Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие, организация и регенерация мышечной ткани стенки влагалища

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Развитие, организация и регенерация мышечной ткани стенки влагалища"

На правах рукописи

ШУРЫГИНА ОКСАНА ВИКТОРОВНА

РАЗВИТИЕ, ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГЕНЕРАЦИЯ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ СТЕНКИ ВЛАГАЛИЩА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 5 >,г:3 2015

Казань-2014

005557319

005557319

Работа выполнена в Государственное бюджетной образовательное учреждение высшего профессионально образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ямщиков Николай Васильевич

доктор медицинских наук, профессор заслуженный работник высшей школы РФ Баженов Дмитрий Васильевич доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент РАН, заведующий кафедрой анатомии ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России, Банин Виктор Васильевич доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент РАН заведующий отделом медико-биологических проблем ГНУ ВИЛАР ФАНО РФ Павлов Алексей Владимирович доктор медицинских наук, профессор заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО ЯГМУ Минздрава России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится марта 2015 г. в 10.00 на заседании

Диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 «Б»),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 «Б») и на официальном сайте www.kgmu.kcn.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор '' Л.Д. Зубаирова

Введение. Актуальность темы. Изучение гистофизиологии тканей в нормальных и экспериментально измененных условиях является одним из ведущих направлений современных фундаментальных исследований. Многочисленные работы морфологов посвящены вопросам структурно-функциональных характеристик мышечной ткани, которая входит в состав стенок большинства полых органов (Баженов Д.В., 1988; Клишов А.А., 1994; Ямщиков Н.В., 1991; Данилов Р.К., Зашихин А.Л., 1994, 2001; Кузнецов С.Л., 1999; Суворова Г.Н., 2001; Одинцова И.А., 2004; Данилов Р.К., 2008; Gabella G., 1981; Campbell G.H. et al., 1987; Worl J. et al., 2005; Garfield R.E. et al., 2010; Liu R. et al., 2014). Общепризнана ее определяющая роль в нормальном функционировании органов и при развитии реактивных состояний.

В настоящее время усилия ученых направлены на детальное изучение гистофизиологии мышечной ткани внутренних органов, ее органоспецифичности с применением новых методов исследования в нормальных и экспериментальных условиях (Агафонов Ю.А., 1999; Башилова Е.Н., 2000; Пахтусова Н.В., 2002; Бурыкин И.М., 2004; Бармина А.О., 2008; Gannon B.J. et al., 2000; Gualteri M. et al., 2011; Wanjare M. et al., 2013; Ludlow J.W. et al., 2013).

Однако, до сих пор недостаточно внимания уделялось вопросам эмбрионального и постнатального гистогенеза и гистофизиологии мышечной ткани стенки влагалища млекопитающих. В связи с этим анализ структурно-функциональной организации, особенностей базисных процессов гистогенеза мышечного компонента стенки влагалища половозрелых лабораторных животных представляется весьма актуальным. Аномалии развития и заболевания органов репродуктивной системы во многом определяют увеличение частоты осложнений во время беременности и родов (Краснопольский В.И. и др., 1999; Farage М., Maibach Н., 2006; Breech L.L. et al., 2009; Trad M., Palmer S., 2013). Поэтому всестороннее, детальное изучение структурных основ жизнедеятельности мышечной ткани органов женской половой системы является в настоящее время не только важным разделом современной морфологии, но и имеет большое значение в решении проблемы сохранения репродуктивного здоровья женщины. В последние годы многочисленные исследования посвящены изучению гистофизиологии тканей стенки влагалища при пролапсе тазовых органов (Ящук А.Г., Каюмов Ф.А., 2008; Takacs Р. et al., 2010; Takacs Р. et al., 2011; Kannan К. et al., 2011). Появляются новые работы в области инженерии тканей, образующих стенку влагалища in vivo (De Filippo R.E. et. al., 2003; Но M.H. et al., 2009; Gualtieri M. et al., 2011; Shridharan I. et al., 2012; Wanjare M. Et al., 2013; Raya-Rivera A.M. et al., 2014). В связи с чем полученные данные в ходе настоящего исследования могут быть весьма полезными для тканевой инженерии и реконструктивной хирургии.

Данные литературы о межтканевых взаимоотношениях тканей в ходе закладки органа и источниках развития мышечной ткани влагалища

противоречивы (Sygalony J.P. et al., 1989; Drews U. et al., 2002; Oh S. J. et al., 2003; Drews U., 2007; Cai Y„ 2009; Masse J. et al., 2009; Fritsch H. et al., 2013).

Гладкая мышечная ткань, являясь ведущим структурно-функциональным компонентом трубчатых висцеральных органов, имеет большое значение в их нормальном функционировании, возникновении реактивных состояний и патологии. В настоящее время проведено достаточное количество исследований, посвященных изучению ГМТ сосудов и висцеральных органов (Ямщиков Н.В., Суворова Г.Н., 2003; Созыкин A.A., 2004; Болдуев В.А., 2006; Gabella G., 1984; Chaabane С. et al., 2014). Однако, работы, посвященные эмбриональному и постнатальному гистогенезу, структурной организации гладкой мышечной ткани стенки влагалища млекопитающих в литературе -единичны, а сведения, приведенные в них, противоречивы (Del Vecchio F.R. et al., 1982; Giraldi A. et al., 2002; Basha M. et al., 2013).

Изучение эмбрионального и постнатального гистогенеза поперечнополосатой мышечной ткани влагалища является практически неизученным вопросом. Само присутствие исчерченной мышечной ткани в стенке влагалища упоминается в некоторых руководствах по гистологии (Быков B.JL, 1999; Leslie P. Gartner, James L. Hiatt, 2007; Michael H. Ross, Wojciech P., 2009) и описана в единичных научных публикациях (Lagunes-Cordora R., Tsutsumi V. et al., 2009, Skocylas L. C„ Jallah Z. et al., 2013). При этом, до сих пор, ни одна из современных классификаций тканей однозначно не определяет место исчерченной мышечной ткани влагалища в общей системе мышечных тканей. Дискуссионными в научной литературе являются вопросы о фенотипе поперечнополосатой мышечной ткани, располагающейся в стенке влагалища, особенностях ее структуры и реактивности при различных воздействиях (Rodriguez-Antolin J. et al., 2009; Martinez-Gomez M. et al., 2009). Данная проблема в настоящее время является одной из наименее изученных.

Анализ структурной организации тканей с позиций учения о гистогенезе и клеточно-дифферонной организации тканей является одним из весьма спорных вопросов современной морфологии. Концепция дифферонной организации тканей, предложенная предложенная A.A. Клишовым (1990) и получившая свое развитие в работах Н.В. Ямщикова (1997), Зашихина А.Л. (2001), Данилова Р.К. (2000, 2008), Одинцовой И.А. (2004), позволяет рассматривать ткани как системы взаимодействующих дифферонов. Исследование их реактивных изменений, взаимодействие в репаративном гистогенезе представляет собой интерес не только для морфологии, но и для практической медицины.

Проблема регенерации тканей является актуальной для современной фундаментальной и практической медицины. В классических гистологических работах Н.Г. Хлопина (1946), A.A. Заварзина (1950, 1957,1986) подчеркивается, что восстановительный потенциал тканей - является одним из важнейших признаков их детерминации. Кроме того, до настоящего времени не решена проблема акушерского травматизма тканей половых путей в родах и его неблагоприятных последствий для организма женщины. Несмотря на

современные способы усовершенствования ведения родов, частота травматизма тканей органов репродуктивного тракта не имеет тенденции к снижению и составляет 10,2-39,0% (Кулаков В.И., Бутова Е.А., 2003). По статистике акушерского травматизма разрыв промежности, в том числе и влагалища, составляет 7-15% у родивших, причем, у первородящих в 2-3 раза чаще, чем у повторнородящих. В связи с чем актуальность изучения регенераторного потенциала мышечной ткани стенки влагалища не вызывает сомнений.

Таким образом, наличие спорных вопросов о ходе эмбрионального и постнатального развития, гистофизиологии и регенерации мышечной ткани стенки влагалища не позволяют иметь целостное представление об этапах развития, базисных процессах гистогенеза мышечной ткани, а также репаративной регенерации мышечного компонента стенки влагалища. Изучение этих проблем имеет не только важное значение для фундаментальной, но и для практической медицины.

Цель исследования - комплексный морфологический анализ закономерностей эмбрионального и постнатального развития, структурной организации и особенностей регенерации мышечной ткани стенки влагалища млекопитающих.

Задачи исследования

1. Исследовать особенности эмбрионального развития и основные этапы становления структурной организации мышечной ткани стенки влагалища млекопитающих

2. Изучить межтканевые взаимодействия в ходе становления структурной организации влагалища млекопитающих и соотношение мышечного компонента его стенки в дефинитивном состоянии

3. Изучить с помощью гистологических методов исследования организацию гладкой мышечной ткани влагалища у лабораторных животных

4. Исследовать морфофункциональные особенности исчерченной мышечной ткани влагалища у лабораторных животных

5. Провести морфофункциональный анализ гладкой мышечной ткани стенки влагалища у различных видов млекопитающих и исследовать возрастную динамику ее популяции

6. Изучить особенности формирования и структуру дифферонов гладкой и исчерченной мышечной ткани стенки влагалища млекопитающих

7. Определить место гладкой и исчерченной мышечной ткани стенки влагалища в современной классификации мышечной ткани млекопитающих

8. Выявить общие закономерности и особенности реактивности и регенераторные потенции мышечной ткани при различных способах повреждения у лабораторных животных

Научная новизна

Впервые в рамках одной работы с использованием комплекса современных морфологических методов проведен детальный анализ мышечного компонента стенки влагалища, результаты которого свидетельствуют о наличии в среднем и проксимальном отделах только гладкой мышечной ткани, пучков гладких миоцитов и волокон поперечнополосатой мышечной ткани в дистальном отделе влагалища лабораторных животных.

Комплексный подход к морфологическому исследованию мышечной ткани стенки влагалища лабораторных животных позволил установить особенности пролиферации, специфической дифференцировки, интеграции, запрограммированной клеточной гибели в ходе эмбрионального и постнатального развития. В работе показан неконкурентный характер процессов пролиферации и дифференцировки гладкой мышечной ткани в эмбриональном периоде. С помощью иммуногистохимических маркеров к а-гладкомышечному актину и кальпонину продемонстрирован гетерохронный характер дифференцировки гладких миоцитов стенки влагалища в постнатальном периоде развития крыс.

Впервые проведено комплексное гистологическое, электронно-микроскопическое, гистохимическое, иммуногистохимическое и морфометрическое исследование исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища млекопитающих, которое указывает на миотомное происхождение этого вида ткани и позволяет по совокупности полученных данных отнести ее к висцеральной несердечной поперечнополосатой мышечной ткани, уточнить ее место в современной классификации тканей.

Приоритетными являются сведения о морфометрических характеристиках гладких мышечных клеток крыс в разные периоды постнатального развития, которые заключаются в констатации факта их более интенсивного роста на первой неделе постнатального развития и в пубертатный период.

Новизной обладают сведения, полученные о структуре популяции гладкой мышечной ткани в разных отделах влагалища у половозрелых крыс.

Получены новые данные о статистически значимых изменениях объемов гладких миоцитов и объемов их ядер в разные фазы эстрального цикла стенки влагалища у крыс. С помощью иммуногистохимического анализа установлены особенности экспрессии а-эстрогеновых рецепторов ядрами гладких мышечных клеток в постнатальный период развития.

Новым является факт обнаружения интерстициальных клеток Кахаля в гладкой мышечной ткани стенки влагалища, который подтвержден данными электронной микроскопии и иммуногистохимического анализа к CD-I 17.

Впервые изучены особенности репаративной регенерации и регенераторные потенции мышечной ткани стенки влагалища при различных способах повреждения. Проведен сравнительный анализ компенсаторно-

приспособительных и восстановительных процессов мышечной ткани при действии различных повреждающих факторов.

Комплексный морфологический анализ позволил изучить и рассмотреть мышечную ткань стенки влагалища как системы клеточных дифферонов, для которых характерно формирование новых внутридифферонных и междифферонных взаимоотношений в условиях репаративной регенерации.

Практическая и теоретическая значимость

В данной работе представлено комплексное сравнительное морфологическое исследование эмбрионального развития мышечного компонента влагалища. Для практической медицины весьма ценными являются сведения о гетерогенности эмбриональных зачатков мышечного компонента влагалища, которые могут быть использованы при дифференциальной диагностике опухолевых заболеваний влагалища.

Установленные в рамках проведенного исследования особенности развития мышечного компонента влагалища у млекопитающих могут быть использованы в практической медицине для понимания формирования врожденных аномалий развития и их коррекции, приобретенной патологии влагалища.

Полученные экспериментальные данные целесообразно использовать для обоснования экстраполяции результатов экспериментов с использованием лабораторных животных на человека.

Полученные данные об основных этапах и закономерностях гистогенеза мышечной ткани стенки влагалища представляют несомненный интерес для эмбриологов и гистологов с целью решения проблем фундаментального характера, в том числе и управления процессами гистогенеза.

Результаты проведенного исследования существенно расширяют современные представления о мышечной ткани стенки влагалища и определяют место исчерченной мышечной ткани в общей классификации тканей. Данные светооптического, электронно-микроскопического, иммуногистохимического, гистохимического, морфометрического анализа структурной организации мышечной ткани влагалища свидетельствуют о том, что она обладает

органоспецифичностью.

Сведения о структурной организации мышечной ткани стенки влагалища имеют значение для понимания механизма функционирования влагалища, что имеет существенное значение для практической медицины, а именно для разработки новых методов тканевой инженерии с последующим применением в реконструктивной хирургии при приобретенной патологии органов репродуктивного тракта (пролапс стенок влагалища).

Полученные в результате проведенного комплексного исследования характеристики мышечной ткани могут быть использованы в качестве базовых при проведении экспериментов на лабораторных животных и исследовании различных видов повреждений и врожденных аномалий у человека.

Экспериментальные данные по изучению компенсаторных потенций и механизмов репаративной регенерации мышечной ткани стенки влагалища

позволяют определить стадии раневого гистогенеза, критерии жизнеспособности элементов мышечной ткани, источники для репаративной регенерации, а также особенности реактивных изменений гладкой и исчерченной мышечной ткани в зависимости от способа повреждения.

Теоретические результаты работы целесообразно использовать в преподавании соответствующих разделов эмбриологии, гистологии, акушерства, гинекологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Репаративная регенерация гладкой и поперечнополосатой мышечной ткани стенки влагалища происходит гетерохронно и характеризуется формированием новых внутридифферонных и междифферонных взаимоотношений.

2. Поперечнополосатая и гладкая мышечные ткани стенки влагалища характеризуются собственными линиями миогенной дифференцировки и обладают органоспецифичностью.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре гистологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, на кафедре физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, на кафедре цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, на кафедре цитологии, эмбриологии, гистологии ГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова Министерства образования и науки Российской Федерации.

Получены патенты на полезную модель Федеральной службы по интеллектуальной собственности (РОСПАТЕНТ):

Ямщиков Н.В., Суворова Г.Н., Шурыгина О.В., Григорьева Ю.В., Коновалов И.В., Яи. Лабораторный инкубатор. Патент на полезную модель №92299.

Шурыгина О.В., Ямщиков Н.В., Григорьева Ю.В., Коновалов И.В., Устройство, для дозированного растяжения трубчатых органов лабораторных животных. Патент на полезную модель №145930.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 52 работы, из них 26 - в ведущих рецензируемых российских научных журналах из перечня ВАК РФ, рекомендованного для публикаций основных результатов диссертации на соискание ученых степеней.

Личный вклад автора

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая организацию и проведение экспериментов,

анализ экспериментальных данных, теоретическое обобщение результатов исследования.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 277 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 272 источника, из которых - 154 иностранные. Иллюстративный материал представлен 3 таблицами. 193 рисунками, которые включают гистограммы, электронограммы и микрофотографии.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на итоговых научных конференция Самарского отделения НМОАГЭ (2006); на V111 Конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Орел, 2006), на Всероссийских научных конференциях «Бабухинские чтения в г. Орле» (Орел, 2006, 2007, 2009, 2011); на Международном научном симпозиуме «Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки» (г. Архангельск, 2006); на II Международном эмбриологическом симпозиуме «ЮГРА-ЭМБРИО-2006» «Закономерности морфогенезов в онтогенезе^ и эксперименте у человека и позвоночных животных» (г. Ханты-Мансийск, 2006); на научно-практической конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию профессора Л.И. Фалина (г. Москва, 2007); на Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей, клеток (г. Самара. 2008 г.); на Международной конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте», посвященной 80-летию профессора П.В. Дунаева (г. Тюмень, 2008)" Международной научной конференции, посвященной 65-летию Ивановской школы лимфологов «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической морфологии» (г. Иваново, 2009), на Всероссийском учебно-научном совещании «Вопросы морфологии XXI века» (г. С-Петербург, 2010); на Международной научной конференции «фундаментальные исследования» (Москва, 2012); на IX, X, XI Конгрессах Международной ассоциации морфологов (г. Бухара, Республика Узбекистан, 2008 г.; г. Ярославль, 2010; Самара, 2012); на XII Международном Конгрессе МАМ и VII Съезде ВНОАГЭ (г. Тюмень, 2014).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для решения поставленных задач в работе было проведено 2 группы экспериментов, в которых в качестве объекта исследований были использованы: белые беспородные крысы различных сроков эмбрионального и постнатального развития, половозрелые самки лабораторных животных (крыса, кошка, собака). Животные содержались в стандартных условиях вивария, уход за ними осуществляли по нормам и правилам обращения с лабораторными животными в соответствии с «Международными рекомендациями по проведении медико-биологических исследований с использованием животных»

(1985), с правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.12.1999. Проведение исследования единогласно одобрено на заседании Комитета по биоэтике при Самарском государственном медицинском университете (протокол №84 от 4.12.2009 г.).

В первой группе было проведено изучение эмбрионального и постнатального развития влагалища. Крыс, с датированным сроком беременности получали по стандартной методике (Методы биологии развития, 1977). Первым днем беременности животных считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках. Плоды необходимых сроков развития получали после вскрытия беременных самок, эвтаназию проводили смертельной дозой эфирного наркоза в соответствии с условиями, изложенными в приказе МЗ РСФСР №754. Изучены плоды самок крыс в возрасте 11-20-х суток эмбрионального развития. Для изучения постнатального развития влагалища брали материал от 1-7- дневных, 2, 3, 4, 5, 6, 8 -недельных крысят, половозрелых крыс, кошек, собак.

Вторая группа опытов поставлена для изучения регенерации мышечной ткани стенки влагалища после различного рода повреждений. Экспериментальная часть проведена на половозрелых самках крыс массой 100150 г.

Проведено три серии экспериментов:

1. В первой серии изучали регенерацию мышечной ткани влагалища после дозированного экспериментального растяжения с помощью устройства для дозированного растяжения трубчатых органов лабораторных животных. Патент на полезную модель №145930.

2. Во второй серии эксперимента изучали реактивные изменения мышечной ткани стенки влагалища и восстановление их целостности в условиях рассечения. В асептических условиях с применением интубационного эфирного наркоза проводили полное продольное рассечение стенки влагалища с последующим наложением швов.

3. В третьей серии эксперимента изучали регенерацию мышечных тканей после химической альтерации. В качестве повреждающего фактора использовали 3-х кратное применение 36%-раствора ваготила, который вводили во влагалище с помощью марлевого тампона на 3 минуты. Ваготил относится к клинико-фармакологической группе антисептиков, выпускается в виде раствора для наружного и местного применения, является антибактериальным препаратом.

Материал забирали на 3, 5, 7,10,12, 15, 21, 30 сутки от начала эксперимента.

Таким образом, в работе изучен материал от 250 объектов исследования. Характеристика животных и численность групп приведены в таблице 1.

Таблица 1- Характеристика материала и методов исследования

Объект Методы исследования, экспериментальная модель Возраст Число особей

Белые беспородные крысы, кошки, собаки Общегистологические, иммуногистохимический, гистохимический, электронная микроскопия, морфометрия, статистическая обработка Зародыши и плоды крыс 14-20-х суток эмбриогенеза, новорожденные. Крысята с 1 по 7 день постнатального развития, 2, 3,4, 5,6, 8 - недельные крысы, половозрелые самки млекопитающих 80 80

Белые беспородные крысы Общегистологические, иммуногистохимический, электронная микроскопия, морфометрия, статистическая обработка Половозрелые самки 90

В работе использованы:

Гистологические методы. Для проведения световой микроскопии использовали фиксацию материала в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН-7,4), заливку в парафин, после чего готовили фронтальные, сагиттальные и поперечные срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизон.

Метод щелочной диссоциации тканей с получением изолированных клеток. Для получения изолированных клеток использован метод щелочной диссоциации тканей по В.Я. Бродскому (1983 г.). Фрагменты влагалища фиксировали в холодном 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН-7,0), затем промывали проточной водой и измельченные кусочки органа переносили в 50% раствор КОН на 12 час. Далее материал помещали в холодную дистиллированную воду на 1 сутки. После 2-х часовой экспозиции при комнатной температуре, воду заменяли на свежую и с помощью магнитной мешалки производили окончательное разделение клеток.

Гистохимический метод. Определение гистохимического профиля поперечнополосатой мышечной ткани влагалища проводили с помощью реакции выявления сукцинатдегидрогеназы по стандартной методике Нахласа (Пирс Э., 1962).

Электронно-микроскопический метод. Для электронной микроскопии использовали префиксацию в 2,5% глутаральдегиде на 0,2 М ка-кодилатном буфере (рН 7,4), фиксацию в 1% Об04 и заливали в аралдит. Для обеспечения прицельного электронно-микроскопического анализа получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов проводили

заточку блоков. Прицельные ультратонкие срезы толщиной помещали на сетки После контрастирования срезов в 2,5% растворе уранилацетата на 50% этиловом спирте и 0,3% растворе цитрата свинца по E.S. Reynolds, срезы просматривали в электронном микроскопе Hitachi-HU-12.

Иммуногистохимический метод. Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии со стандартными протоколами Использовали систему визуализации Ultra Vision ONE с применением моноклональных антител:

1) Моноклональное антитело к маркеру клеточной пролиферации ki-67 (ядерный антиген клеточного деления) - для идентификации клеток находящихся в митотической, Gl, S, G2 фазах клеточного цикла: не обшиваются ядра клеток, находящихся в фазе покоя GO, клон SP6 (Labvision,

2) Моноклональное антитело PCNA - отражает общий уровень синтеза ДНК как в делящихся клетках, так и в полиплоидизирующих, клон PC 10 (Labvision, США)

3) Моноклональное антитело к кальпонину - для определения степени дифференцировки гладкой мышечной ткани, клон CALP (Labvision, США)

4) Моноклональное антитело к а-гладкомышечному актину - для идентификации гладкой мышечной ткани, клон 1А4 (DACO, Дания)

5) Моноклональные антитела к коллагену II, III, IV, VI, VIII типов - для определения типов коллагена в тканях мышечной оболочки влагалища (DACO Дания)

6) Моноклональное антитело к а-эстрогеновые рецепторы - для вдентификации эстрогеновых рецепторов в тканях, клон Н 226 (Labvision,

7) Моноклональное антитело к CD 117- для идентификации клеток Кахаля, клон 104D2(DACO, Дания).

После депарафинизации и регидратации срезов осуществляли демаскировку антигенов кипячением образцов в 10 М цитратном буфере на водяной бане. Визуализацию результатов после иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами проводили с помощью непрямой стрептавидинбиотиновой пероксидазной реакции. Срезы докрашивали гематоксилином Карацци и заключали в глицерин-желатину. Контролем чувствительности и специфичности реакции служили неиммунизированные кроличьи и мышиные сыворотки, а также срезы контрольных тканей.

Морфометрический метод. Для морфометрического исследования использовали мазки изолированных гладких моцитов. Измерение линейных размеров гладких миоцитов и их ядер производили в двух взаимноперпендикулярых направлениях с помощью программы обработки и анализа изображений Image Tool версии 3.0. В соответствии с полученными цифровыми данными вычисляли объем гладких миоцитов и их ядер (Хесин Я.Е., 1967). Расчеты производили, используя формулу эллипсоида: V = 1/6 яа2Ь, где (а - малый диаметр, b - большой диаметр измеряемого объекта). По

вычисленным объемам рассчитывали показатели ядерно-цитоплазменного отношения (ЯЦО) по формуле: ЯЦО = Уядра/(Уклетки-Уядра).

Статистическое исследование данных проводили с использованием статистического пакета SPSS одноименной фирмы. Проверка данных на соответствие нормальному распределению состояла из следующих процедур: а) построение гистограмм с наложенной нормальной кривой и нормальных вероятностных графиков; б) проверка на соответствие нормальному распределению одновыборочным тестом Колмогорова-Смирнова. Для описания выборочной совокупности данных использовали средние значения со стандартной ошибкой среднего показателей или стандартным отклонением, для определения статистически значимых различий между значениями показателей в группах данных были использованы непараметрические критерии Манна-Уитни (для двух независимых групп) и Крускала-Уоллиса (для более чем двух независимых групп).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Источники развития и ранние стадии гистогенеза мышечной ткани стенки влагалища (эмбриональный гистогенез)

В развивающихся органах репродуктивной системы (15,5-16,5 сутки эмбрионального развития крыс) клетки мезенхимы парамезонефральных протоков, прилежащие к эпителию, дифференцируются в фибробласты, чтобы образовать слизистую оболочку, наиболее отдаленные мезенхимные клетки дифференцируются в гладкие миоциты мышечной оболочки проксимального и среднего отделов стенки влагалища. Клетки мезенхимы располагаются как одиночно, так и небольшими скоплениями. Большинство мезенхимных клеток характеризуется высоким показателем ядерно - цитоплазменного отношения (1,64±0,73), митотический индекс составляет . 5,54±0,65%. По своей ультраструктурной организации они соответствуют промиобластам. Между ними начинают врастать нервные волокна, обладающие, по всей вероятности, индуцирующим влиянием на запуск процесса миогенной дифференцировки. Обнаружение первых миофиламентов в цитоплазме клеток свидетельствует о старте миофиламентогенеза и появлении первых миобластов, которые обладают высокой пролиферативной активностью 4,35±0,54%. Проявления дивергентной дифференцировки мезенхимных клеток дистальных отделов парамезонефральных протоков в элементы гладкой мышечной ткани отмечаются на 15,5-16,5 сутки пренатального развития крыс, становясь очевидными на 17,5 сутки. К концу 17,5 суток начинается формирование кластеров из двух - трех клеток с образованием протяженных простых контактов и десмосом между ними.

На 18,5-19,5 сутки пренатального развития крыс митотический индекс клеток в формирующейся мышечной оболочке составляет 3,86±0,23%, ядерно-цитоплазменное отношение 1,49±068. Усиливается гетероморфность и гетерохронность морфологической дифференцировки, что подтверждается обнаружением клеток на разном этапе процесса дифференцировки. Уровень

развития сократительного аппарата соответствует малодифференцированным гладким миоцитам. С увеличением количества миофиламентов, они занимают не только периферическую часть клетки, но и области цитоплазмы, расположенные ближе к ядру, формируют толстые пучки. Клетки с подобной ультраструктурой соответствуют дифференцирующимся гладким миоцитам. Ядерно-цитоплазменное отношение снижается до 1,03±044, митотический индекс составляет 3,24±0,31%. Эти данные свидетельствуют о том, что процесс специфической дифференцировки начинает несколько опережать процесс пролиферации. До этого дифференцировка не мешала активной пролиферации клеток, и они не были конкурентными.

На 19,5-20,5 сутки пренатального развития крыс, наряду с дифференцировкой гладких мышечных клеток, осуществляется их частичная элиминация. Среди нормально развивающихся гладких миоцитов отмечаются клетки в состоянии апоптоза. Вероятно, это объясняется конкуренцией среди гладких мышечных клеток за факторы, влияющие на их рост и дифференцировку. По нашему мнению, источником подобных факторов на этом этапе развития могут являться нервные элементы.

К концу эмбриогенеза на дистальном конце формирующегося органа обнаруживается закладка симпластических структур поперечнополосатого компонента, что определяется скоплением клеток, напоминающих своим строением промиобласты. Дифференцируясь, эти клетки становятся миобластами. Их размеры увеличиваются, развивается цитоплазма и органеллы общего значения. Митотический индекс малодифференцированных клеток составляет 3,83±0,46%. Следует отметить, что в дистальном отделе влагалища мышечный компонент характеризуется наличием элементов разной степени дифференцировки: от делящихся промиобластов до мышечных трубочек, что свидетельствует об активно протекающих процессах специфической дифференцировки. Также, как и дифференцировка гладкомышечных элементов, дифференцировка мышечных волокон характеризуется гетерохронностью. В этот период развития крыс обнаруживаются группы клеток, образующих между собой протяженные контакты. В результате слияния миобластов возникают первые миотубы. Практически сразу после этого начинается миофибриллогенез. Диаметр мышечных трубочек в среднем составляет 6,26±1,62 мкм. Гетерохронность развития элементов поперечнополосатой мышечной ткани отчетливо проявляется на этапе образования мышечных трубочек. В более дифференцированных м йоту бах ядра часто имеют глубокие инвагинации оболочки, расширенное перинуклеарное пространство и очень высокое содержание гетерохроматина, что свидетельствует о запуске апоптотических процессов. Необходимо подчеркнуть, что образование всех основных структурных компонентов клеток происходит в пренатальном гистогенезе, а процессы окончательной ультраструктурной организации происходят на постнатальном этапе гистогенеза. В ходе дифференцировки гладких миоцитов происходит не только усложнение ультраструктурной организации, но и усложнение уровня межклеточных контактов. Анализ

данных пролиферативной активности и специфической дифференцировки гладкой мышечной ткани стенки влагалища позволяет сделать вывод о том, что процессы пролиферации и дифференцировки построены на основе неконкурентного типа. Эта же закономерность выявлена и раннее другими исследователями для гладкой мышечной ткани бронхов, мочевого пузыря, прямой кишки (Зашихин А.Л., 1994, 1995, 1997; Агафонов Ю.В., 1997; Суворова Г.Н., 2001).

Источником развития исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища служат миобласты, которые, скорее всего, мигрировали из зачатков мышц промежности. Гетерохронность развития мышечных элементов поперечнополосатой исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища в процессе специфической дифференцировки наиболее отчетливо проявляется в период слияния миобластов, когда некоторые клетки уже содержат сформированные миофибриллы, а часть миобластов лишена сократительных структур. В процессе специфической дифференцировки для исчерченной мышечной ткани влагалища характерна последовательная смена стадий развития: промиобласты, миобласты, мышечные трубочки и миосимпласты.

Постнатальный гистогенез и структурная организация мышечной ткани стенки влагалища

Сразу после рождения и в течение первой недели постнатального развития крыс митотический индекс клеток гладкой мышечной ткани стенки влагалища составляет в среднем 2,86±0,65%, то есть активность процессов пролиферации сохраняется. Вместе с тем об активно протекающей специфической дифференцировке свидетельствуют результаты проведенного иммуногистохимического исследования к основным белкам-маркерам гладкой мышечной ткани - а-гладко-мышечному актину и кальпонину. Причем, разная степень окрашивания гладких мышечных клеток свидетельствует о разной степени их дифференцировки, то есть о гетерохронном характере процесса специфической дифференцировки. При иммуногистохимическом исследовании к коллагенам разных типов соединительной ткани мышечной оболочки влагалища определена положительная экспрессия коллагена III типа. При исследовании на чувствительность а-эстрогеновых рецепторов тканей стенки влагалища у новорожденных крыс, выявлена положительная экспрессия ядрами не только базального и парабазального слоев эпителия, но и гладких миоцитов мышечной оболочки влагалища.

Исследование ультраструктуры гладкой мышечной ткани стенки влагалища у новорожденных крыс обнаруживает гетероморфность популяции ее клеток. Следует отметить, что на первой неделе постнатального развития темп процессов специфической дифференцировки и интеграции повышается. Гладкие миоциты могут иметь разную электронную плотностью цитоплазмы, что объясняется, в первую очередь, разными темпами дифференцировки и, соответственно, разным количеством миофиламентов в цитоплазме. Гладкие мышечные клетки еще имеют многочисленные отростки, между ними

устанавливаются многочисленные и разнохарактерные межклеточные связи. В клетках хорошо развит кавеолярный аппарат; много рибосом и полисом, которые необходимы для интенсивно протекающего миофиламентогенеза.

В популяции гладкой мышечной ткани стенки влагалища встречаются клетки, находящиеся на разных стадиях апоптоза. Результаты проведенного исследования, как и ранее полученные данные Суворовой Г.Н. (2001), Созыкиным А.А. (2004) по исследованию гистогенеза гладкой мышечной ткани других внутренних органов, подтверждают сведения об обнаружении большинства гибнущих апоптозом клеток в конце эмбрионального и раннем постнатальном периодах.

После рождения крыс в дистальном отделе стенки влагалища интенсифицируется процесс дифференцировки исчерченных мышечных компонентов. При иммуногистохимическом исследовании часть мышечных волокон дистального отдела влагалища обнаруживает положительную экспрессию к миозину типа II, что свидетельствует об интенсивно протекающих процессах специфической дифференцировки. В образовавшихся к концу эмбриогенеза миотубах происходит значительное увеличение объема цитоплазмы, начинает формироваться саркомерная организации миофибрилл, можно различить формирующиеся Ъ- линии. Наряду с миофибриллами, в цитоплазме можно различить и отдельные пучки миофиламентов. Ускорение развития симпластов после рождения достигается, по-видимому, за счет встраивания миобластов не только в терминальных участках, но и на их боковых поверхностях.

Для раннего постнатального периода гистогенеза гладкой и исчерченной мышечной ткани характерна гетероморфность клеточной популяции. В гладкой мышечной ткани при электронно-микроскопическом исследовании обнаруживаются и делящиеся мышечные клетки, и малодифференцированные, и дифференцирующиеся. Последний тип клеток, имеющих в своей цитоплазме миофиламенты и хорошо развитый синтетический аппарат, относится к миоцитам синтетического типа и расценивается рядом исследователей, как популяция молодых клеток, (Зашихин А.Л.. 1994; 2001; Агафонов Ю.В., 1999). Активно происходит процесс интеграции клеток: между терминальными участками соседних клеток образуются комплементарные интердигитации, большую площадь занимают длинные десмосомоподобные контакты, способствующие объединению клеток в пучки, отмечаются простые контакты и формирующиеся щелевидные контакты. Таким образом, в ранний постнатальный период развития крыс в мышечной ткани стенки влагалища продолжается процесс пролиферации, но активность его постепенно снижается, и интенсивно протекает процесс дифференцировки, сопровождающийся, с одной стороны, установлением межклеточных коммуникаций, а с другой — частичной гибелью клеток.

В возрасте 1 месяца постнатального развития крыс поперечнополосатая мышечная ткань имеет структуру мышечных волокон. Гладкая мышечная ткань представлена клетками всего гистогенетического ряда.

Пубертатный период у крыс начинается в 8 недель постнатального развития. В этот период с помощью иммуногистохимического метода обнаруживается положительная экспрессия а-эстрогеновых рецепторов ядрами клеток базального и парабазального слоев эпителия, а также гладких миоцитов мышечной оболочки влагалища. Причем, плотность окрашивания в пубертатный период значительно плотнее, чем у новорожденных. G. Pelletier (2000) считает, что у новорожденных особей женского пола обнаруживаются эффекты действия, вероятнее всего, материнских гормонов. По мнению ряда исследователей (Farage M., Maibach H., 2006), основные органоспецифические изменения происходят в пубертатный период, в течение менструального цикла, во время беременности и менопаузы.

Результаты применения метода щелочной диссоциации тканей с получением изолированных клеток показывают, что у новорожденных и крысят первой недели постнатального развития гладкие миоциты полиморфны по своей форме: встречаются и отростчатые, и веретеновидные клетки. Изучение мазков изолированных клеток позволяет проследить особенности цитокинеза гладких миоцитов различной степени дифференцировки. В гладких мышечных клетках с небольшим количеством миофиламентов цитокинез включает в себя формирование борозды деления, межклеточного мостика и разделение клеток. У дифференцированных миоцитов цитокинез, вследствие хорошо развитого сократительного аппарата и необходимости преодоления препятствия в виде крупных пучков миофиламентов, происходит с некоторым опозданием или цитокинез не происходит вообще, в связи с чем встречаются единичные двуядерные мышечные клетки, как следствие ацитокинетических митозов в ранний постнатальный период.

Анализ линейных параметров гладких миоцитов. полученных методом щелочной диссоциации тканей, является одним из маркеров, позволяющих оценить формирование популяции и судить о темпах дифференцировки гладкой мышечной ткани стенки влагалища. Исследование объема гладких мышечных клеток у крыс в постнатальный период развития показало неуклонный рост этого параметра клеток (таблица 2).

Таблица - 2. Морфометрические показатели гладких миоцитов стенки влагалища в постнатальный период развития крыс___^_

Срок Объем клетки, мкм1 Объем ядра, мкм1 Ядерно-цитоплаз-менное отношение

Новорожденные 982,83±186,36 136,60±11,80* 0,200±0,015*

1 сутки 1184,93±122,54* 96,22±13,18 0,064±0,032*

3 сутки 2149,31±178,67 86.61±12,70 0,045±0,0018

7 сутки 2354,10± 192,44 103,10±14,50* 0,047±0,0017

4 недели 2613,98±186,80 128,16±10,79* 0,056±0,0046

8 недель 3154,65±234,43* 156,82±18,21 0,059±0,0028*

6 месяцев 3602,60±275,22 | 164,42±17,87 0,070±0,0061

Примечание: *- величина значимо (р<0,05) отличается от аналогичной в следующем периоде.

В течение первой недели постнатапьного развития характер нарастания объема гладких миоцитов достаточно интенсивный, затем наступает некоторая стабилизация этого показателя, и следующий пик активности приходится на пубертатный период, что, по-видимому, обусловлено влиянием женских половых гормонов. Биохимический механизм действия эстрогенов, связан со стимуляцией синтеза РНК в клетках и тканях репродуктивных органов, вследствие чего изменяются скорость и объем биосинтеза белков. Увеличение содержания эстрогенов стимулирует транслокацию рецепторов к эстрадиолу из цитоплазмы в ядро. По мнению G. Pelletier (2000), увеличение содержания ядерного рецептора коррелирует с клеточным ростом.

Метод щелочной диссоциации тканей позволяет также идентифицировать волокна поперечнополосатой мышечной ткани дистального отдела влагалища и провести оценку изменений диаметра мышечных волокон.

Средние данные диаметров мышечных волокон в постнатальный период представлены на рисунке 1.

■ ■ I

III

3 дия 7 дней 4 недели 8 недель 6 месяпев

возраст

а ляямстр мишечпп волоков, нкм

Рисунок 1 - Динамика изменения диаметра мышечных волокон поперечнополосатой мышечной ткани дистального отдела влагалища крысы в постнатальный период.

Таким образом, в постнатальный период развития процессы гистогенеза мышечной ткани стенки влагалища продолжаются, они активно протекают до пубертатного периода. Однако, рост и нарастание объема мышечного компонента происходит к периоду половой зрелости, что сопровождается продолжающимися процессами дифференцировки, запрограммированной клеточной гибели, интеграции и адаптации к выполняемым функциям.

Дефинитивная организация мышечной ткани стенки влагалища. Клеточно-дифферонная организация гладкой и исчерченной мышечной ткани влагалища взрослых самок

Методами светового и электронно-микроскопического исследования подтверждено наличие двух видов мышечной ткани в стенке влагалища. Специализированных межклеточных контактов между ними не обнаружено. Электронно-микроскопическое исследование исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища у половозрелых самок млекопитающих свидетельствует, что поперечнополосатая мышечная ткань имеет типичное симпластическое строение. Наличие миосателлитоцитов, обнаружение положительной экспрессии ядрами мышечных волокон поперечнополосатой мышечной ткани влагалища к миогенину указывает на ее миотомное происхождение.

Определение гистохимического профиля поперечнополосатой мышечной ткани дистального отдела влагалища показывает, что по критерию активности сукцинатдегидрогеназы исчерченная мышечная ткань стенки влагалища представлена всеми типами мышечных волокон: окислительными (39,2%), гликолитическими (29,4%), окислительно-гликолитическими (31,4%).

Проведенный морфологический анализ мазков изолированных клеток показал, что в пределах одной возрастной группы животных гладкие миоциты значимо (р<0,05) различаются по размерам. Средний объем гладкомышечных клеток у половозрелой крысы составляет 3602,60±275,22 мкм3. Причем, в дистальном отделе влагалища средний объ'ем клеток составляет 2278±133,26 мкм', в среднем отделе - 2716,82±175,34 мкм3, в проксимальном отделе -4879,31 ±234,48 мкм3. то есть имеет место нарастание средних объемов клеток от к дистального к проксимальному отделу влагалища. Изучение гладкой мышечной ткани свидетельствует о том, что в разные фазы эстрального цикла у половозрелых крыс объем гладких миоцитов. их ядер и ядерно-цитоплазменное отношение отличаются (таблица 3).

Таблица 3 - Морфометрические показатели гладких миоцитов мышечной оболочки влагалища половозрелых крыс в зависимости от стадий эстрального цикла.

Объем клетки, мкм3 Объем ядра, мкм3 Ядерно-цитоплазменное отношение

фазы эстрального цикла Среднее Стд. ошибка среднего Среднее Стд. ошибка среднего Среднее Стд. ошибка среднего

Проэструс 3266,22* 381,40 181,43 21,17 ,0863* ,0086

Метэструс 3857,39 416,61 173,76* 21,27 ,0659 ,0058

Диэструс 3718,18* 507,79 151,83 16,98 ,0587 ,0034

Эструс 3590,86 335,60 150,66 12,09 ,0650 ,0047

Примечание: * - величина значимо (р<0,05) отличается от соответствующей в следующей фазе

По-видимому, колебания морфометрических показателей гладких миоцитов стенки влагалища связаны с изменением гормонального фона, что согласуется с результатами морфометрического анализа Созыкина A.A. (2004) при изучении миометрия крыс в разные фазы эстрального цикла.

Объем клеток, среди других морфометрических показателей, является наиболее вариабельным, и гистограммы распределения объемов гладких миоцитов носят нормальный характер, на основании чего можно судить о неоднородности гладкой мышечной ткани и позволяет выделить группы малых, средних и больших клеток и оценить структуру популяции.

Популяция дефинитивной гладкой мышечной ткани стенки влагалища крыс образована субпопуляциями малых, средних и больших миоцитов, представленной на рисунке 2.

Структура популяции дефинитивной гладкой мышечной ткани стенки влагалища крысы

" малые миоциты средние миоциты большие миоциты

Рисунок 2 - Организация гладкой мышечной ткани влагалища половозрелой крысы

На представленных ниже диаграммах (рисунок 3) показано однонаправленное нарастание средних объемов гладких миоцитов от дистального к проксимальному отделу влагалища.

Структура популяции дефинитивной

гладкой мышечной ткани стенки влагалища крысы (дисгальный отдел)

Структура популяции дефинитивной гладкой мышечной ткани стенки влагалища крысы (средний отдел)

я малые миоциты средние миоциты большие миоциты

п малые миоциты средние миоциты большие миоциты

Структура популяции дефинитивной гладкой мышечной ткани стенки влагалища крысы (проксимальный отдел)

■ малые миоциты ■ средние миоциты большие миоциты

Рисунок 3 - Организация гладкой мышечной ткани в разных отделах влагалища половозрелой крысы

Это обусловлено перестройкой структуры популяции гладкой мышечной ткани и проявляется в увеличении доли больших и снижении малых миоцитов. Выявленные различия организации гладкой мышечной ткани различных уровней влагалища обусловлены, скорее всего, функционально. С помощью метода щелочной диссоциации тканей и морфометрического анализа нами установлено, что у других лабораторных животных, средний объем гладких миоцитов стенки влагалища составляет 2901,44±60,75 мкм3 (кошка) и 2718,28±77,17 мкм3 (собака).

Дефинитивная гладкая мышечная ткань стенки влагалища лабораторных животных обладает следующими клеточными фенотипами (по данным электронной микроскопии): сократительные («светлые» и «темные» миоциты, в зависимости от функционального состояния клеток), синтетические и промежуточные (сократительно-синтетические) лейомиоциты. Первый фенотип специализирован на функцию сокращения, хотя в определенной мере они обладают и синтетической активностью. Синтетические миоциты содержат хорошо развитые органеллы белкового синтеза, комплекс Гольджи, много митохондрий, гранул гликогена, миофиламенты сконцентрированы на периферии клеток. По степени зрелости этот фенотип часть исследователей (Шубникова Е.А., Юрина H.A., Гусев Н.Б. и др., 2001) относят к малодифференцированным. В них может постепенно увеличиваться объем миофиламентов, а доля синтетического аппарата уменьшаться. Промежуточный фенотип (сократительно-синтетический) является переходным, в пределах которого возможна смена фенотипа клеток. По степени дифференцировки их целесообразно отнести к дифференцирующимся клеткам.

Проведенное иммуно гистохимическое исследование к CD117 демонстрирует наличие интерстициальных клеток Кахаля среди гладких миоцитов и подтверждает данные электронно-микроскопического изучения организации гладкой мышечной ткани влагалища.

С позиций клеточно-дифферонной организации тканей в эмбриональном гистогенезе поперечнополосатой мышечной ткани, в результате дивергентной дифференцировки, из миотомных предшественников формируются два дифферона - миосателлитоциты и миосимпласты, которые сохраняются на протяжении всего онтогенеза.

Дефинитивную гладкую мышечную ткань стенки влагалища лабораторных животных с позиций клеточно-дифферонной организации тканей следует рассматривать как звенья единого миобластического клеточного дифферона. Субпопуляция малых миоцитов представляет собой группу менее дифференцированных клеток, содержащих камбиальные элементы. Средние миоциты - наиболее многочисленная и функционально активная популяция. Это дифференцирующиеся и дифференцированные клетки. Группа больших миоцитов является наиболее дифференцированными гладкими мышечными клетками.

Особенности репаративной регенерации мышечной ткани стенки влагалища

Для изучения процесса репаративной регенерации мышечной ткани стенки влагалища, мы провели три серии экспериментов: экспериментальное дозированное растяжение, многократное применение ваготила, рассечение стенки влагалища с ушиванием раны.

В стенке влагалища в ответ на любое повреждение развиваются 2 основных процесса: воспаление (проявления которого отчетливо видны в ходе эксперимента) и восстановление структуры и функции поврежденных тканей. На ход воспапителыю-регенерационного процесса оказывают большое влияние тканевой состав поврежденного органа, гистобластические потенции тканей зоны повреждения, определямые генетической детерминированностью. Гистологическим маркером начала регенерационного гистогенеза является активация и пролиферация камбиальных элементов тканей прираневой зоны. Камбиальные клетки являются ключевыми элементами регенерационного гистогенеза.

При дозированном растяжении влагалища особенностями репаративной регенерации гладкой мышечной ткани влагалища являются невысокая пролиферативная активность мышечных клеток. При электронно-микроскопическом исследовании установлен факт смены фенотипа гладких миоцитов, то есть при данном способе повреждения включаются механизмы и внутриклеточной, и клеточной регенерации. Для исчерченной мышечной ткани характерно восстановление путем отделения от мышечных волокон ядерно-саркоплазменных территорий после нанесенной травмы. Заместительная способность соединительной ткани в условиях конкретного эксперимента менее выражена, что обусловлено, вероятнее всего, высокой адаптацией, широким диапазоном пластичности, который детерминирован и закреплен в ходе эволюционных процессов органогенеза влагалища, поскольку растяжение органа при родовой деятельности имеет регулярный характер.

По результатам проведенных исследований при рассечении тканей стенки влагалища в месте повреждения к концу эксперимента образуется соединительно-тканный рубец. То есть регенерация идет по заместительному типу, поскольку собственных регенераторных потенций недостаточно. В прираневой зоне восстановление волокон исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища осуществляется за счет внутрисимпластической регенерации и активации миосателлитоцитов, образуются молодые мышечные волокна. Восстановление гладких миоцитов при данном виде повреждения происходит, в основном, за счет внутриклеточного механизма, а именно -вынужденной клеточной смены фенотипа и процесса специфической дифференцировки малодифференцированных предшественников.

Исследование репаративного гистогенеза мышечной ткани после многократного применения 36% раствора ваготила показали, что в реактивно измененной гладкой мышечной ткани появляются клетки с хорошо развитой гранулярной эндоплазматической сетью, большим количеством рибосом и полисом. Пролиферативная активность гладкомышечных клеток невысокая. Следовательно, в условиях репаративной регенерации в гладкой мышечной ткани может происходить смена фенотипов гладких миоцитов с одного клеточного типа на другой, то есть дифференцировка не является окончательной. В отличие от многих других зрелых клеток взрослого организма, гладкомышечные клетки сохраняют значительную пластичность и имеют уникальную возможность переходить между дифференцированным состоянием «сократительного» типа и дифференцирующимся «синтетического» фенотипа. Подобные изменения гладкой мышечной ткани прямой кишки, матки, сосудов в своих работах описывают ряд исследователей (Суворова Г.Н., 2000; Созыкин A.A., 2004; Liu R. et al., 2014). Это принципиально важное заключение чрезвычайно актуально для создания новых препаратов и методик лечения, включающих регуляторы пластичности гладкой мышечной ткани при коррекции врожденных пороков развития, функциональных нарушений, травм, заболеваний влагалища. Несмотря на значительный прогресс в нашем понимании относительно пластичности гладкой мышечной ткани, ее диапазона, остается неизвестным каким образом она регулируется и это оставляет за собой большое поле деятельности для новых исследований.

Анализ раневого процесса с позиций клеточно-дифферонной организации тканей показывает, что при повреждении мышечной ткани влагалища возникают реактивные изменения ведущего дифферона, который характеризует основные свойства ткани и определяет ее регенераторные свойства, и сопутствующих дифферонов (макрофагальный, лимфоцитарный и другие). Исследования трех серий экспериментов показали, что при действии любого альтерирующего агента происходит изменение соотношения субпопуляций клеток внутри ведущего диффферона (внутридифферонная гетероморфия), возникает мозаика клеточных дифферонов (междифферонная гетероморфия), миграция субпопуляций клеточных дифферонов (в область повреждения). В ходе регенераторного процесса развитие различных клеточных дифферонов

происходит гетерохронно, формируются новые междифферонные взаимоотношения.

Таким образом, проведенные нами исследования показывают, что гладкая и поперечнополосатая мышечная ткань стенки влагалища имеют собственные источники развития и направленность дифференцировки. Отсутствие межтканевых превращений указывает на специфичность и детерминированность свойств этих видов мышечной ткани. Репаративная регенерация мышечной ткани стенки влагалища осуществляется на основе базисных процессов гистогенеза.

В своем исследовании мы раскрыли только часть вопросов развития, организации и регенерации мышечной ткани стенки влагалища в норме и экспериментально измененных условиях. В процессе работы мы столкнулись с рядом новых аспектов и проблем, которые обозначили перспективу будущих исследований. Тем не менее, мы надеемся, что наши исследования помогут лучше понять сущность гистофизиологии мышечной ткани влагалища и будут полезными для теоретического и практического применения.

ВЫВОДЫ

1. Мышечная ткань стенки влагалища млекопитающих представлена в проксимальном и среднем отделе органа гладкой мышечной тканью, в дистальном отделе влагалища - волокнами поперечнополосатой мышечной ткани и пучками гладких миоцитов.

2. Гладкая мышечная ткань проксимального отдела влагалища развивается из мезенхимы парамезонефральных протоков. В дистальном отделе ее источником является мезенхима синусно-влагапищной луковицы. Установление мионевральных связей является фактором, индуцирующим дифференцировку миогенных клеток-прогениторов.

3. Постнатальный гистогенез гладкой мышечной ткани стенки влагалища характеризуется снижением пролиферативной активности и интенсификацией процессов дифференцировки, которая протекает в клетках гетерохронно. В гладких миоцитах увеличивается содержание миофиламентов и выявляется различная степень экспрессии маркерных белков — а- гладкомышечного актина и кальпонина.

4. Дефинитивная поперечнополосатая мышечная ткань стенки влагалища в его дистальном отделе должна быть отнесена к висцеральной несердечной поперечнополосатой мышечной ткани. Экспрессия миогенина в ядрах мышечных волокон и наличие миосателлитоцитов указывают на миотомное происхождение этой ткани. По критерию активности сукцинатдегидрогеназы поперечнополосатая мышечная ткань стенки влагалища представлена всеми типами мышечных волокон: окислительными, гликолитическими, окислительно-гликолитическими.

5. В течение постнатального периода увеличивается объем гладких миоцитов, причем у крыс выделяются периоды интенсивного прироста объема гладких миоцитов и период относительной стабилизации этого показателя: в течение первой недели постнатального развития, соответственно приросту

массы тела, средний объем клеток возрастает интенсивно, затем наступает период стабилизации этого показателя; следующий пик прироста объема гладких миоцитов приходится на пубертатный период (8 недель постнатального развития), что обусловлено изменением гормонального статуса.

6. В течение постнатального периода возрастает экспрессия а-эстрогеновых рецепторов в ядрах гладких миоцитов. У половозрелых крыс в различные фазы эстрального цикла отмечаются изменения объема гладких мышечных клеток, их ядер и ядерно-цитоплазменного отношения. Средний объем гладких миоцитов возрастает от дистального к проксимальному отделу влагалища.

7. Популяция гладких мышечных клеток стенки влагалища у половозрелых животных включает малые, средние и большие клетки, которые различаются по фенотипу, пролиферативной активности, степени дифференцировки и пластичности. Малые миоциты представляют собой малодифференцированные клетки «синтетического» фенотипа, сохраняющие способность к пролиферации. Часть клеток этой субпопуляции представлена дифференцирующимися клетками («сократительно-синтетический фенотип»). Наиболее многочисленная группа средних миоцитов составляет основу популяции и характеризуется максимальной пластичностью, в цитоплазме этих клеток преобладают сократительные компоненты. Большие миоциты «сократительного» фенотипа являются наиболее дифференцированными.

8. Восстановление гладкой мышечной ткани происходит за счет клеточной и внутриклеточной регенерации гладких мышечных клеток, а также за счет смены их фенотипов с сократительного на сократительно-синтетический и синтетический. Восстановление исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища крыс осуществляется за счет отделения ядерно-саркоплазменных территорий, активации миосателлитоцитов.

9. Регенерация тканевых элементов мышечной ткани стенки влагалища происходит гетерохронно, формируются новые внутридифферонные и междифферонные взаимоотношения. Восстановительные процессы наиболее эффективны при активации собственных камбиальных источников гладкой и исчерченной мышечной ткани (дозированное растяжение). По мере истощения собственных регенераторных возможностей мышечной ткани стенки влагалища регенерация происходит по заместительному типу за счет соединительной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Сведения по ультраструктурной организации мышечной ткани стенки влагалища могут быть полезными для разработки новых методов тканевой инженерии для последующего использования в реконструктивной хирургии при приобретенной патологии органов репродуктивного тракта (пролапс стенок влагалища).

2. Данные о гетерогенности эмбриональных зачатков мышечного компонента влагалища, полученные в ходе исследования пренатального

гистогенеза, могут быть полезными при установлении гистогенеза опухолевых

заболеваний влагалища

3. Концепции регенерационного гистогенеза и клеточно-дифферонной организации тканей расширяют современные фундаментальные представления о реактивности и регенерации мышечных тканей, раскрывают проявления закономерных процессов регенерационного гистогенеза в условиях заживления

различного вида травм

4. Результаты работы по гистофизиологии, клеточно-дифферонной организации мышечной ткани, входящей в состав стенки влагалища, закономерных процессах базисного и регенерационного гистогенеза целесообразно учитывать в процессе преподавания разделов гистологии мышечной ткани, гистофизиологии органов репродуктивного тракта

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шурыгина О.В. Развитие и структурная организация стенки влагалища человека / Н.В. Ямщиков, О.В. Шурыгина // Мат. IV всероссийской конф. «Бабухинские чтения» - М., 2005 - №21 - С.140-142.

2. Шурыгина О.В. Репаративная регенерация мышечной ткани влагалища / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков //Успехи современного естествознания - 2006 -№3 - С.98-99.

3. Шурыгина О.В. Гетероморфизм популяции гладких миоцитов мышечной оболочки стенки влагалища крыс / О.В. Шурыгина, Л.Н. Кучерова // Современные наукоемкие технологии - 2006 - №3 - С.43-44.

4. Шурыгина О.В. Реактивные изменения гладкой мышечной ткани влагалища в условиях экспериментального растяжения. // Мат.У Всероссийской конф. «Бабухинские чтения» - М„ 2006 - №24 - С. 40-41.

5. Шурыгина О.В. Репаративная регенерация стенки влагалища половозрелых крыс при экспериментальном растяжении / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, С.Ю. Миронов // Мат. VIII международного научного симпозиума «Применение современных методов анализа в изучении структуры и функционировании клетки». - Архангельск, 2006. - С.42-43.

6. Шурыгина О.В. Морфологическая характеристика гистогенеза гладкой мышечной ткани влагалища крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Мат. И Международного эмбриологического симпозиума «ЮГРА-ЭМБРИО-2006». Вестник Ханты-Мансийского государственного университета - 2006 - № 2 - С. 116.

7. Шурыгина О.В. Структурная организация мышечной оболочки влагалища крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков И Мат. конф., посвященной 70-летию Тверской гос.мед.академии и 100-летию профессора И.С.Кудрина. «Морфология» - 2006 - № 5- С. 92.

8. Шурыгина О.В. Клеточно-дифферонная организация тканей стенки влагалища половозрелых беспородных белых крыс в норме и эксперименте / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, С.Ю. Миронов // Сборник научных трудов. «Естествознание и гуманизм»,- Томск, 2006.- Т.З, №4 — С. 38-39.

9. Шурыгина О.В. Клеточно-дифферонная организация тканей стенки влагалища половозрелых беспородных белых крыс // Научные труды VII Международной науч.-практ.конф. «Здоровье и образование в XXI веке». -М., 2006. - С.578-579.

10. Шурыгина О.И. Реактивные изменения мышечного аппарата влагалища белых крыс в условиях экспериментального растяжения / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, П.П. Кругляков И Вестник Оренбургского гос.университета. — 2006 - №12. — С.112-116.

11. Шурыгина О.В. Особенности клеточно-дифферонной организации слизистой оболочки влагалища половозрелых беспородных крыс в норме и эксперименте / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, С.Ю. Миронов // Мат. международ.науч.конф., посвященной 450-летию г.Астрахани. Астраханский мед.журнал, 2007.- Т.2, -№2. - С.212.

12. Шурыгина О.В. Регенерация мышечных тканей стенки влагалища половозрелых крыс после применения ваготила / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Материалы VI Всероссийской конф. «Бабухинские чтения» -Москва, 2007 - №25 - С.16-18.

13. Шурыгина О.В. Особенности реактивных изменений мышечного аппарата влагалища беспородных белых крыс при различных типах его повреждения // Сборник научных трудов, посвященный 65-летию организации Красноярской медицинской академии. - Красноярск, 2007. - С.-149-151.

14. Шурыгина О.В. Виды межклеточных контактов в гладкой мышечной ткани влагалища половозрелых белых крыс // Морфология. 2007- Т.131, №2. - С.102-103.

15. Шурыгина О.В. Структурная организация мышечного аппарата влагалища в различные периоды постнатального развития беспородных белых крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, П.П. Кругляков, С.Н. Юхнмец // Морфологические ведомости.- 2007. - №1-2,- С.149-153.

16. Шурыгина О.В. Реактивность мышечного аппарата влагалища половозрелых беспородных белых крыс в эксперименте / О.В. Шурыгина, Р.Б. Балтер, Р.Т. Невзорова |и др.| // Вестник Самарского гос.университета естественнонаучная серия.- 2007. - № 9 (59). - С.349-355.

17. Шурыгина О.В. Гладкая мускулатура влагалища млекопитающих. Морфофункциональная организация / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, П.П. Кругляков, С.Н. Юхимец // Морфологические

ведомости.- 2007. - №3-4. - С.81-82.

18. Шурыгина О.В. Морфологическое исследование посттравматических изменений в стенке влагалища половозрелых крыс // Морфологические ведомости.- 2007. - №3-4. -С.79-81.

19. Шурыгина О.В. Морфологические изменения мышечной оболочки влагалища при различных видах повреждения у половозрелых крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Мат. Всероссийской конф. с международ, участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей, клеток» Самара,2008,- С.-127-131.

20. Шурыгина O.B. Структурная организация мышечного аппарата млекопитающих //. Морфология.- 2008.- Т.133, №2.- С.158.

21. Шурыгина О.В. Межвидовые различия гладкой мышечной ткани влагалища млекопитающих // Материалы Всероссийской конф. с международ, участием, посвященной 85-летию Д.С.Гордон. Морфология и теория в практике,- Чебоксары, 2008. - С. 149- 150.

22. Шурыгина О.В. Репаративная регенерация тканей стенки влагалища половозрелых крыс при различных способах повреждения // Морфологические ведомости.- 2008. - №1-2.- С.136-139.

23. Шурыгина О.В. Структурная организация мышечного аппарата влагалища млекопитающих и человека в постнатальный период развития / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, П.П. Кругляков |и др.] // Морфологические ведомости.- 2008. - №1-2. - С.142-144.

24. Шурыгина О.В. Полиморфизм гладких миоцитов мышечной оболочки влагалища в различные периоды постнатального развития беспородных белых крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Морфология.-

2008.- Т.133, №4. - С.123-124.

25. Шурыгина О.В. Особенности структурной организации мышечного аппарата влагалища у млекопитающих животных и человека // Морфология.- 2008.- Т.134,№5. - С.103.

26. Шурыгина О.В. Клеточно-дифферонная организация тканей стенки влагалища половозрелых млекопитающих в норме и эксперименте // Мат. международ, научн. конф., посвященной 65-летию ивановской школы лимфологов «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической морфологии». - Иваново, 2009. — С.178-181.

27. Шурыгина О.В. Регенерационный гистогенез мышечных тканей влагалища половозрелых крыс в эксперименте. Мат. регион, научно-практ. конф. Вопросы клинической и экспериментальной медицины. - Чебоксары,

2009. - С. 247-248.

28. Шурыгина О.В. Реактивные изменения мышечных тканей влагалища при повреждении. / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Материалы VII Всероссийской научн. конф. «Бабухинские чтения» .- М., 2008, - С.29-31.

29. Шурыгина О.В. Посттравматическая регенерация мышечных тканей стенки влагалища после рассечения у половозрелых крыс // Морфологические ведомости.- 2009. - № 3. - С. 78-81.

30. Шурыгина О.В. Эстрогеновые рецепторы в тканях стенки влагалища экспериментальных животных и человека / О.В. Шурыгина, С.Н. Юхимец, К.Ф. Гарифуллина, A.B. Бормотов // Морфологические ведомости.- 2010. - №3. - С.72-77.

31. Шурыгина О.В. Клеточно-дифферонная организация мышечных тканей стенки влагалища млекопитающих / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Морфология.- 2010.- №3. - С.51-56.

32. Шурыгина О.В. Структурная организация и репаративная регенерация мышечных тканей стенки влагалища с позиций учения о клеточно-

дифферонной организации тканей. / Н.В. Ямщиков, О.В. Шурыгина // Вопросы морфологии XXI века. Сборник научных трудов, посвященный 80-летию со дня рождения профессора А. А.Клишова. - С-Пб., 2010. — С. 195-199.

33. Шурыгина О.В. Особенности структурной организации мышечных тканей влагалища млекопитающих // Морфология.- 2010.- Т. 137, №5.- С. 226.

34. Шурыгина О.В. Эстрогеновые рецепторы в тканях стенки влагалища половозрелых млекопитающих / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Мат. VIII Всероссийской науч. конф. «Бабухинские чтения». М., 2011. — С. 288-292.

35. Шурыгина О.В. Морфологические изменения мышечной оболочки влагалища при различных видах повреждения у половозрелых крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Мат. Всероссийской конф. с международ, участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей, клеток». - Самара, 2008. - С.127-131.

36. Шурыгина О.В. Гистогенез исчерченной мышечной ткани дистального отдела влагалища белых крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сб. науч. тр., посвященный 40-летию Чувашского гос. университета им. Д.И.Ульянова. -Чебоксары, 2007. - С. 163-165.

37. Шурыгина О.В. Развитие влагалища: современные представления / О.В. Шурыгина, A.C. Алексеева // Морфологические ведомости.- 2010. - №4. - С. 113-116.

38. Шурыгина О.В. Регенераторный потенциал тканей стенки влагалища млекопитающих в экспериментальных условиях / О.В. Шурыгина, С.Н. Юхимец // Морфологические ведомости.- 2011. - №3. -С.118-122.

39. Шурыгина О.В. Современные подходы к изучению регенерационного гистогенеза в эксперементальных условиях / С.А. Шурыгин, Н.В. Ямщиков, О.В. Шурыгина // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований,- 2011. - №12. - С. 120-121.

40. Шурыгина О.В. Репаративный гистогенез мышечных тканей стенки влагалища млекопитающих // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований.- 2012. №12.- С. 78-79.

41. Шурыгина О.В. Гетероморфизм гладких миоцитов мышечной оболочки влагалища млекопитающих / Морфология .- 2012.- Т.141, №3. -С.182.

42. Шурыгина О.В. Органоспецифические особенности поперечно -полосатой мышечной ткани влагалища млекопитающих // Международный журнал экспериментального образования.- 2012. - №12 (часть1). - С. 105.

43. Шурыгина О.В. Морфологическая характеристика мышечных тканей стенки влагалища млекопитающих // Фундаментальные исследования.- 2012. - №12 (часть 2). - С. 406-410.

44. Шурыгина O.B. Особенности эмбрионального развития влагалища млекопитающих // Современные наукоемкие технологии,- 2013. -№1 - С.112-113.

45. Шурыгина О.В. Эстрогеновые рецепторы в тканях стенки влагалища млекопитающих // Фундаментальные исследования.- 2013. -№3. - С.181-183.

46. Шурыгина О.В. Особенности репаративных процессов тканей стенки влагалища половозрелых белых беспородных крыс в эксперименте / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков // Известия Самарского центра РАН.-2013.- Т. 15, №3 (6). - С.2032-2034.

47. Шурыгина О.В. Локализация рецепторов эстрогенов в тканях влагалища крысы // Морфология.- 2013.- Т.144,№5. - С.134.

48. Шурыгина О.В. Гистологическое исследование тканевых компонентов стенки влагалища человека / О.В. Шурыгина, Н.В.Ямщиков, О.В.Кулакова [и др.] // Вестник медицинского института «РЕАВИЗ», 2014. - №1 (13). - С. 8-12.

49. Шурыгина О.В. Особенности иннервации гладкой мышечной ткани влагалища у млекопитающих / О.В. Шурыгина, О.В. Кулакова // Ученые записки Орловского государственного университета. -2014. - №7 (63). - С.265-267.

50. Шурыгина О.В. Морфологическое исследование особенностей тканевого состава стенки влагалища млекопитающих / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, О.Н. Тулаева // Морфология.- 2012. - Т.145 , №3. - С.187.

51. Шурыгина О.В. Эмбриональное развитие мышечных тканей стенки влагалища крыс / О.В. Шурыгина, Н.В. Ямщиков, В-Н. Абрамов, В.П. Балашов // Фундаментальные исследования.- 2014. -№7 (часть 4). - С. 812-816.

52. Шурыгина О.В. Ультраструктурные аспекты гистогенеза мышечных тканей стенки влагалища млекопитающих в постнатальный период развития / Н.В. Ямщиков, В.Н. Абрамов, В.П. Балашов // Современные проблемы науки и образования, 2014. - №3 URL:http://www.science-education.ru/l 17-13787.

Подписано в печать 17.12.2014 Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 2 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №1458

Отпечатано в типографии ООО «Экспресс-Принт». 443052, г. Самара, пр. Кирова, 73В, оф. 15 Тел./факс (846)931-91-40, 932-05-65 E-mail: expressprint@list.ru. лу\у\у.бланки63.рф