95% доверительные интервалы.

т..

38.5

2

4

на к актину равном 1:2,5). Следовательно, связывание Ф-актина с кальпонином вызывало конформационные изменения Ф-актина, и эти изменения происходили кооперативно, достигая максимума, когда на 7 мономеров Ф-актина приходилась 1 молекула кальпонина. Интересно отметить, что, по некотрым данным, в нативных тонких нитях гладких мышц молярное соотношение кальпонина к актину равно именно 1:7 (ТакаЬавЫеа 1986).

Поскольку в гладких мышцах обязательным элементом регуля-торной системы, связанной с актиновыми филаментами, является белок тропомиозин, мы исследовали эффект кальпонина на информацию Ф-актина в комплексе с тропомиозином. Связывание тропомиозина с Ф-актином "теневого" волокна, так же как и связывание кальпонина, приводило к возрастанию угла ©иг (рис. 1Б), что свидетельствовало об увеличении гибкости Ф-актина (ОаЬгЬ^юг е( а!., 1987). Однако, в противоположность кальпонину, тропомиозин вызывал не увеличение, а уменьшение угла Ф^ (рис. 1 А).

В последующих экспериментах Ф-актин "теневых" волокон сначала связывали с тропомиозином, а затем с кальпонином. Если связывание кальпонина с Ф-актином в отсутствие тропомиозина сопро-

вождапось увеличением угла ©и на 8,2%, то в присутствии тропомио-зина прирост ©1/2 достигал 37,3% (рис. 1 Б). Следовательно, при связывании кальпонина с комплексом Ф-актин-тропомиозин гибкость Ф-актина возрастала в большей степени, чем в результате связывания Ф-актина с каждым из двух регуляторных белков в отдельности. В то же время в присутствии тропомиозина способность кальпонина увеличивать угол Фк уменьшалась (рис. 1 А). Итак, присутствие тропомиозина в тонких нитях "теневых" волокон обусловливало, соответственно, усиление и подавление возрастания углов 0|а и Фе, наблюдаемого при связывании Ф-актина этих волокон с кальпонином.

Таким образом, как в отсутствие, так и в присутствии тропомиозина кальпонин вызывает значительные изменения в конформации Ф-актина, и этот эффект кальпонина модулируется тропомиозином.

Влияние фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина на конформационное состояние Ф-актина в актомиозиновом комплексе. "Теневые" волокна декорировали фосфорилированным (фТММ) или дефосфорилированным (дфТММ) тяжелым меромиозином в отсутствие АТФ. В параллельной серии экспериментов моделировали структурные перестройки Ф-актина, происходящие при образовании сильной и слабой форм связывания с миозином. Для этого Ф-актин "теневых" мышечных волокон декорировали субфрагментами 1 (С1) скелетного миозина, модифицированными NEM и pPDM. Образующиеся комплексы Ф-актин-NEM-Cl и Ф-актин-pPDM-Cl использовали в качестве структурных аналогов актомиозинового комплекса в состояниях сильного и слабого связывания, соответственно.

Присоединение к Ф-актину каждого из четырех белков - фТММ, дфТММ, pPDM-Cl или NEM-C1 - приводило к изменению параметров поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоидина (рис. 2), что указывало на изменение конформации Ф-актина.

При взаимодействии Ф-актина с фТММ величина угла Фк уменьшалась, а величина угла ©1/2 возрастала. Аналогичные изменения углов Фр. и ©i/2 наблюдались при связывании Ф-актина "теневых" мышечных волокон с NEM-C1 (рис. 2). Следовательно, взаимодействие с фТММ вызывает в Ф-актине конформационные перестройки того же типа, что и взаимодействие с головками миозина, моделирующее сильное связывание между актином и миозином. В соответствии с интерпретацией, предложенной ранее, указанные изменения параметров поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоидина свидетельствуют о повышении гибкости актиновой нити и увеличении относительного количества "включенных" мономеров Ф-актина (Galazkiewicz et al., 1987).

О 38

гХ, А

Д>

г

0 13-

_х„ 4

Б

5

1

2

Рис. 2. Влияние связывания головок миозина с Ф-актином на параметры поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоидина. Показаны величины углов Фе (А) и ©ш (Б), определенные для Ф-актина (I) и Ф-актина, связанного с фТММ (2), ЫЕМ-С1 (3), дфТММ (4), рРБМ-С1 (5). Каждая величина является средним значением, полученным из 125 измерений, выполненных не менее чем на 25 волокнах. Вертикальными черточками обозначены 95% доверительные интервалы.

При взаимодействии Ф-акгина с дфТММ величина угла Фе возрастала, а величина угла ©1/2 снижалась. Аналогичным образом менялись углы Фе и &\а при связывании Ф-актина "теневых" мышечных волокон с рРБМ-С1 (рис. 2). Следовательно, взаимодействие с дфТММ вызывает в Ф-актине конформационные перестройки того же типа, что и взаимодействие с головками миозина, моделирующее слабое связывание между актином и миозином. В соответствии с интерпретацией, предложенной ранее (Воголакоу еХ а1., 1991), указанные изменения параметров поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоидина свидетельствуют о снижении гибкости актиновой нити и повышении относительного количества "выключенных" мономеров Ф-актина.

Таким образом, взаимодействие Ф-актина "теневых" мышечных волокон с фТММ сопровождается "включением" мономеров Ф-актина, то есть конформационными перестройками, характерными для образования сильной формы связывания с головками миозина. При взаимодействии Ф-актина с дфТММ, напротив, происходит "выключение" мономеров Ф-актина, то есть изменения конформации, типичные для формирования слабой формы связывания с головками миозина. Эти результаты позволяют сделать вывод, что фТММ

образует сильную, а дфТММ - слабую или подобную слабой форму связывания с Ф-актином.

Влияние ионов Са2+ на конформационное состояние Ф-актина в актомиозиновом комплексе. В отдельной серии экспериментов декорирование Ф-актина "теневых" мышечных волокон препаратами фТММ и дфТММ осуществляли в присутствии КГ* М СаСЬ или 10"3 М ЭГТА.

При связывании Ф-актина с дфТММ в присутствии ионов Са2+ возрастание угла Фе и снижение угла ©1/2 было меньше (на 1,7 и 5,2%, соответственно), чем в отсутствие ионов Са2+(рис. 3). При взаимодей-

А

16

и 54 ■

г

Ф

52

5 6

5

2

Рис. 3. Влияние ионов Са2+ на изменение параметров поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоидина, вызванное связыванием Ф-актина с головками миозина. Показаны величины углов Фе (А) и ©1/2 (Б), определенные для Ф-актина (1, 2) и Ф-актина, связанного с фТММ (3,4) и дфТММ (5, 6), в присутствии 10 "5 М ЭГТА (1, 3 ,5) или КГ4 М СаС12 (2, 4, 6). Каждая величина является средним значением, полученным из 75 измерений, выполненных не менее чем на 15 волокнах. Вертикальными черточками обозначены 95% доверительные интервалы.

ствии Ф-актина с фТММ в присутствии ионов Са2+ снижение угла Ф|. и возрастание угла ©1/2 оказывалось больше (на 2,8 и 15,0%, соответственно), чем в отсутствие ионов Са2+(рис. 3). В то же время для неде-корированных акгиновых нитей изменения поляризационных параметров, вызываемые введением и удалением ионов Са2+ из раствора, омывающего теневые волокна, находились в пределах ошибки измерения.

Таким образом, на фоне качественных различий характера кон-формационных изменений, вызываемых в Ф-актине его взаимодействием с фТММ и дфТММ, отчетливо проявляется модуляция этих изменений ионами Са2+. Последние ингибируют конформационные перестройки Ф-актина, вызываемые его взаимодействием с дфТММ, и активируют конформационные перестройки Ф-актина, вызываемые его взаимодействием с фТММ, то есть способствуют "включению" мономеров актина.

Описанные эффекты ионов Са2+ согласуются с ранее полученными биохимическими данными, в соответствии с которыми по крайней мере в некоторых видах гладкомышечной ткани повышение концентрации ионов Са2+ усиливает М^+-АТФазную активность актомиозина не только вследствие активации киназы легких цепей миозина, но также и вследствие непосредственного взаимодействия этих ионов с миозином (КатшБк1, СЬаско 1984). На основании изложенных данных можно предполагать, что в гладких мышцах наряду с регуляцией взаимодействия актина и миозина, осуществляемой через фосфорилирование ЛЦда, существует модуляция этого взаимодействия ионами Са2+.

Влияние кальпонина на изменение конформации Ф-актина. вызванное связыванием Ф-актина "теневых" мышечных волокон с головками миозина. В четырех сериях экспериментов Ф-актин "теневых" мышечных волокон декорировали кальпонином, а затем одним из препаратов головок миозина: КЕМ-С1, фТММ, рРОМ-С1, дфТММ.

Связывание МЕМ-С1 с Ф-актином, находящимся в комплексе с кальпонином, вызывало вдвое меньшее снижение угла Фн, чем взаимодействие этих же белков в отсутствие кальпонина (рис. 4, А).

Связывание фТММ с комплексом Ф-актин-кальпонин приводило к возрастанию угла Фе (рис. 4, А), а не к его снижению, которое наблюдалось в отсутствие кальпонина. В присутствии кальпонина взаимодействие Ф-актина как с КЕМ-С1, так и с фТММ вызывало падение величины угла ©(/2 вместо увеличения этого угла, которое имело место в отсутствие кальпонина (рис. 4, Б). Следовательно, кальпонин ослабляет и обращает изменения конформации Ф-актина, происходящие вследствие взаимодействия последнего с ИЕМ-С1 и фТММ. Кальпонин увеличивает жесткость актинового филамента и препятствует "включению" мономеров актина, тем самым блокируя формирование сильного связывания между актином и головками миозина.

Присутствие кальпонина не оказывало статистически достоверного влияния на изменение угла Фн, вызванное связыванием Ф-актина с рРЭМ-С1, хотя наблюдалась тенденция к нарастанию этого изменения (рис. 4, В). Падение величины угла 0^2 вследствие связывания

е 0 <

-2 1 т

т 2

"X"

3 О ©

<

© <

-2 4 I

^ 0

Ф <

-2 '1

2 3

1 2

--С

—и;—

2 -

3

Рис. 4. Влияние кальпонина на изменения параметров поляризованной флуоресценции родаминшт-фаллоидина, вызванные связыванием Ф-актина с головками миозина. А, Б - изменения углов Ф|.; (А) и ©ш (Б), вызванные связыванием Ф-актина с ЫЕМ-С1 (1), кальпонином и ЫЕМ-С1 (2), фТММ (3), кальпонином и фТММ (4). В, Г - изменения углов Ф|; (В) и ©1/2 (Г), вызванные связыванием Ф-актина с рРБМ-О (1), кальпонином и рРБМ-С1 (2), дфТММ (3), кальпонином и дфТММ (4). В каждом варианте опыта на основании 125 измерений, выполненных на 25 волокнах, рассчитывали средние значения обоих углов. В качестве контроля взяты средние значения Ф|; и б^, определенные для Ф-актина. Вертикальными черточками обозначены 95% доверительные интервалы.

рРОМ-С1 с Ф-актином в присутствии кальпонина было на 3,2% больше, чем в его отсутствие (рис. 4, Г).

Аналогичный, но более яркий эффект оказывал кальпонин на изменения углов ф).; и ©1/2, происходящие при связывании дфТММ с Ф-актином (рис. 4, В, Г). В этом случае возрастание величины Фц и падение величины 0|/2 в присутствии кальпонина были приблизительно в 2 раза больше, чем в его отсутствие.

Следовательно, кальпонин усиливает изменения конформации Ф-актина, сопровождающие его взаимодействие с pPDM-Cl и дфТММ. В присутствии кальпонина увеличивается количество "выключенных" мономеров актина и повышается жесткость актинового филамента.

Таким образом, взаимодействие кальпонина с Ф-актином "теневых" волокон ингибирует конформационные изменения Ф-актина,. сопровождающие сильное связывание с головками миозина, и активирует изменения конформации Ф-актина, характерные для образования слабого связывания актина с головками миозина.

Влияние кальпонина на ориентацию и подвижность субфрагмента 1 миозина, модифицированного 1.5-IAEPANS. в комплексе с Ф-актином "теневых" мышечных волокон. Ранее было показано, что в отсутствие АТФ и ионов Са2+ между Ф-актином и субфрагментом 1 миозина, модифицированным флуоресцентным красителем 1,5-IAEDANS (1,5-IAEDANS-CI), возникает сильное связывание (Borejdo, Putnam, 1977; Nowak et al., 1989). Мы исследовали влияние кальпонина на взаимодействие актина и Cl в аналогичных условиях.

Поляризованная флуоресценция 1,5-lAEDANS-Cl, связанного с Ф-актином "теневых" волокон, характеризовалась значительным различием между значениями степеней поляризации при ориентации волокна параллельно и перпендикулярно плоскости поляризации воз-бужадющего света (Рп = 0,411±0,003, Рх = 0,132+0,002). Следовательно, молекулы 1,5-IAEDANS создавали поляризованную флуоресценцию с высоким уровнем анизотропии. Это означало, что данный флуоресцентный зонд связывался с группой SH1 субфрагмента 1 специфично и жестко (Nowak et al., 1989).

Для комплекса Ф-актина "теневых" волокон с 1,5-IAEDANS-C 1 угол Фг.; был равен 45,9±0,2°, а доля неориентированных флуорофоров (N) составляла 0,27±0,02 (рис. 5). Если декорированию Ф-актина меченными головками миозина предшествовало введение в тонкие нити кальпонина, то в актомиозиновом комплексе величина угла Фе оказывалась на 3,5% ниже, а значение N - на 77,4% выше, чем в отсутствие кальпонина (рис. 5). Ранее показано, что возрастание значения N свидетельствует об увеличении подвижности головок миозина, связан-

.Л

е

45

. 1

43

5 ,40 92

,25

.....т..

,10

Рис. 5. Влияние кальпонина на параметры поляризованной флуоресценции комплекса Ф-актина с субфрагментом 1 миозина, меченным 1,5-1АЕВАЫ8. Показаны величина угла Фи (А) и относителное количество неориентированных флуорофоров N (Б), определенные для 1,5-1АЕОАЫ8-С1, связанного с Ф-актином (1) и с комплексом Ф-актин-кальпонин (2). Каждая величина является средним значением, полученным из 75 измерений, выполненных не менее чем на 15 волокнах. Вертикальными черточками обозначены 95% доверительные интервалы.

ных с Ф-актином, а уменьшение угла Ф^ - об изменении ориентации головок относительно оси волокна. Аналогичные изменения параметров Фн и N были описаны для процесса расслабления скелетной мышцы, сопровождавшегося формированием слабой формы связывания миозина с актином (Вогсмкоу е1 а1., 1991). На основании наших результатов и данных литературы можно предполагать, что в присутствии кальпонина сильное связывание между Ф-актином и С1 не образуется. Вместо него в отсутствие АТФ формируется лишь слабое или близкое к слабому связывание между двумя сократительными белками. Возможно, конформационные изменения Ф-актина, вызываемые его взаимодействием с кальпонином, распространяются на субфрагмент 1 миозина, в свою очередь приводя к перестройкам конформации тяжелых цепей головки миозина и к изменению подвижности головки.

Влияние кальпонина на изменения конформации Ф-актина, вызванные связыванием с головками миозина в присутствии тропомно-зина. Ф-актин "теневых" волокон, модифицированный родаминил-фаллоидином, связывали сначала с тропомиозином, затем с кальпони-

ном и далее декорировали эти волокна препаратами ЫЕМ-С1, фТММ и рРОМ-С 1.

Статистически достоверные различия между изменениями, вызываемыми связыванием рРОМ-С I с Ф-актином-тропомиозином в присутствии и в отсутствии кальпонина, не были выявлены ни для угла Фг;, ни для угла <д\ц (рис. 6).

е

<

3,0

1,5-

0,0

-1,5

-3,0-

3,0

1.5

2 0,0

-1,5

-3,0

Г

5] 6

.1

Рис. 6. Влияние кальпонина на изменение параметров поляризованной флуоресценции родаминил-фаллоидина, вызванное связыванием головок миозина с комплексом Ф-актин-тропомиозин.

Показаны изменения углов Фк (А) и ©1/2 (Б), вызванные связыванием комплекса Ф-актин-тропомиозин с ИЕМ-С1

(1), кальпонином и NEM-C1

(2), фТММ (3), кальпонином и фТММ (4), рРРМ-С1 (5), кальпонином и рРОМ-С 1 (6). В каждом варианте опыта на основании 125 измерений, выполненных не менее чем на 25 волокнах, определяли средние значения обоих углов. В качестве контроля взяты средние значения Ф|. и ©1/2, определенные для комплекса Ф-актин-тропомиозин. Вертикальными черточками обозначены 95% доверительные интервалы.

Следовательно, в присутствии тропомиозина кальпонин не оказывает существенного влияния на структурные перестройки Ф-актина, происходящие при моделировании слабого связывания Ф-актина с головками миозина.

В присутствии тропомиозина кальпонин ингибировал изменения углов Фк и 0|/2, вызываемые связыванием Ф-актина с ЫЕМ-С1 и

фТММ (рис. 6), однако эффект кальлонина был выражен слабее, чем в аналогичных экспериментах, проведенных в отсутствие тропомиозина (ср. рис. 6 и 4). Вероятно, тропомиозин ослабляет "выключение" мономеров актина под действием кальпоиина при образовании сильного связывания Ф-актина с головками миозина. Как следует из сравнения данных, представленных на рис. 6 и 4, эффект кальпонина на конфор-мацию Ф-актина качественно не меняется в зависимости от присутствия или отсутствия тропомиозина в тонких нитях. Это дает основание предполагать, что описанный механизм модуляции кальпоиином взаимодействия актина и миозина действует in vivo.

Способность кальпонина блокировать образование сильной формы связывания между актином и миозином может служить объяснением таких наблюдаемых в присутствии кальпонина явлений, как инги-бирование АТФазной активности актомиозина (Winder, Walsh, 1990), снижение скорости движения актиновых филамеитов в тесте биологической подвижности (Borovikov et al., 1996), увеличение изометрического напряжения мышечных волокон (Haeberle, 1994). Действительно, ингибирование кальпонином сильного связывания миозина с актином может означать 1) замедление высвобождения продуктов гидролиза нуклеотида из активного центра актомиозиновой АТФазы или 2) блокирование диссоциации актомиозинового комплекса. Посредством второго из названных механизмов кальпонин может участвовать в обеспечении такой функциональной особенности гладкой мышцы, как поддержание напряжения при снижении уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина.

ВЫВОДЫ

1. При связывании актина тонких нитей с тяжелым меромиознном из гладких мышц в отсутствие АТФ конформация актина меняется. Конформационное состояние актина в актомиозиновом комплексе зависит от того, фосфорилированы или дефосфорилированы регуля-торные легкие цепи тяжелого меромиозина, и от концентрации ионов Саг+.

2. Фосфорилирование регуляторных легких цепей обусловливает "включение" мономеров актина при его взаимодействии с тяжелым меромиозином и образование сильной формы связывания компонентов актомиозинового комплекса, необходимой для генерации напряжения. Дефосфорилирование регуляторных легких цепей

определяет "выключение" мономеров актина и возникновение в актомиозиновом комплексе слабой формы связывания.

3. Ионы Са2+ способствуют "включению" мономеров актина в тонких нитях, усиливая влияние тяжелого меромиозина с фосфорилирован-ными регуляторными легкими цепями и ослабляя влияние тяжелого меромиозина с дефосфорилированными регуляторными легкими цепями на конформацию Ф-актина.

4. Взаимодействие кальпонина с актином тонких нитей сопровождается кооперативным изменением конформации актина.

5. Кальпонин регулирует взаимодействие актина и миозина аллостери-ческим путем, вызывая "выключение" мономеров актина и тем самым блокируя образование сильной формы связывания между актином и тяжелым меромиозином с фосфорилированными регуляторными легкими цепями и активируя формирование слабой формы связывания между актином и тяжелым меромиозином с дефосфорилированными регуляторными легкими цепями. В присутствии тро-помиозина способность кальпонина "выключать" мономеры актина сохраняется, однако тропомиозин ослабляет эффект кальпонина.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Borovikov Yu.S., Horiuchi K.Y., Avrova (Soloveva) S.V., Chacko S. Mechanism of calponin regulation of the strong actomyosin interaction. // XXIII European Muscle Congress, University of Bochum, Ruhr, Germany, June 10-14, 1994 (Abstract).

2. Боровиков Ю.С., Аврова С.В., Ефимова Н.Н., Хорошев М.И., Хориуши К.И., Чако С. Кальпонин ингибирует сильную форму связывания миозина с актином. // Биохимия, т.60, № 10, с.1654-1658, 1995.

3. Avrova (Solovyova) S.V., Horiuchi K.Y., Eftmova N.N., Borovikov Yu.S., Chacko S. Effect of phosphorylation of myosin regulatory light chain on actin-heavy meromyosin interaction. // J. Muse. Res. Cell Motil., Vol. 16, 1995 (XXIII European Muscle Congress, June 10-14, p. 159, 1995), (Abstract).

4. Borovikov Yu.S., Horiuchi K.Y., Avrova (Solovyova) S.V., Chacko S. Mechanism of calponin regulation of the strong acto-myosin interaction // J. Muse. Res. Cell Motil, Vol. 16, 1995 (XXIII European Muscle Congress, June 10-14, p. 162, 1995), (Abstract).

5. Хорошев М.И., Боровиков Ю.С., Аврова С.В., Хориуши К.И., Кириллина В.П., Чако С. Влияние фрагмента кальдесмона с молекулярной массой 38 кДа и кальпонина на способность актина

образовывать с головками миозина "сильную" форму связывания. // Цитология, т.38, № 3, с. 346-350, 1996.

6. Avrova S.V., Borovikov Yn.S., Horiuchi K.Y., Chacko S. Conformational changes induced by phosphorylated and dephosphorylated heavy merotnyosin in actin in "ghost" fiber are modulated by calcium. // Biophys. J., Vol. 70, 1996 (XL Meeting of American Biophysical Society, February 17-21, p. A381, 1996), (Abstract).

7. Borovikov Yu.S., Horiuchi K.Y., Avrova S.V., Chacko S. Modulation of actin conformation and inhibition of actin filament velocity by calponin. // Biochemistry, Vol. 35:13849-13857, 1996.