Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль сероводорода в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль сероводорода в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток"

На правах рукописи

Смаглий Людмила Вячеславовна

РОЛЬ СЕРОВОДОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

03.03.01. — физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2013

2 7 ш

005062311

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Баскаков Михаил Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий Центральной научно-исследовательской лабораторией

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России Банков Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры медико-биологических дисциплин

ФБОУ ТГПУ Минобрнауки РФ Яхонтов Сергей Владиславович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Защита состоится ¿¿ЛР/Ыг 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (634050 г. Томск, Московский тракт, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан "13 " 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Петрова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сероводород (H2S) наряду с другими газообразными сигнальными молекулами, такими как монооксид азота и монооксид углерода, относят к группе газотрансмиттеров. Он, как и другие газовые посредники, свободно проникает через плазматическую мембрану и включает внутриклеточную сигнализацию рецептор-независимым способом [Suematsu, 2003].

H2S вовлечен в процессы как внутриклеточной, так и межклеточной коммуникации и участвует в регуляции большого числа клеточных функций, включая сосудистый тонус [Zhao W., Wang R., 2002], работу центральной нервной системы [Abe К., Kimura H., 1996], воспаление [Lowicka Е., Beltowski J., 2007], пролиферацию, дифференцировку, гибель клеток [Yang G. et al., 2004] и др. В то же время механизмы оперирования H2S как сигнальной молекулы остаются недостаточно изученными. Общепризнанным является сосудорасслабляющее действие сероводорода, однако нерешенными остаются вопросы о мембранных и молекулярных мишенях, через которые реализуются такие эффекты. Расслабление мембраны сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) при действии сероводорода связывают с активацией АТФ-чувствительных К+- каналов (КАТф), гиперполяризацией мембраны и уменьшением потенциал-зависимого входа Са2+ [Mancardi D et al., 2009; Leffler CW et al., 2011].

Значительно менее изучено влияние сероводорода на другие системы трансмембранного переноса ионов. Так, по некоторым данным, H2S активирует калиевые каналы, чувствительные к 4-аминопиридину [Cheang W.S. et al., 2010], Са2+- активируемые калиевые каналы малой (SKca) и промежуточной проводимости (IKCa) [Wang R., 2011], потенциал-зависимые Са2+ каналы L- типа [Tian XY et al, 2012], С17НС03" - обменник [Liu Y-H, Bian J-S., 2011].

Спорным остается вопрос о возможности и механизмах констрикторного действия сероводорода. Возбуждающее действие сероводорода на СГМК было описано в работе J.J. Lim (2008), которая объяснила этот феномен снижением

внутриклеточного содержания цАМФ вследствие ингибирования сероводородом аденилатциклазы (АЦ).

Резюмируя изложенное, можно заключить, что, несмотря на довольно многочисленные исследования действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц (СГМ), многие вопросы не нашли удовлетворительного решения. Это касается как самих эффектов, вызываемых Н28 в СГМК, так и мембранных механизмов, вовлекаемых этим газотрансмиттером в реализацию своего действия.

Цель исследования: Исследовать влияние и механизмы действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц.

Задачи исследования

1. Исследовать действие донора Н28 гидросульфида натрия на механическое напряжение сосудистых гладких мышц аорты крысы, индуцированное деполяризацией мембраны гиперкалиевым раствором Кребса.

2. Изучить эффекты гидросульфида натрия в сосудистых гладких мышцах аорты крысы, предсокращенных стимуляцией а,-адрснергических рецепторов.

3. Определить вклад Ыа+, К+, 2СГ -котранспорта в механизмы действия сероводорода на механическое напряжение гладких мышц аорты крысы.

4. Установить роль изменений калиевой проводимости мембраны в механизмах действия Н28 на сократительную активность сосудистых гладкомышечных клеток.

Положения, выносимые на защиту 1. Действие сероводорода на гладкомышечные клетки аорты крысы разнонаправлено и зависит от концентрации и природы предсокращения сосудистых гладких мышц. При сокращении, индуцированном деполяризацией мембраны в гиперкалиевом растворе Кребса, сероводород в малых (до 100 мкМ) концентрациях увеличивает механическое напряжение изолированных сегментов аорты, а при повышении концентрации - вызывает расслабление последних. В сосудистых гладких мышцах, предсокращенных фенилэфрином,

сероводород во всех использованных концентрациях вызывает дозозависимое расслабление.

2. Одной из ключевых мишеней сероводорода является Na+, К+, 2С1" -котранспортер, через активацию которого реализуется констрикторное действие этого газотрансмиттера на гладкие мышцы аорты крысы.

3. В основе релаксирующего действия сероводорода на сосудистые гладкие мышцы лежит увеличение калиевой проводимости мембраны: в СГМК, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, главным образом, за счет кальций-активируемого, а при предсокращении, индуцированном возбуждением сп-адренорецепторов, - АТФ-чувствительного ее компонентов.

Научная новизна. Установлено разнонаправленное действие сероводорода на механическое напряжение сосудистых гладкомышечных клеток аорты крысы. Впервые идентифицирована новая мишень - Na+, К+, 2СГ-котранспортер, который вовлечен в механизмы регуляции сероводородом сократительной активности сосудистых гладких мышц, и продемонстрирована его роль как ключевого эффектора вазоконстрикторного действия сероводорода. Установлено, что открывание кальций-активируемых калиевых каналов малой и промежуточной проводимости мембраны сосудистых гладкомышечных клеток является основным механизмом релаксации гладких мышц аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, а открывание АТФ-чувствительных калиевых каналов - расслабления СГМК, предсокращенных фенилэфрином.

Научно-практическая значимость. Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных знаний о механизмах внутриклеточной коммуникации. Определены механизмы констрикторного и релаксирующего действия газового посредника H2S. Полученные данные дополняют сведения о механизмах регуляции тонуса кровеносных сосудов газотрансмиттерами. Результаты исследования могут быть использованы при разработке молекулярных технологий управления поведением клеток путем модификации газовой коммуникации в СГМК, местной профилактики спастических

состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов. Сформулированные в работе положения используются в курсах лекций и практических занятиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета. Полученные данные и методические приемы используются в научных исследованиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета. Области применения полученных данных: физиология, биофизика, фармакология.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты исследования и их обсуждение», заключения. Библиография включает 222 ссылок, в том числе 43 - работы отечественных авторов и 179 — зарубежных. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 3 таблицами.

Апробация работы. Основные результаты диссертации обсуждены на всероссийских и международных конгрессах: 74-я итоговая студенческая научно — практическая конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения профессора A.M. Дыхно (Красноярск, 2010), Всероссийская 69-я итоговая научная студенческая конференция, посвященная 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (Томск, 2010), XI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), V Международная научная конференция «Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии», посвященная 100 - летию со дня рождения профессора Павла Дмитриевича Харченко и 65-летию НИИ физиологии имени Петра Богача (Киев, 2010), 21st European meeting on hypertension and cardiovascular prevention (Milan, 2011), 22nd European meeting on hypertension and cardiovascular prevention (London, 2012).

Исследования поддержаны грантами федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-

2013 годы: «Разработка технологических основ селективного управления внутриклеточной газовой сигнализацией» (государственный контракт № 02.740.11.5031 от 20.06. 2009 г.), «Селективная модуляция внутриклеточной коммуникации как основа молекулярных технологий управления функциями клеток» (государственный контракт № 14.740.11.0932 от 12.04.2011 г.), «Гипоксия как фактор регуляции транскриптома и сократительных свойств кровеносных сосудов» (соглашение 8487 от 23.10.2012 г.).

Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке идеи и планировании исследования, анализировал литературу. Автором выполнена экспериментальная часть работы, проведена статистическая обработка полученных данных и интерпретация результатов.

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из которых 4 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Исследование сократительной активности гладкомышечных сегментов аорты крысы методом механографии. Исследование проводилось с использованием сертифицированной четырехканальной механографической установки Myobath II и аппаратно-программного комплекса LAB-TRAX-4/16 (Германия). Объектом исследования служили деэндотелизированные сегменты грудного отдела аорты 11-13 недельных крыс - самцов линии Wistar, которых умерщвляли декапитацией под глубоким наркозом (внутрибрюшинное введение пентобарбитала натрия (Nembutal, 70 мг/кг)) в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Эндотелий удаляли вращением деревянного манипулятора в просвете сосуда. Сосудистые сегменты предварительно растягивали нагрузкой 500 мг и фиксировали с помощью стальных крючков в термостатируемых камерах объемом 10 мл, заполненных стандартным физиологическим раствором Кребса. Механическое напряжение (МН) гладкомышечных препаратов измеряли в изометрическом режиме. Амплитуду контрольных сократительных ответов сегментов на действие гиперкалиевого раствора

Кребса (эквимолярное замещение 30 мМ №С1 на КС1) регистрировали после 40-50 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса и принимали за 100%. В экспериментах с использованием в качестве предсокращающего фактора фенилэфрина (ФЭ) амплитуду сократительных ответов рассчитывали в процентах от амплитуды контрольного ФЭ-индуцированного сокращения (10 мкМ).

Относительный вклад эффекта блокирования ¡-тых калиевых каналов определяли как отношение расслабления сосудистых сегментов в присутствии блокатора ¡-тых каналов к сумме расслаблений СГМ в присутствии каждого из блокаторов калиевых каналов, согласно формуле [Лисенков А.Н., 1979]: п = л1> +й1, > гДе ЛР| - величина расслабления сосудистых сегментов

(%) при действии №Н8 в концентрации, близкой к ЕС5о, в присутствии блокатора исследуемых каналов, ЛР12.з,4 " величины расслабления (%) в присутствии каждого из используемых блокаторов. Чем меньше относительная величина расслабления сосудистых сегментов в присутствии блокатора данного типа каналов, тем больше степень участия этих каналов в механизмах расслабляющего действия сероводорода.

Изучение активности А'я+, К*, 2СГ - котранспорта радионукпидным методом. Исследование проводилось на свежевыделенных СГМК аорты крысы, которые использовали в 3-8 пассажах (Ьопга^аИсегеуШе, МО, США). Активность Ыа", К+, 2СГ -котранспорта (1МКСС) изучали как буметанид-чувствительный компонент входа 8бЯЬ+. Радиоактивность среды инкубации и клеточного лизата измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного анализатора. Скорость входа К+ (8бЯЬГ) (V (нмоль на мг белка за 10 мин) рассчитывалась как У=А/ат, где А - радиоактивность образцов (ерш), а -радиоактивность в среде (ерт/нмоль) и т - содержание белка)

измеряли с помощью модифицированного метода Лоури [Ог1оу Б.М. е1 а1., 1996].

Используемые реактивы. 4-аминопиридин (Sigma); гидросульфид натрия (Sigma); глибенкламид (Sigma); тетраэтиламмония хлорид (Serva); фенилэфрин (Sigma); форсколин (Sigma); харибдотоксин (Sigma), буметанид (Sigma), S6RbCI (Perkin Elmer ,Wattman, MA, USA).

В качестве донора сероводорода использовали гидросульфид натрия (NaHS). Раствор NaHS готовили непосредственно перед использованием, pH раствора поддерживали в пределах 7.35-7.40.

Статистическая обработка. Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 7.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (Х±т). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U test). Для проверки однородности двух зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test). Достоверность различий определялась при р <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование влияния сероводорода на сократительную активность гладких мышц аорты крысы. NaHS в концентрациях 5-1000 мкМ не влиял на исходное МН гладких мышц аорты. Гиперкалиевый раствор Кребса (30 мМ KCl) приводил к развитию поддерживаемого сократительного ответа. NaHS в концентрациях 5, 10, 50 мкМ вызывал увеличение МН сосудистых ГМ на 9.1±2.5 %, 15.9±3.4 % и 18.5±3.5 %, соответственно (п=9, р<0.05). При действии 100 мкМ NaHS наблюдался двухфазный ответ СГМК: транзиторное увеличение МН на 27.5±5.7 % с последующим его снижением на 15.3±2.4 % (n=9, р<0.05). NaHS в концентрациях 500 и 1000 мкМ снижал МН на 35.1±7.5 % и 51.7±5.0 % (п=9, р<0.05), соответственно, от величины контрольного сокращения в гиперкалиевом растворе Кребса (Рис.1 А).

А 17,5

15

я

12,5

X

| 1»

С

X 7,5

1 5

X

|

2,5

0

NatlS S-IB« 5*]«s 5*1(1*

30 mM KCl

^

В 17,5

X

£ 15

«J

I « 12,5

i

О. С 10

I

о 7,5

о

ГГ

I

i

5 2,5

NaHS s-lfl* s"»v i'ja'

0,5 1,0 V 2,0 2,5 3,0 Время, часы

Рис. 1. Влияние ЫаНЗ (5-1000 мкМ) на механическое напряжение гладкомышечных сегментов аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса (А) и фенилэфрином (Б). По оси ординат - механическое напряжение (мН). По оси абсцисс - время (часы).

Фенилэфрин (ФЭ) в концентрации 10 мкМ вызывал увеличение МН, сравнимое по амплитуде с сокращением СГМ при действии гиперкалиевого раствора Кребса. Добавление в перфузионный раствор 5, 10, 50, 100, 500, 1000 мкМ NaHS вызывало дозозависимое расслабление сосудистых сегментов, предсокращенных ФЭ, на 10.2±4.1 %, 17.0±6.2 %, 37.9±7.3 %, 55.8±7.2 %, 66.2±7.5 % и 82.2±8.1 % (п=6, р<0.05), соответственно, от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения (Рис. 1Б).

Следовательно, направленность изменения МН гладкомышечных сегментов аорты крысы зависит от концентрации сероводорода и способа индукции сокращения. В самом деле, NaHS во всем диапазоне использованных концентраций дозозависимо расслаблял сосудистые сегменты, предсокращенные ФЭ. В сосудистых сегментах, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, NaHS в малых (до 100 мкМ) концентрациях увеличивал, а в больших (500, 1000 мкМ) снижал МН сегментов аорты.

3.2. Исследование механизмов констрикторного действия сероводорода на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса. Индуктор освобождения кальция из

саркоплазматического ретикулума (СПР) кофеин (1мМ) обращал констрикторное действие 5, 10, 50, ЮОмкМ NaHS на релаксирующее. Величина

расслабления составила 3.9±1.2 %; 5.1±1.9 %; 11.8±4.6 % и 19.6±3.9% (п=6, р<0.05), соответственно, от величины контрольного сокращения в гиперкалиевом растворе Кребса. Расслабляющее действие 500 мкМ NaHS статистически значимо не изменялось, тогда как действие 1000 мкМ NaHS усиливалось: величина расслабления составила 73.8±6.0% (п=6, р<0.05) от величины контрольного

сокращения сегментов аорты в гиперкалиевом растворе Кребса

Таким образом, истощение кофеин-чувствительного Са2+- депо саркоплазматического ретикулума СГМК устраняло констрикторное действие низких концентраций сероводорода. Соответственно, можно предположить, что малые концентрации (5-100 мкМ) NaHS индуцируют сократительные ответы сосудистых сегментов за счет освобождения ионов Са2+ из СПР. Вместе с тем, Ca2f является кофактором, необходимым для открывания Са2+-активируемых хлорных каналов. Активация входящего хлорного тока ведет к дополнительной деполяризации мембраны СГМК и приросту МН [Kovalev I.V., 2003; Anfinogenova Y., 2004]. Наряду с этим, в исследованиях Kim J.A. et al. (2001) и Shin J.-H. et al. (2004) было установлено, что увеличение цитоплазматической концентрации Са2+ активирует Na+, К+, 2СГ- котранспорт (NKCC) в СГМК.

О 0.5 1.П 1.4 7.0 7.5 1.0

Нрсыя, пасы

Рис. 2. Влияние N<111$ на механическое напряжение сосудистого сегмента аорты крысы, предсокращениого гиперкалиевым раствором Кребса в присутствии кофеина.

По оси ординат - механическое напряжение (мН). По оси абсцисс - время (часы).

(рис.2).

£ «

¿•кика

5*11* 5*М* 5*11' II1 II' К

Ьуиегаишл, 1МмкМ

Для исследования роли ЫКСС в механизмах действия сероводорода на сократительную активность сегментов аорты крысы использовали ингибитор 1ЧКСС буметанид. Предобработка в течение 15 мин сосудистых гладких мышц буметанидом (100 мкМ) устраняла констрикторное действие 5, 10, 50, 100 мкМ №Н8. Напротив, в этих случаях МН сосудистых сегментов

уменьшалось на 4.1±1.2 % (п=5, р>0.5); 7.9±1.9 % (п=7, р<0.05); 6.4±2.8 % (п=5, р<0.05), 66.2±5.8 % (п=6; р<0.05), соответственно, от величины контрольного сокращения сосудистых сегментов в гиперкалиевом растворе Кребса. №НЯ в концентрации 500 мкМ расслаблял сосудистые сегменты на 81.0±4.0% (п=5, р<0.05) от контрольного сокращения в гиперкалиевом растворе Кребса. Добавление 1000 мкМ N348 дополнительного изменения МН не вызывало (Рис. 3). .

Для верификации роли ЫКСС в механизмах констрикторного действия сероводорода исследовали изменение его активности при действии ЫаНЗ. Активность 1ЧКСС была изучена как буметанид-чувствительный компонент входа 86ЯЬ+ в СГМК. Результаты исследований приведены в табл. 1.

Полученные данные свидетельствуют об активации Ыа+, К+, 2СГ-котранспортера низкими концентрациями сероводорода. Следовательно, можно полагать, что МКСС является одной из ключевых мишеней, через которую реализуется сократительное действие сероводорода на сосудистые гладкие мышцы.

о ы М г^ 14 ър

Время, часы

Рис. 3. Влияние МаНБ на сократительную активность гладкомышечного сегмента аорты, предсокращенного гиперкалиевым раствором Кребса в присутствии буметанида. По оси ординат -механическое напряжение (мН). По оси абсцисс - время (часы).

Таблица 1

Влияние гидросульфида натрия на активность К\ 2СГ -котранспорта

Концентрация Активность Ыа+,К+,2СГ -

гидросульфида натрия, мкМ котранспорта, %

N3811, 0 (контроль) 100.0

№8Н, 5 111.0±11.0

№8Н, 10 127.0±8.0

№8Н, 50 146.0±7.0*

№8Н, 100 138.0±11.0*

№8Н, 500 101.0±9.0

Х±ш, полученные в трех независимых экспериментах, выполненных в четырех пробах. Активность Ыа', К+, 2СГ - котранспорта в отсутствии №Н8 принята за 100%. * - р<0.05 в сравнении с контролем.

3.3. Исследование роли калиевой проводимости мембраны в механизмах действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц, индуцированную гиперкалиевым раствором Кребса. Многочисленные исследования указывают на калиевые каналы мембраны СГМК как основную мишень Н28, через воздействие на которую реализуется вазорелаксирующее действие этого газотрансмиттера. Для выявления вклада отдельных компонентов калиевой проводимости мембраны в реализацию эффектов Н28 использовались соответствующие блокаторы калиевых каналов.

Тестировалось действие №Н8 в концентрации 500 мкМ, близкой к ЕС50 для расслабляющего сосудистые ГМ действия Н28, которое составило 35.1±7.5% (п=6, р<0.05) от амплитуды контрольного сокращения, вызванного гиперкалиевым раствором Кребса.

Блокатор калиевых каналов тетраэтиламмоний (ТЭА) в концентрации 10 мМ достоверно снижал расслабляющее действие 500 мкМ ИаН8, которое составило 13.9±3.2 % (п=6; р<0,05) от контрольного сокращения на действие гиперкалиевого раствора Кребса (Рис. 4А). Поскольку ТЭА в миллимолярных

!' я І 12,5

I 10

S

s V«

!

5

1

* гл.

\ 'і

{1,5 1,0 2.0 2£ 3,0

Время, mu

17.»

И

£ с 12,9

! 10

Í

% 7,5

X

а 5

2

г*

0

V

1,5 3.l> 2.5 J.O Вргчя, чаем

В

1 15

і 12,5

I

е» в 10

I

£ t 7.5

е 5

¡

й 2 Л

0

N«fTS.500MKM

і

г\

' V

а* щ їх

12,5 10

ЗОмЛГКЧІ

____________.1

ХТ.О.ІмкМ

Рис. 4. Влияние тетразтиламмония (А), 4-аминопиридина (Б), глибенкламида (В) и харибдотоксина (Г) на эффекты N0115 (500 мкМ) в гладкомышечных сегментах аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса. По оси ординат - механическое напряжение (мН). По оси абсцисс - время (часы). Пунктирная линия - расслабление сегмента при действии Л'а/К' (500 мкМ) в отсутствии блокатора калиевых каналов.

концентрациях примерно в равной степени блокирует Ca +-активируемые К+ каналы большой (ВКса), промежуточной (1КСа) и малой (SKCa) проводимости, а также потенциал-зависимые К+-каналы мембраны СГМК [Sheng J.Z., Braun А.Р., 2007], для выявления вклада каждого из этих компонентов калиевой проводимости мембраны использовали селективные блокаторы калиевых каналов.

Блокатор потенциал-зависимых калиевых каналов 4-аминопиридин (4-АП) в концентрации 1 мМ не влиял на величину релаксации СГМ, вызванную ЫаНБ (500 мкМ) (Рис. 4Б). Можно полагать, что угнетение ТЭА релаксирующего действия 1123 обусловлено блокированием Са2+-активируемых ^-каналов. Блокатор ВКСа - каналов харибдотоксин (ХТ) в концентрации 0.1 мкМ усиливал релаксирующее действие 500 мкМ 1ЧаН8, которое составило 56.4±9.6 % (п=3, р<0.05) (Рис. 4Г). Следовательно, ТЭА уменьшает Нгв - индуцированную релаксацию сосудистых сегментов через блокирование 1КСа- и вКс-каналов. Блокатор АТФ-чувствительных К+-канапов глибенкламид (ГБ) в концентрации 10 мкМ также усиливал расслабляющее действие №Н8, которое составило 54.3±6.6 % (п=6, р<0.05) от величины контрольного сокращения в гиперкалиевом растворе Кребса (Рис. 4В).

Относительный вклад исследуемых типов калиевых каналов в механизмы расслабления сероводородом сосудистых сегментов, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, представлен в табл.2.

Таблица 2

Относительный вклад калиевых каналов в механизмы релаксирующего действия сероводорода на сокращения сосудистых сегментов, вызванные

гиперкалиевым раствором Кребса

Блокатор Относительная величина расслабления

ТЭА(ЮмМ) 0.09

4-АП (1мМ) 0.19

ГБ (ЮмкМ) 0.35

ХТ(0,1 мкМ) 0.37

ТЭА - тетраэтиламмоний, ГБ - глибенкламид, 4-АП - 4-аминопиридин, ХТ -харибдотоксин.

3.4. Исследование роли калиевой проводимости мембраны в механизмах действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц, индуцированную фенилэфрином. Расслабляющее

действие, близкое к ЕС50, оказывал в концентрации 100 мкМ. Величина

расслабления при этом составила 55.8±7.2 % (п=6, р<0.05) от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения.

& 10

Г*»ДО,№ОмкМ

I 5

17.5 1? 12.«

\л

■ С

<1,5 1,0 1,5 2,0 2.5 Прнм.часы

№п1«К, 1(М1мкМ

....................._Т

| 4-АИ.1 мМ |

и

в

17,5

9 15

£ 12.5

|| 10

а

I 7,5

1 з «

¿5

2.5

0

МО мкМ

______:Т

КяМ^ЮОмкМ

1

I I/

О

КШмкМ

ФХ 1« мкМ

г_______I

/ I /

I /

1 \

V

• N

V

XX, (».1 мкМ

Ф*. 10 мкМ

1,0 1,5 2.0

Время, чаем

Рис. 5. Влияние тетраэтиламмония (А), 4-аминопиридина (Б), глибенкламида (В) и харибдотоксина (Г) на эффекты гидросульфида натрия (100 мкМ) в гладкомышечных сегментах аорты крысы, предсокращенных фенилэфрином. По

оси ординат - механическое напряжение (мН). По оси абсцисс - время (часы). Пунктирная линия - расслабление сегмента при действии N0118 (500 мкМ) в отсутствии блокатора калиевых каналов.

ТЭА (10 мМ) достоверно снижал релаксирующее действие 100 мкМ ЫаН8: его величина составила 13.8±5.2 % (п=9, р<0,05) от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения (Рис. 5А). В присутствии 4-АП (1 мМ)

релаксирующее действие 100 мкМ ЫаПЙ достоверно снижалось: его величина составила 16.2±2.7 % (п=7, р<0,05) от контрольного ФЭ-индуцированного сокращения (Рис. 5Б). В то же время, ГБ (10 мкМ) полностью устранял релаксирующее действие 100 мкМ ЫаН8 (Рис. 5В). ХТ (0.1 мкМ) статистически значимого влияния на величину ¡ ^-индуцированной релаксации не оказывал (Рис. 5Г).

Относительный вклад исследуемых типов калиевых каналов в механизмы расслабления сероводородом сосудистых сегментов, предсокращенных ФЭ, представлен в табл. 3.

Таблица 3

Относительный вклад калиевых каналов в механизмы релаксирующего действия сероводорода на сокращения сосудистых сегментов, вызванные

фенилэфрином

Блокатор Относительная величина расслабления

ТЭА(ЮмМ) 0.19

4-АП (1мМ) 0.23

ГБ(ЮмкМ) 0.01

ХТ(0,1 мкМ) 0.57

ТЭА - тетраэтиламмоний, ГБ - глибенкламид, 4-АП - 4-аминопиридин, ХТ -харибдотоксин.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что главенствующую роль в механизмах расслабления сероводородом СГМК аорты крысы играет открывание АТФ-чувствительных калиевых каналов.

Заключение

Одним из основных физиологических эффектов сероводорода является вазорелаксация. В наших исследованиях было установлено разнонаправленное действие сероводорода на МН сосудистых сегментов, которое зависело от концентрации газотрансмиттера и природы предсокращения. Документировано, что при сокращении, вызванном действием ФЭ, Н28 оказывал только

дозозависимое релаксирующее действие на СГМ, а в условиях предсокращения сосудистых сегментов гиперкалиевым раствором Кребса низкие концентрации №Н8 (1-100 мкМ) оказывали констрикторное действие на СГМК, которое обращалось на релаксирующее при действии более высоких концентраций донора сероводорода. Выявленные различия влияния сероводорода на МН сосудистых сегментов, по-видимому, связаны с различной природой этих сокращений. В самом деле, увеличение МН ГМК, вызванное деполяризацией мембраны гиперкалиевым раствором Кребса, обусловлено оперированием только кальций-кальмодулиновой (Са-КМ) ветви кальциевой сигнальной системы. Тогда как в индукцию и поддержание сокращения, вызванного ФЭ, вовлечены обе ее ветви: Са-КМ и С-киназная.

В литературе отсутствуют данные о роли ЫКСС в механизмах действия сероводорода. Однако результаты наших исследований свидетельствуют о том, что данный котранспортер является основным эффектором констрикторного влияния сероводорода. В самом деле, ингибитор МКСС буметанид устранял констрикторное действие сероводорода на СГМК, предсокращенные гиперкапиевым раствором Кребса. В радиоизотопных исследованиях получены прямые доказательства активации сероводородом буметанид-чувствительного компонента транспорта 86ЯЬ+ в изолированные СГМК аорты крысы, который является маркером активности Т^КСС. Цепь молекулярных событий, опосредующих сократительную реакцию СГМК при действии Н2Б, может заключаться в следующем: активация сероводородом Т^КСС увеличивает электрохимический потенциал СГ, усиливает входящий хлорный ток, обуславливающий деполяризацию мембраны, открывание дополнительного числа потенциал-зависимых Са2+- каналов Ь- типа и увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ [Коуа1еу 1.У. й а1., 2003; Апйго^епоуа У. е1 а1., 2004]. Как показали наши исследования, определенную роль в этом процессе играет освобождение сероводородом из саркоплазматического ретикулума СГМК ионов Са2+, которые являются кофактором открывания Са2+-активируемых СГ-каналов.

Согласно полученным нами данным, расслабление СГМК аорты крысы при действии сероводорода связано с увеличением калиевой проводимости мембраны указанных клеток. Для расслабления сероводородом СГМК, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, ключевую роль играет открывание кальций-активируемых калиевых каналов, тогда как для СГМК, предсокращенных ФЭ, - АТФ-чувствительных калиевых каналов плазмалеммы.

В самом деле, известно, что ТЭА в миллимолярных концентрациях

примерно в равной степени блокирует ВКСа, IKCa [Davis J.P.L. et al., 1993; Jiang

G. et al., 2003] и SKCa [Sheng J.-Z., 2007], а также потенциал-зависимые K+

каналы [Ikeda S.R., 1995]. Наши эксперименты с избирательным блокированием

харибдотоксином ВКСа- каналов не выявили участия этих каналов в механизмах

релаксации сероводородом СГМК. Селективное блокирование потенциал-

зависимых К+- каналов 4-АП также практически не влияло на индуцированную

H2S релаксацию сегментов аорты крысы. В соответствии с этим, полученные

~ 2+

нами данные свидетельствует в пользу заключения о том, что открывание Ca -активируемых К+-каналов малой и промежуточной проводимости является ключевым механизмом реализации расслабляющего действия сероводорода на ГМК аорты крысы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса.

Выводы

1. Сероводород оказывает разнонаправленное действие на сокращения сосудистых гладкомышечных клеток, индуцированные деполяризацией мембраны: констрикторное - в малых, и релаксирующее - при действии высоких концентраций.

2. Сероводород дозозависимо расслабляет гладкие мышцы аорты, предсокращенные стимуляцией фенилэфрином cii- адренорецепторов.

3. Ключевую роль в реализации констрикторного действия низких концентраций сероводорода на сосудистые сегменты, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса, играет активация Na+,' К+, 2СГ -котранспорта.

4. Релаксирующее действие сероводорода на предсокращенные в

гиперкалиевом растворе Кребса сосудистые гладкие мышцы обусловлено открыванием кальций-активируемых калиевых каналов малой и промежуточной проводимости.

5. В сосудистых гладких мышцах, предсокращенных активацией и,-адренэргических рецепторов, релаксация, индуцированная сероводородом, связана с открыванием АТФ-чувствительных калиевых каналов мембраны. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Смаглий J1.B. Роль газовых посредников в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы / Л.В. Смаглий, К.В. Еременко // Материалы 74-ой итоговой студенческой научно - практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения профессора A.M. Дыхно, Красноярск. -2010.-С.829-831.

2. Вторушина Т.А. Влияние сероводорода на механизмы сопряжения возбуждения-сокращения гладкомышечных клеток / Т.А. Вторушина, Л.В. Смаглий, Д.С.Носов // Науки о человеке: сборник статей по материалам XI конгресса молодых ученых и специалистов, Томск. - 2010. - С.49 - 50.

3. Смаглий Л.В. Роль сероводорода в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы / Л.В. Смаглий, A.C. Желудева, К.В. Еременко и др. // Науки о человеке: сборник статей по материалам XI конгресса молодых ученых и специалистов, Томск. - 2010. - С.67 - 68.

4. Баскаков М.Б. Влияние сероводорода на сократительную активность гладкомышечных клеток аорты крысы / М.Б. Баскаков, C.B. Гусакова, A.C. Желудева, Л.В. Смаглий и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. -№6. - С.12-17,

5. Смаглий Л.В. Сероводород как регулятор сократительной активности гладкомышечных клеток сосудов / Л.В. Смаглий, A.C. Желудева, К.В. Еременко и др. // Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии»: материалы V международной научной конференции, посвященной 100 -летаю со дня рождения профессора Павла Дмитриевича Харченко и 65-летию НИИ физиологии имени Петра Богача, Киев. - 2010. - С. 56-57.

6. Гусакова C.B. Механизмы регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток: роль активных форм кислорода / C.B. Гусакова, М.Б. Баскаков, И.В. Ковалев, А.С. Желудева, JI.B. Смаглий и др. // Бюллетень сибирской медицины. — 2011. — №3. — С.33-39.

7. Smagly L. Hydrogen sulfide influence on smooth muscle cells contractile properties [Электронный ресурс] / L. Smagly, A. Zheludeva, S. Gusakova et al. // Journal of hypertension. - 2011. - V.29. - P. e335. - Режим доступа: http://journals.lww.com/jhypertension/Citation/2011/06001/Effect_of_Hydrogen_Sul fide_on_Mechanisms_Coupling.965.aspx.

8. Baskakov M. Mechanisms of action of hydrogen sulfide on contractile activity vascular smooth muscle [Электронный ресурс] / M. Baskakov, S. Gusakova, A. Zheludeva, L. Smagly et al. // Journal of hypertension. - 2011. - V.29. - P. e335. -Режим доступа: http://journals.lww.com/jhypertension/Citation/201 l/06001/Mechanisms_of_Action_ of_Hydrogen_SuIfide_on.966.aspx.

9. Kovalev I. Effect of hydrogen sulfide on mechanisms coupling excitation of smooth muscle cells guinea pig ureter [Электронный ресурс] / I. Kovalev, S. Gusakova, M. Baskakov, A. Popov, O. Melnik, T. Vtorushina, D. Nosov, A. Zheludeva, L. Smagly et al. // Journal of hypertension. - 2011. - V.29. - P. 334. -Режим доступа: http://journals.lww.com/jhypertension/Citation/201 l/06001/Hydrogen_Sulfide_Influe nce_on_Vascular_Smooth.967.aspx.

10. Smagly L. Hydrogen sulfide influence on vascular smooth muscle cells mechanical tension: role of intracellular calcium [Электронный ресурс] / L. Smagly, A. Zheludeva, S. Gusakova et al. // Journal of hypertension. - 2012. - V.30. - P. e367. - Режим доступа: http://journals.lww.com/jhypertension/Documents/ESH_2012.pdf.

11. Смаглий JI.B. Роль Na+,K+,2C1~ - котранспорта в механизмах вазоконстрикторного действия сероводорода [Электронный ресурс] / Л.В.

Смаглий // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 2. -Режим доступа: Iittp://www.science-education.ru/108-8675.

12. Баскаков М.Б. Ионные механизмы действия газотрансмиттеров на сократительную активность сосудистых гладких мышц / М.Б. Баскаков, C.B. Гусакова, A.C. Желудева, J1.B. Смаглий и др. // Известия высших учебных заведений. - 2013. - 4/2. - С.73-78.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СГМ - сосудистые гладкие мышцы

4-АП - 4-аминопиридин

ГБ - глибенкламид

ГМК - гладкомышечные клетки

К*АТФ-канапы - АТФ - чувствительные калиевые каналы

К+са2+-каналы - кальций - активируемые калиевые каналы

МН - механическое напряжение

СГМ - сосудистые гладкие мышцы

СГМК - сосудистые гладкомышечные клетки

СПР - саркоплазматический ретикулум

ТЭА - тетраэтиламмония хлорид

ФЭ - фенилэфрин

XT - харибдотоксин

цАМФ - циклический 3:5-аденозинмонофосфат

ВКса - капьций-активируемые калиевые каналы большой проводимости H2S - сероводород

IKca - кальций-активируемые калиевые каналы промежуточной проводимости K+v- каналы - потенциал-зависимые калиевые каналы NaHS - гидросульфид натрия

SKca - кальций-активируемые калиевые каналы малой проводимости

Подписано в печать21.05.2013 Усл. печ. листов 1,25 Печать на ризографе.

Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России 634050, г. Томск, ул. Московский тракт 2, тел 53-04-08 Заказ № 121 Тираж 100 экземпляров

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Смаглий, Людмила Вячеславовна, Томск

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ»

На правах рукописи

0420135^266

Смаглий Людмила Вячеславовна

РОЛЬ СЕРОВОДОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор М.Б. БАСКАКОВ

ТОМСК-2013

Список принятых сокращений

АДФ - аденозиндифосфат АТФ - аденозинтрифосфат АЦ - аденилатциклаза ГМ - гладкие мышцы ГМК - гладкомышечные клетки ГТФ - гуанозинтрифосфат ДАГ - диацилглицерол ИТФ - инозитолтрифосфат

К+АТФ-каналы - АТФ - чувствительные калиевые каналы

К+Са2+-каналы -кальций - активируемые калиевые каналы

К+у - каналы - потенциал-зависимые калиевые каналы

КЛЦМ - киназа легких цепей миозина

КМ - кальмодулин

ЛЦМ - легкие цепи миозина

МН - механическое напряжение

МХ - митохондрии

НАДФ - никотинамиддинуклеотид фосфат ПК-А - протеинкиназа А ПК-О - протеинкиназа в

Са -КМ - кальций-кальмодулиновый комплекс СГМ - сосудистые гладкие мышцы СГМК - сосудистые гладкомышечные клетки СПР - саркоплазматический ретикулум ТЭА - тетраэтиламмония хлорид ФЭ - фенилэфрин

цАМФ - циклический 3:5-аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический 3:5-гуанозинмонофосфат

ВКса- кальций-активируемые калиевые каналы высокой проводимости

3MST - 3-меркаптопируват-сульфуртрансфераза

CAT - цистеин-аминотрансфераза

CBS - цистотионин-Р-синтаза

СО - монооксид углерода

CSE - цистотионин-у-лиаза

EDHF - эндотелиальный гиперполяризующий фактор eNOS - эндотелиальная N0 - синтаза H2S - сероводород (сульфид водорода)

1КСа - кальций - активируемые калиевые каналы промежуточной проводимости

INK - с-Дип-КШ-терминальная протеинкиназа NaHS - гидросульфид натрия NO - оксид азота

Р38 МАРК - митоген- активируемая протеинкиназа р 38 ppm - parts per million - одна миллионная часть

SKCa - кальций - активируемые калиевые каналы низкой проводимости

Содержание

Список принятых сокращений...................................................................................2

Содержание.....................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................7

ГЛАВА 1.........................................................................................................................14

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................14

1.1 Структурная организация гладкомышечных клеток..........................................14

1.2. Организация внутриклеточных сигнальных систем в регуляции сократительной активности гладких мышц сосудов...............................................18

1.3. Ионные механизмы регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток.............................................................................................................................23

1.4. Физико-химические свойства сероводорода.......................................................30

1.5. Токсические свойства сероводорода....................................................................31

1.6. Пути метаболизма сероводорода в организме...................................................33

1.7. Роль сероводорода в регуляции физиологических функций организма.............36

ГЛАВА II.......................................................................................................................44

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ..........................................................................................44

2.1. Методики исследования.........................................................................................44

2.2. Растворы и реактивы............................................................................................46

2.3. Статистическая обработка................................................................................47

ГЛАВА III......................................................................................................................49

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...............................49

3.1. Исследование влияния сероводорода на сократительную активность

гладкомышечных клеток аорты крысы......................................................................49

3.1.1. Влияние сероводорода на механическое напряжение сегментов аорты, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса..............................................50

3.1.2. Влияние сероводорода на сократительную активность гладких мышц аорты крысы, индуцированную фенилэфрином....................................................................50

3.2. Исследование механизмов констрикторного действия сероводорода на сосудистые гладкие мышцы аорты крысы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса.........................................................................................................53

3.2.1. Роль кофеин-чувствительного кальциевого депо саркоплазматического ретикулума сосудистых гладкомышечных клеток в механизмах констрикторного действия сероводорода на изолированные сегменты аорты крысы.........................53

3.2.2. Исследование роли К+, 2СГ - котранспорта в реализации констрикторного действия сероводорода на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса...............................................55

3.2.3. Исследование влияния сероводорода на активность К+, 2СГ -котранспорта..................................................................................................................57

3.3. Исследование роли калиевой проводимости мембраны в механизмах действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц, индуцированную гиперкалиевым раствором Кребса.................................................59

3.3.1. Влияние тетраэти л аммония на релаксирующее действие гидросульфида натрия при сокращениях сосудистых гладких мышц, вызванных гиперкалиевым раствором Кребса..........................................................................................................60

3.3.2. Роль потенциал-зависимых калиевых каналов мембраны в релаксирующем действии гидросульфида натрия на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса...............................................61

3.3.3. Роль кальций-активируемых калиевых каналов мембраны в релаксирующем действии гидросульфида натрия на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса...............................................63

3.3.4. Роль АТФ-чувствительных калиевых каналов мембраны в релаксирующем действии гидросульфида натрия на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса...............................................63

3.3.5. Определение относительного вклада различных типов калиевых каналов в релаксирующее действие сероводорода на сосудистые гладкие мышцы,

предсокращенные гиперкалиевым раствором Кребса...............................................66

3.4. Исследование роли калиевой проводимости мембраны в механизмах действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц, индуцированную фенилэфрином...................................................................................67

3.4.1. Влияние тетраэтиламмония на релаксирующее действие гидросульфида натрия при сокращениях сосудистых гладких мышц, вызванных фенилэфрином 68

3.4.2. Роль потенциал-зависимых калиевых каналов мембраны в релаксирующем действии гидросульфида натрия на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные фенилэфрином...............................................................................68

3.4.3. Роль кальций-активируемых калиевых каналов мембраны в релаксирующем действии гидросульфида натрия на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные фенилэфрином...............................................................................71

3.4.4. Роль АТФ-чувствительных калиевых каналов мембраны в релаксирующем действии гидросульфида натрия на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные фенилэфрином...............................................................................71

3.4.5. Определение относительного вклада различных типов калиевых каналов в релаксирующее действие сероводорода на сосудистые гладкие мышцы,

предсокращенные фенилэфрином...............................................................................74

Заключение...................................................................................................................76

Список литературы

79

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сероводород (Н28) наряду с другими газообразными сигнальными молекулами, такими как монооксид азота (N0) и монооксид углерода (СО), относят к группе газотрансмиттеров. В отличие от классических гормонов и нейротрансмиттеров, Н28, как и другие газовые посредники, свободно проникает через плазматическую мембрану и включает внутриклеточную сигнализацию рецептор-независимым способом. Свое биологическое действие он проявляет путем различных взаимодействий с макромолекулами, такими как нековалентное связывание с регуляторными субъединицами белков, пространственная оккупация ближайшего окружения и пространств внутри структуры белка, что препятствует доступу других газов в функционально критические белковые сайты [190].

Благодаря этим уникальным свойствам Н28 вовлечен в процессы как внутриклеточной, так и межклеточной коммуникации и участвует в регуляции большого числа клеточных функций, включая сосудистый тонус [218], работу центральной нервной системы [44], воспаление [144], пролиферацию, дифференцировку, гибель клеток [214] и др.

В отличие от N0, механизмы действия которого во многом исследованы и определены регуляторные процессы, протекающие с участием этого газа [13, 14, 137], сероводород как сигнальная молекула остается недостаточно изученным. Общепризнанным является сосудорасслабляющее действие сероводорода, однако дискуссионными остаются вопросы о мембранных и молекулярных мишенях, через которые реализуются такие эффекты. В самом деле, в многочисленных исследованиях показано, что донор сероводорода гидросульфид натрия (№Н8) расслабляет кровеносные сосуды различных типов [139, 135].

Гиперполяризацию мембраны сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) и расслабление при действии сероводорода связывают с активацией АТФ-чувствительных К+ каналов (КАТФ). Расслабление СГМК в этом случае может быть обусловлено уменьшением потенциал-зависимого входа Са2+ вследствие гиперполяризации мембраны [148, 136].

Значительно менее изучено влияние сероводорода на другие системы трансмембранного переноса ионов. Так, по данным W.S. Cheang, в коронарных артериях крысы сероводород обуславливает гиперполяризацию мембраны СГМК и их последующую эндотелий - независимую релаксацию посредством активации калиевых каналов, чувствительных к 4-аминопиридину [65]. Высказываются предположения о действии H2S на Са - активируемые калиевые каналы малой (SKca) и средней проводимости (1КСа) [201], потенциал-зависимые Са каналы L-типа [195], СГ/НСОз" обменник [143]. Спорным остается вопрос о возможности и механизмах констрикторного действия сероводорода. Возбуждающее действие сероводорода на СГМК было описано в работе J.J. Lim, которая объяснила этот феномен снижением внутриклеточного содержания цАМФ вследствие ингибирования сероводородом аденилатциклазы (АЦ) [142].

Подводя итог, можно заключить, что, несмотря на довольно многочисленные исследования действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц, многие вопросы не нашли удовлетворительного решения. Это касается как самих эффектов, вызываемых H2S в СГМК, так и мембранных механизмов, вовлекаемых этим газотрансмиттером в реализацию своих эффектов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

Исследовать влияние и механизмы действия сероводорода на сократительную активность сосудистых гладких мышц.

ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Исследовать действие донора Н28 гидросульфида натрия на механическое напряжение сосудистых гладких мышц аорты крысы, индуцированное деполяризацией мембраны гиперкалиевым раствором Кребса.

2. Изучить эффекты гидросульфида натрия в сосудистых гладких мышцах аорты крысы, предсокращенных стимуляцией агадренергических рецепторов.

3. Определить вклад Ыа+, К+, 2СГ -котранспорта в механизмы действия сероводорода на механическое напряжение гладких мышц аорты крысы.

4. Установить роль изменений калиевой проводимости мембраны в механизмах действия Н28 на сократительную активность сосудистых гладкомышечных клеток.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Действие сероводорода на гладкомышечные клетки аорты крысы разнонаправлено и зависит от концентрации и природы предсокращения сосудистых гладких мышц. При сокращении, индуцированном деполяризацией мембраны в гиперкалиевом растворе Кребса, сероводород в малых (до 100 мкМ) концентрациях увеличивает механическое напряжение изолированных сегментов аорты, а при повышении концентрации - вызывает расслабление последних. В

сосудистых гладких мышцах, предсокращенных фенилэфрином, сероводород во всех использованных концентрациях вызывает дозозависимое расслабление.

2. Одной из ключевых мишеней сероводорода является Иа+, К+, 2СГ -котранспортер, через активацию которого реализуется констрикторное действие этого газотрансмиттера на гладкие мышцы аорты крысы.

3. В основе релаксирующего действия сероводорода на сосудистые гладкие мышцы лежит увеличение калиевой проводимости мембраны: в СГМК, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, главным образом, за счет кальций-активируемого, а при предсокращении, индуцированном возбуждением сц-адренорецепторов, - АТФ-чувствительного ее компонентов.

НА УЧНАЯ НОВИЗНА

Установлено разнонаправленное действие сероводорода на механическое напряжение сосудистых гладкомышечных клеток аорты крысы. Впервые идентифицирована новая мишень - Ыа+, К+, 2СГ - котранспортер, который вовлечен в механизмы регуляции сероводородом сократительной активности сосудистых гладких мышц, и продемонстрирована его роль как ключевого эффектора вазоконстрикторного действия сероводорода. Установлено, что открывание кальций-активируемых калиевых каналов малой и промежуточной проводимости мембраны сосудистых гладкомышечных клеток является основным механизмом релаксации гладких мышц аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым раствором Кребса, а открывание АТФ-чувствительных калиевых каналов - расслабления СГМК, предсокращенных фенилэфрином.

НА УЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНА ЧИМОСТЬ

Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных знаний о механизмах внутриклеточной коммуникации. Определены механизмы констрикторного и релаксирующего действия газового посредника Н28. Полученные данные дополняют сведения о механизмах регуляции тонуса кровеносных сосудов газотрансмиттерами. Результаты исследования могут быть использованы при разработке молекулярных технологий управления поведением клеток путем модификации газовой коммуникации в СГМК, местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов. Сформулированные в работе положения используются в курсах лекций и практических занятиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета. Полученные данные и методические приемы используются в научных исследованиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета. Области применения полученных данных: физиология, биофизика, фармакология.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты исследования и их обсуждение», заключения. Библиография включает 222 ссылок, в том числе 43 - работы отечественных авторов и 179 -зарубежных. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 3 таблицами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Полученные результаты обсуждены на всероссийских и международных конференциях и конгрессах: 74-я итоговая студенческая научно - практическая конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения профессора A.M. Дыхно (Красноярск, 2010), Всероссийская 69-я итоговая научная студенческая конференция, посвященная 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (Томск, 2010), XI конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), V Международная научная конференция «Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии», посвященная 100 -летию со дня рождения профессора Павла Дмитриевича Харченко и 65-летию НИИ физиологии имени Петра Богача (Киев,

2010), 21st European meeting on hypertension and cardiovascular prevention (Milan,

2011), 22nd European meeting on hypertension and cardiovascular prevention (London,

2012).

Исследования поддержаны грантами федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы: «Разработка технологических основ селективного управления внутриклеточной газовой сигнализацией» (государственный контракт № 02.740.11.5031 от 20.06. 2009 г.), «Селективная модуляция внутриклеточной коммуникации как основа молекулярных технологий управления функциями клеток» (государственный контракт № 14.740.11.0932 от 12.04.2011 г.), «Гипоксия как фактор регуляции транскриптома и сократительных свойств кровеносных сосудов» (соглашение 8487 от 23.10.2012 г.).

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА

Автор принимал непосредственное участие в разработке идеи и планировании исследования, анализировал литературу. Автором лично выполнена экспериментальная часть работы, проведена статистическая обработка полученных данных, обсуждение результатов, оформ