Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие твитчина запирательных мышц моллюсков с фибриллярным актином

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие твитчина запирательных мышц моллюсков с фибриллярным актином"

На правах рукописи

МАТУСОВСКАЯ Галина Геннадьевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТВИТЧИНА ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ МОЛЛЮСКОВ С ФИБРИЛЛЯРНЫМ АКТИНОМ

03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3446039

Владивосток - 2008

003446839

Работа выполнена в лаборатории биофизики клетки Института биологии моря им А В Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Шелудько Николай Семенович

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Жадаи Петр Михайлович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ламаш Нина Евгеньевна

Ведущая организация Институт цитологии РАН

Защита состоится 25 сентября 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005 008 01 при Институте биологии моря им А В Жирмунского ДВО РАН Адрес 690041, г Владивосток, ул Пальчевского, 17 Факс (4232)310-900 E-mail inmarbio@mail pnmorye ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им AB Жирмунского ДВО РАН

Отзывы просим присылать на e-mail mvaschenko@mail ru

Автореферат разослан 22 августа 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ващенко М А

Актуальность проблемы

Мышцы являются специализированными структурными элементами, способными трансформировать химическую энергию в механическую работу Несмотря на то, что строение и функция мышц разнообразны, общие принципы их работы одинаковы Согласно теории скользящих нитей, мышечное сокращение обусловлено активным скольжением тонких актиновых нитей относительно толстых миозиновых нитей без изменения их длины Работа мышцы заключается в циклической смене двух ее состояний' сокращения в результате повышения концентрации Са2+ в саркоплазме и расслабления при ее понижении Известно лишь одно исключение из этого правила - гладкие мышцы двустворчатых моллюсков способны поддерживать еще одно состояние - запирательный тонус или catch-состояние, при котором мышца при низкой концентрации Са2+ остается сокращенной в течение длительного времени При этом высокое значение поддерживаемой силы сочетается с низким расходом энергии Это явление, описанное более ста лет назад, хотя и свойственно ограниченному кругу мышц, тем не менее, вызывает повышенный интерес исследователей, поскольку его механизм трудно объяснить в рамках современных представлений о механизмах биологической подвижности

Механические свойства нативных и демембранизированных волокон запирательных мышц моллюсков свидетельствуют о том, что в основе catch лежит образование поперечных сшивок между элементами сократительного аппарата Выдвинуты две гипотезы, конкретизирующие это положение «мостиковая», постулирующая в качестве искомых сшивок особое ригороподобное состояние актомиозиновых мостиков (Lowy et al, 1964), и «независимая» или «парамиозиновая» гипотеза, которая постулирует наличие независимой системы поперечных связей Предполагается, что такими связями являются сшивки между толстыми нитями (Johnson et al, 1959)

Мышцы, способные к запирательному тонусу, обладают необычными толстыми нитями, которые имеют большие размеры (10-20 мкм), и в их основе лежит парамиозиновый стержень, составляющий около 60% от массы толстых нитей На поверхности парамиозинового стержня располагается миозин (Szent-Gyorgyi et al, 1971), твитчин (Vibert et al, 1993) и миород (Shelud'ko et al, 1999) Выход из состояния запирательного тонуса стимулируется серотонинэргическим нервом, что приводит к фосфорилированию твитчина (Siegman et al, 1997) В связи с этим открытием «мостиковая» гипотеза была уточнена Предполагается, что дефосфорилированный твитчин, взаимодействуя с миозином, придает миозиновым мостикам свойства catch-ешивок, в то время как

фосфорилированный твитчин не меняет цикл работы миозиновых мостиков (Butler et al, 2001, Funabara et al., 2001, Yamada et a! ,2001,2004)

Хотя «мостиковая» гипотеза catch является общепринятой и тестируется длительное время, убедительных доказательств ее правильности не получено Более того, накапливаются экспериментальные данные, которые не согласуются с этой гипотезой (Siegman et al, 1997, Sugi et al, 1999, Galler et al, 1999, Takahashi et al, 2003)

В данной работе предложена новая «независимая» гипотеза запирательного сокращения - гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» («twitchm-actm linkage hypothesis») Она основана на обнаруженной нами способности твитчина непосредственно взаимодействовать с фибриллярным актином, причем это взаимодействие регулируется фосфорилированием твитчина таким же образом, как распад и образование catoh-сшивок in vivo Согласно этой гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя а дефосфорилированном состоянии catch-сшивки мевду толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков

Наши данные о способности твитчина взаимодействовать с фибриллярным актином противоречат ранее опубликованным данным Ямада и сотр (Yamada et al, 2001), однако подтверждены Фунабарой и сотр (Funabara et al, 2005)

Цель и задачи исследования

Целью работы было выяснение роли твитчина в механизме запирательного тонуса гладких мышц двустворчатых моллюсков

Были сформулированы следующие задачи

1 Разработать методы препаративного выделения твитчина, миозина и актина из гладких мышц мидии Crenomytilus grayanus

2 Провести поиск условий взаимодействия твитчина с фибриллярным актином

3 Исследовать физико-химические свойства твитчин-актинового комплекса и влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина

Положения, выносимые на защиту

1 Твитчин из запирательных мышц двустворчатых моллюсков взаимодействует с фибриллярным актином

2 Взаимодействие твитчина и актина регулируется фосфорилированием твитчина

3 Твитчин-актиновое взаимодействие может быть основой запирательного сокращения мышц двустворчатых моллюсков, обеспечивая поперечные cateh-сшивки между толстыми и тонкими нитями

Научная новизна полученных результатов

Впервые показано, что гигантский белок твитчин способен взаимодействовать с фибриллярным актином, и это взаимодействие зависит от степени фосфорилирования твитчина Взамен общепринятой «мостиковой» гипотезы запирательного тонуса (Lowy et al, 1964) предложена гипотеза «твитчин-актиновых сшивок», согласно которой дефосфорилированный твитчин образует cateh-сшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков

Теоретическое и практическое значение работы

Предложенная гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» открывает новые возможности экспериментального исследования механизма запирательного сокращения и стимулирует поиски аналогичных систем в других мышцах, обладающих тоническими свойствами

В работе детально описаны методы выделения и очистки сократительных белков, а также способы образования синтетических сократительных моделей, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004, 2006), VIII Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005) и ежегодной научной конференции Института биологии моря им А В Жирмунского (Владивосток, 2005) По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе - 5 работ в рецензируемых изданиях из списка ВАК

Финансовая поддержка работы

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-04-49895) и Конкурса проектов ДВО РАН (грант № 06-III-B-06-206)

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 104 страницах, состоит из «Введения», глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение результатов», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 170 ссылок. Рукопись содержит 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка белков

Миозин, твитчин и «природный» Ф-актин выделяли из мышц аддуктора мидии СгепотуШт ^гауапия (мидия Грея) (Э1те1и(1'ко е/ о/., 2001, 2004, 2007). На рисунке 1 приведен пример электрофореграммы, на которой отражены основные этапы комплексного метода выделения основных сократительных белков из гладких мышц мидии. В данном случае показан ход получения конечного препарата твитчина (дорожка 11) и промежуточных препаратов миозина (дорожка 7) и «природного» Ф-актина (дорожка 5). Комплексный метод позволяет получать препаративные количества необходимых в эксперименте белков в одном выделении.

I \у —

МНС — >

6 7 8 9 10 И

Ц р 4$ Щ

-Д1- .мм*

V) 1> «¡ц<с дат ц|1

•*-. щШ ....„» 8Щ _^^ ^^ ^^ ^^

Рис. 1. Основные этапы выделения и очистки твитчина.

1 - мышечный гомогенат, 2 - толстые нити, 3 - остаток после экстракции поверхностных белков толстых нитей (парамиозиновая основа толстых нитей), 4 -поверхностные белки толстых нитей, 5 - 0-33% сульфатно-аммонийная фракция поверхностных белков, 6 - 33-43% сульфатно-аммонийная фракция поверхностных белков, 7 - 43-65% сульфатно-аммонийная фракция поверхностных белков, В и 9 - осадок и супернатант фракции 33-43% после ее диализа против раствора с низкой ионной силой, 10 и 11 - твитчин до и после хроматографической очистки, соответственно.

Твитчин фосфорилировали в присутствии каталитической субъединицы протеин киназы А (ПКА, Sigma) согласно Фунабара с сотр (Funabara et al, 2003)

Скелетный миозин выделяли из спинных мышц и мышц задних конечностей кролика (Margossian and Lowey, 1982) Из мышечного остатка после выделения миозина готовили ацетонизированный порошок и далее получали скелетный Ф-актин (Shelud'ko et al, 2007)

Чистоту и состав препаратов сократительных белков из гладких мышц моллюсков оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) (Laemmli, 1970) с некоторыми модификациями (Шелудько, 1975, Shelud'ko etal, 1999)

Концентрацию белков определяли биуретовым методом или методом Бредфорда

Определение оптических свойств

Оптическую плотность растворов и суспензий белков и белковых комплексов измеряли посредством спектрофлуориметра Спекол-11 (Carl Zeiss, Jena) с использованием приставки ЕК-1 Размер частиц белковых комплексов определяли лазерным дифракционным измерителем размера частиц (Laser Diffraction Particle Sizer ЗбООЕс, Malvern)

Измерение вязкости

Вязкость измеряли при низких градиентах скорости методом «падающего шарика» (Pollard and Cooper, 1982) Рассчитывали приведенную Луд/С и характеристическую вязкость [г|]= (г|уд/С)С-, о

Низкоскоростное и высокоскоростное центрифугирование

Эти методы использовались для тестирования взаимодействия твитчина с Ф-актином в условиях образования крупных агрегатов (осаждаемых при 15000 g) и для соосаждения твитчина с Ф-актином (100000 g) в условиях, когда взаимодействие этих белков не приводит к агрегации их комплексов Перед образованием комплексов для низкоскоростного центрифугирования твитчин и Ф-актин осветляли при такой же скорости, как и при последующем осаждении комплексов Перед высокоскоростным осаждением осветляли только твитчин Условия центрифугирования были подобраны таким образом, чтобы оба белка не осаждались при низкоскоростном центрифугировании, и только Ф-актин осаждался при высокоскоростном центрифугировании Осадки на дне и стенках пробирки промывали и солюбилизировали в 8 5 М мочевине с 5 мМ ЭДТА

Измерение АТФ-азной активности актомиозина

АТФ-азную активность синтетического актомиозина, включающего Ф-актин кролика или «природный» Ф-актин мидии, миозин кролика или мидии и твитчин определяли методом Херса, который представляет собой модификацию метода Фиске-Суббароу (Fiske and Subbarow, 1925)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Твитчин способен взаимодействовать с Ф-актином

Тестирование взаимодействия твитчина с актином проводили оптическими и гидродинамическими методами На рисунке 2 показано изменение оптической плотности смеси двух белков - твитчина и Ф-актина в зависимости от времени Оптическая плотность смеси этих белков в растворах с низкой ионной силой намного превышает сумму оптических плотностей отдельно взятых белков, что указывает на образование комплекса этих белков, т е взаимодействие этих белков в данных условиях

Время (мин)

Рис 2 Изменение оптической плотности после смешивания твитчина и Ф-актина

Концентрация Ф-актина - 0 2 мг/мл, твитчина - 0 4 мг/мл Состав среды (в мМ) 75 КС1, 2 0 5 ЭГТА, 0 5 ДТТ, 2 №N3, 0 5 ФМСФ, 0 5 леупептин, 25 имидазол-НС1 (рН

7 0)

(Т^У+Зч^А - твитчин (0 32 мг) инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов и смешивали с Ф-актином, (ТЛУ+ИПК+ПКА+О 5 ч) + А - твитчин (0 32 мг) инкубировали в присутствии ингибитора протеин киназы (ИПК) (20 мкг) и ПКА (30 и) в течение 0 5 ч и смешивали с Ф-актином, (А+ПКА+0 5ч+ИПК)+Т\\^ - Ф-актин (0 16 мг) инкубировали в присутствии ПКА (ЗОи) в течение 0 5 ч, затем добавляли ИПК (20 мг) и твитчин, (Т\У+ПКА+0 5 ч) + А - твитчин (0 32 мг) инкубировали в присутствии ПКА (30 и) в течение 0 5 ч и смешивали с Ф-актином, (Т\У + ПКА + 3 ч) + А - то же, что и в последнем случае, за исключением 3-х часовой инкубации

При формировании комплекса с использованием in vitro фосфорилированного твитчина посредством каталитической субъединицы ПКА наблюдается существенное уменьшение значений оптической плотности твитчин-актиновой смеси (рис 2) Увеличение времени инкубации до 3-х часов (нижняя кривая) практически ингибирует взаимодействие между актином и твитчином

Таким образом, по данным оптической плотности твитчин и актин взаимодействуют в среде с низкой ионной силой, но это взаимодействие ослабляется и исчезает по мере фосфорилирования твитчина

Аналогичный вывод был сделан на основании данных вискозиметрии На рисунке 3 показана зависимость приведенной вязкости Ф-актина от его концентрации и влияние на нее твитчина

Концентрация актина (мг/мл)

Рис 3 Влияние твитчина на приведенную вязкость Ф-актина Твитчин и актин смешивали в растворе, содержащем (в мМ) 75 KCl, 2 MgCl2, 0 5 ЭГТА, 0 5 ДТТ и 10 имидазол-HCl (pH 7 0) Отношение актина к твитчину - 1 1 по весу

Видно, что присутствие в смеси твитчина резко меняет зависимость вязкости от концентрации при концентрациях Ф-актина 0 15 мг/мл и ниже твитчин увеличивает, в то время как при более высоких концентрациях -уменьшает вязкость Ф-актина Вероятно, твитчин-актиновый комплекс, сформированный при низких концентрациях, обладает большей асимметрией, чем Ф-актин С другой стороны, с увеличением концентрации смеси асимметрия образующихся частиц, по-видимому, уменьшается Отсутствие обычной линейной зависимости вязкости Ф-актина от концентрации указывает на то, что в растворах с низкой ионной силой Ф-актин взаимодействует с твитчином

Таким образом, вискозиметрические данные однозначно подтверждают способность твитчина взаимодействовать с актином Однако это происходит только в том случае, когда твитчин дефосфорилирован

На рисунке 4 показано влияние дефосфорилированного и фосфорилированного твитчина на вязкость Ф-актина в растворах с низкой (50 мМ KCl), физиологической (175 мМ KCl) и высокой (300 мМ KCl) ионной силой. Дефосфорилированный твитчин увеличивает вязкость Ф-актина при 50 мМ KCl и 175 мМ KCl до уровней, которые намного выше суммы вязкостей Ф-актина и твитчина. Как и ожидалось, твитчин не изменяет вязкость Ф-актина в растворах с высокой ионной силой. В растворах с физиологической и низкой ионной силой фосфорилированный твитчин, в отличие от дефосфорилированного, не увеличивает вязкость Ф-актина (рис. 4).

Рис. 4. Вязкость твитчин-актиновых смесей в растворах с различной ионной силой и ее зависимость от фосфорилирования твитчина.

Концентрация Ф-актина - 0.05 мг/мл, твитчина - 0.2 мг/мл. Состав среды (в мМ): 50, 175 или 300 КС1, 2 МёС12, 0.5 ЭГТА, 0.5 ДТТ и 25 имидазол-НС1 (рН 7.0).

А - Ф-актин; т|а + - сумма отдельно измеренных вязкостей твитчина и актина; Т\¥ + А - смесь твитчина и Ф-актина; (Т\У + ПКА) + А - смесь фосфорилированного твитчина и Ф-актина. Твитчин фосфорилировали посредством ПКА (70 и) при комнатной температуре в течение 60 мин.

Состав твитчин-актиновых комплексов

Итак, нами показано, что в растворах с низкой ионной силой дефосфорилированный твитчин взаимодействует с актином. Образующиеся комплексы и агрегаты комплексов могут быть осаждены центрифугированием при высокой или низкой скорости, соответственно. Состав осадков, полученных низкоскоростным центрифугированием твитчин-актиновой смеси в условиях, когда Ф-актин не осаждается (15 000£) показан на рисунке 5.

Видно, что количество осаждаемого Ф-актина возрастает с увеличением концентрации твитчина (рис. 5, дорожки 1-6), а в случае смеси, в которой концентрация Ф-актина составляет 0.1 мг/мл, а твитчина - 0.4 мг/мл (дорожка 6), осадок содержит приблизительно весь актин смеси.

ВЯЗ А

ЕПЗ Па+11™

ES3TW+A [=3 (TW+ ПКА)+А

50 мМ 175 мМ 300 мМ

и

1234567 89 10

ис "с" "о"

Рис. 5. Низкоскоростное осаждение смесей твитчинас Ф-актином.

Дорожки 1-6 - осадки смеси Ф-актина (0.1 мг/мл) с разными концентрациями твитчина: (мг/мл) 0.Ü5, 0.1, 0.2, 0.3 и 0.4, соответственно; дорожка 7 - то же, что на дорожке 6, но был использован фосфорилированный твитчин, дорожка 8 - смесь 0.1 мг/мл Ф-актина и 0.4 мг/мл твитчина. Дорожки 8-10 - результаты эксперимента по механическому извлечению твитчин-актинового комплекса. ИС - исходная смесь, "С" -"супернатант", "О" - "осадок". Белки смешивали в стандартном растворе и центрифугировали при 15000g в течение 30 мин.

Таким образом, полное осаждение Ф-актина в присутствии твитчина происходит при отношении актина к твитчину как 1:4. Это указывает на то, что в разбавленных растворах полное связывание актиновых нитей твитчином требует молярного избытка последнего.

Осаждение смеси двух белков в тех же концентрациях и условиях (отношение Ф-актина к твитчину = 1:4 по весу), но с использованием фосфорилированной формы твитчина, приводит лишь к незначительному осаждению Ф-актина (рис. 5, дорожка 7).

Следует отметить, что при низкоскоростном осаждении осадок твитчин-актинового комплекса наблюдался только при использовании растворов с низкой ионной силой (75 мМ KCl). Увеличение ионной силы раствора до 150 мМ KCl (с использованием тех же молярных соотношений и концентраций белков) приводило к тому, что при центрифугировании твитчин-актинового комплекса при 15000g осадок не образовывался, хотя при центрифугировании этих же препаратов при 100000 g осадок появлялся (см. рис. 6).

Интересно, что твитчин-актиновый комплекс, сформированный в присутствии 75 мМ KCl без перемешивания, образует трехмерную структуру, которая может быть полностью удалена из раствора тонкой стеклянной палочкой. На рисунке 5 показан белковый состав такой структуры (дорожка 10), состав «супернатанта» после удаления структуры (дорожка 9) и состав исходной смеси белков (дорожка 8). Видно, что

удаленная фракция содержит практически весь Ф-актин начальной смеси и минорную часть твитчина (отношение актина к твитчину - 1:0.2 по весу).

Высокоскоростное соосаждение двух белков в условиях, когда один из них не осаждается, широко используется для обнаружения белок-белкового взаимодействия. В случае взаимодействия белков, в осадке находится не только белок, обычно осаждающийся в этих условиях, но и белок, с ним взаимодействующий.

Использование высокоскоростного соосаждения в нашем случае выявило более сложную картину твитчин-актинового взаимодействия. Оказалось, что результаты соосаждения сильно зависят от выбранных экспериментальных условий. При условиях, представленых на рисунке 6 (дорожки 1 -4) осадки формировались как на дне, так и на стенке пробирки и содержали небольшое, приблизительно одинаковое количество твитчина (дорожки 3 и 4). Однако при низком отношении твитчина к актину осадок на стенке содержал намного больше твитчина, чем осадок на дне пробирки (не показано). Мы предполагаем, что появление двух осадков связано с гетерогенностью твитчин-актинового комплекса. Комплексы могут включать как большие частицы, обогащенные твитчином, так и маленькие частицы, обогащенные актином.

1 2

О ш щ ш

6

щ

ю

*• ** —

— тад

ф Ф Ф Ц * ф Ц-А

И С С 01 02 ис с О ис С

75 мМ А:Т\¥=1:2

150 мМ А:Т\У=1:2

75 мМ А:Т\У=5:1

Рис. 6. Высокоскоростное соосаждение твитчина с Ф-актином. Твитчин (0.4 мг/мл), Ф-актин (0.2 мг/мл или 2 мг/мл) смешивали в растворе, содержащем 75 или 150 мМ КС1.

ИС - исходная смесь до центрифугирования, С - супернатант, О - осадок, 01 -осадок на стенке пробирки, 02 - осадок на дне пробирки. Ультрацентрифугирование при 100000g в течение 2 часов.

В тоже время, твитчин-актиновый комплекс, сформированный в присутствии 150 мМ КС1, осаждается одним осадком на дне пробирки и содержит такое же незначительное количество твитчина (рис 6, дорожка 7), как в случае 75 мМ КС1 (рис 6, дорожки 3 и 4) Следует отметить, что значительная часть твитчина после высокоскоростного центрифугирования остается в супернатанте (рис 6, дорожки 2 и 6). Однако использование более концентрированных растворов Ф-актина заметно увеличивает количество связанного твитчина (рис 6, дорожки 8-10)

Таким образом, взаимодействие твитчина и Ф-актина может быть обнаружено как низкоскоростным, так и высокоскоростным центрифугированием в растворах с низкой и физиологической ионной силой In vitro фосфорилированный посредством ПКА твитчин не образует с Ф-актином осаждаемый комплекс (рис 5, дорожка 7)

Влияние твитчина на мехаиохимическую активность актомиозина

Как показано выше, твитчин способен взаимодействовать с Ф-актином, который является основой тонкой нити, и это взаимодействие зависит от фосфорилирования твитчина С другой стороны, твитчин способен взаимодействовать с миозином (Yamada et al, 2001) и другими белками толстой нити - парамиозином и миородом, причем все эти взаимодействия не зависят от степени фосфорилирования твитчина (Shelud'ko et al, 2007) Эти данные позволяют предположить образование твитчином регулируемых сшивок между толстыми и тонкими нитями Такие сшивки должны модифицировать механо-химические свойства актомиозиновых моделей

На рисунке 7А показано влияние твитчина на «спонтанную» суперпреципитацию (СПП) синтетического актомиозина, те на его механические свойства, а на рисунке 7В показано влияние твитчина на АТФазную активность этого актомиозина В этих экспериментах механические и химические свойства комплексов измерялись параллельно, с использованием одних и тех же препаратов

«Спонтанная» СПП нерегулируемого актомиозина наблюдается в условиях пониженного сродства миозина к актину, когда после добавления Mg^-АТФ к актомиозину следует сначала фаза просветления суспензии, а затем спонтанный рост ее оптической плотности (рис 7А, кривая AM) В фазе просветления миозиновые мостики находятся, в основном, в диссоциированном состоянии, что напоминает состояние «расслабления» регулируемого актомиозина Со временем фаза просветления переходит в СПП, поскольку уменьшается концентрация Mg2+-AT® за счет гидролиза АТФ в фазе просветления (Spicer, 1952) Переход к спонтанной СПП сопровождается сильным увеличением АТФазной активности (рис 7В, кривая AM) Механизм «спонтанной» СПП хорошо изучен, включая связь

между механо-химическими и оптическими явлениями (Shelud'ko and Kropacheva, 1996), и поэтому эта модель удобна для тестирования влияния твитчина на свойства актомиозина

Ш-. в

vAM+TW

Й 5

Время (мин)

20 30 AQ 50 Время (мин)

Рис 7 Влияние твитчина на «спонтанную» суперпреципитацию (А) и Mg2+-АТФазную активность синтетического актомиозина (В), реконструированного из «природного» Ф-актина мидии и миозина кролика

Концентрация миозина - 0 15 мг/мл, Ф-актина - 0 1 мг/мл, твитчина - 0 05 мг/мл Состав среды (в мМ) 75 КС1, 2 NaN3, 0 1 СаС12, 0 25 АТФ, 2 MgCl2, 20 имидазол-HCI (рН 7 2)

Твитчин, добавленный к актомиозину при его реконструкции, принципиальным образом меняет его механо-химические свойства. Такой актомиозин в условиях «спонтанной» СПП отвечает на добавление Mg2+-АТФ «немедленной» СПП (рис 7А, кривая AM+TW) которая, как и положено «немедленной» СПП, сопровождается высокой АТФазной активностью (рис 7В, кривая AM+TW) (уменьшение АТФазной активности со временем в этих экспериментах связано, в основном, с уменьшением концентрации АТФ, поскольку АТФ-регенерирующая система не использовалась) Как уже говорилось, фаза просветления наблюдается в условиях пониженного сродства миозина к актину, поэтому очевидно, что эффект твитчина связан с усилением сродства миозина к актину Мы полагаем, что твитчин образует сшивки между актиновыми и миозиновыми нитями, создавая благоприятные условия для их взаимодействия

На рисунке 8 показано влияние твитчина на «расслабление» регулируемого синтетического актомиозина, реконструированного из тонких нитей мидии и миозина кролика Интересно, что при относительно невысокой Са2+-чувствительности тонких нитей (50-70%), их комплекс с миозином кролика полностью суперпреципитирует («сокращается») в присутствии кальция и полностью «расслабляется» в его отсутствии (рис 8)

Оптическая Mg-АТФазная активность

плотность (при 663 нМ) (нмоль/мг/мин)

Время (мин)

Рис 8 Образование Са2+- чувствительного комплекса тонких нитей мидии и миозина кролика в присутствии Са2+ (сплошная линия) и в отсутствие Са2+ (прерывистая линия) и влияние на этот комплекс Mg2+-ATO и твитчина Жирной линией показана АТФазная активность комплекса в условиях расслабления до и после добавления твитчина

Концентрация миозина - 0 05 мг/мл, тонких нитей мидии - 0 05 мг/мл, твитчина -0 005 мг/мл Состав среды (в мМ) 30 КС1, 0 5 MgCl2, 1 ЭГТА или 0 1 СаС12, 0 3 Mg2+-АТФ, 20 имидазол-HCl (рН 7 2)

Добавление твитчина к такому актомиозину в условиях расслабления приводит к сильному увеличению оптической плотности при неизменно низком уровне АТФазной активности Таким образом, как в случае нерегулируемого актомиозина, «расслаблению» которого соответствует фаза просветления (рис 7), так и в случае регулируемого «расслабленного» актомиозина (рис 8), добавление твитчина приводит к агрегации толстых и тонких нитей Эта агрегация не связана с усилением актин-миозинового взаимодействия, поскольку добавление твитчина в условиях расслабления не приводит к увеличению АТФазной активности, а ее увеличение в фазе просветления нерегулируемого актомиозина определяется подавлением этой фазы

Гипотеза «твитчин-актиновых сшивок»

Экспериментальные результаты, представленные в настоящей работе, позволили нам сделать предположение о том, что дефосфорилированный твитчин может самостоятельно образовывать in vivo механические сшивки между толстыми и тонкими нитями, которые поддерживают catch-состояние

независимо от миозиновых поперечных мостиков, т е предложить новый вариант «независимой» гипотезы механизма запирательного сокращения Гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» предполагает существование параллельной системы мостиков между толстыми и тонкими нитями с независимой регуляцией

Обнаруженное нами взаимодействие твитчина с фибриллярным актином, зависимое от фосфорилирования твитчина, подтверждено Фунабарой с сотр (Funabara et al, 2005), и гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» уже используется нашими коллегами при интерпретации экспериментальных данных (Hopflinger et al, 2006, Butler et al, 2006, Franke et al, 2007, Funabara et al, 2007)

Теоретически этой гипотезе может соответствовать три механизма запирательного сокращения

1 Твитчин-актиновые связи выполняют регуляторную роль Этот вариант, в конечном счете, сводится к «мостиковой» гипотезе с той лишь разницей, что влияние твитчина на актин-миозиновое взаимодействие реализуется через актин, а не через миозин Похоже, что такой точки зрения придерживаются Фунабара и сотр (Funabara et al, 2005), которые считают, что связывание дефосфорилированного твитчина с актином усиливает взаимодействие миозиновых мостиков с актином, что и приводит к развитию catch

2 Твитчин-актиновые связи являются cateh-сшивками Поскольку cateh-сшивки присутствуют не только в catch-состоянии, но также во время активного сокращения (Ruegg, 1971, Butler et al, 1998, Andruchov et al, 2006), эти сшивки должны препятствовать работе миозиновых мостиков, генерирующих силу Так как этот эффект не наблюдается (Butler et al, 1998), то должен быть специальный механизм, предотвращающий торможение активных мостиков пассивными Например, есть предположение о том, что catch-сшивки ведут себя подобно «трещетке» (Andruchov et al, 2006) Это означает, что cateh-сшивки обладают высоким сопротивлением силе, когда мышечное волокно удлиняется, и низким сопротивлением при его укорочении В работах Фунабары с сотр (Funabara et al, 2007) и Франка с сотр (Franke et al, 2007) предлагается иное решение данной проблемы - миозин и твитчин конкурируют за места связывания на тонких нитях, в результате чего в каждый момент времени с тонкими нитями взаимодействует только один белок

3 Твитчин-актиновые связи выполняют как силовую, так и регуляторную роль

В этом случае твитчин-актиновые связи могут быть слабыми или сильными Слабые связи не мешают мышце сокращаться, но по мере их накопления меняют структурное состояние тонких нитей и, соответственно,

их взаимодействие с миозином, координируя, таким образом, поведение твитчиновых и миозиновых мостиков. При накоплении достаточного количества слабых связей они могут кооперативным образом переходить в сильные связи. Мы полагаем, что основой координационных и кооперативных процессов являются регулируемые тонкие нити, состояние которых может зависеть как от концентрации Са2+, так и от взаимодействия тонких нитей с твитчином и миозином.

Предполагаемый молекулярный механизм запирательного сокращения

Мы считаем, что твитчин-актиновые связи выполняют как силовую, так и регуляторную роль. Основанием для этого служит обнаруженное нами ингибирование твитчином Mg2+-ATФaзнoй активности комплекса тонких нитей моллюсков с нитями миозина кролика в присутствии кальция (Б11е1исГко et а1., 2007). Это позволяет предложить молекулярный механизм запирательного сокращения, в котором ключевую роль играют регулируемые тонкие нити, координирующие поведение твитчиновых сшивок и миозиновых мостиков (рис. 9).

Рис. 9. Схема возможного механизма запирательного тонуса.

Для построения этой схемы были использованы следующие экспериментальные наблюдения:

а) способность твитчина in vitro взаимодействовать с Ф-актином;

б) зависимость этого взаимодействия от фосфорилирования твитчина;

в) способность твитчина ш vitro взаимодействовать со всеми белками толстой нити (Shelud'ko et al., 2007);

г) способность твитчина in vitro ингибировать активирование тонкими нитями М£2+-АТФазы миозина (Shelud'ko et al., 2007).

Согласно схеме (рис. 9), в расслабленном состоянии как тонкая, так и толстая нити не активны и не взаимодействуют. Твитчин в этом состоянии фосфорилирован и не взаимодействует с тонкими нитями. Холинергическое

возбуждение вызывает кратковременное увеличение концентрации кальция, что активирует тонкие и толстые нити, а также твитчиновую фосфатазу (Yamada et al, 2004) В результате одновременно начинаются два процесса активное мышечное сокращение и формирование твитчиновых сшивок между толстыми и тонкими нитями На начальной стадии активного сокращения твитчин-актиновые связи слабые и не препятствуют скольжению нитей Накопление твитчиновых сшивок приводит к кооперативному переключению тонких нитей в состояние, вызывающее образование «сильных» (load-bearing) сшивок Это переключение одновременно ингибирует акто-миозиновое взаимодействие, по-видимому, посредством ингибирования перехода миозина из слабосвязанного состояния в сильносвязанное Последующее снижение концентрации Са2+ инактивирует толстые нити, и мышца переходит в catch-состояние, поддерживаемое твитчиновыми сшивками Выход из catch-состояния происходит вследствие ПКА-опосредованного фосфорилирования твитчина, которое инициируется серотониновой стимуляцией с последующим увеличением концентрации цАМФ(рис 9)

ВЫВОДЫ

1 Показано, что гигантский белок твитчин из запирательных мышц двустворчатых моллюсков способен взаимодействовать с фибриллярным актином

2 Обнаружено, что твитчин-актиновое взаимодействие in vitro регулируется фосфорилированием твитчина таким же образом, как фосфорилирование твитчина т vivo регулирует запирательный тонус мышц

3 Предложена гипотеза «твитчин-актиновых сшивок», согласно которой в основе запирательного тонуса мышц двустворчатых моллюсков лежит образование твитчиновых сшивок между толстыми и тонкими нитями

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Shelud'ko N , Permyakova Т , Tuturova К, Tyunna О , Matusovskaya G , Matusovsky О Properties of myorod, a thick filament protein m molluscan smooth muscles // Biological Motility New Trends in Research, Pushchino, Russia, August 20 - 26, 2001: Abstracts International Symposium Пущино Пущинский издательский центр РАН, 2001 Р 135-136

Shelud'ko N S , Permyakova Т V , Tuturova К F , Tyunna О V , Matusovskaya G G, Matusovsky О S Proteolytic substructure of myorod, a thick filament protein of molluscan smooth muscles II Comp Biochem Physiol Part В 2002 Vol 133 P 69-75

Shelud'ko N S , Matusovskaya G G , Permyakova T V, Matusovsky О S Twitchin from molluscan catch muscle can interact with actm and thick filament paramyosin core "Twitchin hypothesis" for the mechanism of catch // Biological Motility New Trends m Research, Pushchmo, Russia, May 25-30, 2004 Abstracts International Symposium Пущино Путинский издательский центр РАН, 2004 Р 101-102

Shelud'ko N S , Matusovskaya G G , Permyakova T V, Matusovsky О S Twitchin, a thick filament protein from molluscan catch muscle, interacts with F-actin m a phosphorylation-dependent way // Arch Biochem Biophys 2004 Vol 432, №2 P 269-277

Матусовская Г Г , Пермякова Т В , Матусовский О С , Шелудько Н С NEM-модификация миорода ингибирует полимеризацию миорода // Биофизика 2004 Т 49, №6 С 1003-1007

Матусовский О С , Пермякова Т В , Матусовская Г Г, Дроздов А Л, Шелудько Н С Полимеризация миорода - поверхностного белка толстых нитей гладких мышц моллюсков // Биофизика 2005 Т 50, № 1 С 69-74

Матусовский О С , Матусовская Г Г Твитчин, регуляторный белок запирательных мышц моллюсков, взаимодействует с парамиозиновой основой толстых нитей // IX Международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 18-22 апреля 2005 г Пущино Пущинский издательский центр РАН, 2005 С 120-121

Dobrzhanskaya А V , Permyakova Т V , Matusovskaya G G , Revakovskaya A G , Shelud'ko N S Thm filaments from molluscan smooth muscle of the mussel Crenomytilus grayanus are Ca2+-sensitive // Biological Motility Basic Research and Practice, Pushchmo, Russia, May 11-15, 2006 Abstracts International Symposium Пущино Пущинский издательский центр РАН, 2006 Р 20-22

Shelud'ko N S , Matusovsky О S , Permyakova Т V, Matusovskaya G G "Twitchin-actin linkage hypothesis" for the catch mechanism in molluscan muscles Evidence that twitchin interacts with myosin, myorod, and paramyosin core and affects properties of actomyosm // Arch Biochem Biophys 2007 Vol 466 P 125-135

Цитированная литература

Шелудько H С Белковый состав миофибрилл кролика, определенный методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия//Цитология 1975 Т 17 С 1148-1152

Andruchov О , Andruchova О , Galler S The catch state of mollusc catch muscle is established during activation experiments on skinned fibre preparations of the anterior byssus retractor muscle of Mytilus eduhs using the myosin inhibitors orthovanadate and blebbistatin // J Exp Biol 2006 Vol 209, №21 P 4319-4328

Butler T M, Mooers S U, Li С Q , Narayan S , Siegman M J Regulation of catch muscle by twitchm phosphorylation Effects on force, ATPase, and shortening//Biophys J 1998 Vol 75, №4 P 1904-1914

Butler T M, Narayan S R, Mooers S U, Hartshome D J, Siegman M J The myosin cross-bridge cycle and its control by twitchin phosphorylation in catch muscle II Biophys 1 2001 Vol 80, № 1 P 415-426

Butler T M, Mooers S U, Siegman M J Catch force links and the low to high force transition of myosin//Biophys J 2006 Vol 90, №9 P 3193-3202

Fiske C H, Subbarow Y The colorimetnc determination of phosphorus IIJ Biol Chem 1925 Vol 66 P

375-400

Franke A S , Moers S U , Narayan S R, Siegman M J , Butler T M Myosin cross-bridge kinetics and the mechanism of catch// Biophys J 2007 Vol 93, №2 P 554-565

Funabara D, Kmoshita S, Watabe S , Siegman M J, Butler T M, Hartshome D J Phosphorylation ofmolluscan twitchin by the cAMP-dependent protein kinase // Biochemistry USA 2001 Vol 40, №7 P 2087-2095

Funabara D , Watabe S , Mooers S U, Narayan S , Dudas C, Hartshorne D J, Siegman M J , Butler, T M Twitchin from molluscan catch muscle Primary structure and relationship between site-specific phosphorylation and mechanical function//J Biol Chem 2003 Vol 278, №31 P 2930829316

Funabara D, Kanoh S, Siegman M J, Butler T M, Hartshorne D J, Watabe S Twitchin as a regulator of catch contraction in molluscan smooth muscle//J Muscle Res Cell Motil 2005 Vol 26, № 6-8 P 455-460

Funabara D , Hamamoto C , Yamamoto K, Inoue A, Ueda M , Osawa R, Kanoh S, Hartshome D J , Suzuki S , Watabe S Unphosphorylated twitchin forms a complex with actin and myosin that may contribute to tension maintenance in catch Hi Exp Biol 2007 V 210 P 4399-410

Galler S , Kogler H , Ivemeyer M , Ruegg J C Force responses of skinned molluscan catch muscle following pbotoliberation of ATP II Pflugers Arch 1999 Vol 438, №4 P 525-530

Hopflinger M C, Andruchova O, Andruchov O , Grassberger H, Galler S Effect of pH on the rate of myosin head detachment in molluscan catch muscle are myosin heads involved m the catch state? Ill Exp Biol 2006 Vol 209,№4 P 668-676

Johnson W H , Kahn J , Szent-Gyorgyi A G Paramyosm and contraction of "catch muscles" // Science 1959 Vol 130 P 160-161

Laemmli V K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970 Vol 227, №5259 P 680-685

Lowy J , Millman B M, Hanson J Structure and function m smooth tonic muscles of lamelhbranch muscle mollusks//Proc Roy Soc Ser B 1964 Vol 160 P 525-536

Pollard T D Cooper J A Methods to characterize actin filament networks // Methods Enzymol 1982 Vol 85 P 211-233

Ruegg 3 C Tropomyosin-paramyosin system and "prolonged contraction" in a molluscan smooth muscle II Proc Roy Soc 1964 Vol 160 P 536-542

Ruegg J C Smooth muscle tone II Physiol Rev 1971 Vol 51,№1 P 201-248 Shelud'ko N S, Tuturova K F, Permyakova T V, Plotnikov S V, Orlova AAA novel thick filament protein in smooth muscles of bivalve molluscs//Comp Biochem Physiol PartB 1999 Vol 122 P 277-285

Shelud'ko N S , Permyakova T V , Tuturova K F , Neverkma O V , Drozdov A L Myorod, a thick filament protein m molluscan smooth muscles isolation, polymerization and interaction with myosin //J Muscle Res Cell Motil 2001 Vol 22 P 91-100

Shelud'ko N S , Kropacheva I V Turbidity of myofibril and actomyosin suspensions and its change by ATP//J Colloid Interface Sci 1996 Vol 179 P 194-200

Siegman M J, Mooers S U, Li C Q, Narayan S, Trinklemulcahy L, Watabe S, Hartshorne D J , Butler T M Phosphorylation of a high molecular weight (similar to 600 kDa) protein regulates catch m invertebrate smooth muscle//J Muscle Res CellMotU 1997 Vol 18, №6 P 655-670

SpicerSS The clearing responce of actomyosm to adenosmetriphosphate//J Biol Chem 1952 Vol 199 P 289-300

Sugi H , Iwamoto H , Shimo, M , Shirakawa I Evidence for load-beanng structures specialized for the catch state m Mytilus smooth muscle // Comp Biochem Physiol Part A 1999 Vol 122,№3 P 347-353

Szent-Gyorgyi A G , Cohen C , Kendnck-Jones J PaTamyosin and the filaments of molluscan 'catch'muscles, 2 Native filaments Isolation and characterization IIJ Mol Biol 1971 Vol 56 P 239258

Takahashi I, Shimada M, Akimoto T, Kishi T, Sugi H Electron microscopic evidence for the thick filament interconnections associated with the catch state in the anterior byssal retractor muscle of Mytilus eduhs// Comp Biochem Physiol Part A 2003 Vol 134, №1 P 117-122

Vibert P , Edelstein S M , Castellani L, Elliott B W Mini-titins in striated and smooth molluscan muscles -structure, location and immunological cross-reactivity// ] Muscle Res CellMotil 1993 Vol 14, №6 P 598-607

Yamada A, Yoshio M, Kojima H, Oiwa K An in vitro assay reveals essential protein components for the "catch" state of invertebrate smooth muscle//Proc Nat Acad Sci USA 2001 Vol 98, № 12 P 6635-6640

Yamada A, Yoshio M , Nakamura A , Kohama K., Oiwa K Protein phosphatase 2B dephosphoiylates twitchin, initiating the catch state of invertebrate smooth muscle // J Biol Chem 2004 Vol 279, №39 P 40762-40768

Галина Геннадьевна МАТУСОВСКАЯ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТВИТЧИНА ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ МОЛЛЮСКОВ С ФИБРИЛЛЯРНЫМ АКТИНОМ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Зак №91п Формат 60x84/16 Уел п л 1,0 Тираж 100 экз Подписано в печать 19 08 2008 г Печать офсетная с оригинала заказчика

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор» 690105,г Владивосток, ул Бородинская, 46/50 Тел 32-70-49 Е-тай рге«5-йрг@гатЫег ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матусовская, Галина Геннадьевна

Список основных сокращений и условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. СОКРАТИТЕЛЬНЫЙ АППАРАТ ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ МОЛЛЮСКОВ.

1.1.1. Структурно-функциональные особенности мышц двустворчатых моллюсков.

1.1.2. Толстые нити запирательных мышц моллюсков.

1.1.3. Тонкие нити запирательных мышц моллюсков.

1.1.4. Взаимодействие толстых и тонких нитей в мышцах моллюсков.

1.2. ТВИТЧИН ГЛАДКИХ МЫШЦ МОЛЛЮСКОВ.

1.2.1. Гигантские белки иммуноглобулинового суперсемейства.

1.2.2. Взаимодействие Ф-актина с белками титанового семейства.

1.2.3. Твитчин - регуляторный белок гладких мышц моллюсков.

1.2.4. и ~ участки фосфорилирования в молекуле твитчина.

1.3. МЕХАНИЗМ ЗАПИРАТЕЛЬНОГО СОКРАЩЕНИЯ.

1.3.1. Физиологические и биохимические аспекты запирательного тонуса моллюсков.

1.3.2. «Парамиозиновая гипотеза».

1.3.3. «Мостиковая гипотеза».

1.3.4. Гипотеза «твитчин-актиновых мостиков».

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выделение сократительных белков из запирательных мышц моллюсков.

2.1.1. Выделение толстых нитей.

2.1.2. Экстракция поверхностных белков толстой нити.

2.1.3. Фракция, содержащая «природный» Ф-актин.

2.1.4. Фракция, содержащая твитчин и миород.

2.1.5. Фракция, содержащая миозин и тропомиозин.

2.1.6. Получение синтетического актомиозина.

2.2. Выделение миозина из скелетных мышц кролика.

2.3. Выделение актина из скелетных мышц кролика.

2.4. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5. Фосфорилирование твитчина.

2.6. Использование лазерного дифракционного анализатора.

2.7. Низкоскоростное и высокоскоростное центрифугирование.

2.8. Измерение вязкости.

2.9. Измерение АТФ-азной активности.

2.10. Вспомогательные методы.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина оптическими методами.

3.2. Измерения вязкости твитчин-актинового комплекса.

3.3. Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина низкоскоростным центрифугированием.

3.4. Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина высокоскоростным центрифугированием.

3.5. Влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Взаимодействие твитчина с фибриллярным актином.

4.2. Регуляция твитчин-актинового взаимодействия.

4.3. Влияние твитчина на свойства актомиозина.

4.4. «Парамиозиновая» и «мостиковая» гипотезы запирательного сокращения в свете современных экспериментальных данных.

4.5. Гипотеза «твитчин-актиновых мостиков».

4.6. Предполагаемый молекулярный механизм запирательного сокращения.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие твитчина запирательных мышц моллюсков с фибриллярным актином"

Актуальность проблемы

Мышцы являются специализированными структурными элементами, способными трансформировать химическую энергию в механическую работу. Несмотря на то, что строение и функция мышц разнообразны, общие принципы их работы одинаковы. Согласно теории скользящих нитей, мышечное сокращение обусловлено активным скольжением тонких актиновых нитей относительно толстых миозиновых нитей без изменения их длины. Работа мышцы заключается в циклической смене двух ее состояний: сокращения в результате повышения концентрации Са2+ в саркоплазме и расслабления при ее понижении. Это правило имеет лишь одно исключение - гладкие мышцы двустворчатых моллюсков способны поддерживать еще одно состояние -запирательный тонус, или catch-состояние, при котором мышца при низкой концентрации Са2+ остается сокращенной в течение длительного времени. При этом высокое значение поддерживаемой силы сочетается с низким расходом энергии. Это явление, описанное более ста лет назад, хотя и свойственно ограниченному кругу мышц, тем не менее, вызывает повышенный интерес исследователей, поскольку его механизм трудно объяснить в рамках современных представлений о механизмах биологической подвижности.

Механические свойства нативных и демембранизированных волокон запирательных мышц моллюсков свидетельствуют о том, что в основе catch лежит образование поперечных сшивок между элементами сократительного аппарата. Выдвинуты две гипотезы, конкретизирующие это положение: «мостиковая», постулирующая в качестве искомых сшивок особое ригороподобное состояние актомиозиновых мостиков (Lowy et al., 1964), и «независимая», или «парамиозиновая» гипотеза, которая постулирует наличие независимой системы поперечных связей. Предполагается, что такими связями являются сшивки между толстыми нитями (Johnson et al., 1959).

Мышцы, способные к запирательному тонусу, обладают необычными толстыми нитями, которые имеют большие размеры (10-20 мкм), и в их основе лежит парамиозиновый стержень, составляющий около 60% от массы толстых нитей. На поверхности парамиозинового стержня располагается миозин (Szent-Gyorgyi et al., 1971), твитчин (Vibert et al, 1993) и миород (Shelud'ko et al., 1999). Выход из состояния запирательного тонуса стимулируется серотонинэргическим нервом, что приводит к фосфорилированию твитчина (Siegman et al., 1997). В связи с этим открытием «мостиковая» гипотеза была уточнена. Предполагается, что дефосфорилированный твитчин, взаимодействуя с миозином, придает миозиновым мостикам свойства catoh-сшивок, в то время как фосфорилированный твитчин не меняет цикл работы миозиновых мостиков (Butler et al., 2001; Funabara et al, 2001; Yamada et al, 2001, 2004).

Хотя «мостиковая» гипотеза catch является общепринятой и тестируется длительное время, убедительных доказательств ее правильности не получено. Более того, накапливаются экспериментальные данные, которые не согласуются с этой гипотезой (Siegman et al., 1997; Sugi et al., 1999; Galler et al., 1999; Takahashi et al, 2003).

В данной работе предложена новая «независимая» гипотеза запирательного сокращения - гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» («twitchin-actin linkage hypothesis»). Она основана на полученных нами данных о способности твитчина непосредственно взаимодействовать с фибриллярным актином, причем это взаимодействие регулируется фосфорилированием твитчина таким же образом, как распад и образование catch-сшивок in vivo. Согласно этой гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя в дефосфорилированном состоянии catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков.

Наши данные о способности твитчина взаимодействовать с фибриллярным актином противоречат ранее опубликованным данным Ямада и сотр. (Yamada et al, 2001), однако подтверждены Фунабарой и сотр. (Funabara etal., 2005).

Цель и задачи исследования

Целью работы было выяснение роли твитчина в механизме запирательного тонуса гладких мышц двустворчатых моллюсков. Были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать методы препаративного выделения твитчина, миозина и актина из гладких мышц мидии СгепотуШт ауапт.

2. Провести поиск условий взаимодействия твитчина с фибриллярным актином.

3. Исследовать физико-химические свойства твитчин-актинового комплекса и влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина.

Положения, выносимые на защиту

1. Твитчин из запирательных мышц двустворчатых моллюсков взаимодействует с фибриллярным актином.

2. Взаимодействие твитчина и актина регулируется фосфорилированием твитчина.

3. Твитчин-актиновое взаимодействие может быть основой запирательного сокращения мышц двустворчатых моллюсков, обеспечивая поперечные са1сЬ-сшивки между толстыми и тонкими нитями.

Научная новизна полученных результатов

Впервые показано, что гигантский белок твитчин способен взаимодействовать с фибриллярным актином, и это взаимодействие зависит от степени фосфорилирования твитчина. Взамен общепринятой «мостиковой» гипотезы запирательного тонуса (Ьо\уу & а1., 1964) предложена гипотеза «твитчин-актиновых сшивок», согласно которой дефосфорилированный твитчин образует са^Ь-сшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков.

Теоретическое и практическое значение работы

Предложенная гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» открывает новые возможности экспериментального исследования механизма запирательного сокращения и стимулирует поиски аналогичных систем в других мышцах, обладающих тоническими свойствами.

В работе детально описаны методы выделения и очистки сократительных белков, а также способы образования синтетических сократительных моделей, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004, 2006), VIII Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004) и ежегодной научной конференции Института биологии моря им. А. В. Жирмунского (Владивосток, 2005). По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе - 5 работ в рецензируемых изданиях из списка ВАК.

Финансовая поддержка работы

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-0449895) и Конкурса проектов ДВО РАН (грант № 06-III-B-06-206).

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Матусовская, Галина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что гигантский белок твитчин из запирательных мышц двустворчатых моллюсков способен взаимодействовать с фибриллярным актином.

2. Обнаружено, что твитчин-актиновое взаимодействие in vitro регулируется фосфорилированием твитчина таким же образом, как фосфорилирование твитчина in vivo регулирует запирательный тонус мышц.

3. Предложена гипотеза «твитчин-актиновых сшивок», согласно которой в основе запирательного тонуса мышц двустворчатых моллюсков лежит образование твитчиновых сшивок между толстыми и тонкими нитями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матусовская, Галина Геннадьевна, Владивосток

1. Александров, В. Клетки, молекулы и температура // Л.: Наука. 1975. С.329.

2. Пермякова, Т.В. Зависимость свойств синтетического актомиозина от условий его реконструкции // Автореф. канд. дис., Владивосток. 1997.

3. Тартаковский, А.Д. Методы выделения и характеристика миозина и его субьединиц из поперечно полосатых мышц. В кн. Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков // Л.: Наука. 1978. С. 55-76.

4. Тихонов А. Н. Молекулярные моторы. Часть 2. Молекулярные основы биологической подвижности // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. № 6. С. 17-24.

5. Шелудько, Н.С. Белковый состав миофибрилл кролика, определенный методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия // Цитология. 1975. Т. 17. С. 1148-1152.

6. Шелудько, Н. С. и Пинаев, Г. П. Активный компонент препаратов актинина // ДАН СССР. Т. 224, № з. 1975. С. 725-727.

7. Хайтлина, С. Методы выделения и очистки актина. Оценка чистоты и нативности. В кн. Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков // Л.: Наука. 1978. С. 122-141.

8. Achazi, R.K., Dolling, В., Haakshorst, R. 5-ht-induced relaxation and cyclic AMP in a molluscan smooth muscle // Pflugers Arch. 1974. Vol. 349 №1. P. 19-27.

9. Achazi, R.K. Phosphorylation of molluscan paramyosin // Pflugers Arch. 1979. Vol. 379, №2. P. 197-201.

10. Astier, C., Raynaud, F., Lebart, M.C., Roustan, C., and Benyamin, Y. Binding of a native titin fragment to actin is regulated by PIP2 // FEBS Lett. 1998. Vol. 429, № LP. 95-98.

11. Bartegi, A., Fattoum, A., Derancourt, J., and Kassab, R. Characterization of the carboxyl-terminated 10-kDa cyanogen bromide fragment of caldesmon as an actin-calmodulin-binding region //J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265, № 25. P. 15231-15238.

12. Bear, R.S and Selby, C.C. The structure of paramyosin fibrils according to X-ray diffraction // J: Biophys. Biochem. Cytol. 1956. Vol. 2, P. 55-69

13. Benian, G.M., Kiff, J.E., Neckelmann, N., Moerman, D.G., Waterston, R.H. Sequence of an unusually large protein implicated in regulation of myosin activity in Caenorhabditis elegans //Nature. 1989. Vol. 342. P. 45-50.

14. Benian, G.M., Tang, X., and Tinley, T.L. Twitchin and related giant Ig superfamily members of Caenorhabditis elegans and other invertebrates // Adv. Biophys. 1996a. Vol. 33. P. 183-198.

15. Bennett, P.M., Elliott, A. The structure of the paramyosin core in molluscan thick filaments // J. Muscle Res. Cell Motil. 1981. Vol. 2, № 1. P. 65-81.

16. Bennett, P.M., Marston, S.B. Calcium regulated thin-filaments from molluscan catch muscles contain a caldesmon-like regulatory protein // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 1990. Vol. 11, № 4. P. 302-312.

17. Bobkov, A.A., Bobkova, E.A., Homsher, E., and Reisler, E. Activation of regulated actin by SHl-modified myosin subfragment 1 // Biochemistry. 1997. Vol. 36, № 25. P. 7733-7738.

18. Bremel, R.D., Murray, J.M., and Weber, A. Manifestations of cooperative behavior in the regulated actin filament during actin-activated ATP hydrolysis in the presence of calcium // Cold Spring Harbor. Symp. Quant. Biol. 1973. Vol. 37. P. 267275.

19. Butler, T.M., Mooers, S.U., Li, C.Q., Narayan, S., and Siegman, M.l Regulation of catch muscle by twitchin phosphorylation: Effects on force, ATPase, and shortening // Biophys J. 1998. Vol. 75, № 4. P. 1904-1914.

20. Butler, T.M., Narayan, S.R., Mooers, S.U., Hartshorne, D.J., and Siegman, M.J. The myosin cross-bridge cycle and its control by twitchin phosphorylation in catch muscle // Biophys J. 2001. Vol. 80, № 1. P. 415-426.

21. Butler, T.M., Mooers, S.U., and Siegman, M.J. Catch force links and the low to high force transition of myosin // Biophys. J. 2006. Vol. 90, № 9. P. 3193-3202.

22. Castellani, L. and Cohen, C. Myosin rod phosphorylation and the catch state of molluscan muscles // Science. 1987. Vol. 235, № 4786. P. 334-337.

23. Castellani, L. and Cohen, C. A calcineurin-like phosphotase is required for catch contraction // FEBS Letters. 1992. Vol. 309, № 3. P. 321-326.

24. Cohen, C., Szent-Gyorgyi, A.G., and Kendrick-Jones, J. Paramyosin and the filaments of molluscan catch muscles. I. Paramyosin: sructure and assembly //J. Mol. Biol. 1971. Vol. 56. P. 223-237.

25. Cohen, C. Matching molecules in the catch mechanism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79, № 10. P. 3176-3178.

26. Cohen, C. and Parry, D.A.D. A conserved C-terminal assembly region in paramyosin and myosin rods // J. Struct. Biol. 1998. Vol. 122, № 1-2. P. 180-187.

27. Cole, R.A. and Twarog, B.M. Relaxation of catch in a molluscan smooth muscle. I. Effects of drugs of which act on the adenyl cyclase system // Comp. Biochem. Physiol. 1972. Vol. 43A, №1. P. 321-330.

28. Cornelius, F. The regulation of tension in a chemically skinned molluscan smooth muscle: effect of Mg2+ on the Ca2+-activated tension generation // J. Gen. Physiol. 1980. Vol. 75, №6. P. 709-725.

29. Cornelius, F. Tonic contraction and the control of relaxation in a chemically skinned molluscan smooth muscle // J. Gen. Physiol. 1982. Vol. 79, №5. P. 821-834.

30. Csizmadia, A.M., Bonetkerrache, A., Nyitray, L., and Mornet, D. Purification and properties of caldesmon-like protein from molluscan smooth muscle // Comp. Biochem. Physiol. B. 1994. Vol. 108, №1. P. 59-63.

31. Ebashi, S., Mikawa, T., Hirata, M., Nonomura, Y. The regulatory role of calcium in muscle //Ann. NY Acad. Sci. 1978. V. 307. P. 451-461.

32. Ebashi S, Nonomura Y, Nakamura S, Nakasone H, Kohama K. Regulatory mechanism in smooth muscle: actin-linked regulation // Fed. Proc. 1982. Vol. 41, №12. P. 2863-2867.

33. Elliott, A., Bennett, P.M. Structure of the thick filaments in molluscan adductor muscle // In: Basic Biology of muscle: a comparative approach, ed. by B. Twarog, R. Levine, M. Dewey, Raven Press, N.-Y. 1982. P. 11-27.

34. Fiske, C.H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus // J. Biol. Chem. 1925. Vol. 66. P. 375-400.

35. Franke, A.S., Mooers, S.U., Narayan, S.R., Siegman, M.J., Butler, T.M. Myosin cross-bridge kinetics and the mechanism of catch // Biophys J. 2007. Vol. 93, №2. P. 554-565.

36. Fromherz, S. and Szent-Gyorgyi, A.G. Role of essential light chain EF hand domains in calcium binding and regulation of scallop myosin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92, № 17. P. 7652-7656.

37. Fukuda, N., Wu, Y., Nair, P., and Granzier, H.L. Phosphorylation of titin modulates passive stiffness of cardiac muscle in a titin isoform-dependent manner // J. Gen. Physiol. 2005. Vol. 125, № 3. P. 257-271.

38. Funabara, D., Kinoshita, S., Watabe, S., Siegman, M.J., Butler, T.M., and Hartshorne, D.J. Phosphorylation of molluscan twitchin by the cAMP-dependent protein kinase // Biochemistry USA. 2001. Vol. 40, №7. P. 2087-2095.

39. Funabara, D., Butler, T.M., Siegman, M.J., Hartshorne, D.J., and Watabe, S. Structure of twitchin from molluscan catch muscle and its phosphorylation sites // Biophys. J. 2002. Vol. 82, № 12. P. 420A.

40. Funabara, D., Kanoh, S., Siegman, M. J., Butler, T. M., Hartshorne, D. J., and Watabe, S. Twitehin as a regulator of catch contraction in molluscan smooth muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. 2005. Vol. 26, № 6-8. P. 455-460.

41. Funatsu, T., Kono, B., Tsukita, S. Time-resolved electron microscopic analysis of the behavior of myosin heads on actin filaments after photolysis of cages ATP // J. Cell Biol. 1993. Vol. 121, № 5. P. 1053-1064.

42. Gafurov, B., Chen, Y.D., Chalovich, J.M. Ca2+ and ionic strength dependencies of Sl-ADP binding to actin-tropomyosin-troponin: regulatory implications // Biophys. J. 2004. Vol. 87, № 3. P. 1825-1835.

43. Gallagher, P.J. and Herring, B.P. The carboxyl terminus of the smooth muscle myosin light chain kinase is expressed as an independent protein, telokin // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, № 35. P. 23945-23952.

44. Galler, S.,.Kogler, H., Ivemeyer, M., Ruegg, J.C. Force responses of skinned molluscan catch muscle following photoliberation of ATP // Pflugers Arch. 1999. Vol. 438, №4. P. 525-530.

45. Galler, S., Hopflinger, M.C., Andruchov, O., Andruchova, O., Grassberger, H. Effects of vanadate, phosphate and 2,3-butanedione monoxime (BDM) on skinned molluscan catch muscle // Pflugers Arch. 2005. Vol. 449, № 4. P. 372-383.

46. Graceffa, P. and Mazurkie, A. Effect of caldesmon on the position and myosin-induced movement of smooth muscle tropomyosin bound to actin // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, № 6. P. 4135-4143.

47. Granzier, H., Kellermayer, M., Helmes, M., Trombitas, K. Titin elasticity and mechanism of passive force development in rat cardiac myocytes probed by thin-filament extraction // Biophys. J. 1997. Vol. 73, № 4. P. 2043-2053.

48. Granzier, H. and Labeit, S. Cardiac titin: an adjustable multi-functional spring // Journal of Physiology. 2002. Vol. 541, №2. P. 335-342.

49. Gratecos, D., Fischer, E.H. Adenosine 5'-0(3-thiotriphosphate) in the control of phosphorylase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. Vol. 58, №4. P. 960-967.

50. Greaser, M. Identification of new repeating motifs in titin // Proteins. 2001. Vol. 43, №2. P. 145-149.

51. Gutierrez-Cruz, G., VanHeerden, A.H., and Wang, K. Modular motif, structural folds and affinity profiles of the PEVK segment of human fetal skeletal muscle titin // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, №10. P. 7442-7449

52. Huxley, H.E., Hanson, J. Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation // Nature. 1954. Vol. 173, №4412. P. 973-976.

53. Jancso, A., Szent-Gyorgyi, A.G. Regulation of the scallop myosin by the regulatory light chain depends on a single glycine residue // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 8762-8766.

54. Johnson, W.H., Kahn, J., Szent-Gyorgyi, A.G. Paramyosin and contraction of "catch muscles" // Science. 1959. Vol. 130. P. 160-161.

55. Kalabokis, V.N., Neall, H., and Szent-Gyorgyi, A.G. Regulatory domains of myosins: influence of heavy chain on Ca2+-binding // J. Muscle Res. Cell Motil. 1994. Vol. 15, № 5. P. 547-553.

56. Kamm, K.E., Stull, J.T. Dedicated myosin light chain kinases with diverse cellular functions // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, №7. P. 4527-4530.

57. Kellermayer, M.S. and Granzier, H.L. Elastic properties of single titin molecules made visible through fluorescent F-actin binding // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 221, № 3. P. 491-497.

58. Kimura, S., Maruyama, K. Interaction of native connectin wit myosin and actin // Biomedical Research. 1983. Vol. 4. P. 607-610.

59. Kimura, S., Maruyama, K., and Huang, Y.P. Interactions of muscle connectin with myosin, actin, and actomyosin at low ionic strengths // J. Biochem. 1984. Vol. 96. P. 499-506.

60. Klee, C.B., Draetta, G.F., Hubbard, MJ. Calcineurin // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1988. Vol. 61. P. 149-200.

61. Kondo, S., and Morita, F. Smooth muscle of scallop adductor contains at least two kinds of myosin // J. Biochem. (Tokyo). 1981. Vol. 90, №3. P. 673-681.

62. Kruger, M., and Linke, W.A. Protein kinase-A phosphorylates titin in human heart muscle and reduces myofibrillar passive tension // J. Muscle Res. Cell Motil. 2006. Vol. 27, № 5-7. P. 435-444.

63. Kulke, M., Neagoe, C., Kolmerer, B., Minajeva, A., Hinssen, H., Bullard, B., Linke, W. A. Kettin, a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle // J. Cell Biol. 2001b. Vol. 154, № 5. P. 1045-1057.

64. Ma, K. and Wang, K. Interaction of nebulin SH3 domain with titin PEVK and myopalladin: implications for the signaling and assembly role of titin and nebulin // FEBS Lett. 2002. Vol. 532, №3. P. 273-278.

65. Ma, K. and Wang, K. Malleable conformation of the elastic PEVK segment of titin: non-cooperative interconversion of polyproline II helix, beta turn and unordered structures // Biochem. J. 2003. Vol. 374. P. 687-695.

66. Marchand, D. and Baguet, F. The control mechanism of relaxation in molluscan catch-muscle (ABRM) // Pflugers Arch. 1975. Vol. 354, № 1. P. 87-100

67. Maruyama, K. and Watanabe, S. The role of magnesium in the superprecipitation of myosin B // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237. P. 3437-3442.

68. Maruyama, K. and Gergely, J. Interaction of actomyosin with adenosin triphoshate at low ionic strength 1. Dissociation of actomyosin during the clear phase // J. Biol. Chem. 1962. Vol. 237, № 4. P. 1095-1099.

69. Maruyama, K. Connectin, an elastic filamentous protein of striated muscle // International Review of Cytology, Vol. 104. 1986. P. 81-114.

70. Maruyama, K., Hu, D.H., Suzuki, T., Kimura, S. Binding of actin filaments to connectin // J. Biochem. 1987. Vol. 101, №6. P. 1339-1346

71. Moerman, D.G., Benian, G.M., Barstead, R. J., Schriefer, L. A., Waterston, R.H. Identification and intracellular localization of the unc-22 gene product of Caenorhabditis elegans II Genes Dev. 1988. Vol. 2, № 1. P. 93-105.

72. Niederlander, N., Raynaud, F., Astier, C., Chaussepied, P. Regulation of the actin-myosin interaction by titin // Eur. J. Biochem. 2004. Vol. 271, № 22. P. 45724581.

73. Nishita, K., Ojima, T., Takahashi, A., Inoue, A. Troponin from smooth adductor muscle of Ezo-giant scallop // J. Biochem. (Tokyo). 1997. Vol. 121, № 3. P. 419-424.

74. Nonomura, Y. and Ebashi, S. Electron microscopic studies of superprecipitation with special reference to its optical properties // J. Mechanochem. Cell Motil. 1974. Vol. 3. P. 1-8.

75. Ohtsuki, I., Maruyama, K., Ebashi, S. Regulatory and cytoskeletal proteins of vertebrate skeletal muscle // Adv. Protein Chem. 1986. V. 38. P. 1-67.

76. Ojima, T. and Nishita, K. Isolation of troponins from striated and smooth adductor muscles of Akazara scallop // J. Biochem. (Tokyo). 1986. Vol. 100, № 3. P. 821-824.

77. Oshino, T., Shimamura, J., Fukuzawa, A., Maruyama, K., Kimura, S. The entire cDNA sequences of projectin isoforms of crayfish claw closer and flexor muscles and their localization // J. Muscle Res. Cell Motil. 2003. Vol. 24, № 7. P. 431-438.

78. Pemrick, S. and Weber, A. Mechanism of inhibition of relaxation by N-ehylmaleimide treatment of myosin // Biochemistry. 1976. Vol. 15, № 23. P. 51935198.

79. Perreault-Micale, C.L., Jancso, A., Szent-Gyorgyi, A.G. Essential and regulatory light chains of Placopecten striated and catch muscle myosins // J. Muscle Res. Cell Motil. 1996b. Vol. 17, № 5. P. 533-542.

80. Perry, S.V. Proteins in muscular contraction // Lect. Sci. Basis Med. 19551956. Vol. 5. P. 314-332.

81. Pfitzer, G. and Ruegg, J.C. Molluscan catch muscle: regulation and mechanics in living and skinned anterior byssus retractor muscle of Mytilus edulis II J. Comp. Physiol. 1982. Vol. 147. P. 137-142.

82. Pollard, T.D. and Cooper, J.A. Methods to characterize actin filament networks // Methods Enzymol. 1982. Vol. 85. P. 211-233.

83. Pollard, T.D., Cooper, J.A. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions // Ann. Rev. Biochem. 1986. Vol. 55. P. 987-1035.

84. Rayment, I. and Holden, H.M. Myosin subfragment-1 structure and function of a molecular motor // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. Vol. 3, № 6. P. 944-952.

85. Rees, M.K., Young, Y.M. Studies of the isolation and molecular properties of homogeneous globular actin: Evidence for a single polypeptide chain structure // J. Biol. Chem. 1967. Vol. 242. P. 4449.

86. Root, D. D. and Reisler, E. Cooperativity of thiol-modified myosin filaments -ATPase and motility assays of myosin function // Biophys. J. 1992. Vol. 63, № 3. P. 730-740.

87. Ruegg, J.C. The proteins associated with contraction in lamellibranch 'catch' muscle. Proc. Roy. Lond. Ser.B. 1961a. Vol. 154. P. 209.

88. Ruegg, J.C. On the effect of inhibiting the actin-myosin interaction on the viscous tone of a lamellibranch catch muscle // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1961b. Vol. 6. P. 24-28.

89. Ruegg, J.C. Tropomyosin-paramyosin system and "prolonged contraction" in a molluscan smooth muscle // Proc. Roy. Soc. 1964. Vol. 160. P. 536-542. Ruegg, J.C. Smooth muscle tone // Physiol. Rev. 1971. Vol. 51, № 1. P. 201-248.

90. Shelud'ko, N.S., Dultsev, A.V. Interrelated effect of ATP and ionic strength upon Ca2+-sensitivity of isolated myofibrils // Biofizika. 1987. Vol. 31, № 1. 1987. P. 166-167.

91. Shelud'ko, N.S. and Stadnikov, V.L. Heat resistance of MgATPase and contractility in muscle models // J.Therm. Biol. 1989. Vol. 14, P. 325-532.

92. Shelud'ko, N.S. and Kropacheva, I.V. Turbidity of myofibril and actomyosin suspensions and its change by ATP // J. Colloid Interface Sci. 1996. Vol. 179. P. 194200.

93. Shelud'ko, N.S., Tuturova, K.F., Permyakova, T.V., Plotnikov, S.V., Orlova, A. A. A novel thick filament protein in smooth muscles of bivalve molluscs // Comp. Biochem. Physiol. Part B. 1999. Vol. 122. P. 277-285.

94. Shelud'ko, N.S., Permyakova, T.V., Tuturova, K.F., Neverkina, O.V., Drozdov, A.L. Myorod, a thick filament protein in molluscan smooth muscles: isolation, polymerization and interaction with myosin // J. Muscle Res. Cell Motil. 2001. Vol.22. P. 91-100.

95. Smith, S.H. and Fuchs, F. Effect of ionic strength on length-dependent Ca2+ activation in skinned cardiac muscle // J. Mol. Cell. Cardiol. 1999. Vol. 31, № 12. P. 2115-2125.

96. Smith, L., Stull, J.T.JVIyosin light chain kinase binding to actin filaments // FEBS Lett. 2000. Vol. 480, № 2-3. P. 298-300.

97. Sobieszek, A. The fine structure of the contractile apparatus of the anterior byssus retraction muscle of Mytilus edulis II J. Ultrastructure Res. 1973. Vol. 43. P. 313-343.

98. Sohma, H., Yazawa, M., Morita, F. Phosphorylation of regulatory light chain a (RLC-a) in smooth muscle myosin of scallop, Patinopecten yessoensis II J. Biochem. (Tokyo). 1985. Vol. 98, № 2. P. 569-572.

99. Sohma, H., Inoue, K., Morita, F. A cAMP-dependent regulatory protein for RLC-a myosin kinase catalyzing the phosphorylation of scallop smooth muscle myosin light chain II J. Biochem. 1988a. Vol. 103, № 3. P. 431-435.

100. Sohma, H., Sasada, H., Inoue, K., Morita, F. Regulatory light chain-a myosin kinase (aMK) catalyzes phosphorylation of smooth muscle myosin heavy chains of scallop, Patinopecten yessoensis II J. Biochem. 1988b. Vol. 104, № 6. P. 889-893.

101. Soteriou, A., Gamage, M., Trinick, J. A survey of interactions made by the giant protein titin // J. Cell Sci. 1993. Vol. 104, № Part 1. P. 119-123.

102. Spicer, S.S. The clearing responce of actomyosin to adenosinetriphosphate // J. Biol. Chem. 1952. Vol. 199. P. 289-300.

103. Squire, J.M. Muscle regulation: a decade of the blocking model // Nature. 1981. Vol. 291. P. 614-615.

104. Squire, J.M., Luther, P.K., Knup, C. Structural evidence for the interaction of C-protein (MyBP-C) with actin and sequence identification of a possible actin-binding domain // J. Mol. Biol. 2003. Vol. 331, № 3. P. 713-724.

105. Stewart, M., McLachlan, A.D.Fourteen actin-binding sites on tropomyosin? // Nature. 1975. Vol. 257. P. 331-333.

106. Strzelecka-Golaszewska, H., Piwowar, U., Pliszka, B. Changes in the ultrastructure of actomyosin gel during hydrolysis of ATP under various ionic conditions // Eur. J. Cell Biol. 1981. Vol. 24. P. 116-123.

107. Sugi, H., Iwamoto, H., Shimo, M., Shirakawa, I. Evidence for load-bearing structures specialized for the catch state in Mytilus smooth muscle // Comp. Biochem. Physiol. Part A. 1999. Vol. 122, № 3. P. 347-353.

108. Szent-Gyorgyi, A.G. Nature of the contraction of muscle // Nature. 1951. V. 167. P. 380-381.

109. Szent-Gyorgyi, A.G., Cohen, C., Kendrick-Jones, J. Paramyosin and the filaments of molluscan 'catch' muscles; 2. Native filaments: Isolation and characterization//J. Mol. Biol. 1971. Vol. 56. P. 239-258.

110. Szent-Gyorgyi, A.G., Chantler, P.D. Control of contraction by calcium binding to myosin // In: A. Engel, C. Franzini-Annstrong, C. (eds). Myology, McGraw-Hill, N.-Y. 1994. P. 506-528.

111. Szent-Gyorgyi, A.G., Kalabokis, V.N., and Perreault-Micale, C.L. Regulation by molluscan myosins // Mol. Cell. Biochem. 1999. Vol. 190, № 1-2. P. 55-62.

112. Tobacman L.S. Thin filament-mediated regulation of cardiac contraction // Ann. Rev. Physiol. 1996. Vol. 58. P. 447-481.

113. Trombitas, K., Greaser, M.L., Pollack, G.H. Interaction between titin and thin filaments in intact cardiac muscle // J. Muscle Res. Cell Motil. 1997. Vol. 18, № 3. P. 345-351.

114. Trombitas, K., Greaser, M., French, G., Granzier, H. PEVK extension of human soleus muscle titin revealed by immunolabeling with the anti-titin antibody 9D10 // J. Struct. Biol. 1998. Vol. 122, № 1-2. P. 188-196. ,,

115. Tsutsui, Y., Yoshio, M., Oiwa, K., Yamada, A. Striated muscle twitchin of bivalves has "catchability", the ability to bind thick filaments tightly to thin filaments, representing the catch state // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 365, № 2. P. 325-332.

116. Twarog, B.M. Aspects of smooth muscle function in molluscan catch muscle // Physiol. Rev. 1976. Vol. 56, № 4. P. 829-838.

117. Vibert, P., Edelstein, S.M., Castellani, L., Elliott, B.W. Mini-titins in striated and smooth molluscan muscles structure, location and immunological cross-reactivity // J. Muscle Res. Cell Motil. 1993. Vol. 14, № 6. P. 598-607.

118. Vigoreaux, J.O., Saide, J.D., Pardue, M.L. Structurally different Drosophila striated muscles utilize distinct variants of Z-band-associated proteins // J. Muscle Res. Cell Motil. 1991. Vol. 12, № 4. P. 340-354.

119. Wang, F., Martin, B.M., Sellers, J.R. Regulation of actomyosin interactions in Limulus muscle proteins // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, № 5. P. 3776-3780.

120. Watabe, S., Tsuchiya, T., Hartshorne, D.J. Phosphorylation of paramyosin // Comp. Biochem. Physiol. Part B. 1989. Vol. 94, № 4. P. 813-821.

121. Watabe, S. and Hartshorne, D.J. Paramyosin and the catch mechanism // Comp. Biochem. Physiol. Part B. 1990. Vol. 96, № 4. P. 639-646.

122. Waterston, R.H., Thomson, J.N., Brenner, S. Mutants with altered muscle structure of Caenorhabditis elegans II Dev. Biol. 1980. Vol. 77, № 2. P. 271-302.

123. Weitkamp, B., Jurk, K., Beinbrech, G. Projectin-thin filament interactions and modulation of the sensitivity of the actomyosin ATPase to calcium by projectin kinase // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 31. P. 19802-19808.

124. Xie, X., Harrison, D.H., Schlichtling, I., Sweet, R.M., Kalabokis, V.N., Szent-Gyorgyi, A.G., Cohen, C. Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 angstrom resolution //Nature. 1994. Vol. 368, № 6469. P. 306-312.

125. Yamada, A., Yoshio, M., Oiwa, K., Nyitray, L. Catchin, a novel protein in molluscan catch muscles, is produced by alternative splicing from the myosin heavy chain gene // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 295, № 2. P. 169-178.

126. Yamada, A., Yoshio, M., Kojima, H., Oiwa, K. An in vitro assay reveals essential protein components for the "catch" state of invertebrate smooth muscle // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98, № 12. P. 6635-6640.

127. Yamada, A., Yoshio, M., Nakamura, A., Kohama, K., and Oiwa, K. Protein phosphatase 2B dephosphorylates twitchin, initiating the catch state of invertebrate smooth muscle // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 39. P. 40762-40768.