Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы динамики актиновых структур клетки

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы динамики актиновых структур клетки"

Институт цитологии Российской академии наук

На правах рукописи К и ОД УДК 577.353.23

2 4 НОЯ 10Р7

Хайтлина София Юрьевна

схш^

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДИНАМИКИ АКТИНОВЫХ СТРУКТУР КЛЕТКИ

Клеточная биология 03.00.25

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Георгий Петрович Пинаев, Институт цитологии РАН Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Владимир Иосифович Воробьев, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Николай Борисович Гусев, Московский государственный университет

доктор биологических наук, профессор Вячеслав Константинович Павленко, Санкт-Петербургский государственный университет

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН

Защита состоится « 4Э » декабря 1997 года в /3 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург,Тихорецкий пр., Д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан « 16"» цх>ль1> $ 1997 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук Л.Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актин, один из основных белков сократительного. аппарата мышц, является также одним из основных белков цитоскелета, и его содержание в клетке очень высоко. С актиновыми структурами цитоскелета связано поддержание формы, движение и деление клеток, эндоцитоз, передача медиаторов, свертывание крови, процессы, предшествующие оплодотворению, и многие другие. Предполагается также участие цитоскелета в регуляции активности ионных каналов, в процессах передачи сигнала с рецепторов на геном, в транскрипции и регуляции активности ферментов. Характерной особенностью актиновых структур цитоскелета является их динамичность. В отличие от актиновых нитей стабильного сократительного аппарата скелетных мышц, образующихся однократно, микрофиламенты цитоскелета способны собираться и разбираться в зависимости от физиологического состояния клетки. Динамика микрофиламентов цитоскелета основана на двух фундаментальных свойствах актина: способности к обратимой трансформации из глобулярного состояния (в-актин) в полимер (Р-актин) и взаимодействии с многочисленными актин-связывающими белками, которые могут ускорять или ингибировать полимеризацию, фрагментировать актиновые нити или связывать их в пучки и прикреплять к клеточной мембране. Нарушение процессов сборки и разборки актиновых структур приводит к нарушению нормальной жизнедеятельности клетки, в том числе, к ее опухолевой трансформации. В связи с этим изучение полимеризации актина и его взаимодействия с белками, влияющими на полимеризацию, существенно для понимания механизмов, лежащих в основе биологии клетки и ее регуляции.

В разных мышцах и в немышечных клетках актин представлен разными изоформами. Актин таких постоянных сократительных структур, как миофибриллы (а-изоформа), отличается от р- и у-изоактинов, входящих в состав динамичных структур цитоскелета. Кроме того, специфические изоформы актина обнаружены в гладких мышцах, в тканях беспозвоночных животных, в растениях и в одноклеточных организмах. Показано также, что внутри одной клетки разные изоформы актина компартментализованы. Тканеспецифич-ность изоформ и их локализация в определенных частях клетки поднимают вопрос о связи между структурой, функциональными особенностями изоформ актина и свойствами сократительных и цитоскелетных систем, которые они образуют.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение физико-химических и функциональных свойств изоформ актина, коррелирующих со свойствами сократительных систем, в состав которых они входят. В задачи исследования входило: 1) Изучить особенности структуры и полимеризации актинов, выделенных из разных сократительных систем. 2) Выявить структурно-функциональные связи в молекуле актина и локализовать сайты, участвующие в поддержании стабильной структуры полимеров. 3) Исследовать влияние актин-связывающих белков на структуру актина и его способность формировать стабильные полимеры. 4) Сопостапить структурно-функциональные особенности изоформ актина со свойствами тех структур клетки, в состав которых они входят.

Научная новизна. Впервые обнаружены различия в свойствах актинов, выделенных на разных стадиях формирования сократительного аппарата. Показано, что стабильность полимеров, образованных разными изоформами актина, коррелирует со стабильностью или динамичностью соответствующих микро-филаментных структур. Впервые показано, что причиной меньшей стабильности немышечной изоформы актина может быть более открытая конформация нуклеотидной щели, что, по-видимому, является результатом менее эффективных структурных перестроек в мономере актина при его включении в полимер.

Открыт новый фермент - бактериальная протеиназа ЕСР32, специфически расщепляющая полипептидную цепь актина между С1у42 и Уа143. Это точечное повреждение полипептидной цепи приводит к полной потере способности актина к полимеризации и ингибированию активности ДНКазы I. Эти данные впервые продемонстрировали, что стабильность полимеров актина критически зависит от конформации (^-концевой части ДНКазной петли в субдомене 2 молекулы актина. Показано, что полимеризуемость расщепленного актина восстанавливается при замещении прочно связанного иона Са на ион Мд и при взаимодействии с субфрагментом 1 миозина, что является прямым экспериментальным доказательством активации мономеров актина в этих условиях. Кроме того, нами впервые показано, что взаимодействие с гельзолином, ускоряющим стадию нуклеазции в процессе полимеризации актина, вызывает конформационные изменения в сайтах актин-актиновых контактов, способствующие стабилизации зародышей полимеризации. Локализованы участки молекулы актина, которые участвуют в распространении вызванных гельзолином конформационных изменений вдоль нити актина.

Полученные результаты впервые позволили объяснить физиологический смысл существования разных изоформ актина. Предложена модель сборки актиновых микрофиламентов в миофибриллах и цитоскелете, основанная на адаптивном характере различий между изоформами актина и аллостерической регуляции структурных перестроек, стабилизирующих полимер. Согласно предложенной модели, способность мышечной а-изоформы актина коррелирует со стабильностью филамёнтов в миофибриллах. Динамика цитоскелета обеспечивается сочетанием нестабильности полимеров, образованных цитоскелетными ß- и у-изоактинами, с возможностью стабилизировать полимеры с помощью актин-связывающих белков.

Научно-практическая значимость. Обнаружен и охарактеризован новый штамм бактерий Escherichia coli А2 - продуцент нового фермента, протеиназы ЕСР32, обладающей высокой субстратной специфичностью (авторское свидетельство N 1390241). Протеаза ЕСР32 расщепляет актин в уникальном сайте, который участвует в контактах между субъединицами актина в полимере. Этот сайт не расщепляется другими протеазами, а расщепление протеазой ЕСР32 качественно изменяет свойства актина. Поэтому протеаза ЕСР32 успешно используется для изучения структуры и функций актина в Университете штата Миннесота (Миннеаполис, США), в Институте экспериментальной биологии им. Ненцкого (Варшава, Польша), в Университете г.Билефельд (Германия), в Иерусалимском университете (Израиль). Кроме того, новый фермент может быть использован для изучения структуры белков теплового шока и гистонов. Разработанные в ходе настоящего исследования методы выделения актина и а-актинина из мышц моллюсков могут быть использованы для выделения этих белков из других источников. В частности, метод очистки актина с помощью трипсиновой обработки был успешно применен для выделения актина из гладкой мышцы желудка цыпленка с целью получения поликлональных антител к этому актину (Лаб.им.А.Н. Белозерского, МГУ). Разработанный при участии автора флуоресцентный метод определения количества инактивированного актина в его препаратах применяется для оценки нативности всех исследуемых препаратов актина.

Место проведения работы. Работа проводилась в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН (зав. отделом д.б.н.,

профессор Г.П.Пинаев) и частично- в Институте экспериментальной биологии им. Ненцкого ПАН (Варшава, Польша) и в Университете г.Билефельд (Германия). Основные результаты работы получены автором лично и в сооавторстве с проф. Г.П.Пинаевым и сотрудниками Института цитологии РАН - Т.Д.Смирновой, В.В. Матвеевым, К.К. Туроверовым, И. М. Кузнецовой, А. М. Морозовой и О. А. Антроповой, с A.M. Усмановой (Казанский университет), с сотрудниками лаборатории проф. Х.Стржелецкой-Голашевской (Варшава, Польша) и с проф. Х.Хинссеном (.Билефельд, Германия) Определение N-концевых аминокислотных последовательностей протеазы ЕСР32 и фрагментов молекулы актина проведено в лаборатории проф. Д.Коллинза (Университет штата Мэриленд, Балтимор, США). Масс-спектрометрический анализ фрагментов актина, расщепленного протеазой ЕСР32, выполнен д.б.н. O.A.Миргородской (Институт цитологии РАН) совместно с доктором В.Тиде в Центре молекулярной медицины Макса Дельбрюка (Берлин-Бух, Германия).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II, III, IV, V, VI, VII и VIII Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышц (Ереван, 1971; Тбилиси, 1974; Киев, 1977; Львов, 1980; Тбилиси, 1983; Пущино, 1987; Тбилиси, 1990), на Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1972; Телави, 1985), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на I, II, IV и V Всесоюзных школах по биологической подвижности (Ленинград, 1976; Репино, 1979; Лосево, 1985, 1989), на XVI Конгрессе FEBS (Москва, 1984), на международной конференции «Механизмы адаптации мышц» (Сегед, Венгрия, 1986), на международной конференции «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989), на XX, )0(lll, XXIV и XXV Европейских мышечных конгрессах (Оксфорд, Англия, 1991; Бохум, Германия, 1994; Флоренция, Италия, 1995; Монпелье, Франция, 1996); на международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 1994), на конференции «Молекулярные взаимодействия актина» (Гавайи, США, 1997).

Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме научного доклада на 40'страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 12 рисунков. Материалы диссертации отражены в 34 статьях в отечественных и международных журналах, в том числе в четырех обзорах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Полимеризация актина из разных сократительных систем.

Актин - это глобулярный белок с молекулярной массой 42 «Да, состоящий из 375 или 374 аминокислотных остатков. Сравнение первичной структуры актинов, выделеннных из разных клеток и тканей, показало, что актин является одним из наиболее консервативных из известных белков: аминокислотные последовательности мышечных и немышечных актинов различаются менее чем на 10%; гладкомышечный актин отличается от скелетномышечного только 6 аминокислотными заменами (Elzinga et al., 1973; Vandekerkhove and Weber, 1978, 1979). Наиболее вариабельна N-концевая часть полипептидной цепи актина (табл. 1). Вариации в N-концевой последовательности приводят к различиям в заряде молекулы, что позволило разделить изоформы актина с помощью изоэлектрического фокусирования (Garrels and Gibson, 1976; Whalen and Butler-Brown, 1976).

Таблица 1. N-концевые последовательности аминокислот в изоформах актина

Ткань Изоформа Последовательность

Скелетные мышцы а D-E-D-E-T-T-A-L-V-C-D-N-G-S-G-L-V-K-

Сердечная мышца а D-D-E-E-T-T-A-L-V-C-D-N-G-S-G-L-V-K-

Гладкие мышцы а E-E-E-D-S-T-A-L-V-C-D-N-G-S-G-L-C-K-

Гладкие мышцы т E-E-E-T-T-A-L-V-C-D-N-G-S-G- L-C-K-

Цитоскелет 3 D-D-D-l-A-A-L-V-V-D-N-G-S-G-M-C-K-

Цитоскелет У E-E-E-l-A-A- L-V- I-D-N-G-S-G-M-C-K-

Так как электростатические взаимодействия играют роль и при ассоциации мономеров актина в полимер, и при взаимодействии актина с миозином, различия в заряде изоактинов могут влиять на их функциональные свойства. Распределение других аминокислотных замен в первичной структуре актина выглядит более случайным, но и они могут оказаться существенными, поскольку, как было установлено в ходе нашей работы и в ряде других работ и будет подробно обсуждаться ниже, даже точечные изменения в структуре актина могут принципиально изменить его свойства. Однако до недавнего времени актин считался пассивным элементом сократительной системы, а различия в первичной структуре рассматривались как следствие эволюционного процесса, не имеющее отношения к функции. Поэтому первым этапом работы,

направленной на выявление различий в функциональных свойствах разных актинов, было сравнение их полимеризуемости. Исследовались две модельные системы - актины, выделенные из скелетных мышц кролика на разных стадиях формирования сократительного аппарата, и актин из запирательной мышцы двустворчатого моллюска, приморского гребешка Patinopecten jessoensis, который является аналогом клеточного ß-актина

1.1. Изменение степени полимеризации актина в процессе формирования сократительного аппарата

Известно, что эмбриональная скелетная мускулатура отличается по своим функциональным свойствам от мускулатуры взрослого животного. Формирование зрелого сократительного аппарата сопровождается заменой тонического сокращения, характерного для мышечной ткани ранних сроков развития, на тетаническое сокращение. Этот процесс включает ряд изменений, связанных с иннервацией мышечных волокон, развитием специализированных клеточных систем и формированием специфической ультраструктуры волокна. Кроме того, увеличивается сократительная способность мышечных волокон, возрастает активируемая актином АТФазная активность миозина, обнаруживаются изменения гидродинамических параметров растворов актомиозина, характеризующих размеры и форму актомиозиновых комплексов (Иванов и др., 1961; Пинаев, 1965). Эти данные привели нас к изучению физико-химических свойств актинов, выделенных на разных стадиях развития скелетных мышц (Пинаев, Хайтлина, 1971, 1972), задолго до того, как были обнаружены изоформы актина (Garrels and Gibson, 1976; Rubenstein and Spudich, 1977) и было показано, что слияние миобластов в миотубы приводит к координированной смене набора сократительных белков (Holtzer, 1973) , в том числе к ингибированию синтеза клеточных ß- и у-изоформ актина и активированию синтеза скелетномышечного а-актина (Whalen and Butler-Brown, 1976; Storti and Rich, 1976).

Наши исследования (Хайтлина, Пинаев, 1976, а,б,в) показали, что актин из мышц новорожденного кролика отличается от актина, выделенного из мышц взрослого животного, по характеристической вязкости растворов и величине угла ориентации в потоке. Актин из мышц десятидневного кролика занимает промежуточное положение (рис.1).

т-1-1-1--1-i-Г

0,0 ,2 ,4 ,6 ,8 1,0 1,2 1,4

Градиент скорости, сек-1

1,6

Рис. 1. Изменение угла ориентации в потоке для растворов F-актина из мышц взрослого (1), 10-дневного(2) и новорожденного (3) кроликов. Актин (0.1 мг/мл) полимеризовали 0.1 М KCl.

Различия между препаратами сохранялись после дополнительной обработки их трипсином, к которому F-актин более устойчив, чем другие белки миофибрилл. Кроме того, оказалось, что белки неполимеризующейся фракции препаратов актина, полученных из мышц кроликов на всех стадиях развития (инакти-вированный актин и минорные белки миофибрилл) практически не влияли на степень полимеризации актина взрослого кролика.

Эти результаты явились первым свидетельством различий в степени полимеризации актинов из разных сократительных систем. Мы предположили, что обнаруженные различия отражают увеличение способности актина к полимеризации, связанное с изменением в его структуре. Упоминавшиеся выше данные о существовании изоформ актина подтвердили это предположение.

1.2. Полимеризация р-подобного актина из запирательной мышцы приморского гребешка Patlnopecten Jessoensis

Актин из аддуктора гребешка является (5-подобной изоформой актина (Margulis and Galaktionov, 1982), которая отличается от а-

актина кролика 21, а от клеточного р-актина - 7 аминокислотными заменами (табл. 2). В ходе настоящего исследования был разработан простой метод выделения и очистки актина гребешка, позволяющий получить достаточное для биохимических исследований количество гомогенного белка (КИаКПпа, 1986).

Таблица 2. Аминокислотные замены в ß-подобном актине из аддуктора гребешка по сравнению с а-актином скелетных мышц кролика и клеточным ß-актином (Vandekerkhove and Weber, 1984)

Аминокислотный а-актин ß-подобный ß-актин

остаток скелетных мышц актин из аддуктора гребешка немышечный

1 Asp

2 Glu Asp Asp

3 Asp

4 Glu Asp Asp

5 Thr Val Ile*

6 Thr Ala Ala

10 Cys Val Val

16 Leu Met Met

17 Val Cys Cys

76 Ile Val Val

103 Thr Val Val

129 Val Ala Thr*

159 Leu Met*

162 Asn Thr Thr

176 Met Leu Leu

201 Val Thr Thr

225 Asn Gln*

260 Thr Ser Ala*

267 Ile Leu Leu

272 Ala Cys*

279 Туг Phe*

287 Ile Val Val

297 Asn Thr Thr

299 Met Leu Leu

358 Thr Ser Ser

365 Ala Ser Ser

*Аминокислотные замены, которые отличают р-подобный актин из аддуктора гребешка от клеточного р-актина.

Кинетика полимеризации актинов гребешка (р-подобный актин) и кролика (а-актин) прослеживалась с помощью измерений вязкости

и светорассеяния растворов. Как показано на рис. 2, и кинетика полимеризации сравниваемых актинов и то, в какой мере они отличаются друг от друга, зависит от условий в растворе. Скорость полимеризации Са-актина гребешка существенно ниже, чем скорость полимеризации Са-актина кролика. Эти различия исчезают при замещении прочно связанного Са2+ на Мд2+, свидетельствуя о том, что в оптимальных условиях полимеризации актины гребешка й кролика сходны и различия в Са-актинах не связаны с инактивацией актина гребешка или присутствием примесей. Степень полимеризации обоих изоактинов в этих условиях одинакова (КИаКИпа е\ а1., 1996; 1997). Однако при понижении концентрации полимеризующей соли до 20 мМ КС1 или при понижении температуры степень полимеризации актина гребешка ниже, чем степень полимеризации актина кролика (рис.3, А-С; МаМпа, 1986).'

0)

10 20 Время (мин)

зо

12ч

Рис. 2. Кинетика полимеризации (З-подобного актина гребешка (1,3,5) и а-актина скелетных мышц кролика (2,4,6). 1,2 - Са-актины; 3,4 -Мд-актины; 5,6 - Мд-актины, расщепленные протеазой ЕСР32. Концентрация актина — 0.5 мг7мл. Интенсивность светорассеяния измеряли' при 334 нм.

Различия в полимеризуе-мости актинов гребешка и кролика проявляются еще сильнее при расщеплении пептидной связи между в1у42 и \/а!43, что, как будет показано ниже,

препятствует образованию стабильных полимеров актина. Рис.3,й демонстрирует зависимость степени полимеризации актинов гребешка и кролика от концентрации актина. Видно, что критическая концентрация полимеризации актина гребешка (точка пересечения

кривых с абсциссой) сильнее зависит от температуры и ионной силы раствора, чем критическая концентрация полимеризации актина кролика. При этом прямое дестабилизирующее воздействие на полипептидную цепь актина (протеолитическое расщепление) вызывает такой же эффект, как снижение ионной силы и температуры. Оказалось также, что деполимеризация аюгина гребешка в присутствии ДНКазы I происходит быстрее, чем

Концентрация актина (иМ)

Рис.3. Критическая концентрация полимеризации актина гребешка и актина скелетных мышц кролика, определенная в следующих условиях: А - Са-актин, 0.1 М KCl, 20°С; В - Са-актин, 0.1 М KCl, 4°С; С - Са-актин, 0.02 М KCl, 4°С; • - актина гребешка; о - актин кролика D - Mg-актин, расщепленный, протеазой ЕСР32, 0.1 М KCl, 20°С; о,» -актин кролика; ЦВ - актин гребешка (два эксперимента)

Таким образом, в условиях, оптимальных для полимеризации, р-подобный актин гребешка и а-актин кролика сходны. Однако в условиях, не способствующих формированию стабильных полимеров (низкая температура, низкая концентрация полимеризующей соли, присутствие Са2+ в качестве прочно связанного катиона, расщепление полипептидной цепи), полимеризуемость р-подобного актина нарушается легче. Эти

данные указывают на то, что полимеры а-актина более стабильны, чем полимеры, образованные ß-актином.

Аналогичная зависимость критической концентрации полимеризации разных изоактинов от температуры была ранее обнаружена при изучении немышечных актинов (Gordon et al., 1976, 1977) и актина гладкой мускулатуры (Prochniewicz and Yanagida, 1981; Strzelecka-Golaszewska et al., 1985). Рассчитанные в этих работах термодинамические параметры показали, что связи между субъединицами в полимерах ß- и у-актинов, по-видимому, слабее, чем в полимере а-актина. Для того, чтобы выяснить, какие изменения в структуре актина могут ослаблять взаимодействие между мономерами, мы модифицировали молекулу а-актина кролика с помощью ограниченного протеоализа. Результатом этих исследований посвящена следующая глава доклада.

Глава 2. Роль субдомена 2 в поддержании стабильной структуры полимера актина

Трехмерная структура актина, полученная на основании данных о дифракции рентгеновских лучей в кристаллах актина скелетных мышц с ДНКазой I (Kabsch et al., 1990), изображена на рис. 4. Аналогичные данные получены при исследовании а-актина в комплексе с сегментом гельзолина (McLaughlin et al., 1993) и ß-актина в комплексе с профилином (Schutt et al., 1995; 1996). Молекула отчетливо разделена на два домена примерно одинакового размера; в щели между доменами расположены прочно связанные дивалентный катион (обычно Са2+ ) и нуклеотид (в G-актине обычно АТФ, в F- актине - АДФ). Домены соединены между собой только двумя участками полипептидной цепи в основании мономера, которые позволяют доменам двигаться друг относительно друга (Lorenz et al., 1993; Tiriot et al., 1993). Эта часть молекулы рассматривается как молекулярный шарнир. Каждый из доменов молекулы разделен на два субдомена. Таким образом, молекула актина состоит из 4 субдоменов: субдомен 1 -аминокислотные остатки 1-32, 70-144 и 338-372; субдомен 2 -остатки 33-69; субдомен 3 - остатки 145-180 и 220-237, субдомен 4 -остатки 181-269.

Согласно модели актиновой нити (Holmes et al., 1990), каждый мономер актина контактирует с 4 соседними мономерами в спиральной нити, которую можно описать как двойную правую спираль с длинным шагом и как левую генетическую спираль. Контакты вдоль двойной спирали являются основными. Это -

Рис.4. Трехмерная структура актина (КаЬзс11 е1 а1., 1990). Большие кружки обозначают аминокислотные остатки, которые в а-актине скелетных мышц и в р-подобном актине гребешка различны. Маленькими кружками обозначены аминокислотные остатки, образующие актин-актиновые контакты в полимере.

контакты остатков 322-325 с. остатками 243-245; остатков 286-289 - с остатками 202-204; остатков 166-169 и 375- с 41-45 (рис. 4). Контакты вдоль закрученной влево генетической спирали создаются остатками 110-1.12 и 195-197. Кроме того, петля, содержащая остатки 266-269 одного тяжа, по-видимому, встраивается в гидрофобную область, образованную остатками 166,169,171, 173,285, 289, 63-64 и 40-45 другого тяжа.

Согласно другим представлениям о структуре актиновой нити (Schutt et al., 1995), основными являются контакты между субдоменом 2 одного мономера и С-концом другого мономера.

Модификации аминокислотных остатков в каждом из предполагаемых сайтов акгин-актинового взаимодействия могут влиять, на эффективность этих контактов, т.е. на стабильность полимера. В частности, полимеризация актина ингибируется в результате химических модификаций ряда аминокислотных остатков (Muhlrfd et al., 1969; Lehrer and Elzinga,1972; Hegyi et. al., 1974; Bender et al., 1976) или их замены путем направленного мутагенеза (Chen and Rubenstein, 1995; Ruang and Rubenstein, 1997). Однако такие модификации могут изменять характер связей, поддерживающих структуру мономера. По-видимому, более мягким способом изучения роли отдельных участков полипептидной цепи в функциях актина является селективное расщепление пептидных связей с помощью ограниченного протеолиза. Успешность такого подхода существенно зависит от специфичности используемой протеазы и близости места расщепления к функционально активным сайтам. В ходе настоящего исследования была открыта

новая протеаза, которая расщепляет в актине одну полипептидную связь, между Gly42 и Val43, т.е. в сайте, который, как предполагается, непосредственно вовлечен в контакт между мономерами. Ниже будут описаны свойства протеазы и расщепленного ею актина.

2.1. Протеаза ЕСР32: характеристика фермента

Протеаза ЕСР32 является продуктом нового штамма бактерий Escherichia со// А2 (Хайтлина и др., 1988), спонтанно обнаруженного на биостанции "Восток" Института биологии моря ДВНЦ РАН. Фермент синтезируется на стационарной стадии роста бактериальной культуры и не секретируется.

Протеаза представляет собой белок с молекулярной массой 32 кДа, состоящий из одной полипептидной цепи. N-концевая последовательность протеазы была определена как A-K-T-S-S-A-G-V-V-I-R-D-I-F-L. Оптимум протеолитической активности протеазы при использовании в качестве субстрата актина и мелиттина находился в области рН 6-8. Активность протеазы ингибируется о-фенантролином, ЭДТА, ЭГТА и цинконом. Активность фермента, инактивированного с помощью ЭДТА, восстанавливалась ионами кобальта, никеля и цинка. На основании этих данных протеаза ЕСР32 была классифицирована как нейтральная металлопротеиназа (ЕС 3.4.24). Специфика ингибирования протеазы и аналогия с другими металл-содержащими протеазами позволили нам предположить, что ЕСР32 содержит в активном центре ион цинка. По молекулярной массе, N-концевой последовательности и ферментативным свойствам протеаза ЕСР32 отличается от всех известных бактериальных протеаз. Поэтому мы заключили, что это - новый фермент (Усманова и Хайтлина, 1989; Matveyev, Usmanova, Morozova, Collins and Khaitlina, 1996).

Активность протеазы ECP32 увеличивается при возрастании ионной силы раствора. Примерно двукратное увеличение активности наблюдалось в 50 мМ NaCI; при дальнейшем повышении концентрации соли активность протеазы не изменялась. Кроме того, активность протеазы ЕСР32 увеличивалась в присутствии 0.7-1.0 мМ АТФ, достигая максимума при 8 мМ АТФ. Однако присутствие АТФ не обязательно для протеолиза, и гидролиз мелиттина, который был субстратом протеазы в этих экспериментах, не сопровождался гидролизом АТФ. Эти результаты свидетельствуют о том, что ЕСР32 не является АТФ-зависимым ферментом, но может рассматриваться как АТФ-стимулируемый фермент (Казанина, О.Миргородская, Е Миргородская и Хайтлина,

1995; Mirgorodskaya, О, Kazanina, E. Mirgorodskaya, Matveyev, Thiede and Khaitlina, 1996).

Протеолиз актина протеазой ECP32 между Gly42 и Val43 является ограниченным в широком диапозоне концентраций фермента (от 1:25 до 1:3000), при этом образуются фрагменты с молекулярной массой 36 кДа и 5 кДа. При более высокой концентрации фермента наблюдалось образование фрагмента с молекулярной массой порядка 32-33 кДа. При протеолизе инактивированного актина образуются два дополнительных фрагмента с молекулярными массами 39 и 40 кДа. N-концевая аминокислотная последовательность этих фрагментов соответствует расщеплению пептидных связей между Ala29 и Val30 и Ser33 и Ие34, соответственно (Khaitlina et al,, 1991, Matveyev, Usmanova, Morozova, Collins and Khaitlina, 1996).

Кроме актина, протеаза ECP32 расщепляет мелиттин, гистоны (в том числе гистоноподобный белок бактерий HU) и белок теплового шока бактерий DnaK. Протеолиз мелиттина и DnaK ограничен. Однако ни белок теплового шока эукариот HSP70, обладающий сходной с актином третичной структурой АТФ-связывающего домена, ни многие другие белки (альбумин, лизоцим, РНКаза, ДНКаза I,. миозин, а-актинин, тропомиозин, тропонин, винкулин, тубулин, гельзолин, профилин, инсулин, проинсулин и др,) протеазой ЕСР32 не расщепляются (Усманова и Хайтлина, 1989; Matveyev et al., 1996).

Таблица 3. Сайты, расщепляемые протеазой ЕСР32, в актине и

мелиттине

Субстрат Расщепляемый сайт

Актин Инактивированный актин Инактивированный актин Мелиттин Мелиттин His-Ala-Gly-Val-Met-Val Pro-Arg-Ala-Val-Phe-Pro Phe-Pro-Ser- Ile-Val-Gly Leu-Pro-Ala- Leu-Ile-Met Pro-Ala-Leu- lle-Met-Trp

Анализ аминокислотных остатков в сайтах, расщепляемых протеазой, в актине и мелиттине (табл. 3) показывает, что все остатки, которые входят в расщепляемую связь гидроксильной

группой, содержат гидрофобные боковые цепи. Подобная специфичность характерна для термолизина (Antonov, 1993). Аминогруппа расщепляемых ЕСР32 связей принадлежит небольшим нейтральным или гидрофобным аминокислотным остаткам, что характерно для ферментов с низкой первичной специфичностью. По-видимому, для протеазы ЕСР32 конформация субстрата более существенна, чем его первичная структура.

Активность протеазы ЕСР32 не обнаружена в референтном штамме E.coli ССМ 5172 (коллекция микроорганизмов Института ветеринарной медицины г. Брно, Чехия) и в штаммах С600 и НВ101 линии К12 . Оказалось, однако, что сходной активностью обладает экстракт из клеток ревертантного штамма L-формы Shigella flexneri, полученной с помощью фуразолидона (Федорова и Хайтлина, 1989).

Поскольку прокариоты не содержат актин, физиологическая функция протеазы ЕСР32 остается не ясной. Чувствительность к протеазе белка теплового шока бактерий и гистоноподобного белка бактерий HU позволяет предположить участие протеазы в регуляции белкового обмена. Однако обнаружение протеазы в бактериях Shigella flexneri, способных проникать в эукариотическую клетку, делает привлекательным другое предположение, а именно участие протеазы ЕСР32 во взаимодействии вирулентных бактерий с клеткой-хозяином, в основе которого лежат перестройки актинового цитоскелета (Tilney etal., 1990; 1992).

2.2. Свойства актина, расщепленного протеазой ЕСР32

При расщеплении актина протеазой ЕСР32 образуется два фрагмента, подвижность которых в полиакриламидном геле в присутствии SDS соответствует 36 кДа и 8 кДа (рис. 5). N-концевая последовательность большого фрагмента была определена как Val-Met-Val-Gly-Met, что в известной аминокислотной последовательности актина (Elzinga et al., 1973) соответствует расщеплению связи между Gly42 и Val43 в ДНКазной петле субдомена 2 (см. рис. 4). Целостность С-концевой части большого фрагмента была проверена с помощью специфического мечения предпоследнего амино-кислотного остатка, Cys374, флуоресцентным красителем IAEDANS. После обработки актина протеазой флуоресцентная метка сохранялась во фрагменте с молекулярной массой 36 кДа (Khaitlina etal., 1989; 1991).

Молекулярная масса меньшего (N-концевого) фрагмента была определена с помощью масс-спектрометрии. Она оказалась равной 4372 Да, что хорошо соответствовало расчетной молекулярной

массе фрагмента полипептидной цепи актина, содержащего остатки 1-42 (4369 Да). Таким образом, в молекуле актина протеазой ЕСР32 расщепляется только одна пептидная связь. г Дальнейшая деградация образовавшихся фрагментов не наблюдалась.

Объем, мл

Рис. 5. Гельфильтрация актина, расщепленного протеазой ЕСР32. А -профиль элюции расщепленного актина в Са-форме (в), в Мд-форме (О); в присутствии 1 мМ ЭДТА (Д). В - электрофореграмма соответствующих пиков (а-с). На дорожках йие - исходный препарат расщепленного актина, обработанный 5- иодо-(ацетамид)флуорес-цеином и окрашенный Кумасси, соответственно.

. Как показала гельхроматография расщепленного актина, фрагменты остаются ассоциированными между собой до тех пор, пока актин содержит прочно связанный катион, Са2+ или Мд2+. Обработка расщепленного актина ЭДТА приводит к диссоциации фрагментов, которая сопровождается агрегацией С-концевого (большого) фрагмента (рис. 5).

Положение спектра собственной флуоресценции актина, которое использовалось в нашей работе как мера нативности препаратов актина, после расщепления актина протеазой ЕСР32 не изменялось, что свидетельствовало о сохранении нативной структуры мономера. Тем не менее, расщепленный актин полностью терял способность к полимеризации, индуцированной

КС1, и не был способен удлинять нерасщепленный Я-актин, добавленный в качестве зародышей полимеризации (рис. 6, А).

150

120

s

S

J £ О tf

и ®

а

о >

s. $

j

Ь U О X в

X

о

X в (X S

150-

120

Рис. 6. Полимеризация актина, расщепленного проте-азой ЕСР32. А - ЕСР-Са-актин (1мг/мл,6% Pyrenyl-актина).Полимеризацию индуцировали 0.1 М KCl (□), 0.1 М KCI+0.1 мг/мл ин-тактного F-актина (■), 2 мМ CaCI2 (О), 2 мМ MgCI2 (©), 0.1 М KCl/ 2 мМ MgCI2 (V), 2мМ MgCI2 после инкубации в 0.1 М KCl (Л). В - Мд-актин (1 мг/мл, 10%Pyrenyl-актина).Полимеризацию индуцировали 0.1 М KCl (1) и 2мМ MgCI2 (2). Интенсивность флуоресценции измеряли при 407 нм после возбуждения при 365 нм.

Время, мин

Пептидная связь, которую ЕСР32 расщепляет в актине, не расщепляется другими протеазами. Однако многие другие протеазы расщепляют полипептидную цепь актина в пределах той же ДНКазной петли (Mornet and Ue, 1984). Оказалось, что, хотя сайты расщепления актина субтилизином (Met47-Gly48) и химотрипсином (Met44-Val45) удалены от сайта расщепления протеазой ЕСР32 (Gly42-Val43) всего на несколько аминокислотных остатков, расщепление субтилизином и химотрипсином ухудшает полимеризуемость актина лишь частично, но не ингибирует ее полностью. Поэтому протеаза ЕСР32 оказалась уникальным

инструментом для выявления конформационных изменений в одном из наиболее функционально важных сайтов в молекуле актина (Strzelecka-Golaszewska et al., 1993; 1995), а расщепленный протеазой актин стал удобной моделью для изучения механизмов полимеризации актина (Khaitlina et al., 1993; 1996; 1997; Wawro, Khaitlina, Pliszka and Strzelecka-Golaszewska, 1996; Khaitlina and Hinssen, 1997).

2.3 Восстановление полимеризуемости актина, расщепленного протеазой ЕСР32, после замещения прочно связанного Са2+ на Мд2+

Известно, что полимеризация актина ускоряется в присутствии MgCI2l - который способствует стабилизации зародышей полимеризации (Seiden et al., 1983). Поэтому MgCI2 был первым фактором; который мы использовали в попытке восстановить полимеризуемость актина, расщепленного протеазой ЕСР32 (Khaitlina et'al., 1993). Добавление 2 мМ MgCI2 вместе или после 0.1 М KCl вызывало увеличение флуоресценции расщепленного Pyrenyl-актина и вязкости его растворов, что указывало на появление полимеров актина в этих условиях (рис. 6, А).

Будучи добавленным в милимолярных концентрациях, MgCI2 частично замещает Са2+ в сайте с высокой аффинностью, а также связывается с многочисленными низкоаффинными сайтами. Чтобы сделать эффект MgCI2 более определенным, прочно связанный Са2+ был замещен на Мд2+ в присутствии ЭГТА. Оказалось, что полученный таким образом расщепленный Мд-актин начинает полимеризоваться немедленно после добавления KCl (рис. 6, В). Полимеризация расщепленного актина в этих условиях была подтверждена осаждением актина и электронно-микроскопическими наблюдениями. Эти данные свидетельствуют о том, что для полимеризации актина, расщепленного между Gly42 и Val43, необходимо замещение прочно связанного Са2+ на Мд2+'.

Однако восстановление полимеризуемости в Мд-актине является лишь частичным. Критическая концентарция полимеризации актина, расщепленного протеазой ЕСР32, в три раза выше, чем таковая для актина, расщепленного субтилизином, и в 36 раз выше критической концентрации полимеризации интактного актина (табл. 4). Кроме того, при осаждении расщепленного Mg-актина в ультрацентрифуге значительная часть белка (около 70%) остается в супернатанте (рис. 7). Различие между ожидаемой концентрацией G-актина и количеством белка в супернатанте указывает на то, что полимеры, образованные

расщепленным актином, легко разрушаются гидродинамическими силами. Чтобы проверить это предположение, расщепленный актин был заполимеризован в присутствии фаллоидина, который, как известно (Cooper, 1987), стабилизирует нити F-актина. Как показано на рис. 7, в присутствии фаллоидина вязкость растворов расщепленного актина увеличивалась в 4 раза, а количество осаждаемого в ультрацентрифуге белка достигало уровня 85-95%, что сходно с количеством осаждаемого в этих условиях интактного F-актина (Khaitlina et at., 1993). Обработка фаллоидином приводит также к образованию полимеров расщепленного Са-актина (Orlova and Egelman, 1995). Эти данные позволяют заключить, что расщепление связи между Gly42 и Val43 препятствует образованию стабильных контактов между мономерами.

Таблица 4. Влияние протеолитического расщепления на критическую концентрацию полимеризации Са- и Мд- актинов

Критическая

Актин [KCI],M концентрация (цМ) Ссз/Смд Ссылка

Мд-актин Са-актин

0.1 0.05 0.3 6 Seiden, Gershman

Интактный 0.05 0.05-0.1 0.5-0,9 9-10 et al„ 1986,1989

актин 0.1 0.075 эта работа

0.1 0.5 Schwyter et al.,198S

Актин 0.1 5.0 Schwyter et

расщепл. al.,1989

субтилизином 0.1 1.0 5 эта работа

Актин,

расщепл. ЕСР 0.1 2.7 >76 >28 эта работа

Для того, чтобы выяснить, к каким нарушениям в структуре полимера приводит расщепление связи С1у42-\/а143, было использовано несколько подходов. Сравнение спектров флуоресценции Ругепу1-актина показало, что в спектре возбуждения расщепленного актина отсутствует пик при 365 нм, который в интактном Р-актине возникает в результате взаимодействия пирениловой метки, ковалентно связанной с Суэ374, с аминокислотными остатками соседнего мономера. Обработка расщепленного актина бифункциональным сульфгидрильным реагентом Ы,1\1-фенилен-бис-малеимидом не приводила к образованию сшивки между Суэ374 и 1уэ191 соседнего мономера, образующейся в интактном Р-актине (КИаКПпа а1., 1993). Кроме того, трехмерная реконструкция нитей расщепленного актина выявила существование моста плотности между С-концом одного

мономера и субдоменом 4 другого мономера (Orlova and Egelman, 1995)., Таким образом, расщепление полипептидной цепи между Gly42 и Val43 приводит к структурным перестройкам в полимере актина, затрагивающим С-конец молекулы.

4G

Время, мин

Рис. 7. Стабилизация полимеров актина, расщепленного протеазой ЕСР32, в присутствии фаллоидина. А - количество актина, осаждаемого ультрацентрифугированием: а - Са-актин; b - Mg-актин; с - Мд-актин/ фаллоидин, 1:5 (м/м). В -изменение вязкости растворов интактного (и) и расщепленного (ö,ö) Са-актинов в присутствии фаллоидина при полимеризации 0.1 М KCl (Q) и 2 mM MgCI2 (О). Стрелками показано время добавления фаллоидина.

Согласно атомной модели актиновой нити (Holmes et al., 1990), сегмент полипептидной цепи, включающий остатки 42 и 43, образует контакт с С-концом другого мономера вдоль тяжа двойной спирали и, кроме того, участвует в предполагаемом гидрофобном взаимодействии между тяжами (вдоль генетической спирали), стабилизирующем нить. Наблюдаемые изменения в структуре расщепленного F-актина могут возникать в полимере из-за нарушения этих контактов. С другой стороны, возможно, что расщепление. ДНКазной петли приводит к конформационным изменениям в удаленных частях мономера, и, в частности, на С-конце молекулы, который также играет существенную роль в стабилизации полимера (O'Donoghue et al., 1992; Mossakowska et al., 1993). Для проверки этого предположения мы сравнили положение С-конца в расщепленном и интактном G-актинах с помощью измерения эффективности переноса энергии с триптофановых остатков на AEDANS-Cys374.

2.4. Конформационные изменения в субдомене 1 молекулы

актина, вызванные расщеплением в ДНКазной петле.

Аллостерическая регуляция структуры мономера.

Для того, чтобы выяснить, происходят ли структурные перестройки на С-конце молекулы актина при расщеплении ДНКазной петли,/ регистрировали изменения собственной флуоресценции актина и флуоресценции связанного с Cys374 зонда (AEDANS), вызванные влиянием этих флуорофоров друг на друга. Так как спектр поглощения AEDANS перекрывается со спектром флуоресценции триптофановых остатков, между ними происходит безизлучательный перенос энергии, в котором триптофан является донором, а AEDANS - акцептором. При этом интенсивность триптофановой флуоресценции уменьшается и появляется сенсибилизированная флуоресценция акцептора. Эффективность этих изменений зависит от расстояния между донором и акцептором и от того, -влияет ли . акцептор на конформацию белка в микроокружении донора.

Определенная по уменьшению интенсивности флуоресценции донора эффективность переноса энергии в интактном- актине и в актинах, расщепленных ЕСР32 и субтилизином, оказалась равной

0.90, 0.78 и 0.80, соответственно. При определении по сенсибилизированной флуоресценции AEDANS эффективность переноса энергии была 0.17, 0.24, и 0.24 для интактного актина, актина, расщепленного ЕСР32, и актина, расщепленного субтилизином, соответственно (Kuznetsova, Antropova, Turoverov, Khaitlina, 1996). Эти различия соответствуют изменению расстояния между донором и акцептором с 28.7 до 26.7 А.. Существенно также что связывание AEDANS вызывает изменения в микроокружении триптофана, и в расщепленном актине этот эффект ослабляется.

Анализ структурных и флуоресцентных данных указывает на то, что собственная флуоресценция актина определяется двумя из четырех остатков триптофана, Тгр340 и Тгр356 (Kuznetsova et al., 1997). Таким образом, расщепление полипептидной цепи в верхней части субдомена 2, вызывая структурные перестройки в субдомене

1, изменяет положение Тгр340/Тгр356 и Cys374 друг относительно друга. Эти данные являются еще одним свидетельством конформационной связи разных частей молекулы актина. Известно, в частности, что изменения в ДНКазной петле влияют на конформацию щели между доменами (Strzeleck.a-Golaszewska et al., 1993) и, напротив, изменения в щели передаются в ДНКазную петлю, на С-конец молекулы (Frieden et al., 1980; Strzelecka-Golaszewska et al., 1993) и на сегмент 18-29 (Mejean et al., 1993;

Adams and Reisler, 1994). Показана также связь ДНКазной петли с субдоменом 1 (Crossbie et al., 1994). Таким образом, мономер актина является белком с высоким потенциалом для аллостерической регуляции. Поэтому модификации в субдомене 2, интенсивно участвующем в контакте между субъединицами актина в полимере, могут ингибировать полимеризацию не только непосредственно, но и аллостерически. С другой стороны, модификации в субдомене 1 и в других участках мономера могут передаваться в субдомен 2, модулируя эффективность полимеризации и стабильность полимеров. Как будет показано в следующих разделах работы, именно такой механизм может использоваться при сборке ß- и у-актиновых филаментов и при взаимодействии актина с актин-связывающими белками.

Глава 3. Структурные различия между изоформами актина

Определение трехмерной структуры актина и успешный анализ конформационных изменений в мономере и полимере актина в ответ на действие различных факторов, способствующих полимеризации (Strzelecka-Golaszewska et а!., 1993; Crossbie et al., 1994; Muhlrad et al., 1994; Orlova and Egelman, 1992; 1993; 1995; 1997), позволили распространить эти подходы на клеточные изоформы актина для того, чтобы выяснить, каким образом различия в первичной структуре изоактинов могут приводить к изменению их функциональных свойств.

В качестве объекта исследования в этой части работы был снова использован ß-подобный актин гребешка, который, как было показано, отличается от а-актина кролика меньшей стабильностью полимеров. В трехмерной структуре актина аминокислотные замены, отличающие актин гребешка от актина кролика, расположены в основном в субдоменах 1 и 3, причем существенная часть замен сосредоточена в субдомене 1 (рис. 4). На рис. 4 видно, что только две из аминокислотных замен, lle267Leu и lle287Val, совпадают с сайтами актин-актиновых контактов. Эта ситуация отличает ß-подобный актин гребешка от клеточного ß-актина и от актина дрожжей, в которых аминокислотные замены затрагивают функционально активные сайты мономера, что делает изучение конформации актина гребешка особенно интересным.

3.1.Сравнение конформации G-Са-актинов гребешка и кролика

Как уже отмечалось выше, многие протеолитические ферменты расщепляют актин ограниченно (Jacobson and Rosenbusch, 1976; Schwyter et al., 1989; Konno, 1989). Поэтому ограниченный протеолиз является широко распространенным подходом для изучения конформационных изменений в актине (Hue et al., 1988; Holzer, 1988; Strzelecka-Golaszewska et al., 1993; Crossbie et al., 1994 и др.). Для сравнения актинов гребешка и кролика мы использовали ограниченный протеолиз актина трипсином между Lys68 и Туг69, который приводит к образованию фрагмента с молекулярной массой 33 кДа (Jacobson and Rosenbusch, 1976), субтилизином, расщепляющим актин между Met47 и Gly48 с образованием фрагмента с молекулярной массой 35 кДа , и протеазой ЕСР32.

В соответствии с тем, что в субдомене 2 актина гребешка аминокислотные замены отсутствуют, мы не обнаружили различий в скорости расщепления актинов гребешка и кролика субтилизином и протеазой ЕСР32 (Khaitlina et al., 1996).

Картина расщепления этих актинов трипсином оказалась более сложной. Скорость исчезновения актина в результате трипсинолиза была одинаковой; однако фрагмент с молекулярной массой 32 кДа появлялся в переваре актина гребешка раньше, чем в переваре актина кролика. Идентификация этого фрагмента по аминокислотной последовательности его N-конца показала, что он образуется из «обычного» для трипсинолиза фрагмента с молекулярной массой 33 кДа путем отщепления примерно 10 С-концевых аминокислотных остатков, что может происходить при расщеплении пептидной связи между Lys359 и Gln360. По-видимому, в актине гребешка эта связь экспонирована в большей степени, чем в актине кролика, из-за замещений Thr/Ser358 и Ala/Ser365.

Кроме того, аминокислотные замены в субдомене 1 проявляются в небольшой, но воспроизводимой разнице в положении спектров собственной флуоресценции актинов гребешка и кролика, более коротковолновом для актина гребешка (параметр А спектра флуоресценции равен 2.6 и 2.7 для актинов кролика и гребешка соответственно). Эти различия могут быть связаны с заменой Thr/Val 103 вблизи Тгр356, что делает микроокружение этого триптофанового остатка более гидрофобным.

3.2. Сравнение конформации в-Мд-актинов гребешка и кролика

Протеолиз актина трипсином в верхней части щели (сегмент 61-69) происходит значительно медленнее, если актин содержит Мд2+, а не Са2+ в качестве прочно связанного катиона (Б{гге1еска-Со^эгеууэка е1 а1., 1993). Этот эффект наблюдался также в актине гребешка, однако замещение прочно связанного Са2+ на Мд2+ ингибировало трипсинолиз актина гребешка менее эффективно, чем трипсинолиз актина кролика (рис. 8). Интересно, что аналогичное уменьшение эффективности ингибирования наблюдалось при понижении температуры.

Са-асОп Мд-асЬп

ИаЬЬК ЭсаНор ЯаЬЬ« БсаНор

5 10 20 5 10 20 5 10 20 5 10 20 Ш1П

Рис. 8. Протеолиз в-актинов гребешка и кролика трипсином. Са- или Мд-актин (1мг/мл) инкубировали с трипсином при соотношении фермент:субстрат = 1:5 при 0°С. После инкубации в течение указанного времени реакцию останавливали добавлением соевого ингибитора трипсина.

На более поздних стадиях протеолиза трипсином в препаратах актина гребешка появлялись фрагменты с молекулярной массой 20 и 25 кДа , которые в препаратах актина кролика не образуются. Анализ Ы-концевых аминокислотных последовательностей этих фрагментов показал, что они образуются при расщеплении связи между 1уэ118 и МеШ9. Так как образованию любых фрагментов

молекулы актина предшествует расщепление полипептидной цепи в сегменте 61-69, эти наблюдения подтверждают, что сегмент 61-69 в Mg-актине гребешка более доступен для протеолиза, чем в актине кролика.

з.з. Сравнение конформации F-актинов гребешка и кролика

Известно, что F-актин устойчив к протеолизу (Rich and Estes, 1983). Однако если трипсин или субтилизин добавить к актину при высоком соотношении фермент/субстрат, наблюдается протеолиз F-актина с образованием тех же продуктов, которые образуются при протеолизе G-актина, и новых фрагментов (Muhlrad et al., 1994; Vahdat et al., 1995). Продукты протеолиза F-актина субтилизином идентифицированы (Strzelecka-Golaszewska et al., 1996), поэтому мы использовали субтилизин, чтобы сравнить конформацию F-актинов гребешка и кролика. При этом получаются фрагменты с молекулярной массой 35, 33, 30, 25, 21,19 и 16 кДа (рис. 9).

F-актины гребешка и кролика не отличались по скорости появления фрагментов с молекулярной массой 25 и 30 кДа, которые образуются при расщеплении в субдомене 4. Однако препараты актина гребешка и кролика заметно различались по содержаниюфрагментов с молекулярной массой 21 и 19 кДа. Эти фрагменты, по-видимому, образуются в результате расщепления пептидной связи между Thr66 и Leu67. Следовательно, в F-актине гребешка, где этот сайт более доступен для протеолиза, цель между доменами более открыта, чем в актине кролика.

Таким образом, конформация субдомена 2 в ß-подобном G-актине гребешка сходна с конформацией этого субдомена в а-актине. Различия между изоактинами появляются в G-актине при замещении прочно связанного Са2+ на Mg2+ и усиливаются в полимере.

Модель актиновой нити предсказывает, что при полимеризации актина происходит поворот субдоменов 2 и 4 и щель между доменами сужается (Lorentz et al., 1993; Chick et al., 1996). Сужение щели препятствует протеолизу сегмента 61-69, что действительно происходит в F-актине. Сходные изменения наблюдаются при замещении прочно связанного Са2+ на Мд2+ и при добавлении полимеризующей соли, указывая на то, что эти структурные изменения предшествуют включению мономера в полимер, т.е. происходят на стадии активации мономера (Strzelecka-Golaszewska et al., 1996; Khaitlina et al., 1996). Поэтому мы предполагаем, что в актине гребешка поворот субдомена 2 происходит менее эффективно, чем в актине кролика, и эти

различия сохраняются в полимере. Поскольку более открытая конформация щели коррелирует с дестабилизацией полимера (Strzelecka-Golaszewska et al., 1993; Moraczewska et al., 1996; Orlova and Egelman, 1993; Orlova et al., 1997), это и может быть причиной меньшей стабильности полимеров (3-актина.

Рис. 9. Протеолиз F-актинов гребешка и кролика субтили-зином. Ca- или Mg-актин (1мг/ мл), взятый после того, как полимеризация достигла равновесия, инкубировали с субтилизином при соотношении фермент:актин = 1:50 при 20°С. После инкубации в течение указанного времени реак-цию останавливали добавлением 1мМ PMSF.

Глава 4. Рольактин-связывающих белков в регуляции

структурных изменений в актине

Многие актин-связывающие белки способствуют полимеризации актина, стабилизируя зародыши полимеризации. При этом остается неясным, является ли такая стабилизация только результатом сближения мономеров при их взаимодействии с актин-связываюицим белком или же, кроме того, эти белки вызывают и конформационные изменения в молекуле актина, которые делают ассоциацию мономеров более эффективной. Эта проблема представляет особый интерес для понимания механизмов сборки актиновых филаментов в клетке, поскольку эта сборка, по-видимому, всегда инициируется актин-связывающими белками, локализованными в определенном клеточном компартменте.

ca-actin Mg-actin Rabbit Scallop Rabbit Scallop

-90 —67

-__.... — .__-30

"Hff^ "Ч***1*

— — -25

-- -20

' ш* -"ТВ am mm ae* em* m*> m^ *16

30 60 30 60 30 60 30 60 min

Как было показано в предыдущих разделах работы, актин, расщепленный протеазой ЕСР32, не полимеризуется из-за конформационных изменений в ДНКазной петле и на С-концё молекулы. Для того, чтобы восстановить полимеризуемость этого актина, необходимо восстановить его нативную конформацию. Поэтому если какой-то фактор способствует полимеризации расщепленного актина, этот фактор, вероятно, вызывает конформационные изменения в молекуле „актина. С другой стороны, факторы, вызывающие конформационные изменения в ДНКазной петле и(или) на С-конце молекулы актина, вероятно, будут способствовать его полимеризации. Поэтому для выявления конформационных изменений в актине, индуцированных нуклеирующими актин-связывающими белками, мы попытались восстановить с их помощью полимеризуемость расщепленного актина.

Среди актин-связывающих белков, способствующих полимеризации актина, наиболее важными являются, по-видимому, миозин и гельзолин. Именно эти белки и были использованы в экспериментах, описанных ниже.

4.1. Полимеризация актина в присутствии субфрагмента 1 миозина

Известно, что миозин и его фрагменты, тяжелый меромиозин и субфрагмент 1 (S1), могут полимеризовать актин как вфизиологических условиях, так и в растворах с низкой ионной силой (Grazi etal., 1980; Detmers et al., 1981; Miller et al., 1987). Показано также, что в комплексах G-актина с S1 конформация субдомена 2 соответствует конформации субъединиц актина в полимере (Chen et al., 1992; Fievez and Carlier, 1993). Однако в литературе нет однозначных данных о стехиометрии комплексов S1 с актином, что принципиально для интерпретации наблюдаемых конформационных изменений. Поэтому восстановление полимеризации расщепленного Са-актина в присутствии S1, если бы оно происходило, могло бы подтвердить «активирующий» эффект S1 в ходе полимеризации актина.

Рис. 10 иллюстрирует кинетику возрастания светорассеяния раствора актина в присутствии двух изоформ субфрагмента 1 миозина, S1A1 и S1A2, различающихся составом легких цепей (Wawro, Khaitlina et al., 1996). Очевидно, что полимеризация расщепленного актина восстанавливается в присутствии изоформы S1A1, но не в присутствии изоформы S1A2. Однако введение в раствор 50-100 мМ KCI стимулирует полимеризацию актина и в

присутствии изоформы S1A2. Образование в этих условиях полимеров расщепленного актина было подтверждено измерениями флуоресценции Pyrenyl-актина и электронно-микроскопическими наблюдениями. При этом существенно, .что полимеризация происходит не только при стехиометрической, но и при субстехиометрической концентрации S1. Так как расщепленный Са-актин не полимеризуется KCl, эти данные прямо свидетельствуют об индуцированных S1 конформационных перестройках в мономере актина.

Ф 140

£ *-120

« £

5 s 'ioo

£1 в к

5 £ 80 О и

60

X

|о 40

4>

В 20 U

. А S1(A1) (1:1.5)

$1(А2)(1:1) +100 mMKCI

УУ-

S1(A2) (1:1.5)

— ----.----- . —

20

Время,

40 МИН

60

¿140-"•1203-100 X е о о о и а о

б) в и

8060 -40 20

ß S1{A2) (1:100)+ 100 mMKCI

S1(A2) (1:20) + 100 mM KCl

L/

Рис. 10. Полимеризация актина, расщепленного протеазой ЕСР32, в присутствии стехиометрической (А) и субстехиометрической (В) концентрации субфрагмента 1 миозина. А- актин, расщепленный протеазой ЕСР32, (0.5мг/мл); на рисунке указано соотношение между S1A1 или S1A2 и актином (моль/ моль). В -расщепленный протеазой ЕСР32 актин (1мг/ мл)инкубировали 2 ч в присутствии S1A2; стрелка показывает время добавления 0.1М KCl.

40 60 Время, мин

80

100

Первым этапом взаимодействия актина с субфрагментом 1 миозина является образование бинарных комплексов актин/Si с константами диссоциации К^, равными 0.06 - 0.04 цМ и 0.30 - 0.25 цМ для интактного и расщепленного актина в комплексе с S1A1 и S1A2, соответственно. Аналогично результатам, полученным ранее (Chen et al., 1992; Fievez and Carlier, 1993), протеолиз сегмента 6169 трипсином в этих комплексах ингибируется. В то же время чувствительность актина к протеазе ЕСР32 не изменяется, а чувствительность к субтилизину зависит от вида изомера: в присутствии S1A2 она не изменяется, в присутствии S1A1- слегка ингибируется. Кроме того, взаимодействие с S1 приводит к структурным перестройкам на С-конце мономера, отражающимся в увеличении флуоресценции AEDANS-актина в присутствии S1A1 или S1A2/KC! и в изменении характера реакции с бифункциональным сульфгидрильным реагентом N.N-фенилен-бис-малеимидом (Khaitlina et al., 1996).

Обнаруженные структурные перестройки сходны с конформационными изменениями, которые вызывают в актине связывание ионов Мд в сайте с высокой аффинностью или присутствие KCI. Поэтому можно предположить, что вызванная S1 полимеризация актина в отсутствие солей основана на двух эффектах - активации мономера и стабилизации его взаимодействия с другими мономерами. По-видимому, связывание тяжелых цепей S1 изменяет ориентацию субдомена 2 и сдвигает С-концевой сегмент молекулы, что характерно для активации мономера. Связывание легких цепей, как и KCI, сдвигает реакцию полимеризации в сторону образования олигомеров и полимеров. Мы предполагаем, что KCI и N-концевой сегмент легкой цепи А1 взаимодействуют с одним и тем же кластером отрицательно заряженных аминокислотных остатков на N- и С-концах молекулы актина (сегмент 18-28 и остатки 361, 363, 364), которые сближены в трехмерной структуре. Так как в легкой цепи А2 N-концевой сегмент отсутствует, это может быть причиной неспособности изоформы S1A2 образовывать стабильные полимеры актина, и этот дефект может быть компенсирован добавлением KCI. Интересно, что в немышечных клетках и на ранних стадиях формирования сократительного аппарата синтезируется только изоформа S1A1 (Syrovy, 1979), более эффективная при полимеризации актина, а появление изоформы S1A2 связано с изменением иннервации мышц и их физиологической адаптацией уже сформированного сократительного аппарата..

4.2. Конформационные изменения в молекуле актина, вызванные взаимодействием с гельзолином

Основным свойством гельзолина является его способность разрезать нити актина. Однако, кроме этого, гельзолин способствует образованию зародышей полимеризации, взаимодействуя с двумя мономерами актина. Это взаимодействие Са-зависимо. В отсутствие ионов Ca один из мономеров диссоциирует. Оставшийся бинарный комплекс стабилен и устойчив к действию ЭГТА. Кроме того, бинарный комплекс получается в результате взаимодействия актина с фрагментами гельзолина с молекулярной массой 40 и 45 кДа, каждый из которых содержит один актин-связывающий сайт (Brayan and Kurth, 1984, Yin, 1989). В наших экспериментах (Khaitiina and Hinssen, 1997) полимеризация расщепленного актина индуцировалась комплексом гельзолина с

40

ji

Ö о

X ш S

о

X ф

ь х

20 -

Время (сек)

Рис.11. Восстановление гельзолином способности расщепленного актина нуклеировать полимеризацию. Полимеризацию немеченого актина (0.5 мг/мл) инициировали в присутствии 0.1М КС! добавлением коплексов расщепленного протеазой ЕСР32 (1,2) или интактного (3,4) Ругепу!-актина с гельзолином при соотношении 1:100 (кривые 1 и 3) и 1:30 (кривые 2 и 4). Флуоресценция измерялась при 407 нм после возбуждения при 364 нм.

двумя мономерами актина. Для изучения информационных перестроек исследовали различные варианты бинарных комплексов.

Расщепленный протеазой ЕСР32 Са-актин не полимеризуется и не удлиняет нитй интактного F-актина. В соответствии с .этими свойствами расщепленный актин не полимеризуется также и в присутствии гельзолина, добавленного как промотор полимеризации. Однако когда в качестве зародышей полимеризации расщепленный актин использовался в комплексе с гельзолином, на этих зародышах происходила полимеризация интактного актина (рис.11).

Дополнительное исследование показало, что один из мономеров расщепленного актина, по-видимому, может замещаться интактным мономером, но связывание второго мономера на молекуле гельзолина достаточно прочно (Khaitlina and Hinssen, 1997). По-видимому, конформация этого мономера изменяется в результате взаимодействия с гельзолином, и эти изменения восстанавливают способность расщепленного актина к нуклеации полимеризации.

Для того, чтобы локализовать вызванные гельзолином изменения конформации актина, был использован ограниченный протеолиз протеазой ЕСР32 и субтилизином, которые расщепляют полипептидную цепь актина в ДНКазной петле.

Рис. 12. Влияние гельзолина на расщепление субдомена 2 в молекуле актина протеазой ЕСР 32.А-актин (1мг/ мл);В-актин/ гельзолин, 2:1; С - актин/гельзолин, 1:1; D-актин/ 40 кДа-фрагмент гельзолина, 1:1. Инкубация с протеазой ЕСР32- в течение времени, указанного на оси (мин).

Как показано на рис. 12, в комплексе двух мономеров актина с гельзолином протеолиз актина протеазой ЕСР32 ингибируется примерно на 50%. Такой же эффект наблюдался при протеолизе актина субтилизином. Уменьшение доступности ДНКазной петли к

А В .... .С D

м о is зо so so a it го я и о to и зо и о « »з» «а

протеолизу могло бы быть связано с тем, что она оказывается между мономерами, как это происходит в F-актине. Однако, вопреки такой интерпретации, протеолиз актина протеазой ЕСР32 ингибировался и в бинарном комплексе актина с целой молекулой гельзолина и с N-концевым 40 кДа-фрагментом гельзолина (рис. 12). Взаимодействие с С-концевым 45 кДа-фрагментом гельзолина на протеолиз актина не влияло. Эти данные позволяют заключить, что гельзолин вызывает конформационные изменения в мономере актина, связанном с N-концевыми сегментами гельзолина. Поскольку именно этот мономер расщепленного актина остается в комплексе, нуклеирующем полимеризацию, можно предполагать, что индуцированные гельзолином структурные перестройки в ДНКазной петле являются частью механизма, лежащего в основе ускоряющего действия гельзолина на полимеризацию актина. Так как гельзолин связывается с субдоменом 1 молекулы актина (McLaughlin et al., 1993; Burtnick et al., 1997), очевидно, что регуляция этих структурных перестроек является аллостерической.

Недавно было показано, что структура нитей актина, заполимеризованных на гельзолине, отличается от структуры спонтанно полимеризованных нитей (Orlova et al., 1995; Prochniewicz et al., 1996). Используя обработку нитей F-актина бифункциональным сульфгидрильным реагентом, мы подтвердили, что этот эффект связан со структурными перестройками на С-конце молекулы (Khaitlina and Hinssen, 1997). По-видимому, распространение этих изменений по нити актина основано на том, что они передаются в ДНКазную петлю, что может влиять на контакт мономера с соседними мономерами, вызывая изменение структуры следующего мономера и, таким образом, всей нити.

Таким образом, полученные нами результаты и данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют об адаптивном характере изменений в структуре изоформ актина. Свойства изоактинов соответствует функциональным особенностям тех сократительных систем, в которые они входят: мышечный а-актин способен к образованию более стабильных филаментов, в то время как филаменты немышечных (J- и у-актинов труднее образуются и легче диссоциируют при отклонении условий полимеризации от оптимальных. Аминокислотные замены, отличающие изоактины друг от друга, расположены далеко от сайтов актин-актиновых контактов, где их появление приводило бы к потере способности к полимеризации и, следовательно, к нарушению клеточных функций. Вместе с тем, аминокислотные замены в субдомене 1 могут аллостерически регулировать положение щели между доменами

молекулы актина, делая связь между мономерами а-актина более прочной.

В микрофиламентах цитоскелета, состоящих из (Зг и у-актинов, стабилизирующую роль могут играть актин-связывающие белки, которые, взаимодействуя с субдоменом 1 актина, могут использовать тот же механизм аллостерической.: регуляции. Поэтому субдомен 1 может рассматриваться как регуляторный субдомен.

По-видимому, описанные структурные различия изоактинов также являются причиной разной кооперативное™ их нитей. При этом кооперативный эффект акгин-связывающих белков и количественные различия во взаимодействии этих белков с разными изоактинами создают дополнительные возможности для регуляции свойств актиновых структур.

ВЫВОДЫ

1. Актины, выделенные из разных сократительных систем, различаются по способности к полимеризации. Немышечные р- и у-изоформы отличаются от а-актина скелетных мышц (1) меньшей скоростью полимеризации, если они содержат Са в качестве прочно связанного катиона; (2) более высокой критической концентрацией полимеризации при понижении температуры и(или) ионной силы полимеризующего раствора или при расщеплении полипептидной цепи в субдомене 2; (3) более быстрой деполимеризацией в присутствии ДНКазы I. Эти данные свидетельствуют о меньшей стабильности полимеров, образованных р- и у-изоформами актина, по сравнению с полимерами а-актина, что может быть связано с различиями в характере связей между мономерами в полимерах а-, р- и у-изоактинов.

2. Более высокая стабильность нитей а-Р-актина скелетных мышц коррелирует с более закрытым положением щели между доменами в субъединцах этого актина по сравнению с положением щели в р-актине. Различия между изоактинами практически исчезают при замещении прочно связанного в щели между доменами Са2+ на Мд2+ - по-видимому, в результате сужения щели за счет поворота субдоменов 2 и 4. С другой стороны, в условиях, снижающих способность актина к полимеризации (присутствие АДФ вместо АТФ в качестве прочно связанного нуклеотида, снижение температуры,

расщепление пептидной связи в ДНКазной петле и т.п.), щель между доменами является более открытой. Таким образом, структурной основой разной стабильности изоактинов могут быть различия в конформации субдоменов 2 и 4 в субъединицах полимера, отражающиеся на положении щели между доменами. В частности, в р-подобном актине гребешка эти различия возникают в ходе полимеризации. По-видимому, они обусловлены менее эффективным переходом субдомена 2 в то положение, которое он занимает в полимере.

3. Даже локальные модификации в субдомене 2 молекулы актина (например, расщепление одной пептидной связи) являются критическими для поддержания стабильности полимера и могут приводить к потере способности к полимеризации и взаимодействию с актин-связывающими белками. Кроме того, эти модификации могут вызывать изменения в других частях мономера, в том числе на С-конце молекулы. С другой стороны, модификации С-концевого сегмента полипептидной цепи влияют на конформацию отдаленных участков субдомена 1. Эти дистанционные структурные перестройки являются результатом конформационного сопряжения субдоменов 1 и 2, которое может быть основой для аллостерической регуляции актиновой нити.

4. Гельзолин, связываясь с субдоменами 1 и 3 молекулы актина, вызывает конформационные изменения в ДНКазной петле, на вершине субдомена 2. Кроме того, гельзолин восстанавливает нарушенную протеолизом способность расщепленного актина включаться в полимер. Эти результаты свидетельствуют о том, что способность гельзолина стабилизировать зародыши полимеризации, по-видимому, связана не только с тем, что он сближает два мономера, но и со способностью гельзолина изменять конформацию отдаленных участков молекулы актина.

5. Способность субфрагмента 1 миозина полимеризовать актин основана на двух эффектах - активации мономера и стабилизации актин-актиновых контактов в олигомерах и полимере. Для стабилизации контактов, по-видимому, существунным является взаимодействие легкой цепи А1 с заряженным кластером аминокислотных остатков на Ы-и С-концах молекулы актина, которые в трехмерной структуре актина сближены. В изоформе миозина, содержащей легкую цепь А2, неспособность к полимеризации актина может компенсироваться КС!.

6. Хотя трехмерные структуры разных изоактинов сходны, а большинство аминокислотных замен находится далеко от сайтов актин-актиновых контактов, данные полученные в настоящей работе и имеющиеся в литературе указывают на то, что аминокислотные замены, расположенные в других частях молекулы, могут аллостерически регулировать способность мономеров собираться в более или менее стабильные полимеры. Необходимое для клетки временное увеличение стабильности актиновых микрофиламентов может быть достигнуто с помощью актин-связывающих белков, также способных регулировать стабильность и свойства полимеров актина аллостерически. При этом субдомен 1 молекулы актина играет роль регуляторной части мономера, и различия в его первичной структуре, характерные для изоформ актина, имеют функциональный (адаптивный) смысл.

Список основных публикаций по теме диссертации

1.Пинаев Г.П. и С.Ю. Хайтлина, 1972. Изменение физико-химических свойств актина скелетной мускулатуры кролика в ходе онтогенеза. Журнал эвол. биохим. физиол... 8, 369-373.

2.Туроверов К.К., С.Ю. Хайтлина и Г.П. Пинаев, 1975. Флуоресцентные свойства актина. Определение содержания нативного актина в его препаратах. Биохимия 40, 316-321

3.Turoverov К.К., S.Yu.Khaitlina and G.P.Pinaev, 1976. Ultra-violet fluorescence of actin. Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62,4-6

4.Хайтлина С.Ю. и Г.П. Пинаев, 1976а. Сохранение различий в степени полимеризации актина, выделенного на разных стадиях онтогенеза, после очистки его препаратов. Биохимия 41, 787-783

б.Хайтлина С.Ю. и Г.П.Пинаев. 19766. Инактивация актина скелетных мышц новорожденного и взрослого кролика лри разных условиях полимеризации и хранения препаратов. Биофизика 21, 495-499

б.Хайтлина С.Ю. и Г.П. Пинаев, 1976в. Изменение степени полимеризации актина скелетной мускулатуры кролика на разных стадиях онтогенеза. В кн.: Биофизика и биохимия мышечного сокращения. М., Наука:

7.Хайтлина С.Ю. и Н.С. Шелудько, 1979. Экстрагируемость сократительных белков из мышц двустворчатых моллюсков. . Журнал эвол. биохим. физиол., Приложение, 187-193.

в.Шелудько Н.С, С.Ю. Хайтлина, Л.А.Цховребова и ЗАПодлубная,

1980. а-Актинин аддуктора приморского гребешка. Физико-химические свойства. Биофизика 25, 164-167

9. Кузнецова И.М., С.Ю. Хайтлина, К.К. Туроверов и Г.П. Пинаев,

1981. Поляризация ультрафиолетовой флуоресценции. Биофизика 26, 756-757.

Ю.Цховребова Л.А., С.Ю.Хайтлина, Н.С. Шелудько , З.А.Подлубная,

1982. Взаимодействие а-актинина и тропомиозина с актином. Биофизика 27, 20-25.

11 .Khaitlina S.Yu., L.A.Tshovrebova, N.S.Shelud'ko, 1982. Unusual extraction of a -actinin from the adductor muscles of bivalve molluscs. Comp.Biochem.Physiol. 73B, 655-661.

12.Мантуленко В. Б., С. Ю. Хайтлина и Н.С. Шелудько, 1982. Высоко-молекулярный устойчивый к протеолизу фрагмент актина. Биохимия 48, 61-66.

13.Хайтлина С.Ю., Е.И.Гончарова и А.А.Орлова, 1986. Деполимеризация актиновых нитей в I-Z-I щетках из миофибрилл скелетных мышц кролика с помощью ДНКазы I. Цитология 28, 227230.

14. Khaitlina S.Yu., 1986. Polymerization of p-like actin from scallop adductor muscle. FEBS Lett. 198:221-224.

15. Khaitlina S.Yu., T.D.Smirnova, A.M.Usmanova, 1988. Limited proteolysis of actin by a specific bacterial protease. FEBS Lett. 228,172174.

16. Хайтлина С.Ю., A..M. Усманова, Т. Д.Смирнова и З.Ф. Федорова, 1988. Штамм бактерий Escherichia coli А2 — продуцент нейтральной протеиназы. Авторское свидетельство N 1390241

17. Kusnetsova I.M., S.Yu.Khaitlina, S.N.Konditerov, A.IVI.Surin, and K.K.Turoverov, 1989. Changes in structure and intermolecular mobility in the course of actin denaturation. Biophysical Chemistry 32, 73-78.

18. Усманова A.M. и С.Ю. Хайтлина, 1989. Протеаза из штамма бактерий E.coliA2, специфически расщепляющая актин. Биохимия 54, 1074-1079

19.Федорова З.Ф. и С.Ю. Хайтлина, 1990. Обнаружение протеазы, специфически расщепляющей актин,у ревертантов L-формы Shigella flexnery. Бюл. Эксп. Биол. Мед., 46-48

20.Khaitlina S. Yu„ J. Н. Collins, I. M. Kusnetsova, V. P. Pershina, I.G.Synakevich, K.K. Turoverov, A.M.Usmanova, 1991. Physico-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E.coli A2 strain. FEBS Lett. 279, 49-51

21. Strzelecka-Golaszewska H., J. Moraczewska, S.Yu.Khaitlina and M. Mossakowska,1993. Localization of the tightly bound divalent-cation-dependent and nucleotide-dependent conformational changes in G-actin using limited proteolytic digestion Eur.J.Biochem., 211,731-742

22.Mossakowska M., J. Moraczewska, S.Yu. Khaitlina, H. Strzelecka-Golaszewska, 1993. Proteolytic removal of three C-terminal amino acid residues of actin alters the monomer-monomer interaction. Biochem.J. 289, 897-902

23. Khaitlina S.Yu., J. Moraczewska, H. Strzelecka-Golaszewska, 1993. The actin-actin interactions involving the N-terminal portion of the DNase l-binding loop are crucial for stabilization of the actin filament. Eur. J.Biochem. 218, 911-920

24. Khaitlina S. and U.Lindberg. 1995. Dissociation of profilactin as a two-step process. J. Muscle Res. Cell Modi. 16, 188-189.

25. Казанина Г.А., О. А. Миргородская, Е.А.Миргородская, и С.Ю. Хайтлина. 1995.Протеиназа ЕСР 32: Характеристика фермента, исследование специфичности. Биоорганическая химия 21, 10, 761766

26. Wawro В., S. Khaitlina, , B.PIiszka and Н. Strzelecka-Golaszewska, 1996. Myosin subfragment 1-induced polymerization of proteolytically modified actin. J. Muscle Res. Cell Motil. 17,125.

27. Khaitlina S., В. Wawro, B.PIiszka and H. Strzelecka-Golaszewska, 1996. Activation of actin monomer during myosin subfragment 1-induced actin polymerization. J. Muscle Res. CeUMotil. 17,122.

28. Mirgorodskaya O., G.Kazanina, E. Mirgorodskaya, V.Matveyev, B.Thiede and S.Khaitlina, 1996. Proteolytic cleavage of melittin with the actin-digesting protease. Protein and Peptide Letters 3, 81- 88,

29. Kuznetsova I., Antropova, O., Turoverov, K. and Khaitlina, S. 1996. Conformational changes in subdomain 1 of actin induced by proteolytic cleavage within the DNase l-binding loop;. Energy transfer from tryptophan to AEDANS, FEBS Lett. 383, 105-108.

30. Matveyev V.V., A.M.Usmanova, A.B.Morozova and S.Yu.Khaitlina, 1996. Purification and characterization of the proteinase ECP-32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta 1296, 55-62.

31. Khaitlina S., О Antropova, I. Kuznetsova and K. Turoverov, 1997. Correlation of conformational changes and polymerizability in scallop p-like actin and skeletal muscle a-actin. J. Muscle Res. Cell Motil. 18, 125

32. Maximov A., E, Vedernikova, S. Khaitlina, H. Hinssen, and Yu. Negulyaev. 1997. Ca-dependent regulation of Na-selective channels via actin cytoskeleton modification in leukemia cells. FEBS Lett. 412, 94-96

33. Khaitlina S. and Hinssen, H. Conformational changes in actin induced by its interaction with gelsolin. Biophys. J. 1997, 73: 929-937.

34. Khaitlina S., O.Antropova, I. Kuznetsova and K. Turoverov, 1997. Correlation between conformational changes and polymerizability in scallop (3-like actin and skeletal muscle a-actin. Biophys. J., submitted.

Заказные обзоры:

1. Хайтлина С.Ю., 1979. Методы выделения и очистки актина. Определение чистоты и нативности В кн.: Биофизические и биохимические методы исследования сократительных белков. М. "Наука", 122-141.

2. Хайтлина С.Ю. 1981. Изменение физико-химических свойств сократительных белков в ходе миогенеза. В кн.: Проблемы миогенеза. Л. "Наука", 98-114.

3. Хайтлина С. Ю. 1985. Полимеризация актина и ее регуляцияю В кн.: Механизмы регуляции мышечной активности. М. "Наука", 171190.

4. Хайтлина С. Ю. 1995. Актин и актин-связывающие белки. В кн.: Белки и пептиды, Москва, "Наука", 264-280