Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние механической стимуляции на фенотип артериальных гладкомышечных клеток

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние механической стимуляции на фенотип артериальных гладкомышечных клеток"

РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО- ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РФ.

Институт экспериментальной кардиологии

рГ Б од

На правах рукописи

1 К И Ц Л

СТЕПАНОВА Ольга Владиславовна

ВЛИЯНИЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ НА ФЕНОТИП АРТЕРИАЛЬНЫХ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК.

03.00.25- Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно- производственного комплекса МЗ и МП РФ.

Научный руководитель: <

кандидат биологических наук В.П. Ширинский Оффициальные оппоненты: Кандидат биологических наук Р.В. Лацис Доктор биологических наук Э.М. Тарарак

Ведущая организация- Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

Защита состоится 20 декабря 1996 г.

в 11 часов на заседании Специализированного ученого совета К 074.22.02. в Российском кардиологическом научно- производственном комплексе по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д.15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно- производственного комплекса.

Автореферат разослан 20 ноября 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Гладкие мышцы, входящие в состав сосудистой стенки, своим сокращением регулируют просвет кровеносных сосудов и, следовательно, приток артериальной крови к органам, тканям и отдельным клеткам. Чтобы выполнять сократительную функцию гладкомышечные клетки (ГМК) должны находиться в дифференцированном фенотипе. Однако, в отличие от мышечных клеток других типов, ГМК обладают фенотипической пластичностью и могут дедифференцироваться в сосуде при некоторых патологиях, таких как атеросклероз, рестеноз. Подобные изменения происходят и при выделении ГМК из сосуда и помещении их в культуру. Переход ГМК из дифференцированного сократительного фенотипа в синтетический называется фенотипической модуляцией (Chamley- Campbell et al, 1979). Фенотипическая модуляция сопровождается значительными изменениями ультраструктуры клетки, изменяется экспрессия ряда белков. В том числе, наблюдается снижение экспрессии белков сократительного аппарата, таких как гладкомышечный миозин, а- актин, h- кальдесмон, кальпонин, что, наряду с другими изменениями при фенотипической модуляции, приводит к потере сократимости ГМК. ГМК синтетического фенотипа приобретают способность к делению и миграции.

Можно утверждать, что на ГМК в сосуде действует группа факторов, определяющая их фенотипическое состояние. Установлено, что гуморальные, в частности гормональные, и межклеточные взаимодействия, а также тип межклеточного матрикса могут влиять на черты фенотипа ГМК (Thyberg et а], 1990). Однако, еще один фактор,

воздействующий на сосудистую стенку, остается малоизученным. Речь идет о гемодинамической стимуляции. ГМК артериальной стенки постоянно находятся под воздействием пульсового давления крови, которое приводит к растяжению аорты и основных артерий от 2 до 15% (Dobrin, 1978). Периодическое растяжение артерий вызывает миогенное сокращение ГМК и, таким образом, представляет собой важное звено системы регуляции кровотока (Mellander, 1989). Также известно, что гемодинамические силы играют существенную роль при развитии сосудов. Накоплено достаточно данных и о восприимчивости культивируемых ГМК к механическим стимулам. Одним из ранних ответов клеток на растяжение является увеличение внутриклеточной концентрации свободного кальция, который входит в клетку через механочувствительные каналы, активация фосфолипазы С, протеинкиназы С и т. д. (D'Angelo, Meininger, 1994). Приведенные данные убедительно свидетельствуют в пользу вовлеченности механических сил в нормальное функционирование сосудистой системы. В силу этого можно предполагать, что в патологических условиях гемодинамические нарушения могут быть одним из факторов, способствующих развитию сосудистых заболеваний. Действительно, наблюдается корреляция между нарушениями гемодинамики и фенотипическими реакциями сосудистых ГМК при некоторых патологиях, таких как гипертония, рестеноз. По аналогии со скелетными мышцами можно ожидать, что механическая нагрузка будет способствовать поддержанию сократительных свойств ГМК. Однако, к моменту начала данного исследования прямые экспериментальные данные о воздействии механической стимуляции на фенотипические свойства ГМК сосудов отсутствовали. Подобные исследования сдерживались отсутствием адекватных

экспериментальных моделей. С развитием методов культивирования клеток в механически активной среде появилась возможность проведешш таких экспериментов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение влияния механической стимуляции на фенотип артериальных гладкомышечных клеток.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Отработать методы культивирования ГМК и сегментов аорты кролика в условиях механической стимуляции.

2. Изучить влияние периодического растяжения ГМК аорты кролика на пролиферативную активность этих клеток и экспрессию в них маркерных белков сократительного фенотипа.

3. Исследовать влияние периодического растяжения сегментов аорты кролика на экспрессию в них маркерных белков сократительного фенотипа ГМК

Научная новизна и практическая значимость работы.

В ходе работы были разработаны и оптимизированы методы культивирования гладкомышечных клеток и тканей в условиях механической стимуляции. Впервые показано, что периодическое растяжение культивируемых артериальных клеток избирательно и обратимо стимулирует экспрессию в них маркерного белка сократительного фенотипа Ь- кальдесмона и цитоскелетного белка филамина. Эффекты механической стимуляции могут быть блокированы ингибитором механочувствительных катионных каналов Установлено, что широкий спектр рецепторов внеклеточных матриксов вовлечен в передачу механических сигналов к клеткам и некоторые из них (например, рецепторы к ламинину) могут потенциировать эффекты,

вызванные механическим воздействием. Продемонстрировано, что механическая стимуляция опосредованно, вероятно, через аутокринные механизмы усиливает пролиферацию ГМК. Периодическое растяжение деэндотелизованных сегментов аорты в условиях органной культуры поддерживает высокое содержание Ь-кальдесмона и филамина в ГМК, что согласуется с данными, полученными в культуре клеток. В целом, результаты исследования впервые показывают, что периодическая механическая стимуляция ГМК сосудистой стенки может быть одним из естественных факторов поддержания их сократительного фенотипа. С другой стороны, в патологических условиях механическая стимуляция может оказывать противоположное действие, усиливая пролиферацию ГМК в ответ на митогены в участках повреждения сосудистой стенки.

Полученные данные расширяют представления о биологии гладкомышечных клеток сосудов и роли гемодинамических сил в функционировании сосудистой стенки в норме и патологии. Разработанные методические приемы культивирования ГМК в механически активной среде вносят вклад в развитие экспериментального моделирования в клеточной биологии. Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференции общества биомедицинской инженерии (Мемфис, США, 1993), международной конференции по сердечной недостаточности (Канада, 1994), конференции "Сосудистая биология и механические факторы" (Франция, 1994), XII конгрессе "Биология и патология сердца и сосудов" (Марсель, Франция, 1995), Всероссийской конференции по биомеханике, Институт Механики МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 1996), Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 129 страниц машинописного текста, 1 таблицу и 16 рисунков. Список литературы включает 186 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Получение поликлоналыплх антител к кальпонину куриных желудков было проведено по методу Такахаси и соавт (Takahashi et al, 1987).

Выделение и культивирование гладкомышечных клеток. ГМК

были получены энзиматически из медии аорты кролика согласно модифицированной методике, описанной раннее (Chamley-Campbell et al, 1979). Полученные клетки культивировали в среде роста М199, содержащей 10% эмбриональную сыворотку теленка (ЭТС); 2мМ L-глутамин; 100 ед/мл, пенициллин; 100 мкг/мл, стрептомицин; при 37°С, в атмосфере 95% воздуха и 5% СС>2. Среду культивирования меняли каждые 2 дня. Для пассирования использовали 0.25% трипсин. Эксперименты проводили с клетками 2-5 пассажей и первичной культуры.

Периодическое растяжение ГМК. В работе использовали 2 экспериментальные модели периодической стимуляции клеток, схематически представленные на Рис.1.

Вакуум

Рис. 1. Модели периодического растяжения культивируемых ГМК (слева- лунка культуральной плашки с эластичным дном, справа-эластичная мембрана).

Основные эксперименты проводили на ГМК, культивируемых на плашках с эластичным дном (Flexcell Corp., McKeesport, USA), которое растягивалось под действием вакуума на установке Flexcell Strain Unit (USA). В части экспериментов применяли модель одномерного растяжения эластичных мембран (Shirinsky et al, 1989). Эти модели различаются величиной и направлением вектора растяжения. В плашках с эластичным дном растяжение направлено вдоль радиуса и имеет переменную амплитуду. На прямоугольных мембранах растяжение направлено вдоль их длинной оси. Относительное растяжение этих мембран (Д1/1о) в каждой точке постоянно.

Для изучения влияния механической стимуляции на пролиферацию ГМК, пассированные клетки были посажены на культуральные плашки с эластичным дном. После 48 часов инкубации ГМК в условиях, описанных выше, среда роста была заменена на аналогичную, но содержащую 0.2% бычий сывороточный альбумин (БСА)

вместо 10% ЭТС. ГМК культивировали в бессывороточной среде 48 часов для получения популяции покоящихся клеток. Затем среда была заменена на содержащую 0.5%, либо 10% ЭТС.

В ряде экспериментов плашки были покрыты различными видами

межклеточного матрикса: коллагенами I и IV типа (концентрация,

2 2 используемая для покрытия- 6-10 мкг/см ), ламинином (1-2 мкг/см ), а

2 2 также желатином (0.1-0.2 мг/см ) и полилизином (2.5-5 мкг/см ). В ряде

экспериментов к культивируемым клеткам были добавлены нифедипин

3+

(4 мкМ) и верапамил (4 мкМ), а также ионы Gd (0.8 мкМ).

ГМК, выращенные в культуральных плашках с эластичным дном, подвергали периодическому растяжению с частотой 60 циклов/мин. и максимальной величиной растяжения 15% от исходного диаметра мембраны сроком до 6 дней. Затем клетки были отмыты охлажденным фосфатно- солевым буфером (ФСБ), после чего из них были приготовлены образцы для электрофореза. Для изучения ориентации ГМК клетки были посажены на эластичные мембраны и подвергнуты периодическому растяжению с частотой 60 циклов/мин. и амплитудой 15% от начальной длины мембраны. Эти величины находятся в пределах таковых in vivo. Ориентацию ГМК оценивали визуально с помощью микроскопа через 24 часа после начала эксперимента.

Периодическое растяжение сегментов аорты кролика. Аппарат для периодического растяжения аортальных сегментов представляет собой модифицированную установку для периодического растяжения клеток, выращиваемых на эластичных мембранах (Рис.1). Грудная часть аорты кролика была очищена от жира и разрезана вдоль на полоски

шириной 3-5 мм. Эндотелий был удален механически. Полоски аорты были лигированы с двух сторон и закреплены в камере на стационарных крючках с одной стороны и крючках, приводимых в движение мотором, с другой. Растяжение полосок аорты не превышало 15% от начальной длины, с частотой 60 цикл/мин. сроком до 4 дней. Аортальные сегменты культивировали при 37°С, в атмосфере 95% воздуха и 5% С02- Среда культивирования была идентична таковой для клеточных культур. Нерастягиваемые сегменты культивировали в таких же условиях отдельно от растягиваемых полосок. По окончании эксперимента из сегментов аорты были приготовлены пробы для электрофореза. 6-8 аортальных сегментов было изучено в каждом эксперименте.

Аналитические методы. Электрофорез белков проводили в 5%, 7.5%, 9% или12% полиакриламидных гелях по методу Лэммли (Laemmli, 1970). При электрофорезе образцы были уравнены по общему белку. Количество белка в пробах определяли колориметрически по реакции с амидовым черным (Schaffner and Wetasman, 1973). После электрофореза проводили сканирование гелей, окрашенных Кумасси R-250, для определения общего количества белка и содержания актина в исследуемых образцах на приборе LKB Ultrascan Laser Densitometer (Sweden).

Иммунохимические методы. Иммуноблоттинг проводили согласно методике, описанной Тоубином и соавторами (Towbin et al, 1979). После электрофоретического разделения белки переносили из геля на нитроцеллюлозный фильтр. Для количественной оценки содержания антигена фильтр, обработанный первыми антителами, и вторыми антителами, меченными ^5j> высушивали и помещали в кассету с

рентгеновской пленкой для последующей авторадиографии. Далее вырезали участки нитроцеллюлозы, соответствующие темным полоскам на пленке, и определяли их радиоактивность на гамма- счетчике. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ^ критерия Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние периодического растяжения на ориентацию культивируемых ГМК. Периодическое растяжение культивируемых ГМК вызывает их ориентацию поперек направления растяжения. Эта реакция клеток соответствует описанной в литературе и свидетельствует о том, что в обеих моделях, использованных в работе, ГМК реагируют на механическую стимуляцию. Наши данные по ориентации ГМК в ответ на растяжение подтверждают предположение о том, что периодическое растяжение артерий пульсовым давлением крови может вносить вклад в формирование цитоархитектуры сосудистой стенки.

Влияние периодического растяжения на пролиферацию ГМК. Характерной особенностью культивируемых ГМК является их способность к пролиферации (СЬат1еу-СатрЬе11 Ы а1, 1979). Было исследовано влияние механической стимуляции на пролиферацию ГМК в культуре. В присутствии 0.5% ЭТС периодически растягиваемые и культивируемые стационарно ГМК начинают делиться на 4 день (Рис.2). Лаг- фаза перед началом клеточного деления в данных условиях культивирования предполагает аутокринную стимуляцию пролиферации

ГМК факторами роста. После начала клеточного деления периодическое растяжение усиливает пролиферацию ГМК примерно на 30%.

Дни в культуре

Рис. 2. Влияние периодического растяжения на пролиферацию ГМК. (*Р< С.05 растяжение против контроля).

Так как до начала пролиферации эффект механической стимуляции не выявляется, можно заключить, что периодическое растяжение не стимулирует деление клеток непосредственно, а действует на пролиферацию опосредованно. Известно, что механические силы стимулируют экспрессию и секрецию тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (Wilson et al, 1993). Возможно, это и является причиной усиления пролиферации в ответ на периодическое растяжение. Такое объяснение вполне применимо в случае культивирования ГМК в 0.5% ЭТС. В то же время нами было установлено, что механическая стимуляция усиливает пролиферацию ГМК, культивируемых в 10% ЭТС. Можно предполагать, что в этих условиях все рецепторы PDGF уже

насыщены. Таким образом, вероятно, существуют и другие механизмы, опосредующие эффекты периодического растяжения на пролиферацию

Экспрессия белков- маркеров фенотипа ГМК, вызванная периодическим растяжением. Было установлено, что в ГМК первичной культуры механическая стимуляция вызывает повышение содержания филамина (Рис.3).

Рис. 3. Влияние механической стимуляции на экспрессию филамина. ГМК культивировали 6 дней в условиях периодического растяжения (А) и в стационарных условиях (Б).

Филамин является цитоскелетным белком, содержание которого в различных органах коррелирует с количеством гладкомышечной ткани. Филамин связывает актиновые филаменты и способен формировать из них трехмерную сеть (Nomura et al, 1987). Филамин, возможно, играет особо важную роль в поддержании целостности цитоскелета ГМК при воздействии на них механических сил.

ГМК

При анализе экспрессии других белков ГМК было показано, что периодическое растяжение вызывает увеличение экспрессии маркерного белка сократительного фенотипа ГМК Ь-кальдесмона, в то время как содержание гладкомышечного миозина (ГММ), кальпонина (КН) и 1-кальдесмона (1-КД) остается практически неизменным (Рис.4).

Рис. 4. Влияние периодического растяжения на экспрессию белков-маркеров фенотипа ГМК. Стационарные условия (белые столбики), Периодическое растяжение (темные столбики). (*Р<0.05 растяжение против контроля).

h-Кальдесмон является одним из основных регуляторов гладкомышечного сокращения и входит в состав сократительного аппарата гладких мышц (Sobue, Sellers, 1991). Он обладает способностью связывать актиновые и миозиновые филаменты in vitro и, вероятно, как и филамин, может выполнять интегрирующую роль в ГМК. Таким образом, помимо влияния на ориентацию и пролиферацию ГМК периодическая механическая стимуляция избирательно усиливает

экспрессию белков, характерных для сократительного фенотипа этих клеток.

Взяв в качестве прототипа Ь-кальдесмон, мы более детально исследовали его экспрессию в ГМК под действием механической стимуляции. Было продемонстрировано, что в пассированных ГМК, где содержание Ь-кальдесмона стабилизировано на низком уровне, механическая стимуляция обратимо повышает экспрессию этого белка в 2-2.5 раза (Рис.5). Отмена растяжения приводит к падению содержания кальдесмона до контрольного уровня.

Рис. 5. Влияние периодического растяжения на экспрессию И- кальдесмона в пассированных ГМК.

А - контроль, Б - растяжение, В - 4 дня растяжение+ 4 дня без растяжения

о 5

О ®

с£

.о с

ГО

СЕ ^

О

о ф

о. с

г

со

А 5 А 5 В

еЬ * "• «¿Э

4 дня 8 дней

~<>—Ф—С>-

-4 Б А

4 8

Дни в культуре

В первичной культуре ГМК, где наблюдается падение содержания кальдесмона в течение культивирования, периодическое растяжение замедляет этот процесс (данные не показаны).

Так как плотность межклеточных контактов и компоненты межклеточного матрикса играют важную роль в реализации фенотипа

ГМК (ТЬуЬег2 е1 а1, 1990), было изучено их влияние на опосредованную механическим растяжением экспрессию маркерного белка Ь-кальдесмона.

СО

□ - контроль Ш - растяжение Рис.6. Влияние периодического растяжения на экспрессию Ь-кальдесмона в конфлуентных и неконфлуентных культурах ГМК

Чтобы оценить вклад межклеточных контактов в эффекты механической стимуляции была исследована экспрессия Ь- кальдесмона в неконфлуентной и конфлуентной культурах ГМК. Содержание Ь-кальдесмона изменялось одинаково и в том, и в другом случае (Рис.6). Это означает, что плотность межклеточных контактов, по крайней мере в случае Ь- кальдесмона, не вносит вклад в эффект механической стимуляции, т. е. механические силы действуют на каждую клетку в отдельности.

Для того, чтобы оценить вклад компонентов межклеточного матрикса в реализацию эффекта периодического растяжения на экспрессию Ь- кальдесмона, ГМК культивировали на различных субстратах (коллаген I и IV типов (КЛ-1, КЛ-1У), ламинин (ЛН), желатин (ЖЕЛ), полилизин (ЛИЗ)).

КЛ-1 К Л -IV ЛН ЖЕЛ ЛИЗ

Рис.7. Влияние различных субстратов на индуцированную механической стимуляцией экспрессию И- кальдесмона. ГМК культивировали в стационарных условиях (белые столбики) и под влиянием периодического растяжения (темные столбики). (*Р<0.05 растяжение против контроля, **Р<0.05 ламинин против коллагена I типа).

Под воздействием механических сил экспрессия Ь- кальдесмона увеличивалась в ГМК культивируемых на всех типах субстратов (Рис.7). Однако, в случае ламинина наблюдаемый эффект был в 2-3 раза более выражен. Поскольку в стационарной культуре ламинин не увеличивает содержания Ь- кальдесмона по сравнению с другими матриксами, можно предполагать, что в ГМК происходит взамодействие сигнальных путей,

связанных с передачей механического сигнала и сигнала от рецепторов ламинина, при котором наблюдается потенциация эффекта. Получение данные согласуются с описанным продифференцирующим действием ламинина (Thyberg et al, 1990). In vivo он является одним из существенных компонентов базальных мембран ГМК. Поэтому, можно предположить, что эффекты периодического растяжения на ГМК в составе сосудистой стенки могут быть более выраженными, чем выявленные нами в искусственной модели на ГМК, культивируемых, в основном на коллагене I типа. Таким образом, различные типы межклеточных матриксов и мембранных рецепторов к ним способны проводить механический сигнал к ГМК. Вместе с тем, рецепторы к компонентам матрикса могут модулировать проведение этого сигнала.

Установлено, что механическая деформация клетки активирует

механочувствительные катионные каналы (D'Angelo, Meininger, 1994).

Принято считать, что Са2+, входящий в гладкую мышцу через

механочувствительные каналы, индуцирует ее сокращение. Чтобы

установить, связан ли наблюдаемый эффект увеличения экспрессии h-

кальдесмона в механостимулированных ГМК с активацией этих каналов,

нами был использован ингибитор механочувствительных каналов Gd3+.

Добавленный к ГМК в концентрации 8х10~7М Gd3+ подавлял прирост

содержания кальдесмона в ГМК в ответ на периодическое растяжение, в

то время как ингибиторы потенциал-зависимых кальциевых каналов

(нифедипин и верапамил) такой активности не демонстрировали (Рис.8).

Вероятно, Gd3+ может обладать более сложным действием на ГМК,

будучи добавленным к ним длительное время (6 дней). Нельзя i •

исключить возможность его проникновения в клетку и конкуренцию с 2+

ионами Са за взаимодействие с кальций- связывающими белками. Тем

не менее, проведенные эксперименты указывают на вовлеченность механочувствительных каналов и Саг+ в реализацию эффектов периодического растяжения на экспрессию Ь- кальдесмона.

С с)3+ Н и ф

Вер

КС Ф

ц о

Рис.8. Влияние активации механочувствительных каналов на индуцируемую периодическим растяжением ГМК экспрессию Ь-кальдесмона. ГМК культивировали в стационарных условиях (белые столбики) и под влиянием периодического растяжения (темные столбики). (*Р<0.05 растяжение против контроля).

Проведенные нами исследования показывают, что такой физиологически значимый для гладких мышц сосудов стимул, как механическая стимуляция может вызывать не только структурные (ориентация) и функциональные (сокращение) изменения в ГМК, но и специфически влиять на экспрессию белков в этих клетках. Причем, приложение к модулированным ГМК механической нагрузки стимулирует экспрессию белка маркера сократительного фенотипа Ь-кальдесмона и мажорного белка гладких мышц филамина. Таким образом, впервые получены экспериментальные доказательства того, что

для гладких мышц механическая нагрузка играет продифференцирующую роль. Следует отметить, что в случае Ь-кальдесмона механическая стимуляция является единственным известным фактором, стимулирующим его экспрессию в ^трансформированных клетках. Хотя механизмы экспрессии кальдесмона и филамина в ГМК под действием механических сил не изучены, такая избирательная экспрессия скорее всего указывает на специфическую регуляцию генов. Исследования ИеизсЬ с1 а] (1994) подтверждают эту точку зрения. На модели эмбриональных клеток аорты крысы эти авторы продемонстрировали, что периодическое растяжение стимулирует экспрессию гладкомышечных изоформ миозина как на уровне белка, так и мРНК.

Необходимо отметить что, влияние механической стимуляции как и других ранее изученных факторов на фенотипические свойства ГМК является частичным. В отличие от поперечнополосатых мышц, где программа дифференцировки представляется более скоординированной и может быть реализована с помощью ограниченного числа факторов транскрипции, в гладких мышцах для поддержания сократительного фенотипа, вероятно, необходимо одновременное выполнение многих условий (плотность клеточных контактов, состав межклеточного матрикса, гуморальные воздействия, механическая стимуляция и др.).

Чтобы получить подтверждение результатов, полученных на культуре клеток, в более приближенной к физиологии модели, было изучено влияние механической стимуляции на экспрессию маркерных белков в органной культуре. Периодическому растяжению подвергали деэндотёлизованные сегменты аорты кролика. Как и в случае первичной культуры ГМК, периодическое растяжение сегментов аорты замедляет

падение экспрессии Ь- кальдесмона и филамина, тогда как содержание гладкомышечного миозина и кальпонина практически не изменяется (Рис.9). Несомненным достоинством модели органной культуры является ее способность поддерживать клетки в естественном окружении, не нарушая межклеточные взаимодействия и тип межклеточного матрикса и сохраняя клетки в неделящемся состоянии. Одним из недостатков модели является диффузионный барьер для питательных веществ. При этом длительное культивирование сосудов (> 8 дней) приводит к изменению параметров клеточного питания и выявлению признаков деградации ткани. Однако, на ранних сроках культивирования органная модель адекватно воспроизводит эффекты механической стимуляции на экспрессию маркерных белков, изученные в культуре клеток.

Рис. 9. Влияние периодического растяжения сегментов аорты кролика на экспрессию в них маркерных белков сократительного фенотипа ГМК. (*Р <0.05% растяжение против контроля).

В данном исследовании с помощью моделей клеточной и органной культуры гладкомьпиечных клеток аорты кролика продемонстрировано, что периодическая механическая стимуляция является одним из факторов, поддерживающих ГМК в сократительном фенотипе. Таким образом, ее действие может проявляться уже на ранних этапах эмбрионального развития параллельно со становлением гемодинамики. С другой стороны, в участках повреждения сосудистой стенки механические силы могут вносить вклад в процесс клеточной дедифференцировки и пролиферации.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны и оптимизированы методы культивирования гладкомышечных клеток и сегментов аорты кролика в условиях периодического растяжения. Изучено влияние механической стимуляции на пролиферацию гладкомышечных клеток и экспрессию белков-маркеров фенотипа: гладкомышечного миозина, кальдесмона, кальпонина и филамина.

2. Периодическое растяжение первичной культуры гладкомышечных клеток и деэндотелизованных сегментов аорты поддерживает более высокое содержание Ь- кальдесмона и филамина, не влияя на экспрессию других маркерных белков.

3. Механическая стимуляция усиливает пролиферацию гладкомышечных клеток в культуре.

4. Экспрессия Ь- кальдесмона в пассированных гладкомышечных клетках усиливается в ответ на периодическое растяжение независимо

от пролиферативного статуса и типа субстрата. Культивирование клеток на ламинине потенциирует эффект механической стимуляции.

5. Ингибитор механочувствительных катионных каналов гадолиний блокирует вызванную механическим растяжением активацию экспрессии h- кальдесмона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Birukov K.G., Stepanova O.V., Nanaev А.К., Shirinsky V.P.: Expression of calponin in rabbit and human aortic smooth muscle cells. Cell. Tis. Res. 266: 579-584, 1991.

2. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Stepanova O.V., Tkachuk V.A., Resink T.J.: Cyclic stretch contributes to smooth muscle cell differentiation in culture. Annals of Biomedical Engineering 21, suppl.l: 29, 1993.

3. Birukov K.G., Shirinsky V.P., Stepanova O.V., Resink T.J., Tkachuk V.A., Smirnov N.V.: Cyclic stretch: a novel factor influencing vascular smooth muscle cell phenotype. Canad. J. Cardiol, 10 (suppl.A), 67A, 1994.

4. Birukov KG., Stepanova O.V., Shirinsky V.P., Tkachuk V.A., Resink T.J.: Mechano- chemical control of smooth muscle cell differentiation. Atherosclerosis, 109: 343, 1994.

5. Birukov K.G., Shirinsky V.P., Stepanova O.V., Tkachuk V.A., Hahn A.W.A., Resink T.J., Smirnov V.N.: Stretch affects phenotype and proliferation of vascular smooth muscle ceils. Mol. Cell. Biochem., 144: 131139, 1995.

6. Shirinsky V.P., Birukov K.G., Stepanova O.V., Tkachuk V.A., Hahn A.W.A., Resink T.J.: Mechanical stimulation affects phenotype features of vascular smooth muscle cells. In: Atherosclerosis X (Woodford E.P.,

Davignon J., Sniderman A., eds). Elsevier Science B.V., Amsterdam, ets. pp. 822-826, 1995.

7. Степанова O.B., Бирюков К.Г., Ширинский В.П., Ткачук В.А.: Влияние периодического растяжения гладкомышечных клеток на экспрессию в них маркерных белков сократительного фенотипа. Физиологический журнал им. И.М. Сеченова, в печати.

8. Дуднакова Т.В., Степанова О.В., Чибалина М.В., Бирюков К.Г., Лапшин A.B., Ширинский В.П.: Экспрессия продуктов гена киназы легких цепей миозина в гладкомышечных клетках аорты цыпленка. Тезисы докл. Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц". Пущино, с. 84, 1996.