Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния простагландинов Е1, Е2 и их нитропроизводных на электрофизиологические и механические характеристики гладкомышечных клеток кровеносных сосудов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния простагландинов Е1, Е2 и их нитропроизводных на электрофизиологические и механические характеристики гладкомышечных клеток кровеносных сосудов"

Го ^

гЪ Л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи

ЗАХАРЕНКО Станислав Семенович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ Е}, Е2 И ИХ НИТРОПРОИЗВОДНЫХ НА ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МЕХАНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ.

03.00.13. физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в группе биофизики ионных каналов Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного

центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук

В .IL Серебряков.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

профессор АЛ. Вызов; доктор биологических наук ELB. Авдошш

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет Защита состоится

^^1996 г. в//час, fi^lam. на заседании диссертационного совета Д002.85.01 в Институте биологии развития игл. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова 26).

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке в Институте биологии развития им. ILK. Кольцова РАН.

Ж

Автореферат разослан _____ декабря 1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета " кандидат биологических наук

Е.В. Волина

Общая характеристика работы. Актуальностт, работы. Fo.ib гладкомышечных клеток (ГМК) привлекает многих исследователей в области физиологии сердечко-сосудистой системы человека и животных. Интерес к гладкомышечяым клеткам особенно возрос в последние годы, когда стало понятно, что кровеносные сосуды представляют собой сложную динамическую систему. Гладкомышечные клетки, входящие в состав кровеносных сосудов, являются тем эффектором, который регулирует тонус сосудов и, в конечном счете, ответственен за поддержание кровяного давления. Функциональная активность гладкомышечных клеток кровеносных сосудов может тонко регулироваться многими экзогенными и эндогенными факторами. Понимание процессов, лежащих в основе формирования, поддержания и регуляции физиологических ответов ■ сосудов, а также механизмов действия на mix различных биологически активных веществ необходимо для разработки и использования новых фармакологических средств, регулирующих сосудистый тонус. Одшш из классов вазоактивных эндогенных веществ являются простпгландины группы Е (простагландин Ej и простагландан Е2). Их действию на гладкие мышцы различных внутренних органов посвящено множество публикаций. Однако, несмотря на обширные экспериментальные данные, эффекты простагландинов на гладкомышечные клетки кровеносных сосудов изучены фрагментарно, и многие вопросы, связанные с механизмами их действия остаются неясными. Изучение эффектов простагландинов, используя современные электрофизкологические методы (метод одновременной регистрации мембранного потенциала, концентрации внутриклеточного кальция и механической активности кровеносных сосудов, метод локальной фиксации потенциала), дало бы возможность понять механизмы действия простагландинов группы В ка гладкую мускулатуру кровеносных сосудов.

Не менее интересной задачей является изучение эффектов китропроизводаых простагландинов на гладкомыше шые клетки кровеносных сосудов. Эти вещества, синтезированные в 1991 году в Институте биоорган; Оческой химии РАН, представляют собой химическую комбинацию эндогенных простагландинов и оксида азота,

который считается сильным вазодилататором. Применение комплексного подхода с использованием вышеперечисленных электрофизиологических методов позволит охарактеризовать этот новый класс веществ, и, возможно, анализ полученных экспериментальных данных выявит новую перспективную структуру соединений, обладающих миотропным спазмолитическим действием. ч

Пелъ работы: изучение механизмов действия простагландинов Е| и £3 на гладкомышечные клетки кровеносных сосудов различных типов, сравнение свойств нативных простагландинов группы Е и их синтетических нитропроизводных.

Основные задачи работы: ^

1. Исследовать влияние и сравнить эффекты простагландинов Е}, Е2 и их нитропроизводных на механическую активность и мембранный потенциал гладкомышечных клеток сосудов эластического типа (аорту) и микрососудов мышечного типа (ветви бедренной, брыжеечной и хвостовой артерий с внутренним диаметром не более 200 мкм).

2. Оценить вклад различных ионов в изменение электрофизиологических характеристик гладкомышечных клеток в ответ на действие простагландинов Е^, Е2 и их нитропроизводных.

3. Определить источник(и) повышения уровня свободного кальция в миоплазме гладкомышечных клеток при действии простагландинов Е}, Е2 и их нитропроизводных.

4. Оценить роль, эндотелиальных клеток в физиологическом ответе кровеносных сосудов, вызванном простагландинами Е^, Е2 и йх нитропроизводзыми.

Научная новизна работы. В данной работе впервые было исследовано влияние данных веществ на электрофизиологические свойства ГМК кровеносных сосудов, вклад различных ионов в эти изменения. В ходе работы были изучены основные механизмы действия нитропроизводных простагландинов группы Е принципиально нового класса

вазодилататоров, сочетающих в себе свойства эндогенных простагландинов и синтетических препаратоЕ-доноров КО-г^упп.

J

Нпучно-практическое значение. Получены данные о механизмах действия простагландинов группы Е ка гладкомышечные клетки кровеносных сосудоз, важные для понимания общего физиологического ответа кровеносных сосудов. Результаты, полупенные в ходе выполнения данной работы, могут представлять определенную ценность, во-первых, как характеристика нового класса вазоактивных фармакологических препаратов и, во-вторых, смогут быть использованы для целенаправленного синтеза новых препаратов, обладающих более выраженным сосудорасширяющим действием. -,

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались ка научных

семинарах ИЭК КНЦ РАМН (Москва, Россия), ИБР РАН (Москва,

Россия), Института физиологии Медицинского университета (Любек,

Германия). Основные результаты исследования были представлены на

международных конференциях "Биологическая подвижность" (Пущино,

Россия 1994); "Pharmacological control of calcium and potassium

homeostasis". (Флоренция, ^ Италия 1994); The First European Congress of

Pharmacology (Милан, Италия 1995); The First Congress of Fédération of

European Physiological Societies ' (Маастрихт, Недерланды 1995), XV

World Congress of the International Society for Ile art Bescarch (Прага,

Чехия 1995). . .

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и б тезисов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания использованных в работе материалов и методов

исследования, собственных экспериментальных данных, обсуждения

результатов, вьгзодсв и цитируемой литературы. Работа изложена на 142

. страницах машинописного текста и содержит 46 рисунков^

Материалы и методы.

Экспериментальная работа представляет результат исследований на 42 изолированных участках грудного отдела аорты крысы, хомяка и морской свинки; 45 изолированных участках ветвей 2-3 порядка (внутренний диаметр не. более 200 мкм) бедренной, хвостовой и брыжеечной артерии крысы, бедренной артерии хомяка и брыжеечной артерии человека; 35 культивированных и свежевыделенных гладкомышечных клетках из аорты крысы.

В работе использовались простагландины Ej (ITTEj), Е2 (ПГЕ2) (Sigma) и их нитропроизводные - простанит (ПРН; 1,3-дапштроглицериновый эфир ПГЕ^), и ~ нитропростон (НПР; 1,3-динитроглицериновый эфир ПГЕ2), любезно предоставленные Институтом биоорганической химии РАН.

Методы. Для измерения механической активности и

j

электрофизиологических характеристик кровеносных сосудов были использованы метод одновременной регистрации механического ответа и • мембранного потенциала (микроэлектродная техника), метод одновременной регистрации диаметра сосудов и концентрации внутриклеточного свободного кальция. Измерение "внутриклеточной концентрации ионов кальция проводилось с помощью кальцш!-" чувствительных флуоресцентных зондов indo-l и fura-2. Для измерения интегральных токоз и токов через одиночные ионные каналы был использован метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp метод). Эксперименты с изолированными сосудами проводились . при температурю 37°С и скорости перфузии 5 мл/мин. Эксперименты с

применением метода локальной фигпации потенциала проводились при комнатной темпер уре.

Результаты исследований и гас обсуждение.

1. Эффекты простагландипов Е| и Ез на механическую активность, концентрацию внутриклеточного свободного кальция и мембранный потенциал гладкомышечзых клеток кровеносных ■ сосудов различных типов.

Простагландлны Е| и Ез расслабляли стенку аорты в пределах концентраций 5*10"® М + 10"^ М. Во время подачи ПГЕ^ в субмаксимальной концентрации (100 нМ) напряжение стенки снижалось

Рис. 1. 'Усредненные кривые влияния простагландина Е] в концентрации 100 нЛГ на мембранный '-потенциал (нижняя кривая) и механическую активность (верхняя кривая) ГМК аорты крысы г - нормальном физиологическом растворе.

Количество экспериментов - 10. Результаты представлены как среднее ± 81).

Эффект ПГЕ^ развивался сразу после подачи агониста в перфузионную камеру и достигал максимума к концу Ч минуты. После отмывки ПТЕ} напряжение стенки аорты возвращалось к исходному уровню в течение 1-2 минут.

на 20.5±2.8 мН (п=10) (рис. 1).

» -15

Г*)

ж Об

í

X

2-е Р

О

ъ*

X

ПЩ

'У

о а «о « аи 23) зю

Л,

0 ' 'ч»

При подаче ПГЕ2 в рабочую камеру происходило снижение напряжения стенки сосуда на 14.1+1.1 мН (п=10). После отмывки ПГЕ2 напряжение стенки возвращалась к исходному уровню, и в 75 % экспериментов наблюдалась фаза сокращения, составляющая 3.7±0.9 мН (п=10) (рис. 2). ЧА

я

" ülf ■ Рис. 2. Усредненные кривые влияния

простагландина Е2 в концентрации 100 нМ на' мембранный потенциал (нижняя кривая) и механическую активность (верхняя кривая) ГМК аорты крысы в нормальном физиологическом растворе. Количество экспериментов - 10. Результаты представлены как среднее ± SD.

Оба эффекта, как сокращение, так и расслабление стенок аорты происходили "быстро - напряжение "стенки возвращалось ' к' базовому уровню в течение 1-2 минут. Пороговая концентрация, при которой наблюдался эффект снижения напряжения стенки аорты при действии ПГЕ^ и ПГЕ2, составляла 5-10 нМ.

Простагландины Е^, Е2 вызывали деполяризацию мембраны ГМК аорты. Потенциал покоя ГМК составлял -46+3.2 мВ (п=24). ПГЕг' (100 нМ) вызывал более выраженную. деполяризацию мембраны ГМК (-36.8±0.8 мВ, п=10), таи ПГЕ: (100 нМ)' (-38.4±0.9 мВ, п=10). Восстановление величины мембранного потенциала до исходного уровня . после отмывки агониста было более задержано во времени в случае ПГЕ2 (2.5-3 мин, п=10), чем при действии UTEj (1.5-2 мин, п=10) (рис. 1, 2). ••

В отличие от действия на изолированную аорту простагландины группы Е оказывали только сократительное действие на изолированные участки мелких (до 200 .и) ветвей артерий мышечного типа . (бедренной артерии хомяка; хвостовой, бедренной и брыжеечной артерии крысы). Влияние простагландинов на кровеносные сосуды обоих типов не зависело от наличия эндотелиальных клеток. Не наблюдалось изменений в эффектах и их амплитуде при наличие. в перфузионной камере блокатора N0-синтетазы К^-шггро-Ь-аргинина (10 цМ) и блокатора циклооксигеназы индометацина (10 цМ).

пге,

140

1 190

е 12«

I 110

1 0.90

I я Р.85

| ».ВО

г 0.75

100 300 30» 400, &00

пге->

120

Рис. 3. Кривые изменения диаметра (верхняя кривая) ветви бедренной артерии крысы и концентрации внутриклеточного свободного

кальция (нижняя кривая) в ответ на действие простагландина Е] и Ег (100 нМ).

Простагландины Ех и Е2 уменьшали диаметр просвета

артерий мышечного типа, повышая уровень внутриклеточного кальция в \ * 0

миоплазме ГМК этих сосудов (рис. 3).

9 >00

I

5 0.10

4

" 1

-

• 10« ж т м нс

-

Действие ПГЕ}, ПГЕ2 на внутриклеточную концентрацию свободного кальция ([Са^+^д) в артериях мышечного типа показано на рисунке 3.

Простагландины Е^ и Е2 повышали [Са2+];п в ГМК аорты,

\

¿ыращенлых в культуре, как в нормальном физиологическом растворе, так я в растворе, не содержащем ионов кальция. При проведении аналогичных экспериментов на изолированных участках аорты были получены сходные результаты.

Рис. 4. Повышение концентрации свободного кальция в миоплазме ГМК изолированных участков аорты крысы при действии простагландина в

концентрации 100 нМ. А. В нормальном физиологическом растворе '

(концентрация ионов калъцгия 2.25 мМ). Б. В бескальциевом „растворе. N=10. Данные представлены как среднее ± ЗО.

Прост агландины Е[ и Е2 повышали уровень свободного кальция в цитоплазме ГМК как в нормальном физиологическом растворе, так и во внешнем растворе, не содержащем ионов кальция (рис. 4). Зависимость величины повышения уровня '• свободного кальция в ГМК аорты от концентрации простагландина Е^ в нормальном физиологическом и а бескальциевом растворах показана на рисунке. 5.

■И"«.

Рис. 5. Зависимость концентрации внутриклеточного кальция г ГМК аорты крысы от концентрации . простагландина Е} в нормальное физиологическом (квадраты) и бескальциевом (треугольники)

растворах. N=10, р<0.01.

Таким образом,

1) Простагландины группы Е обладают сосудорасширяющим эффектом на аорту и сосудосуживающим эффектом на артерии мышечного типа.

2) Простагландины группы Е увеличивают концентрацию внутриклеточного свободного кальция и вызывают деполяризацию мембраны ГМК кровэносных сосудов.

2. Исследование механизмов простагландин—зависимого повышения уровня внутриклеточного свободного кальция в сосудистых ГМК.

Как видно из рисунка а, амплитуда повышения уровня ионизированного кальция в - цитоплазме ГМК в ответ на действие простагландина Е^ значительно выше в нормальных физиолопгческих условиях, то есть, когда во внешнем растворе присутствуют ноны чем в условиях бея:.- льциезого Енешнего растворя. Этот факт свидетельствует о том, что за повьшзснке уровая свободного кальцин в ГМГС при действии ЛГУ. частично ответственен тот к?, ьций, который поступает извне. Одъг.ко этот источник кальция н° >т--,лг'лея основным в ответе ГМК," так как при отсутствии кальция -о внешнем растворе

повышение внутриклеточного кальция • в ответ на действие ПГЕ сохранялось, и амплитуда этого сигнала, составляла примерно 75 % от сигнала в нормальном физиологическом растворе. Это говорит о том, что основную роль в повышении концентрации внутриклеточного свободного кальция при действии ПГЕ играют внутриклеточные" депо кальция. Для выяснения источника или источников высвобождения ионов кальция из внутриклеточных депо нами были выдвинуты следующие гипотезы Одним из кандидатов на хранение кальция, высвобождающегося в ответ на действие ПГЕ, мог бы служить кофеин-чувстзительный пул кальция. Для проверки этой гипотезы нами были поставлены следующие эксперименты. В бескальциевом растворе \ на полоску аорты воздействовали ПГЕ^ в субмаксиыальной ..концентрации 100 нМ. После этого раствор в рабочей камере заменяли на нормальный физиологический и оставляли сосуд в течение 20-30 минут. После того, как внутриклеточные депо кальция заполнялись вновь, подавали в рабочую камеру кофеин в субмаксимальной концентрации (10 мМ) и на фоне действия кофеина снова добавляли ПГЕ^ в концентрации 100 нМ. Как видно из рисунка 6, сигналы в ответ на действие простагландина Е} до подачи кофеина и после его подачи существенно не отличались.

При опустошении кофеин-чувствительных депо кальция

\ ■ ^ -

рианодином (1 цМ) ответ на действие ПТЕ^ сохранялся, в то время, как кофеин был неэффективен (рис 7). ' . •

ПГЕ1 Рис. 6. Экспериментальная кривая,

■ вфсмм

демонстрирующая действие

простпагландина (100 нМ) на

внутриклеточную концентрацию

свободного кальция в ГМК аорты крысы на фоне действия кофеина (10 мМ) в бескальциевом растворе.

Эти результаты дали основание предполагать, что какие-то другие источники кроме кофеин-чувствительного ответственны за повышение уровня внутриклеточного кальция в ответ на действие ПГЕ]^.

Рис. 7. 1 Экспериментальная кривая., иллюстрирующая увеличение

простагландином Е] (100 нМ) уровкл свободного кальция в мионлазме ГМК аорты крысы на фоне действия кофеина (10 мМ) . и рианодина (1 ¡лМ) в бескальциевом растворе.

Другой гипотезой, нуждающейся в проверке, являлась гипотеза о высвобождении ионов кальция под влиянием простагландинов Е} и Е2 из , депо, чувствительного к .повышенному уровню инозитол-1,4,5-трифоефата (Ин-1,4,5-Фз). Для проверки этого предположения внутриклеточное депо кальция, чувствительное к. Ин-1,4,5-Фз, было опустошено норадреналином (1 цМ), и на этом фоне в рабочую камеру добавляли ПГЕ1 (рис 8).

А]

_ ПГЕ,

-V

ч

р

кофеш«

—ПГЕ' Рис. .8. Экспериментальная кривая,

I иллюстрирующая эффект простагландина

!,j Ej (100 нМ) на концентрацию

__внутриклеточного свободного кальция в

1 ■■■

-" ГМК аорты крысы на фоне действия

норадреналина (1 рМ) в бескальциевом растворе.

ПГЕ^ увеличивал концентрацию ионизированного кальция в миоплазме ГМК аорты на фоне действия норадреналина, но амплитуда этого увеличения была снижена по сравнению с первоначальным эффектом ÜTEi-

Соотношение амплитуд повышения концентрации свободного кальция в ГМК аорты крысы, вызванного простагландияом Ei в бескальциевом растворе' и в присутствии норадреналина (при опустошении Ин-1,4,5-Фз-зависимых кальциевых депо) показано на рисунке 9.

•-----Рис. 9. Диаграмма, иллюстрирующая

:i гп . . .. ,

I J|g|s|: соотношение амплитуд повышения ; концентрации внутриклеточного свооооного

кальция в ГМК аорты крысы при действии простагландина Ei (100 нМ) в бескальциевом растворе (1), после опустошения Ин-1,4,5-Фз-зависи..1ых кальциевых депо (2) и е нормальном физ-аологическом растворе (3). N—7, 'р<0.С5.

При использовании повышенных концентрации EG-TA (10 мМ) во кйшнем растворе амплитуды Еиьышения уровня ehj фи"легочного

кальция при действии HFEj на ГМК аорты не изменялись. Сходные результаты были получены и для ПГЕз-

Из полученных данных следует, что основным источником повышения концентрации внутриклеточного кальция в ГМК при действии ПГЕ^ и ПГЕ2 является внутриклеточные депо кальция. Эти депо не связаны с кофеин-чувствительными источниками кальция. Часть внутриклеточного кальция при действии ПГЕ^ и ПГЕ2 на ГМК высвобождается из ' источников, чувствительных к норадреналину, предположительно Ин-1,4,5-Фз-зависимых. Остальная часть внутриклеточного кальция может выходить из митохондриального или околоядерного депо ионов кальция.

3. Ионные токи, регулируемые простагландипами Ej и Е2 в сосудистых ГМК.

Для исследования интегральных токов через мембрану одиночных гладкомышечных клеток мы использовали конфигурацию whole-cell метода локальной фиксации потенциала. В этих условиях потенциал покоя клеток составлял -32±13 мВ (п=34). Экспериментальные кривые, иллюстрирующие ответ отдельной гладкомышечной клетки при добавлении к ней ПГЕ1, показаны на рисунке 10А. При подаче ПГЕ^ в

концентрации 100 нМ клетка отвечала увеличением как выходящего, так

11' / и активацией входящего ионных токов. Вольт-ампернал характеристика

интегральных токов через мембрану ГМК в нормальном

физиологическом растворе в отсутствии и в присутствии ПГЕ^ показана

на рисунке 10 В. График контроля представлял собой прямую,ло в'

присутствии ПГЕ^ при мембранк.-.: потенциалах более 35 мВ

шшш

1)Д

ПГЕ1 (100 нМ)

лшшш

_|0л еа

10 сек

происходило увеличение выходящих токов. Активация входящих токов происходила при негативных потенциалах на мембране клетки. Те же результаты были получены для ПГЕ2 (данные не показаны). ,

Рис. 10. А. Экспериментальная кривая, демонстрирующая увеличение

выходящих и активацию входящих ионных токов через мембрану ГМК аорты крысы при действии ПГЕ] е концентрации 100 нМ.

Поддерживающий потенциал -70 мВ; деполяризующие сигналы от -70 мВ до 140 мВ; длительность - 1 сек.; интервал - 2 сек. Б. Вольт-амперная характеристика токов через мембрану ГМК аорты крысы (та же клетка, что и на рис. А) в контроле и в присутствии ПГЕ2 в концентрации 100,. нМ.

Б и ' .А

и

0.1 ПГЕ1

и

и

и у' ЕОЯТраКЬ

-и ■ ---Ь---— п -в

•12 .

Выходящий ионный ток через мембрану ГМК, вызываемый простагландинами группы Е, снижался или исчезал в присутствии в рабочей камере. ьеспецифического блокатора-калиевой проводимости тетраэтиламмония в концентрация 1 мМ. Те же результаты были получены при использовании стандартных методик для блокирования калиевой проводимости, то есть при наличии во внешнем растворе ионов бария (20 мМ) или при использовании пиаеточных растворов, содержащих ионы цезия. Эти результаты вместе с данными литературы [Bregestovski РЛЭ., 1988] предполагают, что увеличение

амплитуды выходящего тока через мембрану сосудистых ГМК при действии простагландинов происходит, главным образом, за счет активации кальций-актизируемых калиевых каналов.

Для оценки вклада внеклеточных катионов в деполяризацию мембраны ГМК аорты, вызванную простагландинами, в экспериментах были использованы бескальциевый и безнатриевый внешние растворы. В - бескальциевсм растворе как ИГЕ}, так и ПГЕ2 вызывали деполяризацию такой же величины, что и в нормальном физиологическом растворе. Аналогичный результат был получен в растворе, не содержащем ионов натрия (безнатриевом растворе). Такой раствор был приготовлен с помощью эквимолярной замены ионов натрия на М-метил-Б-глюкозамин (НМЮС). В этих условиях деполяризация, вызванная простагландинами Е^ и Е2 не отличалась от изменений мембранного потенциала,

вызванного этими агонистами в нормальных условиях. Исходя из того,

г> -

что в отсутствии ионов кальция или натрия деполяризация, вызванная простагландинами, существенно не менялась, можно сделать два предположения: 1) ионы кальция и натрия не участвуют в ПГЕ-зависимых изменениях мембранного потенциала; 2) в отсутствии ионов

А

натрия во внешнем растворе их функцию в данной деполяризации выполняют ионы кальция, и наоборот, в - отсутствии ионов кальция в деполяризации участвуют ионы натрия. Чтобы выяснить правомочность того или иного предположения, нами были проведены эксперименты по измерению мембранного потенциала ГМК аорты в растворе, не содержащем ни ионов кальция, ни натрия. Для этого безнатриевый раствор готовили без СаС]2, и в него добавляли 1 мМ ЕйТА.

В отсутствии ионов кальция и натрия во" внешнем растворе деполяризация в ответ на действие простагландинов сохранялась, но амплитуда деполяризации была значительно меньше, чем в случае нормального физиологического раствора (рис. 11).

Данные результаты предполагают, что ионы натрия и кальция участвуют в" деполяризации клеточной мембраны ГМК при действии ПГЕ. В присутствии в нормальном физиологическом растворе блокатора хлорной проводимости, niflurnic ' acid, в концентрации 100 цМ простагландины вызывали слабую деполяризацию (2.1±0.4 мВ, п=8) мембраны ГМК В отсутствии в наружном растворе ионов кальция и натрия niflurnic acid полностью блокировала деполяризацию мембраны ГМК, вызванную действием ПГЕ} (рис. 11). Похожие результаты были получены и для ПГЕз- Таким образом, за деполяризацию мембраны ГМК, вызванную простагландинами группы Е, ответственны кроме ионов ••-кальция и натрия еще и ионы хлора," причем иойы кальЦия и натрия' проникают в ГМК, скорее всего, через одни и те же каналы. Этими каналами, проницаемыми для кальция и натрия, согласно литературе, предположительно могут быть неселективные катионные каналы. Эти каналы наряду с внутриклеточными кальциевыми депо могут принимать участие в повышении концентрации внутриклеточного кальция в ГМК при действии простагландинов группы Е.

•а

4. Эффекты яитропроизводпых простаглаядинов группы Е на ГМК кровеносных сосудов. Простанит и нитропростон также как и простагландины Е^ и Е2 вызывали деполяризацию мембраны и увеличивали концентрацию

Кривые,

Э-

tü 405

5 30

Л О

а 2D

ее ч

§ ЮН

о)

ч 0-

в нрлгисмфи! растворе в растр» нгсттттишрдСУ, • +riflumcadd К +rifimicaad

-10

~i-1-i-1-г-

9" 8 ' 7 6 5 кнврояШ^ ("МСЬГЕ,)

Рис. П. иллюстрирующие зависимость величины

деполяризации мембраны ГМК аорты крысы от концентрации простагландина JJj.

Деполяризация, вызванная 80 мМ KCl принята за 100 %. Niflumic and.

использовалась в

концентрации 100 иМ. N=6, *р<0.05, **р<0.01

против нормального физиологического раствора.

свободного кальция в миоплазме ГМК сосудов. Простанит и нитропростон активировали входящие и увеличивали амплитуду выходящих ионных токов в ГМК аорты крысы. Различия в эффектах питропроизводных и нативяых простагландивов наблюдались при их действии на механическую активность кровеносных сосудов. Простанит вызывал сокращение артерий мышечного типа, величина данного сокращения составляла 58.6±11.2 % (п=10) сокращения, вызванного ПТЕ^.

Нитропростон во время подачи в рабочую камеру не оказывал никакого действия на артерии мышечного типа. При действии нитропроизводных простагландинов группы Е на аорту крысы происходило расслабление стенки сосуда, причем этот эффект был намного длительнее, чем в случае действия ПГЕ^ и ПГЕ2 (5.3+0.3 минуты для простанита и 2.1±0.4 минуты для нитрспростона против 1.310.3 минуты для ПТЕ} и 0.5±0.2 минуты для ПГЕ2. п=10, р<0.05). Величина расслабления стенки аорты при действии простанита и нитропростона уменьшалось в присутствии метиленового синего (100 цМ).

При исследовании влияния простагландинов группы Е и их нитропроизводных на одиночные кальций-активируемые калиевые каналы был использован изолированный участок клеточной мембраны. В этих условиях ПГЕ^ и ПГЕ-2 были неэффективны, в то время,} как проставит и нитропростон вызывали активацию каналов за счет ' уменьшения времени" нахождейия канала'в 'закрытом состоянии.

Эффекты простагландинов Е}, Е2 и их нитропроизводных, описанные в этой работе, не зависели от наличия эндотелия или присутствия в рабочей камере индометацина и Н^-нитро-Ь-артанина.

Выводы.

'1. Простагландины Е^ и Е2 расслабляют стенки артерий эластического типа (аорту) и сокращают стенки артерий мышечного типа. 2. Простагландины Е^, Е2, и их нитропроизводные, нростанит и нитропростон, повышают концентрацию свободного кальция в миоплазме гладкомышечных клеток кровеносных сосудов- Увеличение уровня кальция происходит благодаря поступлению ионов кальция из трех

источников: 1) внеклеточного пространства; 2) чувствительных к инозитол-1,4,5-трифосфату внутриклеточных депо; 3) третьего, неидентифицированного, внутриклеточного источника.

3. Простагландины Ej, Е2, простанит и шггропростон вызывают деполяризацию клеточной мембраны гладкомышечных клеток кровеносных сосудов предположительно за счет активации неселективных катионных и хлорных каналов. Увеличение амплитуды выходящих токов, вызываемое данными веществами, ' происходит благодаря активации кальций-активируемых калиевых каналов.

4. Нитропроизводные простагландинов, простанит и нитропростон, оказывают более длительное, чем сами простагландины, расслабляющее действие на стенки артерий эластического типа (аорту). Действие простакита и нитропростона на гладкомышечные клетки аорты частично опосредовано активацией этими веществами гуанилатциклазы. Одним из возможных механизмов, ответственных за пролонгацию расслабляющего эффекта нитропроизводных простагландинов группы Е, является прямая активация ими кальций-активируемых калиевых каналов.

5. Все эффекты простагландинов и их нитропроизводных на кровеносные сосуды не зависят от наличия. или функционального состояния эндотелиальных клеток.

1 Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. V. Serebryakov, Я Zakharenko, V. Snetkov, К. Takeda. Effects of prostaglandins E^ and E2 on cultured smooth muscle cells and strips of rat

4 aorta. Prostaglandins, V. 47, 353-365, 1994.

2. S. Zakharenko, V. Serebryakov. Effects of prostaglandins E and their nitro-derivatives on cultured smooth muscle, cells from rat aorta. Abstracts

of the International Symposium "Biological Motility", September 25-October 1, 1994. Pushchino, Russia.

3. V. Serebryakov, R. Schubert, S. Zakharenko, H.-II Hopp. Prostaglandin activation of Ca--+-dependent K+ channels can be accompanied by a dilation as well as constriction of rat blood vessels. Abstracts of the 6th, International Symposium "Pharmacological" control of calcium and

potassium homeostasis". October 4-6, 1994. Florence, Italy.

■

4. S. Zakharenko, U. PohL Intracellular calcium stores mobilized by prostaglandin Ej in vascular smooth muscle. Abstracts of the First European Congress of Pharmacology, June 16-19, 1995. Milan, Italy.

5. S. Zakharenko, St S. Bolz, R. Schubert, U. Pohl, V. Bezuglov, L Serkov, V. Serebryakov. Effccts of E-series prostaglandins and their novel nitro-derivatives on smooth muscle of small arteries. Abstracts of the First European Congress of Pharmacology, June 16-19, 1995. Milan, Italy.

6. V. Serebryakov, S.' Zakharenko. Prostaglandin Ej and prosta'nit dilate rat aorta with different mechanisms. J. MoL and CelL Cardiol., V. 27(6), A100, 1995.

7. S. Zakharenko, V. Serebryakov.. Ionic currents activated by prostaglandins E in smooth muscle. Pflugers Archiv 430(4), R141, 1S95.

8. С. Захаренко, В. Серебряков. Действие простаглаядинов группы Е на мембранный потенциал, концентрацию внутриклеточного кальция и механический ответ гладкомышечных клеток аорты крысы. Биологические мембраны, Т. 13(3), С. , 1996.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захаренко, Станислав Семенович, Москва

л

у

_/ Л , Л t е.

„Л > х -

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМЕНИ Н.К. КОЛЬЦОВА

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

На правах рукописи

А.

с

ЗАХАРЕНКО СТАНИСЛАВ СЕМЕНОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ Еь Е2 И ИХ НИТРОПРОИЗВОДНЫХ НА ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МЕХАНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность: 03.00.13 - физиология человека и животных

Научный руководитель: ведущий научный

сотрудник к.м.н.

Серебряков В.Н.

Москва 1995

ОГЛАВЛЕНИЕ

7 ВВЕДЕНИЕ

11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

11 1.1. Функциональные характеристики гладкомышечных

клеток

11 1.1.1. Введение

12 1.1.2. Строение гладкомышечных клеток

13 1.1.3. Электрофизиологические характеристики гладкомышечных клеток

14 1.1.3.1. Потенциал покоя

18 1.1.3.2. Выходящие ионные токи

20 1.1.3.3. Входящие ионные токи

22 1.1.4. Механические характеристики гладкомышечных

клеток

22 1.1.4.1. Краткое описание механизмов сокращения-

расслабления гладкомышечных клеток

24 1.1.4.2. Сопряжение процессов возбуждения и сокращения в гладких мышцах сосудов

25 1.1.4.3. Роль ионов кальция в активации сокращения 30 1.1.4.4. Влияние циклических нуклеотидов на процессы

сокращения-расслабления гладких мышц сосудов

32 1.1.5. Заключение

33 1.2. Простагландины Е^, Е2 и их рецепторы

33 1.2.1. Краткая характеристика простагландинов серии Е

35 1.2.2. Рецепторы простагландинов серии Е

1.3. Нитросоединения и их влияние на гладкомышечные клетки

37 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

37 2.1. Метод одновременной регистрации механического ответа и мембранного потенциала гладкомышечных клеток кровеносных сосудов

38 2.1.1. Сущность метода

40 2.1.2. Объект

41 2.1.3. Экспериментальная установка

41 2.1.4. Метод регистрации механического ответа сосудов

41 2.1.4.1. Приготовление сосудистого препарата

43 2.1.4.2. Процедура нормализации

44 2.1.4.3. Экспериментальные условия

44 2.1.5. Метод регистрации мембранного потенциала

44 2.1.5.1. Изготовление пипеток

45 2.1.5.2. Измерение кончикового потенциала

45 2.1.5.3. Критерии для регистрации мембранного потенциала

45 2.1.5.4. Методика измерения мембранного потенциала

46 2.2. Метод измерения концентрации внутриклеточного свободного кальция

48 2.2.1. Сущность метода

49 2.2.2. Объект

50 2.2.3. Экспериментальная установка

51 2.3. Метод одновременной регистрации диаметра сосудов и

концентрации внутриклеточного свободного кальция

51 2.3.1. Сущность метода

52 2.3.2. Объект

52 2.3.3. Приготовление сосудистого препарата

53 2.3.4. Экспериментальная установка

54 2.3.5. Экспериментальные условия

54 2.4. Метод локальной фиксации потенциала ("patch-clamp" метод)

55 2.4.1. Сущность метода

56 2.4.2. Основные конфигурации

58 2.4.3. Объект

59 2.4.4. Проведение экспериментов

60 2.5. Материалы

60 2.5.1. Рабочие растворы

60 2.5.2. Используемые вещества

63 ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

64 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

64 3.1. Влияние простагландинов Ej_, Е2 и их

нитропроизводных на механическую активность, концентрацию внутриклеточного свободного кальция и мембранный потенциал гладкомышечных клеток кровеносных сосудов

64 3.1.1. Эффекты простагландинов группы Е на механическую активность различных кровеносных сосудов

65 3.1.1.1. Простагландин Е^ - дилататор артерий эластического типа

67 3.1.1.2. Простагландин Е2 оказывает двухфазное действие на

артерии эластического типа 69 3.1.1.3. Простагландины группы Е - констрикторы артерий

мышечного типа

74 3.1.2. Сравнение эффектов простагландинов группы Е и их

нитропроизводных на механическую активность кровеносных сосудов 74 3.1.2.1. Простанит и нитропростон - пролонгированные

вазодилататоры артерий эластического типа 83 3.1.2.2. Действие простанита и нитропростона на артерии

мышечного типа 86 3.1.3. Влияние простагландинов Ej, Е2 и их

нитропроизводных на концентрацию внутриклеточного свободного кальция 96 3.1.4. Эффекты простагландинов Е;[, Е2 и их

нитропроизводных на мембранный потенциал гладкомышечных клеток

104 3.2. Влияние простагландинов Е^, Е2 и их

нитропроизводных на проницаемость мембраны гладкомышечных клеток 104 3.2.1. Характеристики интегральных простагландин -

активируемых ионных токов 108 3.2.1.1. Выходящий ток (гиперполяризующий тип ответа)

108 3.2.1.2. Входящий ток (деполяризующий тип ответа)

109 3.2.2. Действие простагландинов и их нитропроизводных на одиночные Са2+ -зависимые К+ каналы

110 3.3. Роль простагландинов группы Е в процессе сопряжения

процессов возбуждения и сокращения в сосудистых ГМК 115 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

130 ВЫВОДЫ

131 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

132 ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Роль гладкомышечных клеток привлекает многих исследователей в области физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы человека и животных. Интерес к гладкомышечным клеткам особенно возрос в последние годы, когда стало понятно, что кровеносные сосуды представляют собой сложную динамическую систему. Гладкомышечные клетки, входящие в состав кровеносных сосудов, являются тем эффектором, который регулирует тонус сосудов и, в конечном счете, ответственен за поддержание кровяного давления.

Функциональная активность гладкомышечных клеток кровеносных сосудов может тонко регулироваться многими экзогенными и эндогенными факторами. Понимание процессов, лежащих в основе формирования, поддержания и регуляции физиологических ответов сосудов, а также механизмов действия на них различных биологически активных веществ необходимо для разработки и использования новых фармакологических препаратов, регулирующих сосудистый тонус. Одним из классов вазоактивных эндогенных веществ являются простагландины группы Е (простагландин Е^ и простагландин Е2). Их действие на гладкие мышцы кровеносных сосудов привлекает пристальное внимание исследователей. Однако несмотря на обширные экспериментальные данные, эффекты простагландинов на гладкомышечные клетки изучены фрагментарно, и многие вопросы, связанные с механизмами их действия остаются неясными. Изучение эффектов простагландинов, используя различные

электрофизиологические методы (метод одновременной регистрации мембранного потенциала, концентрации внутриклеточного кальция и механической активности кровеносных сосудов, метод локальной

фиксации потенциала), дало бы возможность понять механизмы действия простагландинов группы Е на гладкую мускулатуру.

Не менее интересной задачей является изучение эффектов нитропроизводных простагландинов на гладкомышечные клетки кровеносных сосудов. Эти вещества, синтезированные в 1991 году в Институте биоорганической химии РАН, представляют собой комбинацию эндогенных простагландинов и оксида азота, который считается сильным вазодилататором. Применение комплексного подхода с использованием вышеперечисленных электрофизиологических методов позволит охарактеризовать этот новый класс веществ, и, возможно, анализ полученных экспериментальных данных выявит новую перспективную структуру соединений, обладающих миотропным спазмолитическим действием.

Пель работы: изучение механизмов действия простагландинов Е^ и Е2 на физиологический ответ кровеносных сосудов различных типов, сравнение свойств нативных простагландинов группы Е и их синтетических нитропроизводных.

Основные задачи работы:

1. Исследовать влияние и сравнить эффекты простагландинов Е^, Е2 и их нитропроизводных на механическую активность и мембранный потенциал гладкомышечных клеток крупных сосудов эластического типа (аорту) и микрососудов мышечного типа.

2. Оценить вклад различных ионов в изменение электрофизиологических свойств гладкомышечных клеток в ответ на действие простагландинов Е]_, Е2 и их нитропроизводных.

3. Определить источник(и) повышения уровня свободного кальция в миоплазме гладкомышечных клеток при действии простагландинов Е]_, Е2 и их нитропроизводных.

4. Оценить роль эндотелиального слоя клеток в физиологическом ответе кровеносных сосудов при действии на них простагландинов Е^, Е2 и их нитропроизводных.

Научная новизна. Было показано, что простагландины Е^, Е2 и их нитропроизводные обладают противоположными физиологическими эффектами на различные кровеносные сосуды. В данной работе впервые было изучено влияние данных веществ на электрофизиологические свойства ГМК сосудов, вклад различных ионов в эти изменения. В ходе работы были изучены основные механизмы действия нитропроизводных простагландинов группы Е - принципиально нового класса вазодилататоров, сочетающих в себе свойства эндогенных простагландинов и синтетических препаратов-доноров ГГО-группы.

Практическая ценность работы. Получены данные о механизмах действия простагландинов группы Е на сосудистые гладкомышечные клетки, необходимые для понимания общего физиологического ответа кровеносных сосудов. Результаты,

полученные в ходе выполнения данной работы, могут представлять определенную ценность, во-первых, как характеристика нового класса вазоактивных фармакологических препаратов и, во-вторых, смогут быть использованы для целенаправленного синтеза новых препаратов, обладающих более выраженным вазодилатирующим действием.

Публикация результатов работы: По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПГЕ^ - простагландин Е^ ПГЕ2 - простагландин Е2 ПГЕ - простагландины группы Е ПРН - простанит НПР - нитропростон ДНГ - динитроглицерин ГМК - гладкомышечные клетки цАМФ - циклический аденозина монофосфат цГМФ - циклический гуанозина монофосфат [Са2+]т - внутриклеточная концентрация свободного кальция Ем - мембранный потенциал СПР - саркоплазматический ретикулум МХ - митохондрии

МЬСК - киназа легких цепей миозина

Ф-МЬСК - фосфорилированная киназа легких цепей миозина |лм - 10"® метра М - моль/литр

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ

КЛЕТОК.

1.1.1. ВВЕДЕНИЕ

Гладкомышечные клетки (ГМК) входят в состав всех типов кровеносных сосудов человека и животных. Кровеносные сосуды выполняют несколько функций, из них две являются основными: обеспечение кровью все органы и ткани организма и регуляция кровяного давления. Кровеносные сосуды по выполняемым ими функциям можно подразделить на несколько групп. Одна из этих групп, так называемые амортизирующие сосуды, представляет собой артерии различных типов:

- сосуды эластического типа. К ним относятся артерии крупного диаметра (например, аорта, легочная артерия и прилегающие к ним участки больших артерий);

- сосуды эласто-мышечного типа. К этому типу сосудов относятся артерии с небольшим диаметром (ветви 1-2 порядка крупных артерий);

- сосуды мышечного типа. Это, в основном, мелкие артерии и артериолы.

Стенки всех кровеносных сосудов, независимо от типа, состоят из трех оболочек: интимальной (или внутренней), медиальной и адвентициальной (или наружной). У основной массы артерий медиальная оболочка - самый толстый слой стенки. В ее состав входят, в основном, гладкомышечные клетки, расположенные обычно по спирали или по

кольцу, а также различные межклеточные структуры. Долгое время считалось, что основная функция ГМК медиального слоя сосудов -служить каркасом сосуда и сглаживать пульсовые волны, однако с развитием таких методов исследования, как электронная микроскопия, ауторадиография и других стало очевидно, что ГМК сосудов являются эффекторами действия разнообразных экзогенных и эндогенных стимулов и несут на своей поверхности рецепторы к различным веществам, что дало основание предполагать, что ГМК медиального слоя именно тот инструмент, с помощью которого кровеносные сосуды изменяют свой тонус в ответ на действие того или иного агониста. Следовательно, на организменном уровне ГМК сосудов отвечают за поддержание кровяного давления. Поэтому неудивителен тот факт, что изучению функциональных свойств ГМК кровеносных сосудов посвящено огромное количество исследований.

Однако полной ясности в механизмах функционирования сосудистых ГМК нет. До настоящего времени не дано однозначного ответа о взаимосвязи между механическим ответом сосудов и электрофизиологическими характеристиками гладкомышечных клеток. В частности, мало исследованы процессы, происходящие на уровне плазматической мембраны ГМК.

В данном разделе мы постараемся кратко обрисовать известные к настоящему моменту данные о сосудистых ГМК, дать их электрофизиологические и механические характеристики.

1.1.2. СТРОЕНИЕ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК.

Основной структурной единицей сосудистых гладких мышц является гладкомышечная клетка, имеющая удлиненную

веретенообразную форму. Размеры ГМК зависят от вида и функционального состояния гладкой мышцы. В артериолах длина гладкомышечной клетки около 20 мкм, в артерии мышечного типа - 100200 мкм. Толщина ГМК варьирует в больших пределах - от 5-10 мкм до 20 мкм. Соотношение площади поверхности гладкомышечной клетки кровеносных сосудов (без учета площади впячиваний мембраны) и объема составляет 1:5, а в более мелких ГМК может достигать 2:7. Гладкомьппечная клетка покрыта плазматической мембраной, которая не отличается от таковой других клеток. Основными внутриклеточными элементами ГМК являются ядро, саркоплазматический ретикулум, митохондрии, микротрубочки, лизосомы и сократительные белки. ГМК располагаются параллельно и последовательно, образуя мышечные пучки и мышечные слои. Большая часть поверхности одной мышечной клетки отделена от соседних мышечных клеток пространством в 100 нм и более (межклеточное пространство), которое заполнено коллагеновыми и эластиновыми волокнами, фибробластами, капиллярами и др.

1.1.3. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК.

Начало исследований электрических свойств сосудистых гладких мышц приходится на 70-е годы. К этому времени по данной проблеме на других ГМК уже были получены основные результаты, а иммено: 1) изолированная полоска гладкомышечного органа в электрическом отношении не отличается от нервного или поперечнополосатого мышечного волокон. 2) она обладает кабельными свойствами, в основе которого лежит электрическая связь между ГМК (электрический синцитий) [Шуба М.Ф., 1988]. Мембрана ГМК обладает

задержанным выпрямлением, деполяризующий ток активирует, гиперполяризующий ток угнетает генерацию потенциалов действия и т.д. [Воронцов Д.С., Шуба М.Ф.,1966]. Таким образом, в структурном отношении гладкомышечная ткань представляет собой образование, состоящее из множества отдельных мышечных клеток, в функциональном - это электрический синцитий. Наличие электрической связи между ГМК лежит в основе передачи возбуждения с одной клетки на другую с помощью кольцевых токов потенциала действия [Шуба М.Ф.,1961].

1.1.3.1. Потенциал покоя.

Сложное строение мышечного слоя сосудистой стенки и многокомпонентность состава межклеточного материала затрудняет точное количественное определение ионного состава вне- и внутриклеточного пространства. Однако применение различных методов - плазменной фотометрии, изотопного, атомно-адсорбционного методов и рентгеноспектрального анализа - позволило определить внутриклеточную концентрацию основных неорганических ионов в сосудистых ГМК. Концентрация ионов натрия и калия в данных клетках не отличается от таковой в мышечных клетках висцеральных гладких мышц. С помощью ренгтгеноспектрального анализа показано, что ионы калия и хлора равномерно распределены в цитоплазме ГМК [ВоЬг,1980]. Это значит, что данные ионы не связываются какими-то внутриклеточными структурами. Что касается натрия, то к настоящему времени нет достоверных данных о его внутриклеточном состоянии и распределении. Хотя предполагается, что в отличие от ионов калия и хлора значительная часть внутриклеточного натрия находится в

связанном состоянии [Шуба,1988].

При исследовании действия различных ионов наружной среды на сопротивление мембраны ГМК воротной вены был обнаружен большой вклад ионов натрия и хлора в общую проводимость мембраны [Тараненко, 1970]. По-видимому, этим обстоятельством и объясняется различие между измеренным значением потенциала покоя сосудистой ГМК (-55 мВ) и калиевым равновесным потенциалом (Ек), рассчитанным по формуле Нернста (-80...-90 мВ). Поэтому для более точной количественной оценки потенциала покоя сосудистых ГМК предпринималась попытка применить уравнение постоянного поля Гольдмана, в котором, кроме ионов калия, учитывается градиент ионов натрия и хлора, а также относительная проницаемость мембраны (Р) для этих ионов:

Ет=НТ/Т 1п [(РК[К]о+РМа[Ма]о+РС1[С1]о)/ (РК[К]1+РКа[Ка]1+Рс1[С1]1)].

Однако оказалось, что диффузионный потенциал, рассчитанный по данной формуле, намного выше, чем измеренный потенциал покоя. Частично это расхождение может быть обусловлено недостаточно точным определением концентрации ионов и проницаемости мембраны для них, а также наличием какого-то добавочного источника т�