Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм Ca2+-регуляции тонких нитей запирательных мышц двустворчатых моллюсков на примере мидии Crenomytilus grayanus

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Механизм Ca2+-регуляции тонких нитей запирательных мышц двустворчатых моллюсков на примере мидии Crenomytilus grayanus"

На правах рукописи

ВЯТЧИН Илья Геннадьевич

МЕХАНИЗМ Са2 "-РЕГУЛЯЦИИ ТОНКИХ НИТЕЙ ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ НА ПРИМЕРЕ МИДИИ СЯЕтМУПЬиБ а(АК4М/5

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

2 8 ОКТ 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2015

005563885

005563885

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Шелудько Николай Семенович

Официальные оппоненты:

Хайтлина София Юрьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаб. биологии клетки в культуре

Бершицкий Сергей Юрьевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, зав. лабораторией биологической подвижности

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита диссертации состоится «18» декабря 2015 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук по адресу: 690041, Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17. Факс: (423) 2310-900, e-mail: inmarbio@maiI.primorye.ru

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук: http://wwwimb.dvo.rU/misc/dissertations/index.php/sovet-d-005-008-01/2O-vyatchin-ilya-gennadevich

Автореферат разослан

октября 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ващенко Марина Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Запирательные мышцы двустворчатых моллюсков относятся к категории гладких мышц и способны находиться не только в состоянии сокращения и расслабления, но и в состоянии запирательного тонуса («catch»). Состояние запирательного тонуса мышца может поддерживать до нескольких недель без затрат энергии (Twarog, 1967). Явление запирательного сокращения описано более 100 лет назад (Pamas, 1910), но интерес к нему не ослабевает, поскольку механизм запирательного тонуса невозможно объяснить в рамках современных представлений о механизмах мышечного сокращения.

Существует несколько гипотез о механизме catch. В настоящее время наиболее популярна «твитчиновая» гипотеза, предложенная в 2004 году и дополненная в 2007 (Shelud'ko et al., 2004, 2007). Согласно этой гипотезе, при переходе мышцы к catch, белок толстых нитей твитчин образует сшивки между толстыми и тонкими нитями, фиксирующие мышцу в сокращенном состоянии.

Гипотеза «твитчиновых» сшивок объясняет фиксацию мышцы в сокращенном состоянии, но не объясняет, каким образом запирательный механизм сочетается с другими мышечными функциями — актин— миозиновым взаимодействием и его регуляцией ионами калыдаями. Можно предположить, что связующим звеном между ними служит актин-ассоциированная регуляторная система тонких нитей (Avrova et al., 2010).

Степень разработанности выбранной темы. Актин-ассоциированная Са2+-регуляторная система запирательных мышц малоизучена. К настоящему времени в запирательных мышцах найдены свидетельства в пользу существования двух типов азегин-ассоциированной регуляции тонких нитей. Так, в запирательных мышцах гребешков найден тропониноподобный белок, сходный с тропонином скелетных мышц позвоночных (Nishita et al., 1997), а в запирательных мышцах мидий и устриц обнаружен кальдесмон-подобный белок, входящий в Са2+-регуляторную систему гладких мышц позвоночных (Bennett, Marston, 1990). Следует отметить, что наличие кальдесмона в тонких нитях запирательной мышцы мидии Crenomytilus grayanus не было подтверждено (Dobrzhanskaya et al., 2013). Возможно, что в разных группах двустворчатых моллюсков существуют разные системы Са2+-регуляции тонких нитей.

Цели и задачи исследования. Целью работы было выяснение механизма Са2+-регуляции тонких нитей запирательных мышц двустворчатых моллюсков на примере мидии Crenomytilus grayanus.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выявить белки запирательных мышц мидии Crenomytilus grayanus, придающие тонким нитям Са2+-чувствительность.

2. Идентифицировать белковые компоненты регуляторной системы тонких нитей запирательной мышцы мидии по функциональным свойствам, иммуноферментному окрашиванию и MALDI TOF/TOF спектрам.

3. Выяснить причины зависимости свойств гибридных актомиозиновых моделей от их состава и найти условия корректного использования этих моделей.

Научная новизна. Из тонких нитей запирательной мышцы мидии Crenomytilus grayanus выделена фракция минорных белков, способная придавать Са2+-чувствительность актомиозиновым моделям, содержащим тропомиозин. Из этой фракции выделены актин-связывающие белки (actin binding proteins) АВР-19, АВР-20 и АВР-28, которые образуют комплекс, способный придавать Са2+-чувствительностъ актомиозиновым моделям. Показано, что физико-химические свойства этих белков близки к свойствам компонентов тропонина скелетных мышц позвоночных.

Установлено, что молярное содержание компонентов тропонина в запирательной мышце мидии вдвое меньше содержания тропомиозина (ТМ:Тп=1:0.5), а соотношение тропомиозина и актина в ней такое же, как и в скелетных мышцах позвоночных (ТМ:А=1:7). Предложена гипотеза, объясняющая низкое содержание тропонина в тонких нитях запирательной мышцы мидии при высокой степени Са2+-регулируемости этих нитей.

Изучено влияние тропомиозинов мидии и кролика на АТФазную активность сократительных моделей разной степени гибридности. Показано, что необычная способность тропомиозина моллюсков сильно (до 90%) ингибироватъ актин-миозиновое взаимодействие проявляется только в гибридной сократительной модели, содержащей одновременно тропомиозин из мышц моллюсков и миозин из мышц позвоночных. Найдены условия среды, в которых ингибирующая способность тропомиозина мидии не проявляется.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные об устройстве актин-ассоциированной регуляторной системы запирательных мышц важны для понимания роли актин-ассоциированной Са2+-регуляции в запирательном сокращении.

Качественные различия между гибридной и не гибридной актомиозиновыми моделями, выявленные в ходе данной работы, указывают на необходимость осторожно и критически относиться к результатам, полученным посредством гибридных моделей.

Разработан метод получения хроматографически чистых компонентов тропонинового комплекса из мышцы мидии. Детально описаны методы выделения и очистки миозина и тропомиозина, а также реконструкции сократительных моделей, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности. Определены относительные коэффициенты связывания красителя Coomassie brilliant blue R-250 с актином, тропомиозином и компонентами тропонина мидии, что позволяет устанавливать молярные соотношения этих белков.

Методология и методы диссертационного исследования. В данной работе были применены различные физико-химические и биохимические методы получения и анализа белков и их комплексов. При определении состава препаратов в процессе выделения белков и для контроля состава белковых смесей использовали электрофорез в полиакриламидном геле. Для идентификации тропонина мидии были применены методы иммуноферментного окрашивания и МАЛДИ (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) спектроскопии. Для тестирования свойств тропонинового комплекса были использованы хроматографически очищенные компоненты тропонина. Тестирование проводили посредством сократительных моделей, представляющих собой комплекс актина, миозина и тропомиозина. Для определения молярного содержания белков в тонких нитях мидии была применена денситометрия электрофоретических гелей с предварительным определением коэффициентов связывания красителя с белками тонких нитей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Тонкие нити запирательной мышцы мидии содержат тропонин, свойства которого близки к свойствам тропонина скелетных мышц позвоночных животных.

2. Содержание тропонина в тонких нитях запирательной мышцы мидии вдвое меньше его содержания в тонких нитях скелетных мышц позвоночных.

3. Сильное ингибирование тропомиозином мидии акпш-миозинового взаимодействия, описанное в литературе, проявляется только в гибридных сократительных моделях.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов исследования была обеспечена использованием современных молекулярно-биохимических подходов. Все этапы выделения белков и их комплексов контролировали с помощью электрофореза. Предварительная ригоризация мышечной ткани позволила исключить потери белков в процессе их выделения. О достоверности экспериментальных результатов также свидетельствует их воспроизводимость. Идентификацию белков тонких нитей запирательной мышцы мидии подтверждали использованием отрицательного и положительного контроля.

Апробация результатов и публикации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2012, 2014), X Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2011), ежегодных научных конференциях Института биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук (Владивосток, 2011, 2012,2014, 2015).

По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 статьи в журналах, индексируемых в международных системах цитирования.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 117 страницах, состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 245 ссылок, из них 240 на иностранных языках. Рукопись содержит 17 рисунков и 1 таблицу.

Благодарности. Автор выражает признательность сотрудникам лаборатории биофизики клетки Института биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук за постоянную помощь на всех этапах исследования.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 12-04-33076), Российского научного фонда (грант № 14-14-00080) и Программы фундаментальных исследований Дальневосточного отделения Российской академии наук «Дальний Восток» (проект № 14-Ш-В-06-117).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Получение белковых препаратов

Скелетно-мышечный миозин получали из поперечнополосатых мышц спины и задних конечностей кролика по методу Перри (Perry, 1955), модифицированному Тартаковским (1978).

Тропомиозин скелетных мышц кролика экстрагировали раствором Хассельбаха-Шнейдера из мышечного остатка после экстракции миозина, фракционировали сульфатом аммония и очищали изоэлектрическим осаждением (Bailey, 1948).

Для получения актина Штраубовского типа использовали высушенный ацетоном мышечный остаток после экстракции миозина согласно описанной процедуре (Rees, Yang, 1967).

Миозин, «природный» Ф-актин и тропомиозин моллюсков выделяли из заднего аддуктора мидии Crenomytilus gray anus ранее описанными методами (Shelud'ko et al., 2001, 2004b, 2007).

Тонкие нити получали из свежих мышц мидии Crenomytilus grayanus без предварительной отмывки (Dobrzhanskaya et al., 2013).

Са2+-чувствительную фракцию тонких нитей получали LiCl-экстракцией из миофибрилл мидии при pH 4.9. Из этой фракции АВР-белки мидии выделяли, используя ионообменную хроматографию в присутствии мочевины.

Состав и чистоту белковых препаратов оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) (Laemmli, 1970) с рядом модификаций.

Концентрацию белков определяли методом биуретовой реакции с модификациями (Пермякова, 1997).

Денситометрия

Количественные соотношения белков в тонких нитях определяли при помощи программы TotalLab TL120 3.12 (TotalLab Limited 2013) по сканограммам влажных полиакриламидных гелей.

Вестерн-блоттинг

Для идентификации белков с помощью антител использовался метод Вестерн-блоттинга. Идентификацию компонентов тропонина проводили с помощью поликлональных антител к тропонину С и Т сердечной и скелетных мышц человека, соответственно (Novus biologicals, Н00007134-А01; Novus biologicals, H00007138-B01P), а также моноклональными антителами к тропонину I скелетных мышц человека (Novus biologicals, NB200-432).

Матричная лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная тандемная масс-спектрометрия (MALDI/MS-MS)

Масс-спектрометрия была выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства». Образцы предварительно подвергали трипсинолизу, а затем смешивали с 2,5-дигидро-бензойной кислотой. Поиск белков по набору масс пептидов проводили в онлайн базе данных Mascot с помощью программы Scaffold (Scaffold-4.3.4, Proteome Software Inc.)

Измерение АТФазной активности актомиозиновых моделей

Mg-АТФазную активность миозина определяли измерением количества неорганического фосфата по методу Фиске и Суббароу (Fiske, Subbarow, 1925) с некоторыми модификациями.

Результаты и обсуждение

Идентификация компонентов тропониноподобного белка запирательной мышцы мидии Crenomytilus grayanus

На рисунке 1 приведены электрофореграммы изолированных тонких нитей запирательных мышц мидии Crenomytilus grayanus (Dobrzhanskaya et al., 2013). В составе тонких нитей нами зарегистрировано 13 белковых компонентов, содержание и подвижность которых обычно воспроизводятся в данных электрофоретических условиях. Не идентифицированные компоненты обозначены сочетанием аббревиатуры АВР (actin binding protein) и значением молекулярной массы в килодальтонах.

«Ив»

- »

>

1в ИЙ

лн

- Филам ин -АВР-220

- а-актинин

АВР-55

Тропомиозин, 50 кДа Актин

Кальпонин, 40 кДа Кальпонин,34 кДа Тропомиозин, 33 кДа АВР-28

-АВР-20

-АВР-19 -АВР-15

Рисунок 1 - Белковый состав тонких нитей мидии СгепотуШия ^ауапий. Дорожки 1 и 2 - нагрузки 10 и 20 мкл, соответственно (По: ОоЬггЪапзкауа й а1.,

2013).

Ранее было показано, что тонкие нити запирательной мышцы мидии обладают Са2+-чувствительностью (8Ье1ис1'ко е'с а1., 2007; ОоЬггИапзкауа й а1., 2013). Эта Са2+-чувствительность не связана с кальпонином - Са2+-связывающим белком, обнаруженным нами в этой мышце, поскольку его избирательное удаление не сказывается на этом свойстве (ВоЬггИапБкауа й а1., 2013). Также, вопреки литературным данным, мы не обнаружили в этой мышце кальдесмон ШоЬггИапзкауа е1 а1., 2013), который, по мненшо ряда авторов, придает запирательным мышцам Са2+-чувствительность. Для

идентификации фактора, придающего тонким нитям Са2'-чувствительность, мы выделили из тонких нитей мидии фракцию минорных белков, придающую «природному» фибриллярному актину Са2+-чувствительность в присутствии тропомиозина (рис. 2).

Рисунок 2 — Фракция тонких нитей мидии, придающая Са2+-регулируемость синтетическому актомиозину.

А - сравнение состава тонких нитей (дорожка 1) и Са2+-чувствительной фракции тонких нитей (дорожка 2); Б - Влияние Са2+-чувствительной фракции на \^2+-АТФазную активность акгомиозина, реконструированного с тропомиозином и без него, в присутствии и в отсутствие Са2+. Условия: 30 мМ КС1, 0.5 мМ М§СЬ; 2 мМКа№; 20 мМ имидазол-НС1 рН 7.0; М§2+-АТФ, 0.3 мМ; 1 мМ ЭГТА, или 0.2 мМ СаС12. Миозин кролика, 0.1 мг/мл; фибриллярный актин мидии, 0.1 мг/мл; тропомиозин мидии, 0.05 мг/мл.

В отсутствие тропомиозина эта фракция оказывает на 1У^24-АТФазную активность актомиозина Са2+-независимое ингибирующее воздействие (рис. 2Б). Фракция состоит из варьируемых количеств актина и тропомиозина, а также значительного количества неидентифицированных белков, АВР-28, АВР-20 и АВР-19 (рис. 2А, дорожка 2). Эти белки содержатся в тонких нитях в небольших количествах, что видно при сравнении состава белков на дорожках 1 и 2.

Белки Са2+-чувствительной фракции были разделены при помощи ионообменной хроматографии и исследованы посредством сократительных моделей, реконструированных из актина, миозина и тропомиозина (рисунок 3).

АМ-ТМ + АВР-28 + АВР-19 Н + АВР-19 + 28

+ АВР-20 -+ АВР-20 + 28 -+ АВР-20 + 19 -+ АВР-19+20 + 28 -

,2+

шшшшшшшш

тшшжжшжжж

Са' ЕСТА

) 50 100 150

Мд2+-АТФазная активность, нмоль/мг/мин

Рисунок 3 - Влияние различных комбинаций АВР-19, АВР-20, и АВР-28 на АТФазную активность актомиозин-тропомиозинового комплекса в присутствии и в отсутствие Са2+.

Условия: 30 мМ КС1, 2.0 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-НС1 (рН7.5), и 0.1 мМ СаС12 или 1.0 мМ ЭГТА. Миозин кролика, 0.1 мг/мл; актин мидии, 0.025 мг/мл; тропомиозин мидии, 0.0125 мг/мл; АВР-19, 0.025 мг/мл; АВР-20, 0.025 мг/мл; АВР-28, 0.025 мг/мл.

Оказалось, что ни по отдельности, ни вместе, АВР-28 и АВР-19 практически не влияют на М^2+-АТФазную активность сократительной модели, а АВР-20 ее сильно ингибирует. Это ингибирование усиливается после добавления к АВР-20 белка АВР-28. При добавлении к АВР-20 белка АВР-19 происходит снятие ингибирования актин-миозинового

взаимодействия в присутствии, но не в отсутствие кальция. Таким образом АВР-19 придает ингибированию небольшую кальций-чувствительность, что говорит о способности АВР-19 связывать кальций. Значительную кальций-чувствительность актин-миозиновому взаимодействию способен придавать только комплекс из трех АВР-белков.

Таким образом, в тонких нитях запирательной мышцы мидии Crenomytilus gray anus присутствует трехкомпонентный кальций-регуляторный комплекс. В этот комплекс входят: белок, ингибирующий актин-миозиновое взаимодействие, кальций-связывающий белок, и белок, усиливающий влияние ингибитора и кальций-связывающего белка.

По характеру влияния на сократительную модель обнаруженный нами в тонких нитях мидии регуляторный комплекс схож с тропониновым комплексом (Greaser, Gergely, 1971, 1973; Ojima, Nishita, 1986). Сходство АВР-белков мидии и тропонина было подтверждено иммуноферментным анализом (рис. 4).

АВР-28

АВР-20 АВР-19

2 3 4

Рисунок 4 — Результаты Вестерн-блоттинга актин-связывающих белков, полученных из Са2+-чувствительной фракции тонких нитей мидии.

Дорожка 1 - электрофореграмма смеси АВР-19, АВР-20 и АВР-28; дорожка 2 -окраска смеси АВР-белков антителами к тропонину С человека; 3 - окраска смеси АВР-белков антителами к тропонину I человека; 4 - окраска смеси АВР-белков антителами к тропонину Т человека.

Как следует из данных, приведенных на рисунке 4, антитела к ТпС и Tnl избирательно связываются с белками АВР-19 и АВР-20. Следует, однако, отметить, что антитела к ТпТ демонстрируют заметное связывание не только с АВР-28, но и с АВР-20.

Для идентификации АВР-белков нами был также использован MALDI TOF MS/MS анализ. По результатам поиска спектров АВР-белков в базе данных Mascot (рис. 5) было обнаружено, что наибольшее сходство с белками АВР-28 и АВР-19 демонстрируют тропонины Т (gi| 1655496) и С (gi|378408555) двустворчатых моллюсков (Chlamys nipponensis akazara и Ruditapes philippinarium). Максимальное сходство с АВР-20 белком мидии показал белок LOTGITRAFT_200673 (gi|556112145) брюхоногого моллюска Lottia gigantea. Этот белок принадлежит к семейству тропонинов I.

м D Y D D Е Р R Т G DGN E A R L A M Е Е А А R К К К Е К V Е S Е 1 А Е Y Е Е М R R Е Q R Е К Е А Е

D 1 Е Q L R L К R Е Q R К Q E R 1 E E D R R L L Е 1 R К Е Е D К R R К А Е Е Е Е R К R К К Q Е D Е R

К R 1 Е А К К А К L К E L E E R К К M S К Т Р N F V 1 Т К К G А S N L Е Е ASK DMA К S К ЕО L Е

Е Е К R А 1 L A Q R 1 Q P L T VDG L D L А А L МЕКА T Е F Н N К 1 К S LAN Е К Y Е L Е Е R F К

S QQY D М 1 Е L А ERA R 0 M N К G К К R А V Q V D D S Y D Р МА Е К Y G S С Р Р К V О М Y S К Y

Е R Н Т D L R Т Y G T R V D Y F E T К А К К 1 Е А Е М А 1 G R К К Е Е D N L L К Т М Е Е т Е Е Т S Е

А АРА Р Е А EVA A E E E

М К К К G К R KG L GG L S P E К К К М L К К L 1 ÜQ К А А Е О L R N Е А К К К А Е Е К Е К Н 1 N 0

R V Е Р L К V DG L S Q G G L R T L с К Е 1 Q К К Y Е Q L Е А D V Y D WE F К 1 R Е К Е 1 Е 1 N D L

Т V К V N D Т К G К FMK P V L R К V N К т Е S К F S К L Е R К Е N R D F R GN L К S т G О N К Y К

L Е Е Е Е Т S К T P DWR N T L К G к Е Е G G Е HGE Е Е S

М T D F К V т D К Q F T D A К S T F н L Y V К К G S Е Е V А Т К D L D Q L F КА MA L н 1 D D Е К L

К DWA D Е М D E D A T G l 1 TWE к F К V L F ERK L К Е D Е Е Е К Е L К ЕА F R V L 0 S QK К G

V 1 Р V S D L RW 1 L К S L G D D 1 т Е Е Е 1 D ОМ 1 А Е Т D Т О G S G T VDY Е Е F К S L ■Is S Е

Рисунок 5 — Результат поиска пептидов, гомологичных АВР-белкам мидии, в базе данных Mascot.

А - тропонин Т (Chlamys nipponensis akazara)', Б - LOTGIDRAFT200673 (Lottia giganteay, В - тропонин С (Ruditapes philippinarum). Желтым цветом выделены совпадающие аминокислоты. Зеленым цветом показаны аминокислоты с посттрансляционными модификациями.

В целом, приведенные выше данные (рис. 3, 4 и 5) позволяют предполагать, что актин-связывающие белки АВР-28, АВР-20 и АВР-19 являются компонентами тропониноподобного белка мидии. В то же время содержание этих компонентов в тонких нитях мидии, если судить по электрофореграммам (рис. 1 и 2), невелико.

Для определения молярного содержания белков в тонких нитях мидии была применена денситометрия электрофоретических гелей с предварительным определением коэффициентов связывания красителя с белками тонких нитей. По результатам были построены линейные

зависимости интенсивности окраски белковых зон от количества белка в зоне. Полученные значения, характеризующие содержание белков в тонких нитях, были скорректированы с учетом молярного веса белков, их констант связывания красителя и нормированы по содержанию тропомиозина (рисунок 6, таблица).

Белок А ТМ Tnl ТпС

Содержание 7.1 1.0 0.45 0.5

Нагрузка (мкл)

Рисунок 6 - Определение относительного содержания белков в тонких нитях

мидии.

А - актин; ТМ - тропомиозин; ТпС - тропонин С; Tnl - тропонин I. В таблице приведены молярные концентрации белков, нормированные по тропомиозину.

Оказалось, что содержание компонентов тропонина вдвое меньше содержания тропомиозина. Согласно литературным данным, при таком содержании тропонин способен обеспечить лишь половинную Са2+-регуляцию тонких нитей (Galinska-Rakoczy et al., 2008; Lehman, Craig, 2008). Способен ли тропонин мидии при таком содержании обеспечить высокий уровень Са2+-регуляции?

Для выяснения этого мы изучили зависимость Са2+-регулируемости актин-миозин-тропомиозинового комплекса от содержания в нем тропонина мидии (рис. 7).

TN/TM (моль/моль)

Рисунок 7 - Зависимость Са2+-чувствительности реконструированного акгомиозина от содержания в нем реконструированного тропонина мидии.

Стрелкой показано соотношение Тп:ТМ, определенное нами в нативных тонких нитях мидии. Условия: 30 мМ KCl, 2.0 мМ MgCb, 0.5 мМ ДТТ, 10 мМ имидазол-НС1 (рН7.5), и 0.1 мМ СаСЬ или 1.0 нМ ЭГТА. Миозин кролика, 0.1 мг/мл; актин мидии, 0.05 мг/мл; тропомиозин мидии, 0.03 мг/мл; тропонин мидии, 0-0.1 мг/мл.

Как видно на рисунке 7, при соотношении тропонина и тропомиозина 1:2 (показано стрелкой) уровень Са2+-чувствительности актин-миозиновго взаимодействия составляет около 50%. Максимальная степень Са2+-регуляции наблюдается при достижении эквимолярного соотношения тропонина и тропомиозина. Следовательно, механизм «тропониновой» регуляции, существующей в тонких нитях мидии, такой же, как в скелетных мышцах позвоночных. Из этого следует, что тонкие нити мидии обладают вдвое большим уровнем регулируемости по сравнению с тонкими нитями скелетных мышц позвоночных.

Несоответствие низкого содержания тропонина высокому уровню Са2+-регуляции тонких нитей может объясняться тем, что выделяемые нами тонкие нити на самом деле являются смесью двух типов тонких нитей, принадлежащих к цитоскелетному и сократительному доменам гладкомышечных клеток. Тонкие нити сократительного домена содержат тропонин, и являются Са2+-регулируемыми, цитоскелетные тонкие нити не содержат тропонина и, следовательно, не обладают Са2+-регуляцией. При этом цитоскелетные тонкие нити содержат кальпонин, который ингибирует взаимодействие связанного с ним актина с миозином. Поэтому цитоскелетные тонкие нити с миозином не взаимодействуют. В результате уровень АТФазной активности и Са2+-регуляции препарата смешанных тонких нитей определяется только нитями сократительного домена. Подобное сосуществование двух типов тонких нитей показано на примере гладких мышц позвоночных (North et al., 1994).

Распространение «тропониновой» регуляции в запирательных мышцах двустворчатых моллюсков

В ходе данной работы мы выяснили, что Са2+-регуляция тонких нитей запирательной мышцы мидии осуществляется тропонином, что не согласуется с точкой зрения Беннетт и Марстон (Bennett, Marston, 1990), полагающих, что в запирательных мышцах представлена «кальдесмоновая» регуляция. Исследование Беннетт и Марстон проведено на запирательной мышце мидии Mytilus edulis, близкородственной мидии Crenomytilus grayanus, исследованной нами. Оба исследованных вида принадлежат к семейству митилид (Mytilidae), поэтому существование разных типов Са2+-регуляции в мышцах этих двух моллюсков маловероятно. Идентификация, проведенная нами, является более полной и согласуется с обнаружением белков, сходных по молекулярному весу с I и С компонентами тропонина, в мышце другого моллюска этого семейства Modiolus demissus (Lehman, 1981).

Таким образом, «тропониновая» регуляция, по-видимому, распространена среди двустворчатых моллюсков не только подотряда гребешков (Pectinoida), как считалось ранее (Nishita et al., 1997), но и подотряда Mytiloida, к которому относится семейство митилид.

Существуют указания на присутствие «тропониновой» регуляции и в других группах двустворчатых моллюсков. Так, в мышце представителя подотряда Pterioida обнаружена экспрессия гена тропонина (Funabara et al.,

2013). Из мышц представителя отряда Ostreoida при помощи подхода, разработанного для получения тропонинов гребешков, были выделены белки, схожие по молекулярному весу с компонентами I и С тропонина (Lehman, 1981).

Все вышеназванные таксономические группы двустворчатых моллюсков относятся к подклассу Eupteriomorphia, поэтому можно предполагать, что для тонких нитей запирательных мышц этой группы двустворчатых моллюсков характерна именно «тропониновая» регуляция.

Кроме подкласса Eupteriomorphia, в классе двустворчатых моллюсков существуют еще три подкласса. Данных по ахтин-ассоциированной Са2+-регуляции запирательных мышц в этих таксономических группах очень мало. Практически вся информация касается подкласса Heterodonta. В одном из пяти отрядов этого подкласса, отряде Veneroida, были исследованы три вида, принадлежащих к родам Spisula, Ruditapes и Mercenaria. В тонких нитях запирательной мышцы Mercenaria mercenaria были обнаружены белки, по электрофоретической подвижности похожие на тропонины гребешка Aequipecten irradians. Один из этих белков удалось выделить, применив подход, разработанный для выделения тропонина I позвоночных (Lehman, 1981). В мышцах Ruditapes philippinarum была показана экспрессия гена тропонина (Umasuthan et al., 2013). Интересно, что максимальный уровень экспрессии наблюдался в мышце-замыкателе моллюска, а минимальный — в его ноге. В другом представителе этого отряда, Spisula sachalinensis, тропонинов не обнаружили (Chiba et al., 1992). Однако авторы искали тропонин в ноге моллюска, а как показала работа на моллюске Ruditapes philippinarum, в ноге экспрессия гена тропонина минимальна.

Обнаружение тропонинов в тонких нитях запирательных мышц представителей как минимум двух из четырех подклассов двустворчатых моллюсков позволяет полагать, что «тропониновая» регуляция характерна для запирательных мышц всех двустворчатых моллюсков.

Применение гибридных моделей при исследовании сократительных белков

Сократительные модели — это комплексы, реконструированные из отдельных сократительных белков, позволяющие моделировать процессы, происходящие в мышце. Самой простой сократительной моделью является синтетический актомиозин, состоящий только из миозина и актина. Он

позволяет изучать активирование актином АТФазы миозина и сопряженную механохимическую активность. - -

Сократительные модели могут бьггь двух типов: негибридные, состоящие из белков, имеющих одинаковое происхождение, и гибридные, состоящие из белков, полученных из мышц разных животных. В гибридных моделях исследуемые белки комбинируют с хорошо изученными белками, свойства и методы выделения которых известны.

Исследование в гибридной модели тропомиозина из запирательной мышцы моллюсков показало существенные различия между тропомиозином моллюсков и скелетно-мышечным тропомиозином кролика (КПБЫтига е1 а1. 1997). Различия касаются ключевой функции тропомиозина — регуляции взаимодействия миозина с актином. Оказалось, что тропомиозин позвоночных в отсутствие тропонина активирует актин-миозиновое взаимодействие, то время как тропомиозин моллюсков его сильно ингибирует (рис. 8).

Тропомиозин/актин (моль/моль)

Рисунок 8 - Влияние тропомиозина мидии и тропомиозина кролика на АТФазную активность актомиозина кролика.

Условия: 75 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 2 мМ NaN3, 20 мМ имидазол-HCl (pH 7.0), 0.1 мМ СаСк. Миозин кролика, 0.1 мг/мл; актин кролика, 0.1 мг/мл; тропомиозин кролика, 00.33 мг/мл; тропомиозин мидии, 0-0.33 мг/мл.

В ходе данной работы нами была изучена зависимость этого явления от состава сократительной модели: мы изучили влияние тропомиозина мидии и кролика на свойства гибридных и не гибридных актомиозинов. Всего нами было исследовано восемь моделей (рис. 9).

Актин кролика

Актин мидии Миозин кролика

0.00

0.04

0.08

0.12

Миозин кролика

Актин кролика -о—о—о

Актин мидии

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100

Тропомиозин кролика (мг/мл) Тропопмиозин мидии (мг/мл)

100

Актин кролика 175. □

Ü25-

Актин мидии Миозин мидии

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100

Актин кролика

Актин мидии

0.00 0.03 0.06 0.09 0.12

Тропомиозин мидии (мг/мл) Тропомиозин кролика (мг/мл)

Рисунок 9 - Свойства актомиозиновых моделей, реконструированных из миозина, актина, и тропомиозина кролика и мидии в различных комбинациях.

Условия: 75 мМ KCl, 2 мМ MgCh, 2 мМ Na№, 20 мМ имидазол-HCl (pH 7.0), 0.1 мМ СаСЬ. Миозин кролика и мидии, 0.1 мг/мл; актин кролика и мидии, 0.1 мг/мл; тропомиозин кролика, 0-0.12 мг/мл; тропомиозин мидии, 0-0.1 мг/мл.

Шесть моделей из восьми оказались сходны по влиянию на них тропомиозина: М^-АТФазная активность по мере увеличения содержания тропомиозина в большей или меньшей степени увеличивается. В случае же двух моделей, содержащих миозин кролика и тропомиозин мидии (рис. 9В), наблюдается сильное ингибирование АТФазной активности, которое слабо

зависит от источника использованного актина. Если в этих моделях (рис. 9В) заменить миозин кролика на миозин. мидии (рис. 9Б), то ингибирование сменяется активированием опять-таки независимо от происхождения актина.

По-видимому, ингибирование тропомиозином АТФазной активности гибридных актомиозиновых моделей обусловлено стерическим блокированием тропомиозином сайтов связывания миозина кролика на актине. Наблюдаемое в тех же условиях активирование тропомиозином мидии АТФазной активности сократительных моделей, включающих миозин мидии, указывает на то, что миозины мидии и кролика имеют разные сайты связывания на актине.

Следует отметить, что ингибирование тропомиозином сократительной модели, включающей миозин кролика, зависит от условий среды. Так, при снижении ионной силы с 75 до 30 мМ KCL, ингибирование тропомиозином АТФазной активности актамиозина кролика исчезает (рис. 10).

Рисунок 10 — Влияние ионной силы на степень ингибирования тропомиозином мидии АТФазной активности акгомиозина.

Условия: 30-100 мМ KCl, 0.5 мМ MgCl2, 2 мМ NaN3, 20 мМ имидазол-HCl (pH 7.0), 0.2 мМ СаСЬ, 0.3 мМ М^+-АТФ. Миозин кролика, 0.1 мг/мл; актин кролика, 0.1 мг/мл; тропомиозин мидии, 0.03 мг/мл.

Данная корректировка внешне нормализует свойства гибридных моделей, делая их свойства сходными со свойствами негибридных моделей. Однако у нас нет уверенности в том, что в этих условиях гибридные модели становятся идентичными по свойствам негибридным моделям.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что «актиновая» Са2+-регуляция гладких (запирательных) мьппд мидии Crenomytilus grayanus является «тропониноподобной», т.е. такой же, как и в скелетных мышцах позвоночных. При этом «актиновая» Са2+-регуляция гладких мышц позвоночных является «кальдесмоно-подобной», т.е. отличается от регуляции скелетных мышц.

В данной работе процедура установления природы «актиновой» Са2+-регуляции включала несколько стадий:

1. Выделение Са2+-регулируемых тонких нитей в условиях, гарантирующих сохранение состава тонких нитей.

2. Выделение из них фракции белков, придающей Са2+-чувствительность реконструированному актомиозину.

3. Хроматографическое разделение этой фракции.

4. Тестирование влияния белков этой фракции на Са2+-чувствительность актомиозиновых моделей.

5. Идентификация компонентов регуляторной системы как Са2+-связывающего, ингибирующего и тропомиозин-связывающего белка.

6. Подтверждение идентификации посредством иммуноферментного анализа и МАЛДИ.

7. Определение констант связывания красителя Coomassie Brillant Blue R-250 с компонентами тропонина мидии.

8. Определение посредством денситометрии молярного содержания актина, тропомиозина и тропонина мидии в тонких нитях.

9. Определение Са2+-регулируемости комплекса реконструированного актомиозина мидии с реконструированным тропонином мидии.

Согласно литературным данным, только в одной мышце двустворчатых моллюсков «актиновая» регуляция охарактеризована достаточно полно. Это поперечнополосатая мышца гребешков, которая функционально и структурно сходна со скелетной мышцей позвоночных. Сходны и основные черты организации «актиновой» регуляторной системы тонких нитей гребешков и тонких нитей позвоночных: молярное соотношение актин : тропомиозин : тропонин в этих тонких нитях одинаково и равно 7:1:1.

Кроме данных по поперечнополосатым мышцам гребешков, в литературе также представлены данные по гладким (запирательным) мышцам двустворчатых моллюсков. В основном они касаются обнаружения

или необнаружения в тонких нитях компонентов тропонина. Причем, если эти компоненты и обнаруживаются, то в очень небольших количествах. В данной работе показано, что в процессе выделения тонких нитей из гладких мышц двустворчатых моллюсков возможны значительные потери компонентов тонких нитей. Кроме того, в условиях, препятствующих потерям, молярное соотношение между тропонином и тропомиозином вдвое ниже, чем в скелетных мышцах позвоночных. По всей вероятности, необнаружение компонентов тропонина в гладких мышцах двустворчатых моллюсков, или обнаружение их в низкой концентрации, что ставит под сомнение наличие тропониновой регуляции в этих мышцах, обусловлено сочетанием потери белков при выделении тонких нитей и их локализацией только в нитях сократительного домена.

выводы

1. Из Са2+-регулируемых тонких нитей мышц мидии СгепотуШю ¿гауапия выделены актин-связывающие белки АВР-19, АВР-20 и АВР-28, идентифицированные как Са2+-связывающий, ингибирующий и тропомиозин-связывающий компоненты, аналогичные компонентам тропонина позвоночных.

2. Реконструированный комплекс тропонина и тропомиозина мидии придает фибриллярному актину кролика или мидии Са2+-чувствительность в пределах 70-90%.

3. Содержание тропонина в запирательной мышце мидии СгепотуШиз ^гауагш вдвое ниже, чем в скелетных мышцах позвоночных, при таком же уровне Са2+-регуляции.

4. Гибридные актомиозиновые модели, сочетающие в своем составе миозин скелетных мышц кролика и тропомиозин запирательных мышц мидии, обладают аномальными свойствами.

5. Разработан метод получения хроматографически чистых компонентов тропонинового комплекса из мьппцы мидии СгепотуШиз %гауапиз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК:

1. Vyatchin I.G., Shevchenko U.V., Lazarev S.S., Matusovsky O.S., Shelud'ko N.S. Troponin-like regulation in muscle thin filaments of the mussel Crenomytilus grayanus (Bivalvia: Mytiloida) // Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 2015. V. 1854, № 10. P. 1444-1450.

2. Shelud'ko N.S, Vyatchin I.G., Lazarev S.S., Shevchenko U.V. Hybrid and non-hybrid actomyosins reconstituted with actin, myosin and tropomyosin from skeletal and catch muscles // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2015. V. 464, № 2. P. 611-615.

Работы в материалах конференций:

3. Вятчин И.Г. Необычные свойства белка тропомиозина из мышц Crenomytilus grayanus IIX Региональная конференция студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока. - Владивосток: Изд-во ДВФУ, 2011. С. 69-71.

4. Dobrzhanskaya A.V., Vyatchin I.G., Lazarev S.S., Matusovsky O.S., Shelud'ko N.S. Smooth muscle from mussel Crenomytilus grayanus does not contain caldesmon // International Symposium «Biological motility: Fundamental and Applied Science», May 9-14, 2012, Pushchino, Russia. - Pushchino: ITEB RAS, 2012. P. 48.

5. Vyatchin I.G., Shelud'ko N.S. Molluscan smooth (catch) muscle contains a troponin-like protein // International Symposium «Biological motility: New facts and hypotheses», May 11-15, 2014, Pushchino, Russia. - Pushchino: ITEB RAS, 2014. P. 328-330.

Вятчин Илья Геннадьевич

Механизм Са2+-регуляции тонких нитей запирательных мышц двустворчатых моллюсков на примере мидии СгепотуМиз дгауапш

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 09.10.15. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 666

Отпечатано в печатном салоне «Новая точка». 690014, г. Владивосток, ул. Гоголя 39А, тел. (423)2906346