Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие структурных белков тонких филаментов кальдесмона и кальпонина - с фосфолипидами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие структурных белков тонких филаментов кальдесмона и кальпонина - с фосфолипидами"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ «мси М.В.ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи

Богачева Наталья Владимировна

Взаимодействие структурных белков тонких филаментов кальдесмона и кальпонииа - с фосфолнпндамн

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологически* наук

Москва - 1996

Работа иыполненл на ка<]>слре биохимии Биологического «^икультста Московского госулдрстисммого университета имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

H.Б.Гусев.

Официальные оппоненты:

I. Доктор биологических наук, профессор A.A. Болдырев.

2. Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Д.И.Левицкий.

Ведущая организация: Всероссийский кардиологический научный центр РАМН.

Защита состоится • - ^""У 1996 года в_15'°_час

на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Воробьевы горы. Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библотеке Биологического факультета МГУ.

1Ь

Автореферат разослан_ ¿■¡.р'т/^г Я.__1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета:

/

кандидат биологических наук * М.В.Иванов

характеристика раьсгы.

Лктуилытсп. проблемы. Кальдесмои к кальнонин являются компонентами акпшош.и tjxuiaMcn'ion гладких мышц it некоторых кемышечних клепж (Sobuc, Sellers, 1991. Trabclsi-Tcrzidis с( al., 1995). Оба белка взаимодействуют с актином, проиомнозимом, миозином и кальций-связывающими белками EF-рукн. В условиях in vitro кальдесмои н кальпонин способны вызывай» пнгнбнровапие АТФазы актомнознпа, а кальций-кальмодулин (или iniofi кальций-связывающий бедок) обращает этот эффект (Marslon. Uubcr, 1995, Winder. Walsh. 1993). Помимо этого, кальдесмои и кальпонин могут "сшивать" нити актина и миозина, обеспечивая независимую от актомнозиковых мостиков с^жксацию двух систем (}>нламентов (Hacberle et al., 1992, Hacbcrlc, 1994). Кроме того, оба белка оказывают разнообразное влияние на структуру и свойства F-ак-пша. Так. кальдесмои ингибирует фрагментирующее воздействие гсльзолина па нити актина и стимулирует полимеризацию F-ак-пша (Malsumura, Yamashiro. 1993). И кальдесмои, и кальнонии способны нучковать ({жламентм актина (Yamashiro, Malsumura. 1993. Kolakowski cl al., 1995b) Локализация указанных белков и гладкомышечных клетках скорее всего различна. Кальдесмои обнаруживается и сократительном компартситс кле-чки наряду с у-актином и мнозниом. а кальпонин - и цптоскелетиом комиартменте, где колокалнзонан с [З-акишом и деемнном (Mabuchi cl al., 1995а).

Нзвсспю. 41X1 шпн актина принимают участие но многих формах ¡клеточной ноднижиосш'. Помимо сокра'ппсльиоП акитпост. этоэндо- и Ькзощгшз. выдвижение ламеллоподпй ползущих по субстрату клеток, ■'копирование" рецепторов на noiicpxiiocni клечхж (Албертс с соавт., 199-1). Многие aKiiiii -спя зынакмцпе белки в сам акчип способны ■ ипыодсистона'п. с мембранами, обеспечивая прикрепление сечи к'мшоиих <|жламентои к нлачмалемме и клеточиим органеллам Hicnlicrg. 1991). И ряде работ была продемонстрирована нрнмембранная

локализации кальдесмона и калмюннна. Так. и ходе стимуляции секреции катехоламннон кальдесмон обнаруживается вблизи хромас{х|>нниых гранул клеток надпочечников (Sobuc, Sellers, 1991). Показано, что кальдссмои принимает участие и процессе "кэпировання" рецепторов на поверхности лимс}>оцитов (Walker el al.. 1989). Некоторая часть калыюшша в гладкомышечиых клетках локализуется в плотных тельцах н адгезивных пластинках (North el al., 1994). При стимуляции клеток аорты ({жннлэфрином кальпонин мигрирует с периферические компартмеить! клетки (Parker cl al., 1994). Все сказанное позволяло предположить, что кальдесмон и кальпонин, как н многие другие актин-связывающне белки, способны взаимодействовать сфосфолипндами.

Цслыо данной работы было исследование взаимодействия кальдесмона и кальпошша с фосфолипндными мембранами, а также анализ механизмов, обеспечивающих регуляцию такого взаимодействия. В соответствии с этой общей целыо былн поставлены следующие основные задачи: I) используя различные методы, изучить взаимодействие указанных белков с фос^юлнпидами различной природы; 2) локализовать <}>осфолипнд-связывающис участки в структуре кальдесмона и калипоннна; 3) исследовать эффект кальцнй-кальмодулииа на взаимодействие кальдесмона н кальпошша с (}юс(}юлип11днымн мембранами.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проанализирована первичная структура кальдесмона и кальпоннна. С номощыо методов Айзенберга с соавт. (Eisenberg et al., 1984) и Темпеля с соавт. (Tempel cl al.. 1995) выявлены участки, способные образовывать амфнфильные а-спиралн н склонные к ассоциации с поверхностью (jx>c(jxyiHnii;iiioro бнелоя.

Предложен метод совместного выделения кальдссмона и калыюшша из мускульного желудка птиц. С помощью различных! ¡жепернменгальиых подходом наследовано взаимодействие указанных!

белкой с модельными мембранами. Установлено, что кальдесмон и кальпоннн способны индуцировать увеличение светорассеяния сусиензин малых однослойных везикул (SUV), а также нарушат!, целостность их мембран. Последний эс})фект наблюдается только при низкой ионной силе и, no-внднмому, не имеет места in vivo.

Обнаружено, что кальпоннн индуцирует изменение калориметрического поведения мульталамеллярных везикул (MLV) из дипальмитонлфосфзтндилсерина. Добавление белка вызывает уменьшение температуры фазового перехода липидон и степени кооперативности этого перехода.

С помощью делецнонных мутантов кальдесмона, а также протеолитическнх фрагментов кальдесмона и кальпоннна локализованы фосфолипнд-связывающие участки указанных белков. Установлено, что предсказанные на основе анализа первичной структуры сегменты полнпептидной цепи, склонные к образованию ам<]жфпльиых а-спиралей, действительно принимают участие во взаимодействии белков с лнпндным бпелоем. Кальмодулнн- и cjx>cc|xwiíf пид-связывающне центры кальдесмона и кальпоннна располагаются поблизости друг от друга. Вероятно, вследствие этого насыщенный кальцием кальмодулнн ослабляет эффективность взаимодействия исследуемых белков с везикулами фосфолшшда.

Высказано предположение, что кальдесмон и кальпоннн могут участвовать в процессах ассоциации актинового цитоскелета с клеточными мембранами in vivo, а ((юсфолнинд-спязьшающнс свойства [указанных белков могут регулироваться кальций-связывающями Белками или путем cJxxxjxspiUHipouaHUH под действием протеинкиназ. I Апробация работы. Результаты диссертационной работы были ■оложены на международном симпозиуме "Биологическая подвижность* Шущино. 1994) н XXIV европейской мышечной конференции ■Флоренция, 1995).

Публикации. Но материалам исследований опубликовано б научных работ.

Структур« дисссртнцин. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания цатсрналов к методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 240 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Методы получения белков. Для выделения кальпонина и кальдесмона из мускульного желудка утки использовал» методы Такахашн с соавт. (Така1тЫ с! а!.. 1986) и Брстчера (Вгй$сЬег, 1984) с некоторыми модификациями, позволяющими нам получать одновременно оба белка. Препарат кальмодулина из мозга быка был любезно предоставлен М.В.Медведевой.

Методы получения пептидов. Расщепление кальпонина химотрнпенном проводили по ранее описанному методу Мецгуэльдн - с соавт. (МегёисМ» с1 а!.. 1992). Хнмотркпсннолиз кальдесмона осуществляли при весовом соотношении фермент/белок, равном 1/1000. в течение 5-10 минут при 30°С и рН 7.0. Реакцию останавливали добавлением РМБИ. Дслсционные мутанты кальдесмона человека и курицы, экспрсссировашшс в Е.соН. были любезно предоставлены нам лабораторией д-ра СБМарстона (Национальный Институт Сердца н Ле1 'кнх,! Лондон, Великобритания).

Анализ первичной структуры кальдссмонп и кальпонина. Вероятность образования амфк^жльпоН а-сниралк н структуре белков оценивали с помощью методов Айзенберга и соавт. (Г:гчспЬсг£ е( а!.. 1984) и Темнели и соант. ('Гетре! с! а!.. 1995). используя компьютерные программы КОАР. ПШХи/Ш.. С.АКЖ1Ж и ВСТЛТШШ из пакета] программ РСОИМ:.'

Методы получения искусственных мембранных структур. Препараты мульчи лам ел л яри их везикул получали, диспергируя пленку фосс^юлипида п бус|х;ре, содержащем 30 мМ HEPES/NaOH рН 7,3, 45 мМ NaCi, 1 мМ EGTA. Суспензию фосфолипида инкубировали при 54°С п течение ночи. Препараты малых одноламеллярных везикул получали, подвергая ультразвуковой обработке фосфолиппд, суспендированный в 20 мМ зрис-НС! рП 7,5, 0,1 мМ EDTA.

Методы исследования взаимодействия белков с фосфолипида ми. Взаимодействие кальдесмона, кальпошша или их пептидов с мембранными структурами изучали методом ультрацентрифугирования, анализируя способность белков соосаждатъся с везикулами фосфолипида (Adams, Pollard, 1989). Метод светорассеяния (длина волны рассеиваемого света 340 нм) использовали для исследования связывания кальпошша, кальдесмона и его делецнонных мутантов с препаратами SUV (Nelsestuen, Lim, 1977). С помощью названных выше методов изучали влияние кальмодулииа па способность кальдесмона, кальпошша или их пептидов взаимодействовать с фосфолшшдамн. Воздействие кальпоиика на калориметрическое поведение липидного бислоя MLV исследовали методом дифференциальной сканирующей калориметрии (Tempel et al., 1994). Способность кальдесмона и кальпошша вызывать слияние SUV или нарушение целостности их мембран изучали, используя методы смешения в од ора сти ори м or о содержимого везикул и утечки содержимог о везнкул по внецшюю среду (Wilschut et al., 1980).

Электрофорез Щелков и пептидов в присутствии SDS проводили в 10%, 12.5% или 15% полнакриламидных гелях (Laemmli, 1970), которые окраишвали Coomassie R-250.

Конце1працню белков определяли либо методом Спектора (Spector. 1978). используя в качестве стандарта БСА, либо спсктрофотометрически. Концентрацию делецнонных мутантов

кальдссмона измеряли, модифицируя аминогруппы пептидов с})луорсскамнпом (Bohlen et al., 1973). В качестве стандарта использовали иптактный кальдссмон.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ первичной структуры кальдссмона и кальпонина. Для локализации фосфолипид-связывающих центров белка Айзенберг и соавт. (Eisenberg el al., 1984) предложили использовать график, учитывающий среднюю гидрофобность и гидрофобный момент (то есть степень амфифильности) коротких 11-членных участков полипептидной цепи. Было высказано предположение, что оптимальной для поверхностного взаимодействия с липидным бислоем структурой является амфифильная а-спираль, способная вступать одновременно в электростатический и гидрофобный контакт с мембраной. Было постулировано, что 11-члениый сегмент белка, показатели средней гидрофобносш (Н) н гидрофобного момента (ц) которого удовлетворяют требованию ц + 0.392Н > 0,603, будет эффективно взаимодействовать с поверхностью бислоя (рис. 1а). Темпель и соавт. (Tempel et al., 1995) развили это предположение и показали, что для эффективного связывания с кислыми фосфолипидами амфифильная а-спираль дожна обладать тремя функциональными регионами. Гидрофобный регион I погружен в углеводородное ядро бислоя и обогащен неполярными аминокислотными остатками. Латеральный регион II осуществляет контакт с кислыми головками лнпидов и обогащен полярными и положительно заряженными аминокислотными остатками. Наконец, регион III экспонирован в водную фазу и обогащен полярными и заряженными аминокислотными остатками (рис. 2а).

При анализе структуры кальдссмона было обнаружено, что участок белка, ограниченный остатками 648-659. удовлетворяет сформулированным выше условиям (рис. 16 и 26) и. согласно предсказаниям вторичной структуры (Garnier et al.. 1978). действительно

«.« i.«

гмлрофобяогтъ

Л

»I !

- • -V.I

I

л.

-1.0 -0.J

-0.4 -0 2 0.0

Рис. 1. Соотношение гидрофобного' момента li средпей гидрофобности отдельных фрагментов различных белков.

а) Характеристика некоторых 11-членных a-спиральных участков

различных белков и пептидов по величинам их средней пидрофобности (Н, ось абсцисс) и гидрофобного момента (|J, ось ординат). + участки полипептидных гормонов (кальцитокина. глюкагона и др.); х литические полипептиды (бомболитины, мастопараны и Др.); surface - область распределения участков, контактирующих с поверхностью мембраны; Im - область распределения трансмембранных участков белков; globular - область распределения а-спнралей глобулярных белков (Tempel el

al. 1995).

б) Характеристика средней гндрофобности (Н) н гидрофобного

5 момента ((i) 11-членных фрагментов кальдесмона. На график нанесены соответствующие параметры каждого пятого из анализируемых 11-членных сегментов. Прямая линия р=0,603-0.392Н разделяет график на две части. Фрагменты, расположенные выше указанной прямой, могут согласно предсказаниям Айзенберга с соавт. (Eisenberg et al, 1984) вступать в поверхностный контакт с

фосфолипнднымн мембранами.

в) Характеристика средней гидрофобное™ (Н) и гидрофобного момента (ц) 11-членных фрагис1ггов кальпонина. Обозначения как на рис. 16.

з 10 17

Рис. 2. Взаимное расположение

боковых цепей аминокислот, находящихся в составе а-.спирали.

а) Предполагаемая структура идеальной амфифильной а-спирали. Распределение аминокислотных остатков вдоль оси спирали показано в поперечном сечении. Продемонстрировано взаимное расположение трех функциональных регионов а-епкрали: I.

иктеркалированного во внутренние слои мембраны; И, взаимодействующего с кислыми головками фосфолипидов, III, экспонированного в растворитель.

. б) Поперечное сечение

амфифилыюй а-спирали, формируемой остатками 648-659 кальдесмона.

■) Поперечное сечение

амфифильной а-спирали. формируемой остатками 89-95 кальпоиина.

б Р648 W659

1655 . -J-L V652

G651 М658

N654

Е650

S657

F91

; LS

А94

N90

R93

<]юрмнрует устойчивую а-спнраль. Анализ последовательности кальпоннна позволил выявить дпа вероятных с)юсс]х>лш1ид-спязываюишх участка, ограниченных остатками 42-58 и 85-99 (рис. 1в). Однако лишь сегмент кальпонина 89-95 оказался способным к образованию стабильной а-спиралк (рис. 2в). Полученные данные указывают, что кальдесмон и кальпоннн способны эффективно взаимодействовать с мембранамн, осуществляя поверхностный электростатически-гидрофобный контакт с липидным бислоем. Кроме того, результаты анализа первичной структуры исследуемых белков позволяют предсказать локализацию фосфолипид-связывающих участков кальдесмона и кальпонина.

Взаимодействие кальдесмона и кальпонина с везикулами фосфолинида. Исследуемые белки способны соосаждагться с препаратами SUV как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция. Добавление БСА для исключения неспецифической сорбции не препятствует взаимодействию кальдесмона и кальпонина с <3>осс}юлипидам11. Повышение ионной силы приводит к ослаблению эффективности наблюдаемого связывания, однако даже в присутствии 150 мМ NaCl значительная часть кальдесмона и кальпонина обнаруживается в осадке.

Тщрованне суспензии SUV исследуемыми белками сопровождается увеличением светорассеяния анализируемой смеси. Известно, что рассеяние суспензии с^эосфолипида может возрастать вследствие ряда причин. В простейшем случае в основе данного явления лежит повышение молекулярной массы рассеивающего элемента (то есть везикулы) в ходе ассоциации белка с поверхностью мембранной структуры. Когда размеры SUV много меньше длнны волны рассеиваемого света (это правило выполняется в условиях нашего эксперимента), а концентрация рассеивающих элементов неизменна (то есть везикулы не претерпевают агрегации или слияния), изменение

рассеяния суспензии фосфолипидов описывается как I!2/!u ~ (М2/М( )2, где 1,- светорассеяние комплекса белок-везикула (2) или индивидуальных везикул (1), М - молекулярная масса комплекса (2) или индивидуальных везикул (1) (Nelsestuen, Lim, 1977). Если предположить, что в каждой точке титрования весь добавленный в пробу белок связывается с мембранными пузырьками, можно построить теоретическую зависимость увеличения молекулярной массы комплекса от концентрации белка (рис. 3 >). Разница между теоретически предсказанными и экспериментальными данными позволяет оценить в каждой точке количество связанного и свободного белка и сделать поправку на рассеяние, вносимое индивидуальным белком. Анализ результатов титрования согласно описанной модели позволяет заключить, что при связывании кальдесмона с мембранными структурами происходит 'налипание" белка на везикулу. При титровании суспензии фосфолипида кальпонином экспериментальные точки лежат не ниже, а выше теоретической прямой (рис. 36). По-видимому, в отличие от кальдесмона, кальпонин индуцирует какие-то дополнительные процессы (агрегацию или слияние мембранных пузырьков). Параметры исследуемого белок-лнпндного взаимодействия зависят от ионной силы среды. В присутствии 12 мМ NaCl кальдесмон индуцирует полумаксимальное увеличение светорассеяния суспензии везикул фосфатаднлсерина при концентрации 0,9 мкМ. В этих же условиях полумаксимальный эффект кальпонина наблюдается при концентрации белка 3 мкМ. Эксперименты с фосфолипндамн различной природы показали, что кальдесмон и кальпонин более прочно связываются с кислыми фосфолнпидами (фосфатнднлсерином, фосфатидной кислотой), чем со смесью кислых и нейтральных лнпидов (азолектином) или индивидуальными нейтральными фосфолнпидами (фосфатиднлэтаноламином).

б

Кальдссыои.нкМ Кмьпоиии. м»М

Рис. 3. Индуцированное кальдесмоном (а) и кальпонином (б) увеличение светорассеяния суспензии фосфолипидов. Кривые титрования 50 мкМ SUV из фосфатидилсерина (фракция 5 экстракта мозга) в буфере, содержащем 5 мМ трис-HCl рН 7,5, 12 мМ NaCl. Пунктирные линии обозначают теоретически ожидаемые величины светорассеяния, если бы весь добавляемый белок связывался с везикулами фосфолкпкда и такое связывание не влекло бы за собой агрегации или слиянии SUV.

OA 0.Б 0.S 1.0 К»льдссмон. нкМ

№

50

£ 40

т

и 30

г

S

>» го

10

0

га эо Кялиюаин. мМ

Рис. 4. Индуцированное кальдесмоном (а) к кальпонином (б) нарушение целостности везикул фосфаткдилсерина (фракция 5 экстракта мозга). Условия проведения эксперимента идентичны условиям опыта по светорассеянию (рис. 3).

Пйрушсннс КИЛ1.ДССМОНОМ и кпльпонипом целостности мсмбрпн фосфолиииднмх псзикул. Нарушение целостности везикул фосфолнпнда регистрировали, используя препараты SUV. наполненные с)хпуорофором кальцеином в концентрации, приводящей к самотушению флуоресценции. Индуцируемая исследуемыми белками утечка содержимого мембранных пузырьков во внешнюю среду сопровождалась увеличением флуоресценции кальцеина. В присутствии 12 мМ NaCl кальдесмон вызывает нарушение целостности везикул фосфатидплсернна (рис. 4). Со j, определенная из кривой титрования, составляла 0,5 мкМ. Эта величина сопоставима с концентрацией кальдесмона, вызывающей полумаксимальнос увеличение светорассеяния (рис. 3). Можно предположить, что как увеличение светорассеяния, так и утечка содержимого SUV отражают непосредственно ассоциацию кальдесмона с мембранами. Кальпонин вызывает полумаксимальное увеличение флуоресценции кальцеина при концентрации Ю нМ, что значительно меньше концентрации!! белка, индуцирующей полумаксимальное изменение светорассеяния. Это скорее всего означает, что нарушение целостности мембран при низкой ионной силе является следствием образования комплекса кальпоиин-фосфолнпнд. а увеличение светорассеяния, как уже говорилось, отражает какие-то дополнительные процессы, вызываемые кальпонином в суспензии фосфолнпндных везикул. Из данных литературы известно, что белки, вступающие в поверхностный контакт с липидным бислоем посредством взаимодействий смешанной электростатической и гидрофобной природы, как правило, индуцируют увеличение проницаемости мембран (Papahadjopoulos et al., .1975). Вероятно, это явление связано с нарушением упаковки бнелоя амфифнлышмн сегментами белка, вклинивающимися в наружный слой лнпидов мембраны везикул и увеличивающими вследствие этого его площадь.

Отметим, что н наших экспериментах количество вышедшего во внсишюю среду флуоро<}юра зависит от количества добавленного белка. Этот факт свидетельствует в пользу того, что- взаимодей стане кальдесмона и кальпонина с фосфолипидами, по всей вероятности, необратимо. В противном случае добавление единственной молекулы белка к суспензии SUV приводило бы к полному выходу содержимого везикул. Ранее такое же необратимое связывание с мембраной эритроцитов было описано для мелитгина - амфифильного пептида из яда пчел. Считается, что при контакте с липидным бислоем амфнфильная U спираль мелитшна интеркалирует во внешний монослой мембраны. В этот момент происходит дестабилизация бислоя, способствующая увеличению проницаемости, с одной стороны, и дальнейшему утопанню спирали в гидрофобном ядре мембраны, с, друтой стороны (DeGrado et al., 1982). Последнее событие делает взаимодействие мономера мелитгина с е}юсфолипидами необратимым.

Любопытно, что ни кальдесмон, ни кальионин не способны индуцировать 100% выход флуоро(|юра, наблюдаемый при разрушении везикул детергентом тритоном Х-100. Это может быть связано с некоторой гетерогенностью суспензии SUV. Вероятно, определенная часть малых мембранных пузырьков не может эффективно взаимодействовать с крупными молекулами белка (размеры кальпонина сравнимы с размерами везикул, а размеры кальдесмона в несколько раз превышают их). Другое объяснение может заключаться в том, что при связывании с мембраной белок вызывает лишь кратковременную дестабилизацию бислоя, приводящую к выбросу некоторой часта содержимого везикул по внешнюю среду. В связи с тем, что взаимодействие кальдесмона и кальпонина с фосфолипидами необратимо, титрование суспензии SUV исследуемыми белками сопровождается выбросом только определенной доли флуорофора.

При повышении конной силы до 100 мМ NaCl кальдссмон и кальпонпн оказались неспособными индуцировать утечку содержимого везикул. Таким образом, при физиологических условиях исследуемые белки не вызывают нарушения целостности мембран.

Влияние кальдесмона и кальпонина на способность фосфолипидных везикул к слиянию. Для наблюдения за слиянием мембранных структур был избран метод смешения их водорастворимого содержимого. В основе его лежит образование комплекса между способным флуоресцировать ионом тербия и хромофором-хелатором днпиколиновой кислотой (DPA). Спектр возбуждения комплекса тербий-DPA идентичен спектру поглощения DPA, спектр флуоресценции комплекса соответствует таковому для тербия (Wilschut et al., 1980). Эксперименты проводили в присутствии EDTA, чтобы предотвратить образование флуоресцирующего комплекса при утечке во внешнюю среду содержимого наполненных тербием и наполненных DPA везикул. При низкой ионной силе исследуемые белка не вызывают увеличения флуоресценции комплекса тербий-DPA. Возможно, в определенной степени это связано с наблюдаемой в данных условиях утечкой содержимого везикул во внешнюю среду, индуцируемой кальдесмоном и кальпоннном. При повышении ионной силы до 100 мМ NaCI, когда нарушения целостности мембран не происходит, мы также не смогли зарегистрировать сколько-нибудь значительного увеличения флуоресценции комплекса тербий-DPA. Таким образом, при физиологических условиях кальдесмон и кальпонии не способны вызывать слияния SUV.

Влияние кальпонина на фазовый переход бислоя MLV. Для регистрации фазового перехода лнпндов и изучения эффекта кальпонина на этот процесс был использован метод дифференциальной сканирующей калориметрии. Известно, что мембрана SUV вследствие высокой кривизны обладает искаженной бнелойной структурой. Поэтому для

препаратов малых везикул характерен пологий с}>азовый переход с низкой степенью коопсратнвности. Препараты MLV. напротив, демонстрируют острый высококооператшжый фазовый переход, причем малые изменения поведения липидоп под действием внеиших факторов легко регистрируются. Многослойные везикулы из дипальмитонл-фосфатидилсерина претерпевают резкий фазовый переход при 54°С (рис. 5). Контрольные эксперименты с изолированным кальпонином показали, что в диапазоне используемых концентраций белка и рабочем интервале температур дифференциальная сканирующая калориметрия не выявляет тепловых переходов самого кальпонина. Добавление белка к MLV сопровождается появлением на термограмме "плеча" с более низкой температурой плавления. Одновременно с этим уменьшается амплитуда пика основного фазового перехода лнпидов. В то же время энтальпня перехода изменяется незначительно (менее чем на 5% при соотношении белок/лнппд 1/20). Полуширина пика фазового перехода, увеличение которой свидетельствует о нарушении кооперативное™ бислоя, возрастает с 2.1° для чистого фос^юлнпнда до 5,75° при указанном выше молярном соотношении белок/липид (рис. 5). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что калыюнии влияет на упорядоченность упаковки бислоя и фазовое состояние мембраны. Анализ данных литературы о влиянии различных фосфолипид-связывающнх белков на калориметрическое поведение бислоя (Papahadjopoulos cl al., 1975, McElhaney, 1986) указывает на то, что эффект кальпонина сходен с эцхректами других белков, вступающих с мембраной в поверхностный контакт смешанной электростатической и гидрофобной природы.

Суммируя представленные результаты, можно заключить, что, используя различные методы, мы смогли продемонстрировать возможность взаимодействия кальдесмона и кальпоппна с лнппдными

Рис. 5. Термограммы MLV из дипальмитоилфосфатидилсерина (1) и смеси дипальмитоилфосфатидилсерин/ кальпонин в молярном соотношении 40/1 (2) и 20/1 (3).

35 40 45 50 55 60 Температура (°Q

65

Рис. 6. Доменная модель кальдесмона гладких мышц (а) и локолиаация делеционных мутантов кальдесмона человека (б). Нумерация соответствует последовательности h-кальдесмона курицы (Bryan et al, 1989), истинная нумерация остатков кальдесмона человека приведена в скобках. Положение остатков триптофана обозначено W, вероятный фосфолипид-связывающкй участок отмечен вертикальными линиями.

мембранами. На следующем этапе исследования мы обратились к локализации (|юс(|х>лшшд-спязыпаюш.их центров исследуемых белкой.

ЛокаЛИЗИЦИЯ (]>ОС<]х>Л1ШИД-СШ13М11Ш<ПЦИХ участков

кильдс-смонн. Г!рк ультрацеитрнфугнронаини смеси химотриптнческого гидролнзата кальдесмоиа с фосфолилидиыми везикулами было обнаружено, что осадок обогащается фрагментами белка с кажущейся молекулярной массой 20-23 к 40 кПа. Учитывая, что указанные фрагменты локализованы на С-конце молекулы кальдесмона (Marston, Huber, 1995). можно предположить, что £)ххх}юлипнд-связывающий центр белка расположен в С-концевом домене молекулы. Более детально определение локализации фосфолипнд-связывающего участка в структуре кальдесмона было проведено с помощью делеционных мутантов, любезно предоставленных нам лабораторией д-ра СБМарстона (рис б.табл.1).Для исследования взаимодействия фрагментов белка с фосфолипндами использовали уже описанный ранее метод светорассеяния. При титровании суспензии SUV N-концевым, центральным и С-концевым фрагментами кальдесмона курицы было обнаружено, что только С-концевой фрагмент 606С вызывает значительное увеличение рассеяния (табл. !). Иа основании результатов экспериментов но светорассеянию исследуемые дслециониые мутанты кальдесмона человека могли быть подразделены на 4 группы. Фрагменты ИЗ и lió. представляющие домен 3 белка, не влияли на рассеяние суспензии ^юсфолнпидов. Фрагменты Н7 и Н2 имели показатель Qj, близкий к таковому для ннтактного кальдесмона и, следовательно. содержали в своем составе искомый ^юсфолнпид-снязывающий участок. Фрагмент П4 обладал значительно худшим сродством к липидам. чем более длинный фрагмент Н7. Наконец, фрагменты 118 и НУ имели значения C0.s в 2 раза меньише. чем Н7 н Н2. что указывает на важность остатков 626-658 для взаимодействия кальдесмона с мембранами. Н то же время мы не можем также

Табл. !•. Параметры взаимодействия калъдесмона и его фрагментов с фосфатидилсерином (фракция 5 экстракта мозга).

Белок или Номера а-к.о. Номера а-к.о. Молекулярная Максимальная Соотношение Со.5

пептид последователън. последовательн. масса в кОа величина 1,2/1,1 фосфолипид/

калъдесмона калъдесмона белок при

курицы человека насыщении

Кальдесмон 1-756 87 4,04 120 0,4

утки

Фрагменты

калъдесмона

курицы

N128 1.128 15.5 1.05 не определено не определено

центральная 230-419 22.1 1,03 не определено не определено

спираль •

606С 606-756 16 >1,9 >50 не определено

Фрагменты

калъдесмона

человека

Н2 (626-710) 683-767 9 1,3 90 0.3

НЗ (476-510) 506-566 7 1.9 25 12,9

Н4 (566-624) 622-681 6.7 1.5 ■ 40 1.3

Н6 (476-569) 506-625 14.7 1.06 не определено не определено

Н7 (566-710) 622-767 15.6 1.4 100 0.3

Н8 (658-737) 715-793 8.5 1.3 90 0.5

Н9 (669-737) 726-793 7.3 1.4 60 0.6

исключить из рассмотрения участок, ограниченный остатками 658-710 белка (общий для фрагментои И2 и Н8). Интересующая нас последовательность 626-710 содержит не только амфифильную а-синраль, формируемую остатками 648-659, но и участки возможного электростатического контакта с кислыми липидами, имеющие структуру К633(Х)аК(ХЪК63, и K70I(X)4K(X)4R7„. Сегменты полнпептидной цепи сходной природы были обнаружены в составе таких фосфолипид-связывающих белков, как гельзолин, кофилин и белок gCap39 (Yu et al., 1992).

Локализация фосфолипид-связывающих участков кальпонина. Кальпонин подвергали химотрипсинолизу при различном соотношении протеаза/субстрат. Ультрацентрифугирование смеси хнмотрнптического гидролнзата белка, полученного в условиях ограниченного протеолиза, и суспензнн SUV показало, что только N-концевой 22 KDa фрагмент (остатки 7-182 (Mezgueldi et al., 1992)) способен эффективно взаимодействовать с фосфюлнпидами в присутствии 150 мМ NaCl (рис. 7). Основным продуктом расщепления кальпонина в более жестких условиях является 13 KDa N-концевой пептид (остатки 7-144 (Mezgueldi ct al., 1992)). Было обнаружено, что этот пептид сохраняет способность связываться с везикулами липнда в присутствии 150 мМ NaCl (рис 7). Указанный фрагмент кальпонина содержит в своем составе амфифильную а-ашраль, формируемую остатками 89-95. Возможно, именно эта структура ответственна за взаимодействие белка с мембраной.

Влияние кпльмодулинн нн связывание кальдесмоня и кальпонина с <}и>сс|>олинндпми. В экспериментах по ультрацентрифугированию было установлено, что в присутствии насыщенного кальцием кальмодулпна количество кальдесмона и кальпонина, соосаждающнхся с везикулами липнда, уменьшается. Предварительное добавление кальмодулпна к суспензии SUV приводит к

ISPSPSP ISP5PSP

« п • M

67

4) е» __ «

30 «» ~ »

94 _ 67 ..

20 I

20

14 ^ - ф 14 М

Рис. 7. Взаимодействие химотриптичсских пептидов кальпонина с везикулами азолектина, исследованное методом ультрацентрифугирования. Пептиды кальпонина (0,68 мг/мл), полученные в условиях ограниченного (а) и глубокого протеолиза (6), были смешаны с азолектином (2 мг/мл) н подвергнуты осаждению в отсутствие (2) или в присутствии (3) 150 мМ ЫаС1. Результаты ультрацентрифугирования пептидов в отсутствие фосфолипида представлены на треках 1. Состав исходной смеси (¡), супернатанта ($) и осадка (р) анализировали методом электрофореза в полиакрнламидном геле в присутствии БОБ.

Рис. 8. Влияние кальмодулина на индуцируемое кальпонином увеличение светорассеяния фосфолипидных везикул. 40 мкМ суспензию SUV азолектина титровали кальпонином в присутствии 0,1 мМ СаС^ в отсутствие (1) или ■ в присутствии 6,5 мкМ кальмодулина (2).

о.4 од о.е Кальпоикк. мкМ

увеличению количества кальпонина, необходимого для достижении нолумакснмального увеличения снегараессянии (рис 8). Таким образом, кальмодулни ишнбнруст взаимодействие кальдссмопа и кальпонина с <}юе(}х>липпдами, а этот <])акт, н спою очередь, позноляет предположит!), что участки контакта с кальмодулином и фос^юлнппдамн в структуре исследуемых белков располагаются поблизости друг от друга. Действительно, н случае кальдесмона известно, что одни из кальмодулим-связывающнх петров - так называемый участок А -локализован вблизи Trp659 (Zhuang et al., 1995), то есть должен перекрываться с <1>ос(}юлипнд-связывающеЙ амфпфжлыюй спиралью кальдесмона. В случае кальпонина установлено, что одни из кальмодулин-связывающпх участков находится в составе последовательности 61-144 (Winder, Walsh, 1993). Кроме того, имеются сведения о-наличии центра слабого взаимодействия в N-концевой части кальпонина (остатки 1-55) и' центра сильного взаимодействия в центральной части белка (остатки 153-163) (Mezgueldi el al., 1995). Таким образом, возможно, что как в случае кальдесмона, так - и в случае кальпонина амфн^мльная а-спнраль, участвующая в ассоциации с лнпндным бнелоем. располагается поблизости от кальмодулпн-связывающего цс(пра. В настоящее время трудно сказать, насколько важна опосредованная кальмодулином регуляция взаимодействия кальдесмона и кальпонина с мембранами in vivo. Тем не менее представленные результаты свидетельствуют о возможности такой регуляции.

Суммируя полученные нами данные, можно предположить, что наблюдаемая ассоциация исследуемых белков с с|юс(}х)лнпндами вносит определенный вклад н выполнение цнтоскслетом некоторых связанных с клеточными мембранами функций. Имеющиеся в литературе сведения о локализации калмюпнна н цитоскелетном. а кальдесмона - и сократительном комнартмеите гдадкомишечных клеток (Mabuchi et al.

1995а) наводят на мысль о различной фонологической роли этих белков. Наши данные о том, что кальпонин способен более эффективно взаимодействовать с фосфолипидамн, чем кальдесмон, косвенно свидетельствуют в пользу предположения о преимущественно цитоскелетиой функции кальпонина. Как бы то ни было, сведения литературы в комплексе с представленными выше результатами позволяют заключить, что кальдесмон и кальпонин не только могут участвовать в регуляции сокращения гладких мышц, но, по-видимому, играют определенную роль в осуществлении различных форм немышечной подвижности (эндо- н экзоцитоз, выдвижение ламеллоподий), а также в процессах, сопряженных с изменениями фазового состояния мембран.

ВЫВОДЫ.

1. Исследовано взаимодействие двух актнн-сиязываюших белков, кальдесмона и кальпонина, с фосфолипидамн. С помощью методов светорассеяния. флуоресцентной спектроскопии, ультрацентрнфугкровання и калориметрии установлено, что кальдесмон и кальпонин способны связываться с фосфолшшднымн мембранами.

2. Кальдесмон и кальпонин преимущественно взаимодействуют с кислыми фосфолипидамн (фосфатиднлсерин, фосфатпдная кислота). Связывание белков с фосфолипидамн ослабевает прн повышении ионной силы.

3. Прн низкой ионной силе взаимодействие кальдесмона и кальпонина с фосфолипидамн сопровождается нарушением целостности мембран и утечкой содержимого везикул во внешнюю среду. Для достижения полумаксимального выхода содержимого везикул необходимы меньнше концентрации кальпонина, чем кальдесмона. Прн высокой ионной силе пи кальдесмон, ни кальпонин не способны повреждать мембраны везикул (}юсфолипндов.

4. Калмюннн способен шшить на состояние бнслоя ({юсфатнднлссрнпа. уменьшая кооперативное п, (|>азовог(> неорехода жнриокиелотных цепей н понижая температуру плавления части молекул ^ххх^юлипнда.

5. Эксперименты с использованием протеолитических фрагментов кальноннна и кальдесмоиа и делеционных мутантов кальдесмоиа позволили картировать (}юсс}>олнпид-сиязывающ)|е центры исследуемых белков. Установлено, что фосфолипид-связывающнй участок кальдесмоиа ограничен остатками 626-710, а соответствукнцнй участок кальпоннна содержится в составе последовательности 7-144.

6. Насыщенный кальцием кальмодулин ослабляет взаимодействие кальдесмоиа и кальпоннна с фосфолнпндамн. Это может быть связано с тем, что фосфолипнд- и кальмодулнн-связывагащне центры исследуемых белков расположены в непосредственной близости друг от друга.

СПИСОК РАКОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Vorolnikov Л.V., Bogatcheva N.V., Gusev N.B. Caldesmon-phospholipid interaction. Effect of protein-kinase С phosphorylation and sequence similarity with other phospholipid-bindmg proteins. Biochem. J.. 284. 911-916 (1992)

2. Bogatcheva N.V.. llubcr P.A.J.. Fraser I.DC.. Marston S B.. Guscv N.B. Localization of phospholipid-binding sites of caldesmon. FEBS Lett.. 342, 176-180(1994)

3. Bogatcheva N.V.. Gusev N.B. Caldesmon-phospholipid interaction Abstracts of the international simposium "Biological motility4, Pushchino, 10-11 (1994)

4. Bogatcheva N.V.. Guscv N.B. Computer-assistant prediction of phospholipid-binding sites of caldesmon and calponin. FEBS Led.. 363. 269272 (1995)

5. Itugaluhcvsi N.V.. Ciuxcv N.H. Interaction of smooth muscle calponin with phospholipids. I:I;I3.S Lett.. 371. 123-126 (1995)

6. liogatchova N.V., Guscv N.U. Interaction of caldesmon and calponin with phospholipids. Abstracts of the XXIV curopcan musclc conference. Fircnze, 116(1995)

Лнтор благодарен Д.И.Левицкому н М.А.Пономареву за помощь п'мропсдспни опытов по мнкрокалориметрнн.

Данная работа проводилась при поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований (93-04-20213 и 95-04-11030а) н Международного Научного Фонда (ISF М 92000 и М 92300).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

АТ^Фаза - адснозннтрифос<1>атаза, БСА - бычий сывороточный альбумин, трис - трис(п1дрокс«метил)амнпомстан, EDTA этмлендиамиитетраацетат, EGTA - этнлепгликольтстраацетат, HEPES -МЬгндроксиэтнлпнпсразип-^-этансуль^юнат. MLV

мультнламеллярные везикулы. PMSF - ^хишлметилсуль^хмшлфторид. SDS - додсцнлсульс]итнатрия, SUV - малые одиоламелляриые везикулы.