Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные свойства и экспрессия калдесмона и кальпонина в гладкомышечных клетках

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональные свойства и экспрессия калдесмона и кальпонина в гладкомышечных клетках"

'У *'-? ' ту- Л'

' ' КАРДИОЛОГИЧЕСКИМ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

российской академии медицинских наук

Институт экспериментальной кардиологии

На правах рукописи

БИРШОВ Константин Геннадьевич

функциональные свойства и экспрессия каддесмона и калы10нина в гладкомышечных клетках

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена б лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научвогс центра Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.П.Ширинский

Оф&ициальные оппоненты: кандидат биологических наук О.Ю.Принцева доктор биологических наук Д.И.Левицкий

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова

Зашита состоится " /? " /-£.1 •■.. - 19Э2 г. е часов на заседании. Специализированного ученого совет;

К 001.22.02. в Кардиологическом научном центре Российской Академш Медицинских Наук по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул. д.15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан *.?~>

,¿992 г.

Ученый секретарь Специализированно кандидат биология

Т.М.Венгерова

: V. -¡АН БИБЛИОТЕКА

,. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 ;

Догтажность' проблемы. Гладкие мышцы обусловливают двигательную активность различных органов и структур организма, в том числе и кровеносных сосудов. Однако, молекулярные механизмы регуляции ?ладкодашечного сокращения изучены недостаточно. Известно, что зигналом для сокращения гладкой мышцы служит увеличение концентра-ши ионов кальция в цитоплазме, который активирует Са-кальмодулин-швисимую киназу легких цепей миозина (КЛИМ). Фосфорилирование шозиновых (толстых) филаментов КЛИМ является необходимым условием юкращения (Кегтиок е! а!. ,1980). В то же время в литературе на-сапливаются данные о существовании в гладких мышцах другой системы югуляции сокращения, связанной с актиновыми (тонкими) филамента-ш. Среди актин-связывающих регуляторных белков особое внимание сривлекают кадцесмон и кальпонин (ЗоЬие et аХ., 1981, Така1газЬ1 ^ а1.,198б). Несмотря на обилие публикаций о калдесмоне, ряд важ-их свойств этого белка продолжает оставаться неизученным. Так, |собенности строения молекулы и функциональные свойства калдесмона .елают его похожим на тропонин - регуляторный белковый комплекс онких филаментов поперечнополосатых мышц. Однако, вопрос о струк-урном родстве калдесмона и тропонина изучен не был. Уникальным ля актин-связывающих белков свойством калдесмона является его пособность непосредственно взаимодействовать с миозином гладких ыш (1кеЬе,Кеагаоп,1988). Этот феномен может лежать в основе так азываемого тонического сокращения, характерного лишь для гладких ышц. Тем не менее, следует отметить, что механизмы регуляции вза-иодействия калдесмона с миозином мало изучены.

По сравнению с калдесмоном кальпонин является значительно энее исследованным белком тонких филаментов. К началу данной ра-эты были известны лишь отдельные факты о его структурно-/нкциональных свойствах и содержании в некоторых тканях

(Takahashi et al.,1987). Лишь недавно установлено, что Кальпонин, как и калдесмон ингибнрует актин-активируемую АТФазу миозина (winder, Walsh,1990), и важно понять, как эти белки осуществляют совместную регуляцию тонких филзментов.

В настоящее время становится общепризнанным, что для уставов ления роли тех или иных белков в регуляции сокращения необходим' сопоставлять результаты, полученные в экспериментах in vitro исследованиями in vivo. Одним из подходов, демонстрирующих участи калдесмона и кальпонина в регуляции гладкомышечного сокращени является соотнесение внутриклеточной локализации и экспрессии эти белков в гладкомышечных клетках со способностью клеток к сокраще нию. Однако, до настоящего времени таких данных получено не было.

Таким образом, исследование свойств калдесмона и кальпонина реконструированной системе из очищенных сократительных белков и культуре гладкомышечных клеток представляется важным для понимаи механизмов регуляции гладкомышечного сокращения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являло изучение роли калдесмона и кальпонина в регуляции актомиозиново взаимодействия in vitro и связи их экспрессии с сократительн фенотипом культивируемых гладкомышечных клеток сосудоь.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи

1. Изучить структурно-функциональное родство калдесмона тропонина. ,

2. Локализовать на молекуле калдесмона участок взаимодейси с гладкомышечным миозином и изучить возможность регуляции эт< взаимодействия.

. 3. Исследовать взаимоотношения калдесмона и кальпонина регуляции актин-активируемой АТФазы миозина.

4. Изучить локализацию и экспрессию кальпонина и калдесмон культивируемых ГМК.

5. Исследовать связь между экспрессией калдесмона и сальпонина и способностью ГМК к сокращению.

{аучнзя новизна и практическая значимость работы. Обнаружено галичие общей антигенной детерминанты у калдесмона и тропонина Т. 1оказано, что участок структурного родства калдесмона и тропонина Р вовлечен во взаимодействие этих белков с тропомиозином.

Уточнена локализация миозин-связывающего участка в и-концевом домене молекулы калдесмона. Обнаружено, что фосфорилирование этого ¡домена с помощью казеинкиназы II типа влияет на сродство калдесмона к миозину.

Установлено, что новый белок тонких филаментов кальшник днгибирует актин-активируемую АТФазу миозина. Степень ингибирова-ния актин-активируемой АТФазы миозина кальпонином пропорциональна связыванию кальпонина с ф^актином. Обратимость эффекта наблюдается в присутствие Са-кальмодулина. Совместное действие калдесмона и кальпонина на актин-активируемую АТФазу миозина является аддитивным.

Подробно исследована внутриклеточная локализация и экспрессия калдесмона и кальпонина в культуре ГМК аорты кролика. Установлена корреляция между уровнем экспрессии этих белков и спосооноетьк культивируемых ГМК к сокращению. Поскольку подавляющее большинство работ с использованием культуры ГМК проводится на клетках синтетического фенотипа или ограниченного сократительного фенотипа с неизвестной способностью клеток к сокращению, эти модели трудно считать адекватными для изучения механизмов регуляции сокращения. Поэтому одной из методических задач работы являлась разработка условий культивирования сократимых ГМК сосудов. Б результате проведенных исследований найдены услоеия, позволяющие продлить способность ГМК сокращаться в культуре в течение 2 недель.

Для наблюдения за сокращением ГМК применена модифицированная

методика Хнрриса и соавт. (Harris et al.,1977). Данная методика позволяет оценивать способность ГМК к сокращению на разных сроках культивирования. Она также может быть использована для оценки действия ряда вазоактивных гормонов и лекарственных препаратов 'на сократилость культуры ГМК.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на хп Научном симпозиуме Международного общества Гипертонии (Киото, Япония, 1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Советско-Американском симпозиуме по гипертонии (Томск, 1990), IX Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Тбилиси, 1990), мемориальном симпозиуме Дж.Сейдела "Регуляция сокращения гладкой мышцы" (Бостон, 1990)

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано 12 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения

результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

/ У Г" ^

Работа содержит __страницы машинописного текста, таблиц и

^t рисунков. Список литературы включает ^^источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Методы получения белков. Для получения калдесмона и тропомиозина гладких мышц использовали метод Бретчера (Bretscner,"984). Кальпо-нин из гладких мышц мускульного желудка кур получали по методике Такахаси'и соавт. (Takahashi et al.,1986). Кальмодулин был получен ПО методу Гопалакришна и Андерсон (Gopalakrishna & Anderson,1985), а миозин гладких мышц выделяли по методу Селлерса и соавт. (Sellers et al.,1981). Химотриптические и цианолитические фрагмента

калдесмона и тропонина Т были любезно предоставлены А.В.Воротниковым и Н.Б.Гусевым (Кафедра биохгадш МГУ им. М.В.Ломоносова). Фос-форилированный казеинкиназой II типа калдесмон и его химотрипти-ческие фрагменты были любезно предоставлены Н.В.Богачевой и Н.Б.-ГусвЕым. Степень включения фосфата составляла 0,6 моль на I моль белка. Поликлональные антитела к калдесмону и кальпошшу были получены согласно описанным методикам (Ngai, WalBh, 1985), (Takahachi et al.,1987).

Ферментативное выделение гладкомышечннх клеток из медии аорты кролика проводили согласно методике Чемли-Кэмпбелл и соавт. (Charaley-Campbell et al.,1979). Выделенные клетки культивировали либо в среде 199 со стандартными добавками, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, либо в бессывороточной среде МОНОМВД, в состав которой включены инсулин, трансферрш и селенит. Определение сократительной способности гладкошшечних клеток в культуре. Эксперименты по изучению сократимости клеток в культуре проводили с использованием эластичных силиконовых мембран, способных деформироваться и образовывать складки при сокращении прикрепленных к ним гладкомышечных клеток. Мембраны были приготовлены из полидиметилполисшюксана (вязкость 12500 сантипуаз, фирма Sigma), как описано Харрисом и соавт. (Harris et al.,1980). Покровное стекло с приготовленной мембраной помещалось б перфузионную камеру Роуза, куда иньецировалась суспензия гладкомышечных клеток. Клетки прикреплялись к мембране в течение 2-3 часов.

Аналитические методы. Электрофорез белков и пептидов в присутствие ЦС-Ка проводили в 7,5%, 9%, или 12% полиакриламидных гелях по '¿етоду Лэммли (Laemmli,1S70).

Концентрацию белков измеряли методом Лоури (Lowry et il.,1951) используя БСА в качестве стандарта, либо спектрофото-летрически, используя известные коэффициенты экстинкции. Относите-

льное содержание белка б белковых полосах окрашенных гелей оцени вали с помощью сканирования гелей на лазерном денситометр Ultrasoan фирмы LKB, оборудованном интегратором Hewlett-Packard.

Активность актин-активируемой АГФазы миозина измеряли следую щим образом. Изолированные белки смешивали в буфере, содержащем 2 мМ имидазол-HGX, рН-7,0; 40 мМ HaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 м АТФ, 0,1 мМ СаС12 или 2 мМ ЭГТА и инкубировали 3-5 минут при ком натной температуре. Молярное соотношение актингтропомиозин состав ляло 7:1. АТФазную активность измеряли при 25°С, определяя кон цбнтрацию неорганического фосфата в среде инкубации после добавле ния миозина скелетных мышц (Hers et al.,1966). Молярное соотноси ние актин:миозин составляло 10:1.

Измерение связывания калдесмона и кальпоника с актином. Взаимс действие калдесмона и кальпонина с актином анализировали с помощ! метода соосавдения белков при ультрацентрифугировании. Экспер! мент проводили в буферном растворе, содержащем 10 мМ трис-НС] .рН-7,4; 100 мМ КС1, 1мМ 2-меркалтоэтанол, 2 мМ MgCL, . Последним образец вносили Ф-актин, и после инкубации при 25°0, 30 мин. смес подвергали, ультрацентрифугированию при 150 OOOg, 30 мин. Сост; надосадочной жидкости и осадка анализировали электрофоретически. Измерение связывания калдесмона и его химотриптических фрагмент! с гладкомышечным миозином проводили аналогичным образом. Калде^ мои, либо его фрагменты вносили в пробирки до конечной концентр ции С,3 мг/мл; миозин использовали в конечной концентрации О мг/мл; буферный раствор содержал 10 мМ морфэлинопропанс.ульфонов кислоту, рН-7,0; 40 мМ ЫаСХ, 0,1 мМ ЗГТА, 10 мМ 2-меркаптоэтано После центрифугирования смеси белков при 150 OOOg, 30 мин., сост надосадочной жидкости и осадка анализировали с помощью электрофо за. Для изучения влияния фосфорилирования калдесмона на его вза модействие с миозином методом дэнситометрии окрашенных гелей опр

деляли количество связавшегося с миозином белка, а денситометрией соответствующего радиоавтографа оценивали долю фосфорилированного калдесмона или его пептидов в общем количестве калдесыска или пептидов, связавсихся с миозином. Отношение констант ассоциации с миозином для дефосфэ- и фосфсжалдесмснз определяли по фодауле:

Кф:К= ( ЩШШ )ссадок : ( щтш Ьупернатапт Иммунохимические и иммунофлу оресцентные методы. Конкурентное взаимодействие тропонин Т-специфических антител к калдесмону и тропо-миозина с тропошшсм Т и калдесмоном изучали методом иммунофермен-тного анализа. Для этого иммобилизованные в плашетгх для иммуно-ферментнсго анализа тропошш Т, либо калдеемои инкубиросались 30 глин, при 37°С со смесью тропомиозина и тропонин Т-спепифических антител к калдесмону, взятых в разных пропорциях. Несвязавшийся материал отмывали фосфзтно-солевым буфером.Долю связавшихся с иммобилизованным антигеном тропошш Т-спецкфических антител к калдесмону определяли спектрофотометрически с помощью вторых антител, конъюттрованных с пероксидазой хрена и ортофенилендиамина в качестве хромогена.

Иммунопреципитацию калдесмона и ка^ьпонина из экстрактов культивированных 1?ИК проводили по стандартной мэтодтке. Лизис ГМК проводили при ^С в буферном растворе следующего состава: 20 мМ трис-НС1, рН-7,4; 160 мМ КаС1, 0,1% ДОН, 0,5% тритон Х-100, 0,5% деоксихолат- натрия, 0,5 мМ ф^шт.таетилсульфонилфторид, 0,5 мМ то-зилфенилаланилхлорметил кетон, 0,5 у" тозпллизилхлсрметил кет-он. Иммунный комплекс исследуемых белков с соответствующими антителам! сорбировали на протеин-А агарозе и анализировали с помощью электрофореза.

Иммуноблоттинг проводили по методу Таубш:а (ТсжЫп а1., 1979). После электрофоретического разделения белки переносили из геля на нитроцвллюлозный фильтр; для количественной оценки содержания антигена реплику, обработанную первыми антителами, и вторыми

TOR

антителами, меченными I, экспонировали на рентгеновскую пленку, затем вырэзаж участки нитроцеллюлозы, соответствующие темным полоскам на' пленке, и определяли их радиоактивность ::а гамма-счетчике.

Локализацию кальпонина в ткани и культуре ГМК изучали методом двойного иммунофлуорвецентного окрашивания, используя поликлональные антитела к кальпонину и вторые антитела, меченые флуоресцеинизотиоцианатом (ФМТЦ) для выявления кальпонина к родамин-меченый фаллоидин для выявления Ф-актина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение структурно-функционального сходства каллесмона и тропочина. Функциональные свойства калдежша и тропонина, известные из литературы, имеют много общих черт. Оба белка способш взаимодействовать с актином, тропомиозином и обратимо ингибировать актин-актизируемую АТФазу миозина (Gergely et al.,1988, Sotue et at.,1988). Это позволило Марстону (Marston.1983) выдвинуть гипотезу о том что калдесмон являемся эволюционным предшественник« тропонинового комплекса поперечнополосатых мышц.

Методом иммуноблотинга нами было показано, что поликлональны; антитела к калдесмону гладких мышц не реагируют с тропонином I, н реагируют с тропонином Т (ТнТ). Далее, методом аффинной хромате графии поликлональк^с антител к калдесмону на колонке с иммооили зоеэнным ТнТ были получены тропонин Т-специфичеокие антитела к калдесмону (ТнТ-КД-АТ), которые и иопользсватась в дальнейшем. JLj локализации на молекуле тропонина Т участка, взаимодействующего полученными антителами, был использован метод пептидного картир; вания. Было установлено, что ТнТ-КД-АТ взаимодействуют ¿- иммую Олоттинге с так называемыми ТнТ-7 химотриптическим и CB-I и СВ

щанолитиче сними фрагментами тропонина Т. Все указанные фрагменты принадлежат к С-концевой части молекулы ТнТ и содержат учсотск, вовлеченный по всзимодействие с тропомиозином (Jackson ct al., 1975). Предположив, что именно тропомюзип-СБдзывающие участки могут быть родственны?«! у калдесмона п тропонина Т, мы исслэдовалл вопрос, способны ли ТнТ-КД-АТ конкурировать с тропомиозином за общую антигенную детерминанту на молекулах КД и ТнТ.

Методом иммуноферментчого анализа нами установлено, что присутствие тропоштазина снижает эффективность связывания ТнТ-КД-АТ как с тропонином Т, так и с калдесмспом. Тропомиозин способен также вытеснять ТнТ-КД-АТ с иммобилизованных ТнТ и КД (Рис Л К

1,25 1

О О

с 40

Тропомиозин,

60

М1(Г/МЛ

0-ю го 40

Тропомиозин, MK1-/MJ1

Рис Л. Изучение вытеснения тропомиозином тропонин Т-специфичвского пула антител к калдесмояу (3 мкг/мл) с иммобилизованного калдесмона (слева) и тропонина Т (справа/ методом иммуноферментного анализа.

Такил образом, полученные данные свидетельствуют, что ТнТ и КД имеют общую антигенную детерминанту. Участок сгруктурной гомологии калдесмона и тропонина Т вовлечен в во взаимодействие с тропомиозином. Эти данные были подтверждены данными первичной структуры калдесмона (Bryan at al.,1989, Hayashi et al.,1989). Взаимодействие калдесмона с миезинтад гладких мкшц. Проведенный

нами анализ химотриптиче ских пептидов калдесмона, соосаадакшхся с миозином гладких мшц при ультрацеитрифугироваши, показал что N-концевсй фрагмент калдесмона с кажущимся мол. весом 27 кДа способен реагировать с миозином. Эти данные также согласуются с данными Велаз и соавт. (Velaz et al.,1990), которые также локализовали этот участок в N-концевой части молекулы.

В работе Сазерленд и Волша (Sutherland,Walsh,1989) было уста новлэко, что фосфорилирование калдесмона Са-калъмодулин-зависимо киназой предотвращает его взаимодействие с миозином гладких мыши Однако, этот фермент способен фэсфорилировать молекулу калдесмоЕ по крайней мере в четырех участках, расположенных как N-концевом, так и в С-концевом доменах молекулы (Ikebe, Reardoi 1990). На основании этих данных трудно сделать вывод, фосфорилир вание каких участков влияет на взаимодействие калдесмона и миоз на. Свойство казеинкиназы II типа фосфорилировать калдесмон единственному участку - Ser-73, расположенному в 27 кДа N-концег пептиде молекулы (Wawrzynow et ai.,1991). позволило изучить вл! нив фосфорилирования этого пептида калдесмона на его взаш действие с миозином.

При ультрацентрифугировании смеси миозина и химотриптичес фрагментов калдесмона, фосфорилированного казеинкиназой II типа кДа пептид калдесмона , соосавдавшийся с миозином, действите; содержал включенный меченый фосфат, что подтверждает сделш нами ранее вывод о происхождении этого пептидг; из N-концевого ; стка КД. С другой стороны, приведенные в Табл I. данные показ; ют, ■что фосфорилирование N-концевого домена КД казеинкиназо! типа ведет к снижению кажущейся константы связывания с миоз как нативного калдесмона, так и его 27 кДа фрагмента.

Наш данные не исключают того, что фосфорилирование дрз N-концевого участка - Ser-26 может также влиять на взаимодей

ю

калдесмона с миозином, как зто оыло показано Сазерленд и Волшем (Sutherland,Walsh,1989).

Таблица I. Влияние фзсфорилкрованкя на взаимодействие калдесмона и его 27 кДа (фрагмента с глэдкожшечккм миозином. К/Кф - соотношение констант ассоциации фосфэрилированного и нефосфорилированного калдесмона с миозином, п - количество экспериментов.

Белок Конная сила (vlti ICaCl) К/Кф

Интактный каддесмон ьи I,85+0,18 (n=I0)

27 кДа фрагмент 7С 1,84+0,18 (n=I0)

160 2,51+0,35 (n=4)

2 4 6 10 0 0.05 0.10 0.15 о;с

Калы:./акт., мель/моль Калд./акт., моль/моль

Рис.2 Влияние кальпонина (ол-ьа, на вызванное калдесмоном и калдесмона (справа) на вызванное кальпонином ингибирование АТФазной активности актмякглша скелетных мышц. (®) - Индивидуальное влияние калъпс/шна (слеза) и калдесмона (справа) на актомиезиновую АТФэзу. Влияние кальпонина на АТФазную активность актомиозкна в присутству в молярном отношении к

актину 0,07:1 (Д) и 0,20:1 ;. Влияние калдесмона на АТФазную активность актомиозина в присутствие кальпонина в молярном отношении к актину 1:1 и (в).

Участие кальпонина в регуляции активности актин-активируемой АТФазы миозина. В литературе показана способность КН. взаимодействовать с актином, тропомиозином и кальмодулином (ТакаЬавМ е1 а1.,1937), однако, его влияние на актин-активируемую АТФазу миозина к началу данной работы изучено не было.

На Рис.2 показано, что КН ингибирует актин-активируемую АТФ-азную активность миозина, сникая ее до 20% от исходного значения. Степень ингибирования пропорциональна связыванию кальпонина с актином (Рис.З.А). Кальмодулин в присутствие ионов кальция вызывает

Рис.3 Конкуренция мезду кальпонкном (КН) 1» калдесмоном (КД) взаимодействие с актиновыми филамектами. (А) - связыве кальпонина. с актином в отсутствие (О) и присутствие ( трапомиозина ( I моль на 7 моль актина) а также присутствие кавдесмона в молярном отношении к актину 1:14 (¿3 1:5 (А). (Б) - связывание кавдесмона с актином в отсутствие (С в присутствие кальпонина в молярном отношении к актину 1:1 ( (В) - Отмена рвя^каяштя кавдесмона с актином в присутс кальпонина. (Г) - Частичная отмена связывания кальпонина с акт. в присутствие кадцесмона.

диссоциацию кальпонкна с актиновых филаментов и одновременное снижение ингибирующего эффекта КН на активность актин-активируемой АТФазы миозина (Рис.4).

Рис. 4- Влияние кальмэ^у^^а на связывание кальпонина с актином (вверху) и кнгкбируксий эдак? кальпонкна ка актсмиозиновую АТФ-азную активность (внизу:. Связывание и АТФззная актигг/ость измерялись в присутствие 0,1г,*М и I мМ ЭГТА (О).

2 6 10 14 18 Кальмодулин/кальпонин, моль/'моль

Из представленных данных видно, что КН способен регулировать активность АТФазы актомиозина весьма сходным с калдесмоном образом. Поскольку оба белка присутствует в гладкомышечной ткани, возникает вопрос, каков механизм та совместного действия на актин-активируемую АТФазу миозина?

Совместное действие калдосмона и кальпонкна на актин-активируемую АТФазу миозина. Данные о влиянии кальпонина на АТФазу, частило или полностью ингибированную калдесмоном, а также обратные эксперименты (Рис.2) свидетельствуют, что ингибирукзщий эффект калдесмо-на и кальпонина на АТФазную активность актомиозина является аддитивным. Анализ данных ультрацентркфугирования смеси Ф-актина, кал-

десмона и кальпонина показал, что калдесмон и кальпонш конкур ют между собой за участки связывания на актине (Рис.3).

Полученные данные о прямой конкуренции мевду кальпонинс калдесмоном за связывание с актином ставят вопрос, могут ли белка функционировать на одном филаменте, или же они распреде, по разным классам филаментов? Оба бежа обнаружены в экстракта гладких мышц, а также в составе изолированных тонких филамент* пропорциях к актину, ниже насыщающих (МвМйа et а!., 1991). видно из наших данных, колокализация кальпонина и кадцесмонг одном и том же филаменте при таких концентрациях вполне возмож Тканевая и внутриклеточная локализация кальпонина. К моменту начала данной работы кальпонин с помощью ме иммуноблоттинга был идентифицирован в ряде тканей и кл (ГакаЬаБМ et а1.,1987). Однако, внутриклеточная локализ этого белка оставалась неизвестной.

Методом непрямого иымунофлуоресцентного окрашивания ср пупочного канатика человека была показана преимуществе: локализация кальпонина в гладкомышечных клетках стенок сос; пупочного канатика. Окружающие сосуды клетки мезенхималь: происхождения выявляли крайне слабое окрашивание на кальпонин.

С помощью метода двойного иммунофлуоресцентного окрашив мы определили, что в культивированных гладкомышечных клетках С аорты кролика расположение кальпонина совпадает с расположе

актиновых филаментов. В перше 2-3 дня в первичной культуре п

«

тически все клетки окрашивались полкклональными антителами к к понину. Наибольшая концентрация кальпонина отмечалась в центр ной части клетки; ближе к периферии его содержание убывало. К понин йе выявлялся в периплазматическом пространстве. По мере та ГМК в культуре было отмечено появление кальпонин-негати клеток, а в кальпонин-позитивных клетках наблюдалось более ра

мерное распределение кальпонина вдоль актинонах филаментоз. Этот процесс связан, по нашему мнению, с фенотипической модуляцией ГШ В культуре (Charr.ley-Carapbell et al., 1977).

Таким образом, распределение кальпонина в культивируемых ГМК сходно с распределением калдесмона (Bretscher,Lynch,1985). Локализация кальпонина на •актшовых филаментах хорошо согласуется с предположением о том, что этот белок in vivo так же, как и калдес-мон, регулирует актомиозиковое взаимодействие.

Другим доказательством в пользу участия кальпонина и калдесмона в регуляции сокращения гладкокышечных клеток может быть соответствие между высоким уровнем экспрессии этих белков в ГМК и способностью клеток к сокращению. Мк попытались исследовать этот вопрос и выбрали в качестве модели культуру ГМК аорты кролика. Известно, что культивирование ГМК приводит к утрате сократительно- го фенотипа (Thyberg.et al.,1990). Таким образом, эта модель дает возможность проследить на одном и том же объекте за изменением экспрессии кальпонина и калдесмона и сократительной способностью клеток.

Экспрессия калдесмона и кальпонина в культуре ГМК. Экспрессия белков в культуре ГМК изучалась методом количественного иммуноблот-тинга. Параллельно оценивалась относительная интенсивность синтеза этих белков по включению в них с— метиошша на разных сроках культивирования. На Fiic.5 представлены кривые синтеза и экспрессии

калдесмона и кальпонина в 2 вариантах культивирования ГГ.И: низкая плотность посадки ГМК + среда, содержащая 5% сыворотки, и низкая плотность посадки + бессыЕэроточная среда МОНОМЕД. В. первые"" дни культивирования ГМК экспрессия изучаемых белков снижается независимо ст условий культивирования. Различия начинают проявляться после того, как клеточная популяция проходит временную точку нача-

VI"'

I

о X X

"10

о £

х' о 2 и

а '.!«

к

о *

е •

о.

9)

а

5

X а и

а

о к

>5

' ж о

X

л

и

х ■

А1

Б1

Б2

Л—-

БЗ

^--

•4

3

с с. V X

а я 2

О

2 и § с

0 X

1

и

о

0 5 10 15 О 5 10 15 ДНИ В К У.Л Ь Т У Р Е

I §

г о

О Ю

2 а

Рис.5. Кинетика роста к лето::, экспрессия ( синтез ; ,

калдесмона и кяльпошша при различных Вс<р:*г!и7-'п. т'улъткы'роьзниг ГМК. Клетки были Еысеяны в культуру с низкой г.ло:н;гл1,ь культивировались в ьрисутсгьае спвороткд (А) ил;1, в ЫЖМЕД*

(Б). Количество клеток в культуре

а ! ,

интес п

н-калдесмона ( ряд 2) и кальпонина (ряд С-) пре г^а^лекы в вид; зависимости от срока культивирования ГМК.

з

лэ пролиферации (6-7-й день в культуре).

Культивирование Ж в бессывороточной среде МОНОМЕД ингибиру-•эт клеточное деление и позволяет поддерживать экспресса ь-калдесмона н^ уровне в 2 раза выше по сравнению с культизирово-нием ГМК в среде с Ъ% сывороткой, где клетки пролиферируют (Рис.5.А,Б-2).

Экспрессия кальпонина также зависит от условий культивирования (Р/с.5.А,Б-з). Культивирование ГЖ низкой плотности в среде с Б% сывороткой приводило к тому, что содержание кальпсниьа в клетках снижалось и достигало к 13-му дню зий от доходного уровня. Культивирование ГМК В МОНОМЕДе поддерживало экспрессию кальпонина, подобно ь-калдэсмону, на более высоком уровне. Необычный профиль кривой экспрессии кальпонина з этом случае может объясняться тем, что при фснотипичиской модуляции ГМК происходит переключение синтеза изоформ кальпонина. Для кальпонина описано существование нескольких изозлектричэских вариантов, неразличимых :;а ДиН-электроф:резе (ТакаПагШ еъ а1.,1937). Допустив, что используемые поликлональные антитела реагируют со всем; изоформами, можно представить кривую экспрессии кальпо;:ина как сушу двух кривых, одна из которых описывает убывающую экспрессию исходной изоф'.рш, а другая - возрастающую экспрессию нового варианта кальпонина.

Для сравнения экспрессии калдесмона и кальпонина с известными маркера?.'« гладкс-мышечнст'"- фег.отипа мы параллельно наблюдали за экспрессией миозина к изоформ винкулиьа. Зкспресс/.я глздкоми-ечно-го миоя1шз была похожа на экспрессию Ъ-калдесчсна 1: сумм:: изоформ кальпошша, т.е. ь пролидзертфушой культуре ГЖ их экспрессия значительно снижалась, а в присутствие КОНСМЕНа стабилизировалась па более высоком уровне (Бис.6). Р то же время эхспрэсл'.я изсфэрм виккулина (соотношение кетгвинкулингвинкулш) отличалось о? экспресса калдссмона, кальпошша и гладкотлышечнгто миозина г том,

что она зависела от состояния клеточных контактов в культуре. Только для изоформ винкулина мы наблвдали восстановление экспрессии до исходного уровня при достижении конфлуентности (Рис.7).

Рис.6. Экспрессия гладкомышечного миозина в культуре ГМК. А низкая плотность посадки + 5% сыворотка, Б - низкая плотно посадки + МОНОЦЕД

~~ Flic. 7. Экспрессия винкулина в культуре ГМК. А т низкая сверхнизкая(О) плотность посадки + 5% сыворотка, Б - i платность посадки + МОНОМЕД,

В культуре сверхшзкой плотности, где конфлуентность не достиг лась в течение 2 недель культивирования ГМК, исходное соотноше! метавинкулин:вкнкулив также не восстанавливалось (Рис.7,А). В п] сутствие МОНСМЕДа экспрессии винкулина практически не меняла' что, вероятно, связано с интенсивным развитием контактов клето: субстратом в этих условиях культивирования. Таким образом, н

результаты показывают, что экспрессия кальпонина и калдесмона в ГМК согласуется с экспрессией другого маркера, необходимого для сокращения гладких мшц, а именно гладкомышечного миозина. Оснсгы-ваясь на этих данных, мы попытались оценить сократительную способность ГМК на различных сроках в культуре и сопоставить ее с экспрессией калдесмона и калълонина.

Сократимость ГМК в культуре. Для оценки сократительной способности культивированных ГШ были использованы эластичные мембраны из по-лидиметилполисилоксана. Клетки, посаженные на такие мембраны, при сокращении вызывали образование на мембране складок, видимых в микроскоп.

ГМК, пересаженные ка мембраны на третий день после выделения из аорты кролика, отвечали ярко выраженным сокращением на обработку кальциевым ионофором иокомицином. Сокращение клеток, посаженных в культуру с низкой плотностью, выращенных в присутствие 5% сыворотки и поресеянных на мембрану, наблюдалось в течение первых 5-6 дней после выделения из сосудов. Чем дольке был период культивирования ГМК в среде, содержащей сыворотку, тем менее выраженным было сокращение клеток, и большее число клеток не сокращалось ь ответ ка воздействие иономицином. Появление клеток, не способных сокращаться, коррелирует с отмеченной нага; гетерогенизацпей модулирующей культуры 1Ж по отношению к кальпонину, а также появлением в культуре ГМК клеток, не выявляющих гладкомышечного миозикз (НагпЕэгХе, 1 936}.

ГШ низкой плотности, культивируемые в МОНиМЕДе, были способны сокращаться после стимуляции иономицином вплоть до 13-го дня, т.е. на неделю дольше, чем те же клетки, в присутствие сыворотки.

Как было отмечено выше, уровень экспрессии калдесмона и каль пенила, а также гладког,млечного миозина в этей культуре был также выше, чем в присутствие сыворотки. Из Таблицы 2 бидно, что высокое

содержание ь-калдесмона и калыюнина в ГМК коррелирует с их сократимостью. В то же время, содержание изоформ винкулина в ГМК не коррелирует с.этим параметром.

Таблица 2. Содержание ь-калдесмона, кальпогоша и изоформ винкулина в сократимых и несократимых 1Ш. (% от значения в свезкевыделекных ПК).

Условия культивирования Содерз гание белке Сократимость

Ь-калдесмон кальпонин метавин./вин

3-й день +5% сыв. 13-й день +556 сыв. 13-й дань +МОНШЕД 90 42 70 80 36 56 73 83 1СЮ + +

Таким образом, сравнение экспрессии калдесмона и кальпошша в 1"МК с экспрессией других маркеров сократительного фенотипа и параллельное определение сократимости клеток свидетельствует в пользу того, что эти белки действительно вовлечены в регуляцию сокращена гладкомшечных клеток. В отличие от этих белков, экспрессия изоформ винкулина не коррелирует с сократимостью клеток, а в больна! степени характеризует состояние клеточных контактов.

ВЫВОДЫ.

1. Ь-Калдесмон и регуляторный белок поперечнополосатых мыш тропонин Т -. иммунологически родственные белки. Участо структурйой гомологии калдесмона и тропонина Т вовлечен в эта молекулах во взаимодействие с тропомиозином.

2. ь-Калдесмон способен непосредственно взаимодействовать

хадксмышечным миозином с помощью миозин-связыващего участка, неположенного в 28 кДа к-концевом фрагменте молекулы калдесмона. зефорилирование данного участка казеинкиназой II типа ослабляет га взаимодействие.

3. Кальпонин, подобно 1г-калдесмону, ингибирует АТФазу стомиозина. Са-кальмодулин снижает 1шгибирующий эффект игьпонина. Степень ингибирования пропорциональна связыванию 1Льпошша и калдесмона с актиновыми филаментами. Калдесмон и 1Льпонин конкурируют за связывание с Ф-акпшом.

4. Гладкомкшечные клетки сосудистой стенки содержат большое ■личество кальпошша. Кальпонин локализуется вдоль пучков :тиновых филаментов. При фенотипической модуляции в культуре капливаются кальпонин-негативные клетки.

5. В процессе фенотипкческой модуляции экспрессия кальпошша

ГМК аорты кролика снижается. Экспрессия кальпошша в этих

етках сходна с экспрессией ь-калдесмона и гладкомышечного озина, но отличается от экспрессии метавинкулина. Тагам образом, льпонин может быть использован в качестве маркера кратительного фенотипа ГМК сосудов в культуре. Высокий уровень спрессии маркеров сократительного фенотипа в гладкомкзечню: етках коррелирует с их сократимостью в культуре.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

«UD

Бушуева Т.Л., Ширинский В.П., Бирюков К.Г. Fo. зктростатических взаимодействий в образовании комплекса лдесмон-кальмодулин. Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума яофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси, 1930, 7.

Gusev N.E., Shirinsky Y.P., Birukov К.G., Ycrotnikov A.Y. Ldesmon150, oaldesmcn?? and skeletal troponin T are nunologically related proteins. International symposium 3lecular organisation of biological structures", Moscow, 198Э,

3. ShirinBky V.P., Birukov K.G., Sobolevsky A.V., Posin E.Ya., Popov E.G. The expression of myosins and caldesmons and contractile activity of rabbit aortio smooth muscle oells in culture. International symposium "Molecular organisation of biological structures" Moscow, 1989. p.21 4.

4. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Vorotnikov A.V, Gusev N.B. Caldesmon 150, oaldesmonT? and skeletal muscle troponin T share a common antigenic determinant. FEBS Lett., 1989, Vol.251, p.65-68.

5. Birukov K.G., Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V., Gusev N.B. Competitive binding of the troponin T-specific pool of oaldesтоп antibodies and tropomyosin to skeletal troponin T and smooth musole oaldesmon. FEBS Lett., 1990, Yol.2b2, p.263-265-

6. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Vorotnikov A.V., Gusev N.B. Tropomyosin interacts with caldesmon and troponin T involving regions of structural homology shared by these proteins. John

. C.Seidel Memorial Symposium on the Regulation of Smooth Musole Contraction. Boston, 1990, Poster 22.

7. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Koteliansky V.E., Glukhova Ы.А., Spanidis E., Rogers J.D., Campbell J.H., Campbell G.R. Density-related expression of oaldesmon and vinculin in oulturec rabbit aortio smooth musole cells. Exper. Cell Res., 1991 Vol.194, p.156-189.

8. ' Birukov K.G., Stepanova o.V., Nanaev A.K., Shirinsky v.p Expression of oalponin in rabbit and human aortic smooth musci oells. Cell Tis. Res., 1991, Vol.266, p.579-584.

9. Makuoh R., Birukov K.G., Shirinsky V.P., Dabrowska F Functional interrelationships between oalponin and caldesmor Biochem. J., 1991, Vol.280, p.33-38.

10. Гусев.Н.Б., Воротников А.В., Бирюков К.Г., Ширинский E.I Кальдесмон и кальпонин - белки, участвующие в регуляцз взаимодействия миозина и актина в немышечных клетках и гладк: мышцах. Биохимия, 1991, Т.56, вып.8, стр.1347-1366.

11. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Sobolevsky A.V., Vedernik Yu.P., Posin E.Ya., Popov E.G. Contractile rabbit aortic smoc musole oells in culture: preparation and charaoterizatic Amer.J.Hypertens., 1992, Vol.5, p.124S-130S.

12. Shirinsky V.P, Birukov K.G., Hettasch J.M., Sellers J Inhibition of the relative movement of actin and myosin

oaldesmon and oalponin. J. Biol. Chem., 1992, Vol.267, N

p.15886-15892.