Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая и электронно-микроскопическая идентификация актина из растительных объектов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая и электронно-микроскопическая идентификация актина из растительных объектов"

?" Б М

.'V--. На правах рукопис

Грингауз Ольга Константиновна

БИОХИМИЧЕСКАЯ И ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ АКТИНА ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1998

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорп нмзмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) г. Саратов.

НаучныП руководитель:

кандидат биологических наук, зам. директора по НИР

Соколов О. И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Левицкий Д.И. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Куликова АЛ.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН 117071, г. Москва В-71, Ленинский проспект, 33.

Защита состоится 1998 г. в Ю час. мин. на заседании Диссертг

ционного совета К 002.45.01 в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязев РАН по адресу 127276, Москва, ул. Ботаническая 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии раст£ ний им. К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан " д^бе^е 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Азаркович А/.//.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По современным представлениям актин является одним из эвных универсальных белков не только эукариотических, но и прокариотических "ок (Nakamura et al. 1978). Это связано с рядом его уникальных свойств, таких, как :обность к саморегулирующейся сборке и разборке и поддержание динамического ювесия системы мономер-полимер (Wanger et al.. 1985), а также способность к :тию в контрактильном взаимодействии в комплексе с некоторыми актин-ывающими белками (например, миозином).

(ласспческой и достаточно детально изученной моделью такого взаимодействия :ет служить актомиозиновое сокращение мышечной клетки (Энгельгардт, Люби-з 1942).

1аличие актина во всех типах клеток и высокий структурный и генетический кон-;атизм свидетельствуют об универсальности его функций в живой клетке (Korn, !). Сложный и динамичный актиновый каркас, наряду с тубулиновыми микротрусами. лежит в основе системы, составляющей понятие цитоскелета любой клетки, vi числе и клеток растений.

5 последние годы в литературе стали появляться разнообразные сведения об ак-IX из растительных объектов. Изучение актина в растениях попрежнему сопряже-рядом трудностей в связи с низким содержанием его в цитоплазме растительной ки и-высокой лабильностью по отношению к протеазам. Поэтому эти сведения ются весьма отрывочными и неполными по сравнению с традиционными объек-i (мышечное сокращение, амебоидное движение). В связи с этим проблема био-пческой идентификации и пространственной визуализации актиновых компонен-является весьма актуальной. Будучи одним из основных компонентов сложного тлекса цитоскелета растительной клетки, актин принимает участие в осуществле-большинства функций как в цитоплазме: формирование микрокомпартментов |.ментативные циклы, биосинтез белка), направленное движение цитоплазмы и нелл. пространственное определение взаиморасположения составляющих клетки, ез клеточной стенки, митоз и мейоз (Schmit, Lambert. 1987; Bereiter-Hahn, 1988; dbodv et al. 1992; Williamson, 1993); так и в системе межклеточных взаимодейст-участие в передаче сигнала с мембранных рецепторов (Drobak et al., 1994). регу-iii транспорта веществ через плазмодесмы (White et al., 1994), а также в механиз-1Лоэмного транспорта (Cleary, 1995).

{альнейшее изучение модификаций актинового цитоскелета и его функций в рас-[ях необходимо для формирования более полной и целостной картины фчнкцио-)вания живой клетки.

Подходы к идентификации актина разнообразными методами детально разраб( ны лишь для традиционных мышечных объектов, в то время, как для растений методы нуждаются в существенной модификации с учетом их биохимической спе фики .

Кроме того, для детального рассмотрения функционирования актинового ш скелета очень важно дифференцирование полимерного и мономерного состоя этого белка в цитоплазме живой клетки. Имеющиеся традиционные иммуноцитс мические маркеры не способны различать глобулярную (мономерную) и фибрил; ную (полимерную) формы актина.

Цель работы. Целью данной работы было выделение, идентификация и очис фракций актина из различных тканей растений (корней проростков пшеницы и эк карпа незрелых плодов томата), разработка специфических маркеров на глобуляр! и фибриллярную формы актина. Применение этих маркеров для выявления актш дот-блот анализе и методами электронной микроскопии. Визуализация с их помои особенностей строения актинового цитоскелета на ультратонких срезах и в суб[ точных препаратах корней проростков пшеницы и эндокарпа плодов томата.

В соответствии с данной целью, в работе решались следующие задачи:

1. Модифицировать традиционную методику выделения и обогащения фрак: актина для растительных объектов.

2. Синтезировать узкоспецифические маркеры на основе коллоидного золота выявления глобулярной и фибриллярной форм актина в дот-блот анализе и метод; электронной микроскопии.

3. Показать на электронно-микроскопическом уровне особенности актина рас тельного происхождения в сравнении с мышечными актинами.

4. Выявить морфологические особенности конфигурации актинового цитоскел на ультратонких срезах и в субклеточных препаратах тканей растений с использс нием синтезированных биомаркеров.

Научная новизна работы. Впервые удалось получить обогащенную актш фракцию из корней проростков пшеницы. Разработан метод получения специфг ского маркера к филаментной форме актина на основе фаллоидина и коллоидн золота.

С помощью синтезированных маркеров показаны некоторые особенности и д( ли строения актиновых филаментов на препаратах очищенного актина и на улы тонких срезах растительных объектов.

Разработан метод "давленного препарата" корней проростков пшеницы для эх тронно-микроскопической визуализации деталей морфологии актинового цитоске та с использованием специфических маркеров.

Практическая значимость работы. Результаты исследования вносят су шесгвен-1 вклад в изучение пространственной организации актинового цитоскелета расти-ьнон клетки. Они дают сведения о биохимических и структурных особенностях тительного актина и его роли в жизнедеятельности клеток растений. Синтезирован новый маркер, специфичный к филаментноП форме актина и про-онстрнрованы возможности его применения в дот-блот анализе и различных элек-нно-микроскопических методах.

Препараты фаллоилин-коллоидное золото и антиактиновые антитела-коллоидное ото были использованы в исследованиях ряда лабораторий ИБФРМ РАН, а также еданы по заказам в следующие научные организации: Институт физиологии рас-ий им. Темирязева РАН (г. Москва). Институт ботаники им. Холодного АН Ук-ны (г. Киев). Институт физиологии и биохимии растений АН Молдовы (г. Киши). Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург), Санкт-Петербургский государ-;нный университет.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Выделение и очистка фракций, обогащенных актином, из растительных объек-(корней проростков пшеницы и эндокарпа незрелых плодов томата), и их сравнимый анализ.

2. Синтез узкоспецифнчески.х маркеров на основе коллоидного золота для иден-икации глобулярной и фибриллярной форм актина с помощью различных мето-

3. Электронно-микроскопическое изучение морфологии актиновых филаментов из шх растительных объектов. Их сравнение с мышечными актинами.

1. Пространственная визуализация актин-содержащнх структур в цитоплазме кле-растений с использованием специфических маркеров.

Работа выполнялась по плану НИР ИБФРМ РАН в рамках темы: "Изучение странственно-временной организации белков цитоскелета клеток растений", на-ый руководитель темы к.б.н., с.н.с. О.И. Соколов. № гос. регистрации Э0008367.

-1астично работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундамен->ных исследований (код проекта 94-04-13673-а).

Препараты маркеров на основе коллоидного золота были синтезированы совмест-:о старшими научными сотрудниками лаборатории физической химии клеточных • ктур Богатыревым В.А. и Дыкманом Л.А.

-\пробаипя работы. Основные результаты диссертационной работы представля-докладывались и обсуждались на: 20th Meeting of the Federation of European :hemical Societies. Budapest (Hungary). 1990: 15 International Congress of

Biochemistry. Jerusalem (Israel). 1991: 21 st Annual Meeting of the FEBS. Dublin (lrelan 1992: 3 Съезде Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербу 1993; International Symposium on Biological Motility. Pusbchino (Russia). 1994. а так na заседании Саратовского отделения Всероссийского биохимического общества и отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отече венных и зару бежных изданиях.

Структура п объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти г: (включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, ложение полу ченных результатов и их обсуждение), заключения и списка исполь ванных литературных источников. Работа изложена на 117 страницах, иллюстри вана 16 рисунками и включает 3 таблицы. Список использованных литературн источников включает 236 наименования.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературным обзор представлен в первой главе, в нем подробно рассматри ются основные характеристики актина: структура и свойства мономерной фор; поддержание равновесия мономер-полимер, функциональные особенности в связ актин-связывающими белками. Отдельно подробно рассматриваются некоторые о бенности морфологии и функций актина в клетках растений разных таксономичеа групп.

Во второй главе приведено описание использованных материалов п метод Оригинальные методики и модификации традиционных методик описаны в cooti ствующих разделах третьей-пятой глав.

В работе использовали актин животного и растительного происхождения. Ист ником животного актина служили поперечнополосатые спинные мышцы кролик гладкие мышцы куриного желудка. Для исследований растительного актина испс зовали ткани кончика корня 3-х дневных проростков пшеницы сорта Саратовская и зндокарпа незрелых плодов томата.

Для работы были использованы стандартное оборудование и реактивы, в том 1 ле: просвечивающий электронный микроскоп BS-500 "Tesla" (ЧССР): ультрамиь том Ultracut Е "Reichen-Jung" (Австрия): ультрацентрифугу "Beckman" (США): ( тему высокоэффективной жидкостной хроматографии FPLC "Pharmacia" (Швец спектрофотометр Spekol 221 "Jena" (ГДР) и др.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и сравнительный анализ актина из растительных объектов

Известно, что содержание актина в клетках растений значительно ниже, чем в етках животных, и он сопряжен с большим количеством высоко- и низкомолеку-рных актин-связывающих белков, поэтому нами был разработан метод выделения гина с учетом специфики растительных объектов. Для этого в качестве исходного тода выделения актина нами был использован принцип полимеризации-толимеризации, описанный в работах Спьюдич с соавт. (1971, 1982) и Вэй с соавт. >80, 1982).

Кроме того, известно, что в растительных тканях очень высока протеолитическая гивность, поэтому нами был использован большой набор ингибиторов протеаз. ходя из этого, для экстракции актина и ассоциированных с ним белков использова-буфер следующего состава: 40 мМ Трис-НС1 рН 7,5; 1 мМ ЭДТА; 5 мМ ДТТ; 0.5 КС1; 0.1 мМ ФМСФ; 0.01 мМ пепстатин А; 0.0005 мМ лейпептин; 0.0005 мМ БА-0.0005 мМ ТФХК, 0.0005 мМ ТЛХК. Гомогенизацию растительных тканей прошли либо из замороженного состояния (-70°С) растиранием в ступке с порошком )2 в случае корней пшеницы, либо в гомогенизаторе \lPW-340 при 300-500 об/мин I эндокарпа плодов томата. Соотношение навески ткани и объема экстрагирующе-буфера составляло 1:3. Время гомогенизации старались свести к минимуму и все :рации проводили при температуре 4°С.

Полученный гомогенат центрифугировали при 23 000 g 30 мин, а супернатант не-хпенно высаливали сульфатом аммония до 60% от конечного насыщения для кон-прирования белков и приостановки возможного протеолиза. Высаливание прово-ш насыщенным раствором соли, дополнительно содержащим 10 мМ ЭДТА в каче-е неспецифического ингибитора протеаз и для связывания тяжелых ионов. При ■м рН среды поддерживали около 7.0 добавлением концентрированного раствора лиака.

Образовавшийся осадок белков собирали центрифугированием при 23 000 g 30 н и промывали 30% сульфатом аммония и вновь центрифугировали при тех же овиях. Полученный супернатант, содержащий фракцию актина, диализовали в ение 24-36 часов для удаления соли и одновременной деполимеризации актина )тив буфера: 5 мМ Трис-НС1 рН 8.0; 0.5 мМ АТФ; 0.2 мМ СаСЬ; 1 мМ ЭДТА; 0.5 1 ДТТ: 0.1 мМ ФМСФ; 0.001 мМ пепстатин А; 0.0005 мМ лейпептин; 0.0005 мМ ХК; 0.0005 мМ ТЛХК.

После осветления диализата центрифугированием при 80 ООО g 30 мин получе} ный супернатант, содержащий деполимеризованный актин, подвергали полимериз; ции в два этапа: сначала добавлением КС1 до 100 мМ и MgCl2 до 2 мМ в течение часов при комнатной температуре, а затем дополнительным повышением концентр: ции КС1 до 0.5 М в течение 12 часов при 4°С.

Полимеризованную фракцию актина собирали ульрацентрифугированием при 1С 000 g 60 мин.

Такой цикл полимеризации-деполимеризации повторяли еще дважды.

В результате очистки нами была получ! на фракция белка, обогащенная растител] ным актином. На рис. 1 представлены да] ные электрофоретического анализа поел* довательных стадий очистки актина из ко] ней проростков пшеницы. Как видно i рисунка, по мере очистки полимеризацие! деполимеризацией, происходило обогащ ние препарата полосой, соответствующе молекулярной массе 41-42 кД. Актинов; природа данного полипептида (помим молекулярной массы) подтверждается те! что его удельная концентрация возрасты по мере очистки полимеризаций деполимеризацией, в то время, как в грубо экстракте полоса, соответствующая моле к лярной массе актина, не выявлялась. Хо' полного отделения от других, предполож] тельно актин-связывающих белков, на осуществить не удалось.

В случае выделения актина из эндокар1 плодов томата (рис. 2) происходило более заметное обогащение фракции полипепт: дом с молекулярной массой 41-42 кД, а спектр примесных белков существенно отл: чался от такового корней проростков пшеницы. В этом препарате актина происход: ло видимое желирование, и оно, по-видимому, связано с достижением концентрацш белка в этом препарате, достаточной для гелеобразования. Как видно из рисунка, э* подтверждается и электрофоретическими данными. В препарате актина из корш проростков пшеницы желирования мы не наблюдали.

1 2 3 4 5 6 1

Рис. 1 Электрофоретический анализ последовательных стадий очистки актина из корней проростков пшеницы:

1 - маркерные белки,

2 — грубый экстракт корней проростков

пшеницы,

3 - фракция белков после 1-ой полимериза-

ции,

4 - супернатант после 2-ой полимеризации,

5 — фракция, обогащенная растительным

актином, после 2-ой полимеризации,

6 - очищенный кроличий актин.

ричин отсутствия желнрования в дан-препарате может быть несколько. Во-ых, это пониженная, по сравнению с ■юм из эндокарпа плодов томата, кон-рация его в препарате корней пророст-тшешщы. Более высокой удельной кон-рации белка нам получить не удалось, торых, наиболее вероятно, это объясня-разными спектрами оставшихся актин-лвающих белков в двух актиновых пре-тах. Можно предположить, что присут-г в препарате актина из корней проро-а пшеннцы значительного количества омолекулярных кэпируюших белков ятствует формированию филаментов ической длины, при которой происхо-образование сшивок и желирование вора (Р1огу, 1941).

1опытки дальнейшей очистки этой ;ции повтором циклов полимеризации-лимеризации не приводили к получению электрофоретически гомогенного пре-та актина.

I связи с этим, после трех циклов полимеризации-деполимеризации обогащенную ительным актином фракцию использовали для дальнейшей очистки с помощью юбменной хроматографии на анионообменной колонке (РРЬС). (ля определения времени выхода актина на данной колонке при концентрации :-НС1 буфера 20 мМ и рН 8.0 при элюции возрастающим линейным градиентом 1 от 0 до 0.5 М и скорости элюции 1 мл/мин, мы проводили калибровку очищен-куриным актином. Регистрацию пиков осуществляли при Х= 280 нм. Сак видно из рисунка ЗА, было получено несколько пиков, из которых только пик 4, (элюция с колонки при концентрации соли 0.29-0.31 М КаС1) соответст-ш мышечному актину.

Тосле. определения значения концентрации соли, при котором элюируется мы-ный актин, мы проводили дополнительную очистку фракции растительного акти-из корней проростков пшеницы) при тех же условиях.

3 результате ионообменной хроматографии фракции растительного актина был /чен достаточно большой спектр пиков (рис. ЗБ). Среди этого спектра прнсутст-

кД

г

Рис. 2 Электрофоретический анализ этапов очистки актина из эндокарпа плодов томата:

1 - грубый экстракт кроличьего актина,

2 - обогащенная актином ( ) фракция - из эндокарпа плодов томата,

3 - помежуточная фракция очистки актина

из эндокарпа плодов томата.

4 - грубый экстракт эндокарпа плодов томата,

5 - грубый экстракт куриного актина.

6 - маркерные белки.

л ь

Рис. 3 Профили элюции фракций актина из гладких мышц курицы (А) и из корней про ков пшеницы (Б) на анионообменной Mono Q колонке в линейном градиенте NaCl. Ско] элюции — 1 мл/мин.

вовал пик, элюируемый в области значений концентрации соли, характерной элюции мышечного актина. Электрофоретический анализ полученных пиков not присутствие полосы, соответствующей молекулярной массе актина, именно в 4 ш

Таким образом, учитывая два параметра: молекулярную массу (по данным : трофореза) и заряд (по данным ионообменной хроматографии), а также обогащ экстракта этим белком после нескольких циклов полимеризации-деполимеризаци сравнивая их с аналогичными параметрами мышечного актина, мы можем еде вывод об актиновой природе данного белка.

Для дальнейшего подтверждения этого вывода необходимо было применить полнительные специфические методы идентификации растительного актина.

2. Разработка маркера на основе фаллоидина и

коллоидного золота и его применение в различных методах идентификации F-актина.

Для визуализации и исследования актинового компонента в живых клетках vitro широко используются конъюгаты различных флуоресцентных зондов с фа токсином (Barden et al., 1987). Для изучения локализации актина in situ на элект но-микроскопическом уровне применяются такие методы, как декорирование т лым меромиозином (Trinick, 1979), использование антител (Raikhel et al, 1982) i Применение этих методов сопряжено с рядом трудностей, таких, как пермеабих ция клеток, что вызывает нарушения морфологии филаментов, а использование а тел для непосредственного мечения не позволяет отличить G- и F-форму актин; исключением использования моноклональных антител) и дает слабый сигнал.

Фаллоиднн является уникальным связывающим агентом, специфическим по с избирательности к F-форме актина (Tewince. 1989). Не смотря на то. что конкрет

еханизм необратимого информационного воздействия фалдоидина на актиновый олимер до сих пор не ясен, это свойство фаллоидина мы использовали для синтеза а его основе узкоспецифического маркера по аналогии с маркерами на основе анти-;л. Его преимуществом является возможность быстрого прямого одноэтапного ме-ения и его применение избавляет от многих проблем, которые возникают при ис-ользовании других методов. Таким образом, высокая избирательность действия гого маркера аналогична иммунохимическим маркерам, хотя сам маркер, в данном 1учае, не является иммунологическим по своей природе.

Коллоидное золото в последние годы стало, одним из самых распространенных аркеров в электронной микроскопии и иммуноцитохимии. Большим преимуществом ¡ляется возможность получения частиц заданного диаметра и с узким распределени-.1, что позволяет проводить одновременное дифференциальное мечение.

Для приготовления маркера фаллоидин-коллоидное золото мы использовали золи шота со средними диаметрами частиц 10 и 20 нм. Для этого водный раствор фал-)идина из Amanita phalloïdes ("Олайна", Эстония) конъюгировали с коллоидным шотом без доведения рН золей. В качестве вторичного стабилизатора использовали )лиэтиленгликоль 20 ООО (ПЭГ) в конечной концентрации 0.02%. После осаждения жъюгата центрифугированием при 40 000 g 40 мин, полученный осадок ресуспен-фовали в 100 мМ фосфатном буфере рН 7.2, содержащем 0.02% ПЭГ (Lachapelle et , 1988, Рихтер с соавт., 1990). Различные разведения полученного препарата были юверены для получения наилучшего мечения: для дот-блот анализа оптимальная :бочая концентрация маркера составляла А520=0.5, а для электронно-1кроскопического мечения - А52о= 0.1 .

Полученный препарат хранили при -20°С в 100 мМ фосфатном буфере, содержа-гм 0.02 M азида натрия и 50% глицерина.

В результате синтеза этого маркера нам удалось совместить преимущества пользования частиц коллоидного золота (высокая электронная плотность, простота в •ращении, возможность использования в дот-блот анализе) с высокой селективно-ью мечения F-формы актина фаллоидином.

Синтезированный маркер оказался способным связываться и выявлять полимер-то форму актина в препаратах из различных объектов как на электронно-1кроскопическом уровне, так и в дот-блот анализе.

На рис. 4 представлен вариант сравнительного мечения растительного F-актина и лшечных F- и G-актинов в последовательных четырехкратных разведениях. Как дно из рисунка, маркер способен выявлять как растительный (А), так и мышечный ) F-актин. мышечный G-актин (В) связывания с маркером не показал.

© *

«и?'

ф ф ^ * При работе с обогащенными актина

фракциями в электронной микроскопии ж блот анализ (помимо возможности коли1 . ственного определения белка) можно р;

Рис"1^Гт^о7'опреде"л;'н7еТув- сматривать и как экспресс метод предвар

ствительности маркера фаллоидин- тельной оценки возможности использован

коллоидное золото к растительному и жи- конъюгатов коллоидного золота для поа вотному актинам (последовательные четырехкратные разведения): ДУющеи электронно-микроскопическ

1 - растительный Р-актин, визуализации Р-актина.

2 - мышечный Р-актин,

3 - мышечный в-актин.

3. Электронно-микроскопическое изучение морфологии растительного актина

Помимо вышеперечисленных подходов мы прибегли к широкому арсеналу медов электронно-микроскопического анализа, которые, с нашей точки зрения, яв: лись наиболее информативными и достоверными.

На рис. 5 приведены микрофотографии актиновых филаментов мышечного п] исхождения (поперечнополосатые мышцы кролика и гладкие мышцы куриного > лудка) и из обогащенных фракций растительных объектов (корни проростков niuei цы и эндокарп незрелых плодов томата), меченные маркером фаллоидин-колоид! золото с последующим контрастированием уранил-ацетатом. Характер упако! выявляемых пучков растительных филаментов имеет существенное сходство с та: вым мышечного происхождения, хотя есть и определенные различия. По литераг ным данным характер агрегации актиновых филаментов определяется, во-перв! наличием разных изоформ актина и, во-вторых, присутствием разнообразных акт) связывающих белков. Фракция, обогащенная растительным актином из корней п] ростков пшеницы, возможно, содержит смесь двух изоформ актина: Х-актина, ко рый, в основном, экспрессируется в меристематических тканях, и к-актина, котор характерен для немеристематических тканей корня. ¡Обогащенной актином фракг из эндокарпа незрелых плодов томата, в основном, вероятно, содержится р-акт характерный для фотосинтезирующих частей растения (An_et al., 1996).

Кроме того, по литературным данным известно, что различные изоформы дг мышечного актина проявляют разные биохимические и биофизические гелеоб зуюшие свойства, и некоторые вообще не способны формировать эластичные стр туры (Allen, et al 1996).

. 5 Сравнительный электронно-микроскопический анализ мечения мышечных и расти-,1Х F-актинов маркером фаллоидин-коллоидное золото (10 нм). Доконтрастирование л-ацетатом (bar 100 нм):

А - актин из поперечнополосатых мышц кролика, Б - актин из гладких мышц курицы, В - актин из корней проростков пшеницы, Г - актин из эндокарпа зеленых плодов томата, связи с низким содержанием актина в растительной клетке, в обогащенном эксе, даже после нескольких циклов полимеризации-деполимеризации, содержание :сных белков остается высоким. Особенно трудно избавиться от низкомолеку-IX актин-связывающих белков, типа профилина, которые способны связываться юмерной формой актина и почти не удаляются этим методом. Это касается 1ентирующих и кэпирующих белков, типа фрагмина, северина, которые способ-зрезать полимерное волокно на олигомеры и участвуют в стабилизации опреде-|й длины филамента. При этом они способны оказывать влияние на конформа-1ктиновых филаментов и на характер их агрегации в очень низких концентраци-

ы предполагаем, что уровень содержания подобных белков выше в препарате >рм актина из корней пшеничных проростков, так как в клетках активно расту-корня интенсивность физиологических процессов (и синтеза актиновых фила-ib) намного выше, чем в клетках эндокарпа плода томата. Присутствие этих в препятствует формированию филаментов достаточной длины, необходимой ;елирования раствора. Их присутствие также влияет и на характер агрегации

одиночных актиновых филаментов, как видно из рисунка 5, актин из корней пше ных проростков формирует плотную сеть из коротких филаментов с большим к чеством сшивок. Изоформа ц-актина из эндокарпа плодов томата, видимо, прис; вует в растворе в виде более длинных и стабильных филаментов и легко агрегир; плотные пучки или образует равномерную сеть, по аналогии с мышечными актин;

Возможно, этим и объясняется не столь равномерная посадка маркера фаллои коллоидное золото на сеть актиновых филаментов из растительных объектов сравнению с характером мечения филаментов мышечных актинов. Низкомолеку ные актин-связывающие и другие примесные белки, от которых не удалось по стью избавиться в процессе очистки, по-видимому, конкурируют с фаллоидино маркером в местах специфического связывания и тем самым препятствуют его пс ке на актиновый филамент. Хотя процесс этот до конца не ясен, так как, во-пер до сих пор не известен конкретный механизм узкоспецифического связывания лоидина с полимерным актином, и, во-вторых, данные о наличии и функциях в спектра актин-связывающих белков в растительной клетке остаются весьма отры ными.

Полученные нами результаты с использованием маркера фаллоидин-коллои, золото по выявлению актин-содержащих структур на ультратонких срезах позво; не только обнаружить наличие актиновых филаментов в клетке, но и выявить ра чия в их морфологии и характере посадки на них маркера.

Одной из структур актинового цитоскелета являются филаменты, формирую достаточно "толстые" тяжи с плотной упаковкой индивидуальных филаментов. П речные срезы этих тяжей достаточно контрастно выделяются среди других о> плотной посадкой маркера (рис. 6). Причем эти тяжи могут располагаться как в са

Рис. 6 Ультратонкий поперечный срез трансцитоплазматического (А) и трансвакуоляр (Б) тяжей F-актина в клетке корня проростка пшеницы, меченные маркером фаллои коллоидное золото (Ю им) (bar 100 им)

»плазме - трансиптоплазматпческие тяжи (рис. 6Л). так и проходить через вакуо-трансвакхолярные тяжи (рис. 6Б). Если же исходить из плотности посадки мар-. то явно заметно, что эта плотность выше для трансвакуолярных тяжей и ниже трансцитоплазматических. Очевидно, трансвакуолярные тяжи включают в боль-степени. чем цлтоплазматические. другие составляющие, возможно липидной )оды. Не исключено, что различия актиновых тяжей обусловлены их разной к'ционалыюй ролью.

(ругая морфологическая группа актиновых филаментов выявляется тем же мар-1М в составе электронно-прозрачных структур клетки. На рис. 7 представлены эграфии этих структур. Они выглядят не электронно-плотными, четко ограниче-

ic. 7 F-актин-содержашие структуры на ультратонких срезах в клетках корня проростка шцы. меченные маркером ф&ллоидин-коллоидное золото (10 им) (bar 100 нм).

электронно-плотной мемораной и их внутренние структуры метятся маркером лоидин-коллоидное золото, хотя его посадка не очень интенсивна и диффузна. можем интерпретировать эти структуры, как срезы фрагментов пузырьков аппа-I Гольджи. транспортная функция кото) в растущей клетке очень интенсивна. -1а рис. S представлен ультратонкий i эндокарпа зеленого плода томата, под-тленный по стандартной методике, уализация актина проводилась марке-

на основе кроличьих антиактиновых . ' 1тел и коллоидного золота. Интенсивная _

I

здка маркера свидетельствует о значи- р11С. 8. Ультратонкий поперечный срез .ном содержании актинового компонен- трансиитоплазматического тяжа в клетке

-г - эндокарпа зеленого плода томата, мечсн-

I аким ооразом. мы можем сделать вы- '

нын маркером кроличьи антиактиновые

о достаточно высоком иммунологиче- анипела-коллоплиое золото (10 нм) (bar

100 им)

ском консерватизме структуры молекулы актина, растительного в гом числе. В ; ном слечае антитела против гладкомышечного актина специфически выявляют pat тельный актин на срезе клетки плода томата. На рис. 8. скорее всего, представ участок трансцитоплазматического тяжа.

Для более подробного изучения обнаруженных нами различных конфигураций тинового скелета, а также из-за невозможности выявить трехмерную сеть F-актинг ультратонких срезах, нами был применен метод "давленного препарата" кончи корней пшеницы непосредственно на электронно-микроскопических сетках в прис ствии актин-стабилизирующего бу фера.

Это позволило выявить обширную актиновую сеть (рис. 9А). которая присутст ет в меристематических клетках и выявляется на ультратонких срезах только в в диффузного распределения фаллолдинового маркера. На рисунке мы можем вид фрагмент этой сети, пронизывающей все пространство цитоплазмы растителы клетки (Васильев, 1996).

..... ж

m_

А Б

Рис. 9 F-актин-содержащие структуры в субклеточных препаратах корня проростка пше цы. меченные маркером фаллоиднн-коллоидное золото (10 им) (bar 100 нм): А - фрагмент сетевидной структуры. Б - трансцитоплазматнческий тяж.

Кроме того, на этих препаратах нами обнаружены толстые электронно-плст тяжи, иногда имеющие веретенообразную форму, с очень плотной посадкой марк (рис. 9Б). Видимо, эти тяжи состоят из большого количества параллельно упаков пых актиновых филаментов, объединенных между собой актин-ассоциированнь белками и представляют собой трансцитоплазматические тяжи. На ультратон: срезах эти структуры выявлялись в виде плотной посадки метки на поперечных се ниях этих тяжей, проходящих под разными углами к плоскости среза (см. рис. 6).

выводы

. Получены фракции, обогащенные актином, из растительных объектов - корней эостков пшеницы и эндокарпа зеленых плодов томата. Проведено сравнение их ирующих и филаментообразуюших свойств.

!. Разработан специфический маркер на основе фаллоидина и коллоидного золота, зляюший избирательно филаментную форму актина. Продемонстрировано его ченение в дот-блот анализе и электронной микроскопии, его преимущества по !нению с иммуномаркерами.

I. На электронно-микроскопическом уровне показана структура актиновых Филатов из разных растительных объектов и их сравнение с филаментами актина мы-ного происхождения.

■. Показано наличие актин-содержаших структур на ультратонких срезах расти-ных объектов с помощью специфических маркеров на основе коллоидного золо-

. Разработан метод приготовления субклеточных препаратов корней проростков ницы, в которых впервые выявлены актин-содержащие структуры с помощью сера фаллоидин-коллоидное золото.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. Т.Я.Рихтер, О.К.Грингауз, О.И.Соколов. Выявление и характер мечения F-на маркером фаллоидин - коллоидное золото // Цитология, - 1990. - Т.32, № 11.114- 1119.

. В.В.Ильчуков, О.К.Грингауз, О.И.Соколов Функциональное значение лектинов оцессе дифференциации клеток каллусных культур // Зй Съезд Всероссийского гства физиологов растений. Санкт-Петербург, 24-29 июня. 1993.: Тез.докл. -ст-Петербург, 1993. - 2. - С. 119.

. Соколов О.И., Рихтер Т.Я.. Грингауз O.K. Выделение и характеристика расти-ного актина // Зй Съезд Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-'рбург, 24-29 июня. 1993.: Тез.докл. - Санкт-Петербург,-С.36. . T.J.Richter, O.K.Gringauze, O.I.Sokolov. The Visualization and Character of F-actin cing with Phalloidin - Colloidal Gold Marker.// 20th Meeting of the Federation of pean Biochemical Societies, Budapest, 19-24 aug. 1990.: Abstr. - Budapest, 1990. - P.

. Soklov O.I.. Richter T.J.. Gringauze O.K. Wheat actin marking with phaloidin idal gold probe.// 15 Int. Congr. Biochem, Jerusalem. 4-8 aug. 1991.: Abstr. -alem. 1991. - P. 186.

6. Sokolov О.I., Richter Т.J.. Gringauze O.K. Wheat actin marking with phallo colloidal gold probe.// 21st Annual Meeting of the FEBS, Dublin. 9-14 aug. 1992.: Abs Dublin, 1992. - P. 32.

7. 0.1.Sokolov, O.K.Gringauze, T.J.Richter. Plant Actin Identification With Collo Gold Markers.// Biologia Plantarum. -1994. - 36 (suppl). - P. SI8.

8. O.I.Sokolov, O.K.Gringauze, Y.V.Krivopalov, V.V.Ilchukov. Plant A Identification in Cytoskeletal Network.// Int.Symp. on Biological Motility, 25 Sept - 1 ( 1994: Abstr. - Pushchino, 1994. - p. 270 -271.

9. E.A.Zak, O.I.Sokolov, O.K.Gringauze and N.L.KIyachko. Polysomes from V Faba Leaves Bound to the Actin Cytoskeleton.// J. Exp. Botany. -1997. -V.48. -P. 10 1026.

Ю.Соколов О.И., Грингауз O.K., Рихтер Т.Я. Идентификация F-актина расте! фаллоидин - коллоидным золотом 1. Биохимические препараты.// Физиол. рас 1998.-Т.45,№2.-С.227-234.

11.Грингауз O.K., Негрецкий В.А., Соколов О.И. Идентификация F-актина рас ний фаллоидин - коллоидным золотом 2. Клетки и субклеточные препараты.// Фи ол. раст. -1998. - Т.45, №2. - С.235-240.

Подписано ь печати 6 10 97 Ответственный за вып\ск Мельников А Г Объем 1 п л Тираж- 100 Заказ 42

Отпечатано в ПБФРЧ РАН

Саратов, пр Энт\энастов 13