Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Потенциал-управляемые и рецептор-зависимые ионные токи в гладкомышечных клетках сосудов при действии эндогенных вазоконстрикторов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Потенциал-управляемые и рецептор-зависимые ионные токи в гладкомышечных клетках сосудов при действии эндогенных вазоконстрикторов"

На правах рукописи

Л Л

СЕРЕБРЯКОВ Владимир Николаевич

ПОТЕНЦИАЛ-УПРАВЛЕМЫЕ И РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМЫЕ ИОННЫЕ ТОКИ В ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ СОСУДОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭНДОГЕННЫХ ВАЗОКОНСТРИКТОРОВ

03.00.13 - физиология человека и животпых

Автореферат диссертации па соискание ученой степени доктора биологических иаук

Москва - 1997

Работа выполнена в группе биофизики ионных каналов, отдела физиологии института Экспериментальной Кардиологии Кардиологического научно-производственного центра МЗ РФ.

Научный консультант:

член-корр. РАН, профессор JLB. Розенштраух

Официальные оппоненты:

1. Академик РАН, доктор биологических наук

JLM. Чайлахян

2. Доктор биологических наук, профессор

И.М. Родионов

3. Доктор медицинских наук, профессор

В Л Канелько

Ведущее учреждение - Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится 62.1?. 9%. в /Г в Большой Биологической аудитории на заседании Специализированного Совета Д.053.05.35 Биологического факультета МГУ им. Ломоносова (119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 1997г.

Ученый секретарь Специализированною совета, кандидат биологических наук 1 Е.А-Умарова

А.А !

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Ионные каналы - это белковые структуры, пронизывающие липидный матрикс клеточных мембран и обладающие способностью при изменении мембранного потенциала, или при взаимодействии с медиаторами и гормонами, избирательно изменять свою проницаемость для определенного типа ионов. Функционирование ионных каналов лежит в основе физиологических процессов, связанных с метаболизмом клеток, передачей электрических и химических сигналов, сокращением, расслаблением и выполнением многих других жизненно важных функций.

При этом необходимо заметить, что практически все выше перечисленные процессы опосредуются через изменение внутриклеточной концентрации свободного кальция ([Са++]вн).

Поступление ионов Са++ из внеклеточной среды через цитоплазматическую мембрану внутрь возбудимых клеток происходит в основном через потенциал-управляемые ионные каналы, а также Ма+/Са++ обменный процесс. Поскольку Ыа+/Са++ обменный процесс вносит существенный вклад в регуляцию внутриклеточного кальция в основном в клетках миокарда, то в гладкомышечных клетках сосудов главная роль в поступлении ионов Са++ в клетку из экстраклеточного пространства принадлежит потенциал-управляемым кальциевым каналам (Курский М.Д., и др., 1987).

Управление ионными каналами осуществляется, в основном, либо через потенциал-чувствительные сенсоры, либо через высокоизбирательные рецепторы для гормонов или медиаторов.

Несмотря на то, что электрофизиологические особенности взаимодействия гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов с такими вазоконстрикторами, как адреналин, норадреналин, эндотелия, ангиотензин и другие широко изучаются как у нас в стране, так и за рубежом, ионные механизмы этого взаимодействия исследованы пока еще не полностью. Особенно это касается вовлечения потенциал-управляемого Са++ тока в

процесс изменения [Са"1"4^, при действии различных вазоактивных соединений.

Так, из данных литературы (ОЬуа У. et а1 1988; Ме1шг^ег О.А. е! а1. 1992) следует, что вазоконстрикторы, как правило, повышают [Са++]вш однако, какое участие в этом принимает потенциал-управляемый Са++ ток, а также какова ионная природа возникающего при этом рецептор-зависимого тока остаются мало изученными направлениями.

При развитии рецептор-зависимого тока в ГМК обычно активируются выходящие потенциал-управляемые калиевые токи. Причин для указанного активирования существует несколько: это увеличение [Са++]вн, деполяризация клеточной мембраны, увеличение содержания циклических нуклеотидов в клетке и т.д. Однако ионная природа рецептор-зависимого тока и механизмы, которые лежат в основе деполяризации и реполяризации мембраны ГМК сосудов при взаимодействии с вазоконстрикторами остаются в настоящее время наиболее спорными вопросами.

Поэтому исследование механизмов регуляции ионных каналов в мембранах ГМК сосудов как в норме, так и при действии эндогенных вазоактивных соединений является одним из наиболее актуальных направлений современной электрофизиологии.

ЦЕЛЬЮ настоящего исследования было изучение возможных механизмов регуляции потенциал-управляемых ионных токов в гладкомышечных клетках сосудов при действие эндогенных вазоконстрикторов, а также выяснение ионной природы рецептор-зависимых токов. Исследования проводились как на свежевыделенных ГМК сосудов, так и на клетках в условиях первичной клеточной культуры.

Во время выполнения данной работы были поставлены следующие экспериментальные ЗАДАЧИ:

1. Экспериментально доказать возможность генерировать прекультивируемыми и свежеизолированными ГМК сосудов:

а. Потенциал-управляемые входящие Са++ токи;

б. Потенциал-управляемые выходящие К+ токи;

в. Рецептор-зависимые ионные токи;

2. Выяснить основные механизмы потенциирующего и ингибирующего действия норадреналина, АТФ, ангиотензина II и простагландинов (группы Е и простациклина) на потенциал-управляемые ионные токи в изолированных ГМК магистральных сосудов;

3. Выяснить ионную природу рецептор-зависимого тока, генерируемого ГМК, в ответ на действие указанных выше вазоконстрикторов;

4. Исследовать роль экстраклеточного кальция в увеличении [Са++]вн в ГМК сосудов под влиянием перечисленных выше вазоконстрикторов с помощью флуоресцентных зондов;

5. Изучить особенности электромеханического сопряжения в ГМК сосудов на примере действия липопротеидов низкой плотности и простагландинов группы Е;

6. Изучить механизм регуляции Са++-чувствительных К+ каналов большой проводимости (Кса) через изменение микровязкости (текучести) липидного бислоя клеточной мембраны;

7. Исследовать возможность регуляции Кса каналов через цАМФ/цГМФ зависимое фосфорилирование цитоплазматических участков канал-формирующих белков.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: В результате работы был проведен детальный анализ потенциал-управляемых входящих и выходящих ионных токов в мембране ГМК аорты крысы и человека. В работе анализируется и экспериментально доказывается наличие, по крайней мере, двух типов потенциал-управляемых Са++ токов: транзиторного, быстро инактивирующегося, низкопорогового Са++ тока Т-типа и медленно инактивирующегося высоко-порогового тока Ь-типа.

Полученные в настоящей работе результаты занимают одно из лидирующих положений в доказательстве существования потенциал-управляемого Са++ тока в изолированных ГМК из магистральных сосудов. Кроме этого было показано, что соотношение, указанных выше, двух типов кальциевых каналов в

формировании Са++ тока в ГМК зависит от условий и сроков их культивирования. Так, после ферментативного выделения клеток, к 4 - 5 дню культивирования, восстанавливается Т- компонент Са++ тока, далее появляется возможность регистрировать "смешанный" тип Са++ тока, т.е. ток, состоящий из Т- и Ь- компонент, а к 10 -12 дню культивирования в ГМК из аорты крысы преобладают клетки экспресирующие в основном кальциевые каналы Ь- типа. Все выше сказанное справедливо, по крайней мере, при использовании папаина во время выделения клеток из сосуда и искусственной сыворотки при их культивировании.

В связи с этим, нами были разработаны специальные условия выделения и культивирования ГМК из аорты крысы, позволяющие регистрировать Т- и Ь- компоненты потенциал-управляемого Са++ тока.

В результате проведенных исследований впервые было установлено ингибирующее влияние вазоактивных соединений на потенциал-управляемый Са++ ток (Т-компонента) и дифференцированное действие на Ь-компоненту в ГМК аорты крысы, из чего был сделан вывод, что потенциал-управляемые Са++ каналы (в основном Т-типа) не принимают участие в начальной фазе увеличения [Са++]в„ при действии вазоконстрикторов.

Показано, что в ответ на действие вазоконстрикторов ГМК генерируют рецептор-зависимый входяхций ионный ток, принимающий участие в начальной фазе деполяризации ГМК. Ионный анализ этого тока показывает, что в основном он опосредован активацией выходящего С1~ тока, что приводит к деполяризации клеточной мембраны и увеличению [Са++]вн в клетке в основном за счет освобождения кальция из внутриклеточных депо.

В настоящей работе впервые экспериментально доказывается модулирующее действие липопротеидов низкой плотности (ЛНП), известных как кальций-мобилизующие вазоконстрикторы, на кинетические свойства Кса каналов через изменение микровязкости липидного матрикса клеточной мембраны. Кроме этого, аналогичный, не кальций зависимый механизм

активирующего действия на калиевую проводимость был нами показан и для других липидорастворимых соединений, но экзогенной природы.

Анализируется и доказывается ключевая роль протеинкиназы А и протеинкиназы G в регулировании активности К+ ионных каналов, вероятнее всего, через цАМФ (цГМФ) - зависимое фосфорилирование цитоплазматических участков канал-формирующих белков в ГМК из сосудов крысы и аорты человека. При этом процесс фосфорилирования, через названные выше протеинкиназы, вызывает увеличение активности Кса каналов в ГМК сосудов и приводит к гиперполяризации их клеточной мембраны.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В работе показано, что одним из ведущих факторов при действии вазоконстрикторов является юс влияние на потенциал-управляемые ионные каналы и генерирование рецептор-зависимого ионного тока. Норадреналин, АТФ, ангиотензин II и простагландины Е ингибируют потенциал-зависимый вход Са++ через Са++ каналы Т-типа, а также и через каналы L-типа, но в различной степени, и в то же время увеличивают [Са++]вн. Ингибирование потенциал-управляемого Са++ тока происходит не за счет увеличения [Са++]вн, т.е. по механизму обратной связи, как можно было предположить, а за счет активирования соответствующих конкретному вазоконстриктору рецепторов и вовлечения системы G-белков.

Увеличение [Са++]вн в ГМК при действии вазоактивных веществ может быть недостаточным (под пороговым) для сокращения клетки, но в тоже время способным вносить определенный вклад в изменение электрофизиологического статуса клетки [Ambler S.K. et al, 1988]. Так, при микроаппликации простагландинов группы Е были отмечены транзиторное увеличение [Са++]вш незначительная деполяризация клеточной мембраны и, в то же время, расслабление сосудистой стенки. Анализируя полученные результаты можно предположить, что для сокращения ГМК важным фактором является не только увеличение [Са++]вн, но и

чувствительность сократительного аппарата клетки к этому иону. Последний фактор при этом, как известно, в значительной мере зависит от уровня циклических нуклеотидов в ГМК сосудов.

Рецептор-зависимый входящий ток, вызванный АТФ и ее производными, а также ангиотензином II и простагландинами, который вызывает тригерную деполяризацию мембраны ГМК, в основном обусловлен активацией неселективных ионных каналов с преимущественной проницаемостью для анионов С1".

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Увеличение [Са++]вн в ГМК сосудов в ответ на микроаппликацию вазоконстрикторов на первом этапе их действия, происходит в основном за счет освобождения Са++ из внутриклеточных депо, а не как следствие активации потенциал-управляемых кальциевых каналов, как считалось ранее. Тригерным звеном этого процесса является развитие рецептор-зависимого входящего тока, который и обуславливает начальную фазу деполяризации ГМК. Увеличение [Са++]вн, с одной стороны, является начальным и необходимым звеном как при сокращении, так и при расслаблении сосудистой стенки, а с другой стороны, ограничивает использование известных фармакологических блокаторов потенциал-зависимой Са++ проводимости при коррекции острых патологий, связанных с увеличением концентрации циркулирующих в кровотоке эндогенных вазоконстрикторов.

Кроме этого, известно, что ряд патологий сердечнососудистой системы обусловлен нарушениями липидного обмена. Мембран-формирующие липиды могут участвовать в регуляции ионной проницаемости мембранного бислоя через изменение его микровязкости. В настоящей работе экспериментально доказывается модулирующее действие ЛНП и соединений экзогенной природы, содержащих жирные кислоты, на кинетические свойства Кса каналов. Применение соединений с указанными выше свойствами, позволяет воздействовать на процесс возбуждения-сокращения ГМК, не вовлекая Са++ систему регуляции калиевой проводимости клетки.

В работе показано, что результатом цАМФ- и цГМФ-зависимого фосфорилирования цитоплазматических участков канал-формирунлцих белков является увеличение активности калиевых ионных каналов за счет увеличения среднего времени их открытого состояния и частоты открывания. Проводимость ионных каналов при этом не изменяется. Учитывая тот факт, что многие вазоконстрикторы при взаимодействии с ГМК сосудов способны изменять уровень цАМФ и цГМФ в клетке, можно сделать вывод, что активирование при этом процессе калиевой проводимости является необходимым звеном в реполяризации мембраны ГМК после их действия.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на 7-ом международном симпозиуме по Атеросклерозу (Мельбурн, Австралия, 1985), на 4-ом конгрессе по кардиологии (Москва, 1986), на международном симпозиуме по Атеросклерозу (Рим, Италия, 1987,1988), на региональном симпозиуме ГОРБ (Прага, Чехословакия, 1991), на 3-ем международном семинаре по ионным каналам (Париж, Франция, 1992), на 62-ом европейском конгрессе по атеросклерозу (Иерусалим, Израиль, 1993), на 6-ом международном симпозиуме по фармакологическому контролю кальциевого и калиевого гомеостаза (Флоренция, Италия, 1994), на международном симпозиуме по биологической подвижности (Пущино, 1994), на 1-ом ГЕРБ конгрессе (Маастрихт, Голландия, 1995), на 1-ом европейском конгрессе по фармакологии (Милан, Италия, 1995), на 16-ой научной конференции общества по гипертензии (Глазго, Англия, 1996), на 1-ом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), на 76-ом конгрессе немецких физиологов (Росток, Германия, 1997).

Основные положения диссертации, выносимые на

зашиху.

1.В ответ на деполяризацию клеточной мембраны прекультивируемые ГМК аорты человека и крысы способны генерировать входящие потенциал-управляемые Са++ токи Т- и Ь-типов.

2.Выходящие потенциал-управляемые токи, наблюдаемые при деполяризации ГМК из магистральных сосудов, генерировались клетками в основном за счет активации Кса каналов. Основные параметры этих токов были одинаковыми у прекультивированных и свежеизолированных ГМК.

3.Норадреналин, АТФ, ангиотензин, и в некоторых случаях простагландины группы Е обладают выраженным констрикторным действием на ГМК перечисленных выше сосудов. Их микроаппликация на ГМК приводит к генерированию рецептор-зависимого тока, который вызывает деполяризацию клеточной мембраны и увеличене [Са++]Ш1.

4.Анализ ионной природы рецептор-зависимого тока показывает, что он не чувствителен к наружной концентрации ионов Ыа+ в присутствии ионов Са++, слабо зависит от [Са++]нар_ Этот ток блокируется нифлюмовой кислотой (блокатором СГ проводимости) и зависит от соотношения [С1"]нар/[С1"]вн, что указывает на участие анионов СГ в формировании рецептор-зависимого тока в ответ на аппликацию перечисленных ранее вазоконстрикторов.

5.Норадреналин, АТФ и АТФуБ снижают максимальную амплитуду в основном Т-компоненты Са++ тока, в то время как ангиотензин II и простагландины Е преимущественно ингибируют Ь-компоненту этого тока.

6.При исследовании действия ангиотензина II на ГМК из аорты крысы был обнаружен выраженный эффект десенситизации АТ1 -рецепторов, что является дополнительным доказательством рецепторного действия этого агониста на клетки.

7. Функциональная активность КСа каналов в клеточной мембране ГМК из аорты человека и крысы прямо зависит от микровязкости мембранных липидов. Микровязкость может изменяться под воздействием как эндогенных (ЛНП, холестерин), так и экзогенных (дециноевая кислота, ИЭМ-1194) жирорастворимых соединений.

8.Увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ/цГМФ приводит к потенцированию выходящих К+ токов в ГМК аорты человека и хвостовой артерии крысы в основном за счет активации КСа каналов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), результатов и обсуждения (глава 3), заключения и выводов. Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста, включает 32 рисунка и 3 таблицы. В список цитируемой литературы включено 231 работа, из которых 17 отечественных и 214 зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования

В настоящей работе экспериментальным материалом служили ГМК сосудов животных и человека как в первичной клеточной культуре, так и в свежевыделенном состоянии.

Первичную культуру клеток из медиального и интимального слоев аорты эмбриона и взрослого человека получали следующим образом:

ГМК из грудного отдела аорты человека выделяли по методике, описанной в работе Printseva O.Yu., et al. (1989), через 1-3 часа после внезапной смерти (возраст 25-50 лет). С выделенного участка удаляли адвентицию, затем медию отделяли от интимы механическим способом. В зависимости от необходимого типа ГМК, медиальный или интимальный слой разрезали на полоски шириной 3-5мм и инкубировали в 0,2% растворе коллагеназы "Sigma"(тип IV) США, содержащем 0,05% эластазу (тип II) "Sigma" США в течение 2-3 часов. ГМК из интимального слоя

обычно достаточно было инкубировать только в растворе коллагеназы 0,2% (тип IV) [Orekhov A.N., et al., 1983].

Полученную суспензию клеток культивировали в среде MEM, содержащей 2мМ глутаминовой кислоты, 100Ед/мл пенициллина, 100мкг/мл стрептомицина, ЮмМ HEPES и 10-15% фетальной бычьей сыворотки (все GIBCO, США). Клетки выращивали в С02 инкубаторе (5% : 95% - С02 : воздуха) при температуре 37°С.

Во всех электрофизиологических экспериментах использовали клетки первичной культуры, начиная с 4-12 дня культивирования при комнатной температуре (18-22°С) обычно не более 3-5 часов, затем покровное стекло с клетками заменяли на новое.

Основу ферментативного выделения клеток из грудного фрагмента аорты и хвостовой артерии крысы составлял метод Clapp L.Y. & AM. Gumey, разработанный в 1991 году для работы на свежеизолированных ГМК. Полученные клетки использовали как свежевыделенные, либо помещали на покровные стекла плотностью 15002000 клеток/см2 для последующего культивирования.

Для культивирования ГМК был разработан специальный метод, включающий использование синтетической сыворотки. Клетки высевали в 35 мм чашках Петри с добавлением Eagle's MEM/Ham's F-10 среды, содержащей 3% раствор синтетической сыворотки (Ultroser SF/Ultroser G 3/1); 100 Ед/мл пенициллина; 100 Ед/мл стрептомицина; 0,5 мМ витамина С и 2 мМ глутамина [Serebryakov V. & К. Takeda, 1992].

Методика выделения ГМК из хвостовой артерии крысы была аналогична описанной выше.

Метод локальной фиксации потенциала. Метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) был разработан Hamill OP. и соавт. в 1981 году. В нашей работе мы использовали все основные конфигурации этого метода, позволяющие регистрировать токи через одиночные ионные каналы от фрагментов клеточной мембраны (cell-attached, inside-out и outside-out), а также интегральные (макроскопические) ионные токи от мембраны целой клетки (РЦК - конфигурация). Для этого

использовали микропипетки, изготовленные из боросилгасатного стекла, с сопротивлением около 5-7 Мом. Микропипетки покрывали пчелиным воском для снижения их емкости и заполняли фильтрованным раствором непосредственно перед их использованием.

Регистрацию интегральных ионных токов и токов через одиночные ионные каналы осуществляли с помощью усилителей ЕРС-5, ЕРС-7 (List Eiectronic-ФРГ), а также АХОРАТСН 200А (США).

Для микроаппликации агонистов использовали пневматический микроинъектор (ВН-2, WPI-instrument-США) и обыкновенный микроэлектрод с сопротивлением кончика около 0,5-1Мом.

Метод определения концентрации свободного кальция в цитоплазме ГМК. Измерение [Са++]вн проводили как на одиночных ГМК сосудов, используя флуоресцентный краситель Indo-IAM, так и на конфлуентном монослое ГМК с красителем Fura-2AM.

Для определения [Са4^^ на одиночных клетках использовали первичную культуру ГМК из аорты крысы. К клеткам добавляли флуоресцентный краситель Indo-IAM [Grynkiewicz С., et al., 1985] до конечной концентрации 5мкМ и флюрановую кислоту (F-127; 0,02%). Клетки инкубировали с красителем при температуре 37°С в течение 40 минут, после чего краситель отмывали. Флуоресценцию возбуждали двумя длинами волн - 340 и 380 нм. Регистрацию сигнала проводили на флуоресцентном микроскопе при увеличении 400 или 800 под масляной иммерсией.

В случае измерения [Са++]ви на конфлуентном монослое ГМК применяли флуоресцентный индикатор Fura-2AM [Andre P., et al., 1990]. Покровные стекла 1см2 с конфлуентным слоем ГМК из аорты крысы помещали в пластиковые чашки Петри, в раствор содержащий 5мкМ Fura-2AM (Molecular Probes) на 20 минут при температуре 37°С. После отмывки от красителя стекла помещали под утлом 40-45 градусов в прямоугольные кварцевые кюветы объемом 2см3 при 37°С. в двухлучевой флуориметр фирмы SPEX1681 при длинах волн

возбуждения 340 и 380нм. Расчет [Са++]вн проводили согласно [Poenie К. et al., 1985].

Метод регистрации изометрического сокращения полосок., аорты крысы. Для указанных экспериментов использовали грудной сегмент аорты крысы. После выделения, аорту разрезали по направлению продольной оси и удаляли эндотелий с помощью ватного тампона. Полоски размером 3x6мм помещали в рабочую камеру (37°С) объемом 7см3, где соединяли с пьезоэлектрическим датчиком [Van de Voorde J., et al., 1992]. После процедуры нормализации приступали к регистрации изометрического сокращения. Обработку полученной информации проводили на микрокомпьютере (486DX), используя пакет графических с статистических программ "Sigma Plot 5.0".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Потснциал-управляемые ионные токи в ГМК сосудов.

Анализ интегральных токов проводили как на культивируемых одиночных ГМК аорты крысы, эмбриона и взрослого человека, так и на свежевыделенных клетках из аорты и хвостовой артерии крысы.

При потенциале фиксации от -40 до -бОмВ в ответ на деполяризующие импульсы напряжения можно было регистрировать два основных типа интегрального тока: входящий и выходящий.

Входящий интегральный ионный ток. Так как в нормальных условиях при концентрации ионов Са++ в экстраклеточном растворе 1 мМ амплитуда входящего тока мала, а присутствующий выходящий ток сильно маскирует входящий, все последующие исследования по регистрации входящего ионного тока были проведены с использованием внутриклеточного раствора, где 140мМ KCI были замещены на ЮОмМ глютамата цезия и 40мМ CsCI, а в наружном растворе использовали 20мМ Ва++ вместо 1мМ Са++ с соответствующей коррекцией общей осмолярности растворов. Указанные изменения позволили заблокировать выходящий калиевый ток (ионы Cs+) и потенцировать входящий (ионы Ва++). В этих условиях

можно было регистрировать входящий ток амплитудой до 200 пА с быстрой кинетикой инактивации, (~50мв -потенциал полной инактивации тока), потенциал реверсии составлял +30мв, максимальное значение амплитуды тока можно было регистрировать при потенциале на мембране -Юмв (рис.1а,б).

Зарегистрированный входящий быстро инактивиру-ющийся ток был нечувствителен к тетродотоксину (1мкМ) и замещению наружного натрия на холин, но в то же время блокировался ионами Сс1++ и №++(1мМ), а также никардипином (5мкМ). Все перечисленные выше факты позволяют утверждать, что этот входящий интегральный

В

БО-гРА

I-

■50 -30

-10

8 ..

О *

•10сР--

•200-1-

10 о

_125 рА

100ГО»

Рисунок 1. А - входящий потенциал-управляемый Са++ ток Т-тпипа в ответ на прямоугольные деполяризующие импульсы. Б и Г - вольт-амперные характеристики Са++ тока. В - входящий потенциал-управляемый Са++ ток Ь- типа. А и Б - УН=-70мв.; В и Г - УЬ,=-40мв.

Более эффективное блокирующее действие низкой концентрации ионов №++ (50мкМ), по сравнению с такой же концентрацией Сс!4"*, а также неэффективность

стереоспецифических изомеров дигидропиридина: (-) BAY К8644 (1мкМ) и S (+) 202 791 (1мкМ) позволило предположить, что указанный ток переносится через низкопороговые, быстро инактивирующиеся Са++ каналы Т-типа.

При более поздних сроках культивирования ГМК из аорты крысы (на 10 - 14 день), на большинстве клеток (до 80%) можно было зарегистрировать кинетически другой тип входящего Са++ тока (рис.1в,г). Этот ток имел сравнительно медленную кинетику инактивации, активировался при потенциале фиксации -40мв, а также более эффективно потенцировался ионами бария, и в то же время полностью блокировался ионами Cd++ (1мМ) и (ЮОнМ). Согласно выше указанным

характеристикам, этот тип потенциал-управляемого Са++ тока можно было отнести к высокопороговому, медленно инактивирующемуся L-типу Са++ тока.

При потенциале фиксации -70мв примерно в 40% случаях на культивируемых ГМК из аорты крыс, можно было регистрировать при деполяризации присутствие одновременно Т- и L- компонент Са++ тока (с различным процентным вкладом).

Выходящий интегральный ионный ток. Выходящий ионный ток на ГМК сосудов человека и крысы переносится в основном через К+ каналы. Пример наиболее типичного выходящего интегрального тока при регистрации от целой клетки (РЦК) на прекультивируемых ГМК аорты крысы представлен на рис. 2а.

Основу выходящего интегрального тока составляла Са++-зависимая К+ компонента. В зависимости от типа клеток эта компонента составляла 50-70% амплитуды выходящего тока. Доказательством переноса ионов калия в основном через Кса каналы в ГМК из аорты человека и крысы являются данные экспериментов с использованием высокоспецифичного блокаторов этих каналов ибериотоксина (рис. 26). Так микроаппликация этого вещества в концентрации 1 мкМ блокировала амплитуду выходящего тока на 60-70%. Остаточная, после блокирования, компонента выходящего ионного тока

указывает на присутствие других типов потенциал-зависимых К4 каналов.

Выходящий интегральный ток на ГМК из аорты человека и крысы блокировался на 50-80% добавлением ТЭА (ЗОмМ) (рис. 2в), 1-5мМ Сс1++, и был практически нечувствителен к 5мМ раствору 4-аминопиридина (4-АР), а также глибенкламида, высоко-специфическому блокатору АТФ-чувствительных К+ каналов. Аналогичные результаты по чувствительности интегрального выходящего ионного тока к указанным выше блокаторам были получены и при исследовании ГМК из медиального и интимального слоев аорты человека.

Полученные результаты указывают на практическое отсутствие при наших условиях регистрации в составе интегрального выходящего тока на ГМК из аорты крысы и человека как калиевого тока задержанного выпрямления (4-АП - чувствительного), так и АТФ-чувствительного (ингибируемого) К+ тока.

Однако все вышесказанное, вероятно, справедливо только для ГМК из аорты крысы и человека. Анализ выходящих интегральных токов при деполяризации на ГМК из других сосудов позволяет выявить совсем другие соотношения типов калиевых токов.

Так, например, прекультивируемые ГМК из коронарных артерий человека при деполяризации генерируют кинетически другой тип потенциал-управляемого К+ тока, который эффективно ингибируется глибенкламидом (рис. 2г,д). Тем не менее, практически все ГМК из сосудистой стенки обладают Са++ чувствительной К4 компонентой в составе выходящего интегрального тока. При действии вазоконстрикторов эта компонента, с одной стороны, вносит основной вклад в изменение мембранного потенциала клетки, а с другой стороны, является вторичной, т.к. генерируется в ответ на деполяризацию и увеличение [Са++]вн.

Таким образом, представленные результаты позволяют утверждать, что:

во

ПОша

Control

200 рЛ

control

тех

SO рА

_J

IOObs

1Я |>A

100 mi

Рисунок 2. Семейство потенциал-управляемых выходящих К+ токов в ГМК ао-рты крысы (А). Ибериотоксин (1мкМ), а также ТЭА (ЗОмМ) па 70% ингибируют величину К+ тока (Б,В). Потенциал-управляемые выходящие токи в ГМК из коронарных сосудов человека (Г). Глибенкламид (1мкМ) оказывает ингибирующее действие на К+ ток в ГМК из коронарных сосудов человека (Д). VК=-70мв (А) и -40мв (Б,В,Г,Д); Уком=30мв.

а. ГМК из аорты крысы и человека в ответ на деполяризацию генерируют входящий, потенциал-зависимый Са++ ток Т- и Ь- типов и выходящий

потенциал-зависимый К+ ток, переносимый главным образом через Кса каналы;

б. Процентное соотношение Т- и L- компонент в выходящем Са++ токе зависит в основном от сроков культивирования ГМК и определяется скоростью их пролиферации и дифференцировки;

в. Основные электрофизиологические параметры и свойства выходящего потенциал-управляемого К+ тока имеют сходные характеристики как на культивируемых ГМК из аорты человека и крысы, так и на свежевыделенных клетках из хвостовой артерии крысы;

2. Рецептор-зависимый ионный ток в ГМК сосудов

В настоящей работе были исследованы рецептор-зависимые ионные токи на одиночных прекультивированных и свежевыделенных ГМК из аорты крысы, в ответ на действие норадреналина, АТФ и его производных, ангиотензина II и простагландинов.

Хорошо известно, что рецептор-зависимый ток в ответ на аппликацию агонистов может иметь в своем составе как выходящий интегральный ток, так и входящий (Benham C.D. & R.W. Tsien, 1987; Bean В.Р. & D.D. Friel, 1990).

В этой главе мы продемонстрируем основные свойства рецептор-зависимого ионного тока, генерируемого ГМК сосудов в ответ на экстраклеточную аппликацию АТФ, хотя основные параметры этого тока имели много сходного с током, генерируемым в ответ на действие и других вазоконстрикторов.

Наиболее типичный ответ культивируемых ГМК из аорты крысы в РЦК конфигурации на экстраклеточную аппликацию 100 мкМ АТФ показан на рис. 3. При поддерживаемом потенциале -50мв с латентным периодом от 1-3 сек, после аппликации агониста, можно было регистрировать развитие входящего и одновременное увеличение амплитуды выходящего тока (в ответ на деполяризующие пилообразные импульсы). На рис. 36

O.SnA

ЮОцМАТР 3i

Рисунок 3. Микроаппликация АТФ (ЮОмкМ) вызывает рецептор-зависимый входящий ток и увеличивает амплитуду выходящего К+ тока (А). Б - волът-амперные характеристики ионных токов в норме (1) и при аппликации АТФ (2). В - результирующая вольт-амперная кривая (полученная после вычитания кривой 1 из 2) УЪ.=-50мв. Пилообразный деполяризующий импульс до ПОмв.

показаны вольт-амперные характеристики указанных токов в контроле и после аппликации АТФ. Потенциал реверсии в данном случае (рис Зв) составлял -18мв (в среднем - 10,3±8,1мв; п=15).

Так как в большинстве случаев этот потенциал был достаточно близок к 0 мв, это указывает на то, что АТФ может активировать либо хлорный ток, либо неселективный катионный ток. В то же время нами- было установлено, что аппликация АТФ вызывала увеличение [Са++]вн.

Входящий интегральный ток в ответ на микроаппликацию АТФ практически не зависел от концентрации наружного и внутриклеточного Са++, так как он сохранялся в бескальциевом наружном растворе или с ЮмМ В APT А во внутрипипеточном растворе (вместо обычных 0,1мМ EGTA).

Аппликация а,[3-метил-АТФ (ЮОмкМ), аналога АТФ с измененной структурой молекулы, не вызывала генерирование рецептор-зависимого тока на ГМК.

Полученные результаты указывают на то, что регистрируемый нами ток был рецептор-специфичным и видоизмененная молекула АТФ не приводит к генерированию этого тока.

Дополнительным доказательством рецепторной природы регистрируемого нами тока являются эксперименты с высокоспецифическим блокатором Р2х-пуринорецепторов - сурамином [Dunn Р.М. & A.G.H. Blakely, 1988; Nakazawa К. et al., 1990]. В присутствии сурамина (ЮОмкМ), микроаппликация АТФ или АТФуБ (негидролизуемый аналог АТФ) не приводила к генерированию ионного тока на ГМК из аорты крысы.

Чтобы определить, движение каких ионов участвует в формировании рецептор-зависимого тока, мы поочередно исключали из состава наружного раствора наиболее вероятные ионы, перенос которых, может участвовать в генерировании этого тока. Как было уже отмечено выше, исключение ионов Са++ из наружного раствора не сказывалось на параметрах рецептор-зависимого тока в ответ на аппликацию АТФ. (Аналогичные результаты были получены при аппликации норадреналина, ангиотензина II и простагландинов серии Е). Эквимолярное замещение ионов Na+ на NMDG (N-methyl-D-glucosamin) также не оказывало влияния на параметры рецептор-зависимого входящего тока.

Использование холин-хлорида в составе наружного и внутриклеточного раствора позволило нам полностью исключить моновалентные катионы с обеих сторон клеточной мембраны. В указанных условиях аппликация АТФ (ЮОмкМ) вызывала генерирование рецептор-зависимого тока с потенциалом реверсии около Омв (рис 4а-в). Полученные результаты однозначно доказывают, что в указанных условиях АТФ вызывает генерирование рецептор-зависимого тока за счет анионов хлора.

Если в наружном растворе NaCl (140мМ) эквимолярно заместить на холин-хлорид, а во внутриклеточном растворе КС1 (140мМ) эквимолярно заместить на CsCl и добавить TEA (ЮмМ), то и в этом случае микроаппликация АТФ вызывает генерирование рецеп-

Puq/кок 4 Мшроаптишация АТФ (ЮОмкМ) в РЦК конфигурации при. А-а симметричный экстраклеточный и внутриэлектродныи растворы холин-хлорида (140мМ)- Г-Е в наружном растворе холин-хлорид (140мМ) во внутриэлектродном Cs+ (140мМ) и TEA (ЮмМ). А=-50ш пилообразный импульс деполяризации до 50мв. Б,В,Д,Е - вольт-амперные характеристики рецептор-зависимого тока. 1 - ток в

U ' ™СЛе аппликаЧии мониста, 3 - результирующие кривые, полученные после вычитания кривой 1 из 2.

тор-зависимого тока (рис. 4г-е). При этом необходимо заметить, что входящая компонента тока по своим параметрам остается аналогичной, полученной в условиях при использовании симметричных растворов с холин-хлоридом, в то время как выходящая компонента становится значительно меньшей амплитуды. Последнее наблюдение может быть объяснено блокирующим действием ионов Cs+ и TEA на выходящий К+ ток который принимает участие в формировании выходящего рецептор-зависимого тока при действии АТФ.

Таким образом рецептор-зависимый ионный ток, генерируемый ГМК сосудов в ответ на микроаппликацию АТФ, обусловлен активированием в основном хлорной проводимости, что и приводит к фазе начальной деполяризации клетки.

Аналогичный вывод был получен, анализируя полученные нами результаты по ионной природе рецептор-зависимого тока в ответ на действие норадреналина, ангиотензина II и простагландинов серии Е.

Подводя некоторый итог данным, обсуждаемых в этой главе, а также результатам по анализу рецептор-зависимого тока в ГМК в ответ на аппликацию других вазоконстрикторов можно сделать следующие выводы:

а. Рецептор-зависимый ток при действии эндогенных вазоконстрикторов на ГМК из аорты крысы определяется участием неселективных ионных каналов, имеющих в наших экспериментах большее сродство к анионам СГ.

б. Для каждого из изученных нами вазоконстрикторов характерна высокая рецептор-специфичность ответа ГМК и проявление эффекта десенситизации.

в. Во всех проведенных нами экспериментах при микроаппликации вазоконстрикторов можно было регистрировать деполяризацию ГМК, основной вклад в которую вносит активирование рецептор-зависимого ионного тока, в то время как реполяризация мембраны осуществляется в основном за счет активирования Кса токов, а также других типов потенциал-управляемых К+ каналов.

3. Изменение внутриклеточной концентрации свободного Са++ в ГМК при действии вазоконстрикторов

Основной характеристикой действия вазоконстрикторов на ГМК является увеличение [Са++]вш как фактора необходимого для сокращения клетки.

На этом этапе наших исследований было необходимо непосредственно показать увеличение [Са++]вн под воздействием вазоконстрикторов на ГМК из

магистральных сосудов, культивируемых в условиях, аналогичных и для метода точечной фиксации потенциала. Это увеличение подтверждается данными экспериментов с прямым измерением [Са++]вн с использованием флуоресцентных зондов.

Так в нормальном наружном растворе, содержащем 1мМ Са++, микроаппликация АН вызывала быстрое увеличение [Са++]вн в ГМК, переходящее в длительное плато, часто сопровождаемое флуктуациями сигнала (рис. 5). Иногда можно было регистрировать двухфазное увеличение [Са++]вн. Повторная аппликация АН вызывала вторичное увеличение [Са++]вн, но меньшее по амплитуде, чем первое, и после относительно длительной отмывки исследуемой клетки (до 2 мин). Исключение ионов Са++ из наружного раствора приводило к снижению амплитуды флуоресцентного сигнала в ответ на аппликацию АН, но не устраняло последний (рис. 5д).

Полученные результаты позволяют нам утверждать, что в бескальциевом экстраклеточном растворе в ответ на действие АН, [Са++]вн увеличивается за счет освобождения этих ионов из внутриклеточных мест связывания. Снижение [Са++]ви в безкальциевом наружном растворе по сравнению с его контрольным значением указывает на то, что и экстраклеточный Са++ принимает участие в этом процессе.

Микроаппликация АТФ, норадреналина и простагландинов группы Е также вызывала увеличение [Са++]вн в изолированных ГМК сосудов и конфлуентном монослое этих клеток. Результаты этих исследований более подробно показаны в соответствующих разделах диссертации.

Основным выводом из полученных результатов является тот факт, что все из используемых в настоящей работе вазоконстрикторов при аппликации на ГМК из магистральных сосудов увеличивают [Са++]ш. Этот процесс происходит в условиях аналогичных для исследований указанных клеток методом точечной фиксации потенциала. В связи с этим становится очевид-

А 0.8 О.в 0.4 0.2

0.0 В

О.в

0.4

0.2

0.0 1

Д

о.в

0.4

0.2 0.0

Б

20 «

20 с

20i

во«

к

20«

20 S

Рисунок 5. Микроаппликация ангиотензина (ЮнМ) вызывает быстрое увеличение [Са++]ен на ГМК из аорты крысы (Indo 1АМ флуоресценция) (А-Г). Е - сигнал, полученный в отсутствии ионов Со++ в наружном растворе.

ным, что увеличение [Са++]ш, является основным фактором потенцирования выходящих потенциал-управляемых К+ токов (за счет Кса компоненты) при действии вазоконстрикторов.

4. Ингибирующее действие вазоконстрикторов на величину потенциал-управляемого Са++ тока

В наших экспериментах, при исследовании прекультивированных ГМК из аорты крысы в ответ на деполяризацию можно было регистрировать две

компоненты (Т- и Ь- компоненту) потенциал-управляемого Са++ тока.

Из данных литературы известно, что чувствительность указанных компонент кальциевого тока к действию эндогенных вазокострикторов, таких как норадреналин и АТФ различна. Одной из причин этого различия может быть то, что указанные выше компоненты Са++ тока формируются функционированием различных ионных каналов (проводимостью 8 и 25 пСим. соответственно).

В настоящей работе мы изучали влияние таких вазоконстрикторов как норадреналин, адреналин, АТФ, ангиотензин II, простагландины Ех и Е2 на Т- и Ъ,-компоненты Са4"1" тока на прекультивируемых ГМК из аорты крысы. На этом этапе работы было важно изучить какое участие принимает потенциал-управляемый Са++ ток и различные его компоненты в увеличении [Са++]вн при действии перечисленных выше вазоконстрикторов.

Микроаппликация норадреналина (КА) (ЮмкМ), на указанные выше клетки, вызывала обратимое ингибирующее действие на максимальное значение Т-компоненты кальциевого тока. Среднее значение амплитуды данного тока при микроаппликации этого агониста уменьшалось на 37+9% и при отмывке восстанавливалось до 87±4% (п=18) от контрольного значения (рис. ба-в).

Другие параметры интегрального тока, такие как потенциалы активации и реверсии, время инактивации и т.д. при этом не изменялись.

Хорошо известно (ОЪуа У. е1 а!., 1988; Кг^а Т. et а1., 1990), что аппликация №А вызывает освобождение ионов Са++ из внутриклеточных мест связывания, а это в свою очередь может приводить к кальций зависимому процессу инактивации потенциал-управляемого Са++ тока.

Однако в наших экспериментах при увеличении буферной емкости внутриклеточного раствора к ионам Са++ за счет использования 10 мМ ЕОТА или ЮмМ ВАВТА, блокирующий эффект №А на Са++ ток полностью сохранялся. При этом ЮмМ ЕСТ А было достаточно, чтобы

исключить активирующее действие NA на КСа выходящий ток, за счет увеличения [Са++]вн.

Использование известных антагонистов а- и р-адренорецепторов на мембране ГМК, не устраняло ингибирующее действие NA на величину Са++ тока. В то же время использование указанных антагонистов исключало вазоконстрикторное действие NA [Mulvany M.J.et al., 1980] на хвостовую и брыжеечную артерии крысы. Определенный интерес представляют данные по влиянию АН и простагландинов на Т- и L- компоненты потенциал-управляемого входящего кальциевого тока. Как было отмечено в результатах, полученных нами, так и другими исследователями [Drogmans G., et al., 1991], большинство вазоконстрикторов, одним из проявлений действия которых является увеличение [Са++]вш редуцируют величину потенциал-управляемого Са++ тока. Этот вывод вполне справедлив и в отношении действия АН и простагландинов группы Е.

Указанные вазоконстрикторы также ингибировали величину потенциал-управляемого Са++ тока в РЦК конфигурации, но в

различной степени. Так микроаппликация АН (ЮнМ) практически не оказывала никакого влияния на Т-компоненту Са++ тока. В ряде случаев нами было отмечено лишь незначительное уменьшение максимальной величины Т- компоненты Са++ тока -92±6% (п=11) от ее контрольного значения.

Что касается L- компоненты кальциевого тока, то аппликация АН приводила к необратимому снижению амплитуды этого тока до 37+18% (п=18) с незначительным восстановлением при отмывке до 52+15%, (п=18) от начального уровня (рис. бг-д).

Простагландины Ei и Е2 также оказывали ингибирующее действие в основном на L- компоненту Са++ тока, но несколько в меньшей степени, чем AIL Использование в составе внутриклеточного раствора высокой концентрации EGTA или ВАВТА не устраняло ингибирующее действие указанных агонистов на потенци-

110 рА

/Wash ^Control

Б

100| PA

SO

Г

ж.

100 ms

150 300

Time (s)

в 1.0ШУ21

305mu

60 m«

Рисунок 6. А-В - микроаппликация норадреналина (ЮмкМ) ингибирует величину Т- компоненты Са++ тока. Ангиотензин (ЮнМ) ингибирует величину Ь- компоненты Са++ тока (Д) и практически не изменяет параметры Т- компоненты (Г). УЬ.=-70мв (для Д - -40мв); Уком=-10мв.

ал-управляемый Са++ ток. Все это позволило нам, как и в случае исследования ингибирующего действия нора дрена лина, предположить участие в этом эффекте вторичных посредников и в частности й-белков.

Действительно, использование в пипеточном растворе негидролизуемого аналога ГДФ (ООРрБ, ОД мМ) полностью устраняло ингибирующее действие NA (рис. 7а). Отмеченный эффект был получен нами как при эквимолярном замещении ГТФ в составе

внутриклеточного раствора на ОБРрБ, так и просто при добавлении этого соединения во внутриклеточный раствор.

А Б

GDPßS

ößxA*

35 рА

95 ms

GDP/JS

All jf*

_| 25 pA

100 mi

Рисунок 7. Эквимолярное замещение во внутриэлектродном растворе 0,1мМ ГТФ на СОРДУ устраняет ингибирующее действие норадреналина (ЮмкМ) на Т- компоненту (А) и ангиотензина (10нМ) на Ь- компоненту (Б) Са+4" тока. УК--7Оме (А) и -40мв (Б); Уком=-10мв.

Приведенные выше результаты, позволяют сделать вывод, что в ингибирующем действии NA на амплитудное значение Т- типа Са++ тока принимают участие G-белки. Этот вывод подтверждается исследованиями других ученых на ГМК брыжеечной артерии кролика [Nelson М.Т. et.al., 1988], на ГМК трахеи быка [Welling L. et.al., 1990].

Аналогичный результат был нами получен и при устранении ингибирующего действия АН на L-компоненту Са++ тока (рис. 76).

Таким образом, в качестве заключения по настоящему разделу можно предложить следующие выводы:

1. Все исследованные в настоящей работе вазоконстрикторы оказывают ингибирующее действие на величину Т- и L- компонент Са++ тока, а следовательно и на потенциал-управляемый Са++ ток в целом;

2. Ингибирующее влияние вазоконтрикторов на потенциал-управляемый Са++ ток не удается устранить, используя специфические агонисты соответствующих рецепторов;

3. Изменения [Са++]вн, за счет использования во внутриклеточном растворе EG-TA (ЮмМ) или ВАВТА

(ЮмМ) не приводит к устранению ингибиторного влияния вазоконстрикторов на потенциал-управляемый Са++ ток, что исключает прямой эффек этого иона через 1Р3 зависимый механизм блокирования;

4. В ингибиторном влиянии вазоконстрикторов на амплитудное значение потенциал-управляемого Са++ тока принимают участие внутриклеточные посредники, в частности G-белки;

5. Потенциал-управляемые Са++ каналы не принимают участие, по крайней мере, в начальной фазе увеличения [Са++]вн в ГМК сосудов при действии вазоконстрикторов за счет экстраклеточного кальция.

5. Вазоконстрикторы активируют выходящий потенциал-управляемый К+ ток

Как было отмечено ранее, микроаппликация всех, исследуемых в настоящей работе вазоконстрикторов на ГМК сосудов, приводила к увеличению выходящего потенциал-управляемого тока в РЦК конфигурации. Основными причинами этого эффекта при действии вазоконстрикторов является увеличение [Са++]вн и деполяризация клеточной мембраны. При этом необходимо учитывать, что в составе выходящего ионного тока в ГМК магистральных сосудов основное участие принимают Кса каналы, активность которых, увеличивается как при деполяризации клеточной мембраны, так и особенно, при увеличении [Са++]БН. Активация Кса каналов, которая происходит после аппликации АТФ, в конфигурации cell-attached, вероятно как следствие увеличения [Са++]вн, показана на рис. 8а. Аналогичные результаты были получены и при аппликации АН в cell-attached и РЦК конфигурациях (рис. 8 б, в). При этом необходимо обратить внимание, что эксперименты по активированию Кса каналов в cell- attached отведении являются прямым доказательством вовлечения [Са++]вн и деполяризации клеточной мембраны в это потенцирование.

IJLJLl ,ILI,L.....IU.,.L

'UHmLkk

10pA

IMfflS

В

AH

JX

All

_J 10 pA

2s

Control

jvW^KW1^' --s j 0.1 nA

100 ms

Рисунок 8. (A) - Микроаппликация АТФ (100мкМ) в cell-attached. -конфигурации увеличивает активность КСа каналов. Аналогично действует ангиотензин (ЮнМ) в cell-attached - конфигурации (Б) и в РЦК конфигурации (В). Vh--40Me. Для В - Уком=40мв.

6. Изменение микровязкости липидного матрикса клеточной мембраны оказывает влияние на активность потепциал-управляемых К+ каналов

В наших ранних исследованиях было показано, что 60-80% выходящего калиевого тока в ГМК из магистральных сосудов человека и крысы реализуется через КСа (Bregestovsky P., et al., 1987). Основной

характеристикой указанных каналов является их зависимость от [Са++]БН и потенциала на мембране.

Сейчас практически доказано, что функционирование Кса каналов кроме этою, зависит как от подвижности липидов в мембранном матриксе клетки, так и от уровня фосфорилирования белков входящих в состав ионных каналов (Galle J., et al, 1990; Serebryakov V., et al., 1991; Carl A., et al., 1991).

Известно, что уровень липопротеидов низкой плотности (ЛНП), а также липидный состав клеточных мембран, в частности содержание холестерина, изменяется в процессе развития организма (Brown А.М. et al., 1986; Bregestovski P.D., et al, 1991). Уровень содержания холестерина в мембранах клеток в значительной степени определяет динамические свойства липидов, т.е. микровязкость мембраны, что в свою очередь сказывается на функционировании канал-формирующих белков.

Кроме этого известно, что ЛНП стимулируют в ГМК механизмы, аналогичные для Са++ мобилизующих агонистов, активирование которых приводит к увеличению [Са++]вн и сокращению клеток (Bochkov V., et al., 1992). Однако действие как ЛНП, так и холестерина на возбудимость клеточных мембран и функционирование ионных каналов практически не исследовано.

В наших исследованиях инкубация ГМК из аорты человека с ЛНП приводила к экспрессии на поверхности клеточной мембраны КСа каналов двух различных популяций со средним временем открытого состояния 3,5+1,5 мсек. (п=17) и 17,8+5,4 мсек. (п=5), по сравнению с гомогенной популяцией каналов в норме со средним временем открытого состояния 4,0+2 мсек. (п=15) (рис 9). Это позволило нам сделать вывод, что ЛНП способны изменять ионную проводимость фрагментов клеточной мембраны, не вовлекая рецепторный механизм их действия на клетку. На основании этого, а также учитывая тот факт, что ЛНП в силу своей липофильности могут свободно встраиваться в липидный слой мембраны, было предположено, что эти соединения могут влиять на

О 50 100

мембранный потенциал

400

х аои -

о ¡о юо

мебранный потенциал

Рисунок 9. Преинкубация ГМК с ЛНП (ЬОмкг/мл) приводит к появлению двух типов КСа каналов с высокой и низкой активностью, по сравнению с контролем. П - контроль; • и ▼ после инкубации с ЛНП в течение 24 часов.

активность ионных каналов через изменение микровязкости мембраны.

Дополнительно было обнаружено, что

микроаппликация дециноевой кислоты (0,9мМ) на изолированные фрагменты мембран ГМК из интимального слоя аорты человека приводила к увеличению вероятности нахождения КСа каналов в открытом состоянии (Ро) более чем в 40 раз при условии, что ни мембранный потенциал, ни [Са++]вн при этом не изменялись (рис. 10а). Это позволило нам получить дополнительное доказательство участия микровязкости липидного матрикса клеточной мембраны в регулировании К+ проводимости.

Для исключения участия эндогенных компонентов клетки в этом потенцировании были проведены эксперименты с применением синтетических жирорастворимых производных тетраэтиламмония (ТЭА).

Микроаппликация одного из таких соединений ИЭМ-1194 (363 м.в.), синтезированного в Институте Экспериментальной медицины г. Санкт-Петербурга, в концентрации 1мкМ приводила к увеличению вероятности нахождения каналов в открытом состоянии в5-10 раз по сравнению с контролем (рис. 106,в) на изоли-

julii

в

__TUIJ......1 ..

/ \

m.

MJLLi-JtPL

JILL

JIFR

IT

L

T

ХЦ 1ГШПГ 5ni] Ihlf o,o5 L1ГППГТ

LjuJi

Рисунок 10. Микроаппликация дециноевой кислоты (0,9мМ) в outside-out конфигурации (А), и ИЭМ-1194 (10мкМ) (Б) u inside-out конфигурации (В) увеличивает активность КСа каналов. Vh=70мв (А); 20мв (Б) и -7Оме (В).

рованных фрагментах клеточной мембраны ГМК из медиального слоя аорты человека как в inside-out, так и outside-out конфигурациях (Серебряков В.Н. и др. 1990).

Аналогичные эксперименты и с тем же эффектом проведенные в cell-attached конфигурации с экстраклеточной аппликацией ИЭМ-1194 позволяют сделать вывод, что активирующее действие на ионные каналы ИЭМ-1194 реализуется через изменение латеральной подвижности мембранных липидов или ее микровязкости.

В дальнейших наших исследованиях этот вывод был подтвержден измерением микровязкости клеточной

мембраны ГМК медиального слоя аорты человека с помощью ЭПР-зондов.

7. цАМФ- и цГМФ-зависимое фосфорилирование канал-формирующих белков активирует Кса капалы в ГМК

сосудов

В настоящее время однозначно показано, что увеличение концентрации в ГМК как цАМФ, так и цГМФ приводит к релаксации сосудистой стенки [Lincoln Т.М. & T.L. Cornwell., 1991]. Многие вазоактивные соединения, такие как аденозин, изопротеренол, ацетилхолин и простагландины способны при взаимодействии с ГМК изменять уровень циклических нуклеотидов в клетке.

Однако прямых доказательств участия циклических нуклеотидов в регулировании работы как КСа каналов, так и других типов потенциал-управляемых каналов в мембране свежеизолированных и прекультивируемых ГМК сосудов человека и животных в настоящее время очень мало.

В наших экспериментах добавление цАМФ и цГМФ на изолированные фрагменты клеточной мембраны ГМК из интимального слоя аорты человека (inside-out конфигурация) не приводило к изменению активности указанных каналов^ однако в условиях регистрации от фрагмента мембраны целой клетки (cell-attached конфигурация), указанная аппликация активировала Кса каналы в 3-5 раз.

Применение соответствующих протеинкиназ при реакциях фосфорилирования канал-формирующих белков на изолированных фрагментах клеточной мембраны показало их ключевую роль в активировании Кса каналов. Так при аппликации каталитической субъединицы РКА (lOU/мл) совместно с М§АТФ (ЮОмкМ) или каталитической и регуляторной субъединицы в комплексе с цАМФ (ЮОмкМ) и МяАТФ увеличивало Р0 Кса каналов в inside-out - конфигурации с 0,004 до 0,034 при потенциале на мембране -20мв (рис. 11а,в).

Аппликация только каталитической субъединицы РКА или М§АТФ не приводило к достоверному

изменению активности указанных каналов. На основании этого можно сделать вывод, что собственно каталитическая субъединица РКА не оказывает влияние на активность каналов, для ее активирования необходимо присутствие М§АТФ.

Кривая Больцмана - зависимость Р0 от мембранного потенциала при активирующем действии протеинкиназы А на Кса каналы сдвигалась влево по оси потенциалов, но оставалась параллельно контрольной в диапазоне потенциалов от 0 до 40мв. Эти результаты указывают на то, что активирование Кса каналов при аппликации РКА происходит не за счет изменения их потенциал-чувствительности (рис. 11а).

ConUol МдАГР РКА РКА4МВАТР

60 Б0--40 •• 30 20 + 10 о

Po(uen)/ Р<Чмшт.)

Control MgATP

Рисунок 11. РКА (lOU/мл) и каналы на изолированных интималъного слоя аорты конфигурации.

сО№Р РКС PKQ*cGMP+MflATP

PKG (би/мл) активируют КСа фрагментах мембраны ГМК человека только в inside-out

Аналогичные по типу результаты были нами получены при аппликации протеинкиназы G. Так аппликация PKG (611/мкл) совместно с цГМФ (ЮОмкМ) и М£АТФ (ЮОмкМ) на изолированные фрагменты клеточной мембраны ГМК интимального слоя аорты человека (inside-out конфигурация) увеличивало Р0 Кса каналов с 0,005 до 0,153, т.е. более чем в 30 раз при потенциале на мембране -20мв (рис. 116,г).

Добавление каждого из перечисленных выше компонентов отдельно друг от друга не приводило к достоверному изменению активности указанных каналов.

Кривая Больцмана при этом сдвигалась влево более чем на 42мв, что также демонстрирует значительное увеличение активности Кса каналов в большом (от -40 до 80мз) диапазоне потенциалов (рис. 116).

Таким образом, полученные результаты, с одной стороны, однозначно доказывают возможность регулирования активности ионных каналов протеинкиназами А и G, вероятно, через фосфорилирование канал-формирующих белков как на ГМК из сосудов человека, так и из сосудов животных. С другой стороны, доказывается участие РКА и PKG как необходимых звеньев в процессах цГМФ- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белковых структур Кса каналов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведено изучение потенциал-управляемых и рецептор-зависимых ионных токов в ГМК сосудов как в норме, так и под действием эндогенных вазоконстрикторов. При этом мы не рассматривали все возможные потенциал-управляемые ионные токи, а только те, которые вносят основной вклад в генерирование мембранного потенциала и сокращение ГМК из магистральных сосудов.

Так нами было показано, что при деполяризации клеточной мембраны ГМК способны генерировать

потенциал-управляемый Са++ ток (в наших случаях Т- и Ь- типов) и выходящий потенциал-управляемый К+ ток. Наибольший вклад, в генерирование которого, вносят Кса каналы большой проводимости.

В представленной работе нам удалось, используя специально разработанную методику культивирования ГМК сосудов, не только успешно регистрировать Са++ ток двух типов, но и изучить его изменения под действием вазоконстрикторов. При этом нами было экспериментально доказано, что ГМК из магистральных сосудов человека и крысы обладают всем комплексом потенциал-управляемых ионных токов характерным для возбудимой клетки.

Интересным на наш взгляд оказался и тот факт, что экспрессия Са++ каналов Т- и Ь- типов зависит от сроков культивирования ГМК. При этом электрофизиологические свойства Са++ каналов не зависели от процентного соотношения Т- и Ь- компонент тока на мембране ГМК.

Потенциал-управляемому Са++ току в ГМК сосудов отводится роль тригерного звена во многих кальций-зависимых процессах в клетке, но в основном это механизм сокращения.

Напряжение сосудистой стенки магистральных сосудов и сосудов сопротивления в конечном итоге зависит от [Са++]вн, источником которого являются как внутриклеточные кальциевые депо, так и экстраклеточное пространство. Поступление ионов Са++ в клетку из экстраклеточного пространства зависит от уровня мембранного потенциала и реализуется в основном через систему потенциал-управляемых Са++ каналов и обменных процессов.

Однако наши исследования показывают, что все изученные нами вазоконстрикторы, по крайней мере, на первом этапе своего действия, ингибируют величину потенциал-управляемого Са++ тока. В нашей работе доказывается, что в это ингибирующее влияние вовлекается система О-белков клетки и, следовательно, этот. процесс управляется клеткой активно после получения соответствующего сигнала с рецепторов. Показано, что при наших условиях экспериментов,

[Са++]вн в клетке действительно увеличивается под влиянием вазоконтрикторов, о чем однозначно позволяют утверждать эксперименты по флуоресцентному измерению этого параметра. Отсюда можно сделать вывод, что при аппликации вазоконстрикторов происходит освобождение Са++ из внутриклеточных мест его связывания и возможно его вход из экстраклеточного пространства, посредством обменных процессов, а не за счет потенциал-управляемого входа этого иона через Са++ каналы.

Следующим наиболее интересным звеном во взаимодействии "вазоконстриктор - ГМК" является развитие рецептор-зависимого тока.

В наших экспериментах микроаппликация всех исследуемых нами вазоконстрикторов приводила к развитию рецептор-зависимого тока на ГМК сосудов. Генерирование указанного тока было строго рецептор-зависимо. Изменение мембранного потенциала на клеточной мембране приводило как к модуляции величины этого тока, так и его кинетических параметров.

Учитывая полученные нами результаты, можно с уверенностью утверждать, что основным компонентом при генерировании рецептор-зависимого тока является активирование СГ каналов. Активирование хлорной проводимости как выходящего ионного тока (в наших случаях это регистрировалось как входящий ток, т.к. переносится отрицательный заряд в РДК конфигурации), вероятно, и приводит к фазе начальной деполяризации клеточной мембраны при действии вазоконтрикторов. Указанная фаза является тригерным звеном, приводящим к освобождению ионов Са++ из внутриклеточных депо и увеличению [Са++]вн.

Необходимо отметить, что в некоторых случаях, например при аппликации АТФ, при развитии рецептор-зависимого тока активируются и катион неспецифические каналы, которые могут проводить ионы Са++ и Ка+, но и в этом случае активирование хлорной проводимости принимает значительное участие в генерировании рецептор-зависимого тока.

Реполяризация клеточной мембраны ГМК после действия вазоконстрикторов происходит за счет активации выходящих потенциал-управляемых К+ токов. Это было подтверждено во всех наших экспериментах как при регистрации амплитудных значений выходящих интегральных токов (РЦК конфигурация), так и увеличении активности одиночных Кса каналов (cell-attached конфигурация).

Основное внимание в наших исследованиях было уделено "нетрадиционным", но очень важным механизмам управления потенциал-зависимыми ионными каналами. Прежде всего, это регуляция активностью К+ каналов через изменение микровязкости липидного слоя мембраны и процессов фосфорилирования канал-формирующих белков.

В последствии, проведя эксперименты по целенаправленному изменению микровязкости клеточной мембраны без вовлечения метаболитических процессов в клетке, мы показали, что уменьшение микровязкости мембраны приводит к активированию К^ каналов.

Эти результаты очень важны, т.к. с одной стороны, позволяют установить взаимосвязь между функционированием белковых молекул ионных каналов и их липидным окружением, а с другой стороны, показывают, что процессы (или агонисты), приводящие к изменению микровязкости клеточной мембраны могут оказывать влияние на возбудимость ГМК сосудов в целом.

Влияние уровня циклических нуклеотидов в клетке на электрофизиологические свойства ГМК сосудов было отмечено сравнительно давно.

В наших исследованиях мы изучали влияние процессов фосфорилирования только на примере Кса каналов большой проводимости. Это может быть объяснено, прежде всего, тем, что указанный тип ионных каналов вносит основной вклад в генерирование выходящих потенциал-управляемых токов в ГМК магистральных сосудов.

Проведенные нами эксперименты показывают, что усиление процессов фосфорилирования приводит к активированию Кса каналов. Этот процесс выражается в

увеличении среднего времени нахождения каналов в открытом состоянии, а также в частоте их срабатывания.

Увеличение концентрации цАМФ или цГМФ в ГМК активирует указанный тип ионных каналов в cell-attached конфигурации и увеличивает величину выходящих интегральных К+ токов в РЦК конфигурации. На изолированных фрагментах мембраны при этом необходимым звеном оказалось присутствие протеинкиназ (соответственно А или G).

В представленной работе доказывается, что фосфорилированию подвержены только

цитоплазматические участки белковой молекулы Кса канала, это послужило дополнительным доказательством асимметрии в структурной организации этого типа ионного канала.

В настоящей работе мы рассмотрели лишь основные звенья процессов электромеханического сопряжения в ГМК сосудов как в норме, так и под воздействием эндогенных вазоконстрикторов. При этом основное внимание было уделено тем процессам, которые мы могли реально подтвердить или опровергнуть полученным экспериментальным материалом.

ВЫВОДЫ

1. Прекультивируемые гладкомышечные клетки магистральных сосудов человека и крысы в ответ на деполяризацию способны генерировать входящие (кальциевые) и выходящие (калиевые) потенциал-управляемые интегральные ионные токи. Это экспериментально доказывает возбудимый тип указанных клеток.

2. Входящие потенциал-управляемые интегральные токи при деполяризации ГМК из аорты крысы генерируются за счет активирования Са++ каналов в основном Т- и L-типов.

3. Выходящие потенциал-управляемые токи при деполяризации ГМК магистральных сосудов человека и крысы опосредуются функционированием К+ каналов, причем основную функциональную роль выполняют КСа каналы.

4. Взаимодействие ГМК магистральных сосудов с такими вазоконстрикторами как адреналин, норадреналин, АТФ, ангиотензин II и простагландины Е приводит к генерированию клетками входящего рецептор-зависимого тока, который опосредуется через активирование неселективных ионных каналов с преимущественной проницаемостью для анионов хлора и приводит к начальной фазе деполяризации мембраны клеток.

5. Взаимодействие перечисленных выше вазоконстрикторов с ГМК сосудов, по крайней мере, на первом этапе юс действия приводит к ингибированию величины Т- и Ь- компонент Са++ тока а также вызывает активирование выходящего КСа тока, как за счет деполяризации клеточной мембраны, так и увеличения [Са++]вн.

6. Увеличения [Са++]вк в ГМК сосудов происходит в основном за счет освобождения этого иона из внутриклеточных мест связывания, а также экстраклеточного пространства, вовлекая обменные ионные механизмы.

7. Активность Кса каналов, не Са++-зависимым образом увеличивается при уменьшение микровязкости липидного бислоя клеточной мембраны, что оказывает влияние на возбудимость ГМК сосудов в целом.

8. Активности Кса каналов в мембране ГМК магистральных сосудов человека и крысы может непосредственно регулироваться через цАМФ- и цГМФ-зависимое фосфорилирование канал-формирующих белков, что оказывает прямое действие на электрофизиологический статус ГМК сосудов.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Брежестовский П.Д., Замойский В., Серебряков В.Н., Топтыгин А., Антонов А. (1985) Кальций-управляемые калиевые каналы большой проводимости в культивируемых гладкомышечных клетках из аорты человека. Биологические мембраны, 2(5):487-498.

2. Bregestovski P., Zamoyski V., Serebryakov V..Toptvgin A., Antonov А. (1985) Patch-clamp investigation of cultured smooth muscle cells from human aorta. Abstracts of 7-th International Symposium on Atherosclerosis, Melbourne, p. 107.

3. Bregestovski P., Zamoyski V., Serebryakov V. (1985) Calcium-activated potassium channels in membrane of smooth muscle cells. In: Physiology and biochemistry of mediator processes, Moscow, p.50.

4. Bregestovski P., Zamoyski V., Serebryakov V. (1985) Pharmacology of Ca-activated К channels in human aorta smooth muscle cells. In: Metal ionic, proteins and membranes. Algave, Portugal, p.70.

5. Брежестовский П.Д., Замойский В., Серебряков В.Н. (1986) Действие хинина на Са++-активируемые К+ каналы в гладкомышечных клетках аорты человека. Биологические мембраны, 3(6): 601-608.

6. Bregestovski P., Zamoyski V., Serebryakov V- Stinnakre J., Printseva О., Tyurmin A. (1986) Comparative characteristic of Ca-dependent potassium channels in smooth muscle cells membrane from foetal and adult human aorta. Abstr. of 4-th Congress of Cardiologists, Moscow, p.103.

7. Серебряков B.H.. Замойский B.JI., Байденков С., Брежестовский П.Д. (1987) Действие ингибиторов кальмодулина на активируемые К+ каналы в мембране гладкомышечных клеток из аорты человека. Биологические мембраны, 4, (11):1164-1173.

8. Bregestovski P., Serebryakov V.. Stinnakre J.,Zamoyski V. (1987) Ca-dependent K+ channels in the membrane of cultured smooth muscle cells from adult or foetal human aorta. In: Abstract book of 8th Int. Symposium on Atherosclerosis, Rome, p. 104.

9. Bregestovski P., Printseva O., Serebryakov V..Stinnakre J., Tyurmin A., Zamoyski V. (1988) Comparison of Ca-dependent

K+ channels in

the membrane of smooth muscle cells isolated from adult and foetal human aorta. Pflugers Arch., 413:8-13.

lQ.Serebrvakov V.. Zamoyski V., Baldenkov G.,Bregestovski P. (1988) Effect of calmodulin inhibitors on Ca2+-activated K+ channels in the membrane of smooth muscle cells from human aorta. In:Abstract book of 8-th Int. Symposium on Atherosclerosis, Rome, p.847.

ll.Bolotina V- Serebrvakov V.. Bregestovski P. (1988) Membrane fluidity modifies Ca2+-dependent K+ channel activity in smooth muscle cells from human aorta. In:Physiology and Pharmacology of Smooth Muscle. Varna, Bulgaria, p.40.

12.Serebrvakov V., Zamoyski V., Stinnakre J.,Bregestovski P. (1988) Effect of low density lipoproteins on Ca-activated K+ channels in smooth muscle cells from human aorta. In:Physiology and Pharmacology of Smooth Muscle. Varna, Bulgaria, p.116.

13.Bregestovski P.D., Bolotina V.M., Serebrvakov V.N. (1989) Fatty acid modifies Ca^"^-dependent potassium channels activity in smooth muscle cells from human aorta. Proc. of the Royal Society of London, 237:259-266.

14.Zamoysky V., Serebrvakov V.. Schubert R. (1989) Activation and blocking effects of divalent cations on the calcium-dependent potassium channels of high conductance. Biomed. Biochim. Acta, 5/6: S388-392.

15.Serebrvakov V.. Bregestovski P., Zamoyski V.,Stinnakre J. (1989) Effect of quinine and calmodulin inhibitors on calcium- dependent potassium channels of human aorta. Pflugers Arch. 414:184/185.

16.Serebrvakov V.. Takeda K_ (1989) Effect of epinephrine on the calcium currents of smooth muscle cells from rat aorta. In: Ionic channels in biological membranes. Moscow; p.90.

17.Serebrvakov V., Zamoyski V., Printseva O.,Stinnakre J., Tyurmin A., Bregestovski P. (1990) Effect of low-density lipoproteins on Ca-dependent K+ channels in the membrane of smooth muscle cells isolated from human foetal aorta. BiomedSci., 1:89-94.

18.Serebrvakov V.T Bregestovski P. (1990) Ionic currents in isolated smooth muscle cells from human coronary. In: Ionic channels in biological membranes. Moscow, p. 81.

19.Schubert R, Serebrvakov V. (1990) Effects Ba2+ and Ca2+ ions on calcium-dependent potassium channels of human aorta. In: Ionic channels in biological membranes. Moscow, p.102.

20.Серебряков B.H.. Шуберт P., Гмиро B.E., Брежестовский П.Д. (1991) Третичный аммониевый катион, аналог тетраэтиламмония, одновременно блокирует и активирует Са+^-зависимый К"*" ток гладкомышечных клеток сосудов человека. Биологические мембраны, 9:959-965.

21.Schubert R, Serebrvakov V. (1991)А tertiary relative of the Ca~ dependent maxi К channel blocker tetraethylammonium also activates the Ca-dependent maxi К channel. Abstracts "Regional Meeting of the ITJPS", Prague, p.115

22.Serebrvakov V.. Takeda K. (1991) Ca currents from rat aortic myocytes and the effects of noradrenaline. J.Molec.Cell.Cardiol. 23 (Suppl IY), S56.

23.Serebrvakov V.. Takeda K. (1992) Voltage-dependent calcium current and the effect of adrenergic modulation in rat aortic smooth muscle cells. Phil.Trans.R.Soc.Lond.B. 337:37-47.

24.Snetkov V., Von der Weld P., Serebryakov V..Orallo F., Bergmann C., Takeda К (1992) Actions of ATP on rat aortic myocytes. 3 Colloque Canaux Ioniques, Carry-le-Rouet, France.

25.Serebrvakov V., Takeda K. (1992) Voltage-dependent calcium current in rat aortic myocytes. 3th Colloque Canaux Ioniques, Carry-le-Rouet, France.

26.Von der Weid P-Y., Serebryakov V.N., Orallo F., Bergmann C, Snetkov V.A., Takeda K. (1993) Effects of ATP on cultured smooth muscle cells from rat aorta. Br.J.Pharmacology, 108:638-645.

27.Мартынова E., Серебряков В.. Ольшанская А, Злобина E, Бабичев В. (1993) Трансмембранные ионные токи в инсулин-секретирующих клетках клона RIN-5AH. Биологические мембраны, 10:424-433.

28.Serebrvakov У.. Schubert R. (1993) Tertiary ammonium ion, analogue of tetraethylammonium, blocks and activates Ca-activated К current in the cells from human vessels. European Atherosclerosis society 62nd EAS congress. Jerusalem, Israel, 5S, p.91.

29.Andreeva E., Serebrvakov V. (1993) The influence of modified LDL on intercellular communications via gap junctions in primary culture

of human aortic sells. European Atherosclerosis society 62nd EAS congress. Jerusalem, Israel, 5S, p.55.

3Q.Serebryakov V., Zakharenko S., Snetkov V., Takeda K. (1994) Effects of prostaglandins Ei and E2 on cultured smooth muscle cells and strips of rat aorta. Prostaglandins, 47:353-365.

31 .Serebryakov V., Schubert R., Zakharenko S., Hopp H-H. (1994) Prostaglandin activation of Ca-dependent K-channels can be accompanied by a dilation as well as a constriction of rat blood vessels. 6th International symposium on Pharmacological control of calcium and potassium homeostasis. Florence (Italy) p.32.

32.Fomina M., Shipachov V., Nesterov A., Gmiro V.. Serebrvakov V. (1994) Effects of tertiary and quaternary ammonium ions on smooth muscle cells and rings of rat aorta. 6th International symposium on Pharmacological control of calcium and potassium homeostasis. Florence (Italy) p.48.

ЗЗ.Захаренко С., Серебряков В. (1994) Действие простагландинов группы Е и их нитропроизводных на гладкомышечные клетки аорты крысы. Тезисы Международного симпозиума "Биологическая подвижность", г, Пущино, Россия.

34.Schubert R., Mewes Н., Serebrykov У.. Hopp H-H. (1994) Iloprost dilates resistance vessels by activating potassium channels. J.Mol.Cell.Cardiol., 26, LXV.

35.Schubert R., Mewes H., Serebrykov V.. Hopp H-H., Pfeiffer C. (1994) Iloprost-induced modulation of potassium channels and of protein kinase A. Pflugers Arch., 426: R122.

36.Andreeva E, Serebrvakov V. Orekhov A. (1995) Gap junction communication in primary culture of cells derived from human aortic intima. Tissue & Cells, 27, 5: 591-597.

37.Nesterov A., Serebrvakov V. (1905) On-line analysis of continuous patch-clamp data. Abstracts 1st PEPS Congress, Maastricht. Pflugers Arch., 430 (Suppl.4): R130.

38.Zakharenko S., Serebrvakov V. (1995) Ionic currents activated by prostaglandins E in smooth muscle cells. Abstracts 1st FEPS Congress, Maastricht, Pflugers Arch., 430 (Suppl.4): R141.

39.Schubert R. Serebrvakov V.. Mewes H., Engel H., Hopp H-H. (1995) Iloprost activates calcium-dependent potassium channels in vascular

smooth muscle cells: Role of cAMP-dependent protein kinase. Pflugers Arch., 429: R67.

40.Hopp H-H-., Schubert R., Serebryakov V., Mewes H. (1995) The level of the spontaneous myogenic tone of rat tail resistance arteries is determined by protein kinase A activation of Ca-activated K-channels. Pflugers Arch., 429: R72.

41.Zakharenko S., Bolz St S., Schubert R., Pohl U., Bezuglov V., Snetkov V., Serebrvkov V. (1995) Effects of E-series prostaglandins and their novel nitro-derivatives on smooth muscle of small arteries. Abstracts 1st Eur. Congress of Pharmacology, Milan.

42.Serebryakov V., Zakharenko S. (1995) Prostaglandin Ej and prostanit dilate rat aorta with different mechanisms. J.Mol.Cell.Cardiol.,27: A100.

43.3ахаренко С., Pohl U,, Серебряков В. (1996) Действие простагландинов группы Е на мембранный потенциал, концентрацию свободного кальция и механическую активность гладкомышечных клеток аорты крысы. Биологические мембраны, 13(4), 42-54.

44.Schubert R., Serebryakov У.. Engel Н, Норр Н-Н. (1996) Iloprost activates Ca-activates К channels of smooth muscle cells: role of cAMP-dependent protein kinase. AmJ.Physiol., 40: C1203-C1211;

45.3ахаренко С., Шипачев В., Гусев А., Серебряков В. (1996) Роль калиевых каналов в зависимом от эндотелия расслаблении брыжеечной артерии крысы. ДАН: 15-23.

46. Zakharenko S., Serebryakov У. (1996) A Novel Nitroderivative of Prostaglandin Ej-Prostanit Dilates a Rat aorta Via Activation of Guanylate Cyclase. 16th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension, 23-27 June, Glasgow, UK, P221.

47.Serebrvakov V.. Schubert R. (1996) cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Activate-Human Smooth Muscle Calcium-Activated Potassium Channel. 16th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension, 23-27 June, Glasgow, UK, P1260.

48.Shipachov V., Serebryakov V.. Zakharenko S. (1996) The Role of KCI Reconstruction of Rat Aorta in Endothelium-Mediated Responses to

acetylcholine. 16th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension, 23-27 June, Glasgow, UK, S375.

49.3ахаренко C.C., Шипачев В.Б., Серебряков B.H. (1996) Действие блокаторов калиевых каналов на зависимое от эндотелия расслабление брыжеечной артерии крысы. Тезисы на Первом Российском конгрессе по Патофизиологии. Москва., 17-19 октября 1996 г. Стр. 185.

5 О.Серебряков В.Н.. Шуберт Р., Захаренко С. (1996) Активация Са++-зависимых К+ каналов простагландинами сопровождается как дилатацией, так и констрикцией кровеносных сосудов крысы. Тезисы на Первом Российском конгрессе по Патофизиологии. Москва., 17-19 октября 1996 г. Стр. 187.

51.Zakharenko S.S., Serebrvakov Y.N. (1996) Effects of prostaglandin E on membrane potential, intracellular free calcium concentration and mechanical response of rat aortic smooth muscle cells. Membr. and Cell Biol., 10(4):411-420.

52.Schubert R., Serebrvakov V.. Meves H., Hopp H-H. (1997) Iloprost dilates rat small arteries: role of KATP - and KCa-channel activation by cAMP-dependent protein kinase. Am. J. Physiol. 272: H1147-H1156.

53.Serebrvakov V.N,. Schubert R., Pfeiffer С. (1997) KCa-channel Ca-sensitivity is not altered in arterial smooth muscle from spontaneously hypertensive rats. Pflugers Archiv 433(6):R54, 0-163.

54.Шипачев B.B., Тимошин A.A., Гмиро В.Е., Гусев A.C., Савина М.В., Серебряков В.Н. (1997) Третичный аммониевый катион вызавает сокращение сегментов аорты крысы и увеличивает подвижность липидов в мембране гладкомышечных клеток. Биологические мембраны. 14(3):262-269.

55.Schubert R., Serebrvakov V.N. (1997) Die Kalziumsensitivitat des kalziumaktivierten kaliumkanals glatter muskelzellen aus der schwanzarterie spontan hypertensiver ratten ist nicht verändert. Nieren- und Hochdruckkrankheiten 26:202.

56.Serebryakov V.. Snetkov V., Lynch J., Takeda K. (1997) Effects of angiotensin II on smooth muscle cells from rat aorta. Circ. Res, (In press).

57.Serebrvakov V.. Schubert R. (1997) Effect of iloprost on vascular smooth muscle KCa current is smaller in SHR than in WKY. J. of Hypertension, (In press).