Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость характера перераспределения поверностных рецепторов у клеток А431 от природы лиганда и организации актинового цитоскелета

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Зависимость характера перераспределения поверностных рецепторов у клеток А431 от природы лиганда и организации актинового цитоскелета"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи

ХРЕБТУКОВА Ирина Анатольевна

ЗАВИСИМОСТЬ ХАРАКТЕРА ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ У КЛЕТОК А431 ОТ ПРИРОДЫ ЛИГАНДА И ОРГАНИЗАЦИИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологи»! АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Г. П. Пинаев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Д. Бершад-ский; кандидат биологических наук Р. С. Баркан.

Ведущая организация: Государственный Санкт-Петербургский Университет.

Защита диссертации состоится » 1991 года

в // часов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии АН СССР по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан

1991 г. «

Ученый. секретарь /л> ?

Специализированного совета, ¡11 р П

кандидат биологических наук л. Н. Писарева

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из центральных и активно развивающихся областей клеточной биологии является изучение пространственной организации и молекулярных механизмов функционирования цитоскелета. Иитоскелет играет важную роль в поддержавши формы клетки и в осуществлении многих ее двигательных реакций, обеспечивающих выполнение таких важных клеточных функций, как деление, эндо- и экзоцитоз, перемещение клеток в пространстве, контакт их с субстратом и другими клетками (Bershadeky, Vaaili-ev, 1988). В последние годы появилось много экспериментальных работ, свидетельствующих о том, что цитоскелет, помимо ужо указанных функций, принимает участие в передаче' сигнала с поверхности клетки на ядро и таким образом включается в систему регуляции активности генетического аппарата (Bissel, Barcellos-Hoff, 1987). Согласно высказываемым гипотезам, способность цитоскелета принимать различные формы пространственной организации обеспечивает специфичность передаваемой информации (Puok et' al., 1990). ■Однако, механизмы, регулирующие образование различных форм организации и взаимодействие цитоскелеткых структур, до настоящего времени не Еыяснены. .

Первым этапом передачи сигнала из внешней среды в клетку является взаимодействие биологически активных веществ '(лиган-дов), находящихся в среде, на субстрате, на поверхности других клеток, со специфическими белками на клеточной поверхности - рецепторами, в результате которого запускается целый каскад клеточных реакций, приводящий к определенному ответу клетки на внешний стимул. Обнаружено, что многие, поверхностные рецепторы после взаимодействия с соответствующими лигандэми образуют связь с подаембранным актиновым цитоскелетом. В разных клетках и при действии разных лигандов в это взаимодействие вовлекается целый спектр ак.тин-связывающих белков, обеспечивающих контакт актино-вых структур с рецепторами и, по-видимому, специфический характер их пространственной организации (Singer et al., 1986). Несмотря на большое количество разрозненных данных, остается тем не менее неясно, в какой мере взаимодействие лиганд-рецепторных комплексов с подмембранными микрофиламентами, влючающее разные наборы актин-связивающих бе лгав, зависит от природы лиганда, типа клеток и организации цитоскелета.

Наиболее-полно изучены молекулярные механизмы клеточной адгезии и взаимодействия с цитоскелетом рецепторов, участвующих в образовании контактов клетки с субстратом и другими клетками (Geiger et ai.t 1987). Однако, молекулярные механизмы взаимодействия актиновых филаментов с рецепторами, не связанными с клеточной адгезией, в особенности рецепторов для гормонов и ростовых факторов, участия актин-связыващих белков в этом взаимодействии, а также роль такого взаимодействия в процессе передачи сигнала, на сегодняшний день еще не ясны и требуют дополнительного изучения.

Одним из подходов к изучению трансмембранного взаимодействия лиганд-рецепторных комплексов (ЛРК) с актиновым цитоскелетом является исследование перераспределения рецепторов на клеточной поверхности в результате взаимодействия с поливалентными лиган-дами и участия в этом процессе различных актин-содержащих структур и актин-связывавдих ,белков.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение того, как зависит характер перераспределения рецепторов клеточной поверхности от природы лиганда, состояния клеток и . организации цитоскелета. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: •

1) На примере клеток А431, имеющих на, своей поверхности большое число рецепторов к эпидермальному фактору роста (ЭФР), получить модель перераспределения поверхностных рецепторов, функция которых не связана с адгезией. Выяснить, происходит ли в данном случае образование трансмембранной связр' с цитоскелетом.

2) Провести сравнительные исследования перераспределения лиганд-рецепторных-комплексов у клеток, находящихсясуспензии и распластанных на подложке. Выяснить роль различных частей ак-тинового цитоскелета в этом процессе.

3) Определить участие некоторых актин-связыващих белков в перераспределении рецепторов ЭФР у суспензионных и распластанных клеток. ■

4) Сравнить перераспределение рецепторов ЭФР с' перераспределением рецепторов к конканавалину А - традиционному лиганду'в исследованиях перераспределения поверхностных рецепторов.

Научная новизна. В работе впервые получен кэппинг рецепторов ЭФР на поверхности клеток эпидермоидной карциномы человека

линии А431, в котором принимают участив актиновыв микрофилвмен-ты, и. исследована динамика этого процесса. Впервые обнаружено явление обратимой дезорганизации активово-о цитоскелета под действием низких температур (0°С). Проведено сравнительное исследование перераспределения поверхностных рецепторов к ЭФР и конка-навалину А у клеток, находящихся в суспензии и прикрепленных к подложке и выявлена различная роль разных частей актинового цитоскелета в этом процессе. Продемонстрированы различные типы перераспределения ЛРК у клеток, находящихся в суспензии и распластанных на подложке, а также у распластанных клеток, имеющих разную организацию актинового цитоскелета. Исследовано участие ак-тин-связывающих белков - спектрина, кальпактина и винкулина - в процессе кластеризации рецепторов ЭФР, Показано, что у распластанных клеток все эти белки перераспределяются вместе с ЛРК, тогда как у клеток в суспензии винкулин и кальпактин не принимают участия в кластеризации рецепторов ЭФР, а спектрин вовлечен в перераспределение ЛРК только на этапе формирования кэпа.

Практическая значимость работы. На примере клеток эпидермо-идной карциномы человека линии А431, имеющих на своей поверхности большое число рецепторов к ЭФР, предложена щ»вая модель для изучения перераспределения поверхностных рецепторов и образования трансмембранной связи ЛРК с актиновыми микрофиломентами. Совокупность данных, полученных в работе, показывает, что характер перераспределения поверхностных рецепторов, а также участия в этом процессе белков подмембранного цитоскелета, зависит от природы лиганда, от того, находятся клетки в суспензионном или распластанном состоянии, и от взаимодействия с различными частями актинового цитоскелета. Полученные результаты могут быть использованы при изучении участия цитоскелета в процессах передачи информации из внешней среды в клетку.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на рабо.чем совещании "Молекулярные основы цитоскелета" (Тбилиси,

1987), на Всесоюзных совещаниях "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987) и "Немышечные формы подвижности" (Чернигов,

1988), на 5-ой Всесоюзной школе по проблемам биологической подвижности (Лосево, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), на 6 съезде Европейского цитоскелетного'клуба (Дания, 1939), 38 и 39 годич-

них конгрессах Европейского общества тканевых культур (Лондон, 1990; Краков, 1991), на зимней УНЗЗ/ЕЫВО школе "Белки карно- и уитоскелета" (Австрия, 1991).

Но материалам диссертации опубликовано И работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения и выводов. Работа изложена на/&2?стр., из машинописного текста, иллюстрирована рисунками и -^таблицами. Список литературы содержит2JO названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на клетках эпидермоидной карцинош человека А431, полученных из Всесоюзной коллекции клеточных культур. Клетки культивировали на среде Игла с добавлением глутамшш и 10% сыворотки крупного рогатого скота.

В экспериментах по перераспределению ЛРК использовали ЗФР (200 нг/мл).полученный из подчелюстных желез самцов мыши (Соркин и др., 1988),полш<лоналыше антитела к ЭФР, моноклоналыше антитела' 5А9 к рецептору ЭФР (Сорокин и др., 1989), конканавалин А (10 .миг/мл), кроличью антисыворотку против конканавалина А, а. также флуоресцентно меченые вторые антитела: антитела осла или козы против кролика (GAR-FITC) и антитела свиньи против мыши (SWAM-PITC).

Для визуализации актин-содержащих структур использовали ро-дамин-фаллоидан. Для наблюдения за распределением актин-связыва-кядих. белков использовали поликлональные антитела: к а-спектрину куршшх эритроцитов (Kw'iatkowska, Sobota, 1990.)'; к винкулину человека (предоставлены В.Е.Котелянским, 'Кардиоцентр, Москва); к кальпактину 2 (предоставлены К.Номера, Институт Пастера, Парик). Обработка клеток лагандаш ц тшунофлуоросцентная цикроскопия.

Суспензию клеток в культупальной среде последовательно инкубировали при 0°С с лигандами, после чего переносили клетки в теплую среду (21-1°С) для индукции перераспределения ЛРК (рис. 1а). Через различные. промежутки времени клетки фиксировали Л%-шм формальдегидом или метанолом и использовали для 'флуоресцентной микроскопии.

Распластанные клетки выращивали на покровных стеклах. Использовали следующие схемы обработки клеток: 1) взаимодействие с "лигандами при 0°С и затем инкубация при 20°С (рис.16); 2) взаи-

модействио с лигандоми при 20°С (рисЛв). По окончании инкубации клетки фиксировали ЗЯИгом формальдегидом на рвз с 1 мМ

0.03%

эдтд

£

37 С

о°с

>

1 \

перераспределение (20 С)

20°С

) порерасп-У ределение

й-

а

Рис. 1. Экспериментальная схема обработки клеток лигандоми и индукция перераспределения ЛРК.

а- перевод клеток в суспензию 0.02 % ЭДТА, взаимодействие с ли-гандами при О С, инкубация при 20 С для индукции перерапеределе-ния ЛРК; лигяндо: 1) ЭФР, анти-ОФР, аАП-Р1ТС; 2) ЭФР, 5АЭ, БИАМ-Р1ТС; 3) 5А9, Б\УАМ-Г1ТС;

б.в- распластанные клетки: б~ взаимодействие с лигандэми при О С, затем инкубация при 20 С; в- взаимодействие о лигандоми при 20 С; лиганди: 1) ОФР, 5А9, 8\УЛМ-Р1ТС; 2) 5А9, 3'.УАМ-Р1ТС; 3) Кои А, анти-Кон Л, САИ-ПТС. '

После фиксации формальдегидом клетки экстрагировали 0.1% Тритоном-Х100 (после метанольной фиксации экстрагирование не проводили) и инкубировали.либо с родамин-фаллоиданом, либо с антителами к актин-связывающим белкам. После обработки первыми антителами проводили дополнительную инкубацию с GAR-TRITC. Препараты анализировали с помощью микроскопов Fluoval и Opton.

Иммуноэлектронная микроскопия. Были приготовлены коныогаты белок A-коллоидное золото (диаметром 8 нм и диаметром 15 нм) (Roth, 1906). Клетки А431, находящиеся в суспензии, обрабатывали лигандами при 0°С с дополнительной обработкой белком А-золото (16 нм) при той же температуре. На разных стадиях перераспределения ЛРК (20°С) клетки фиксировали (6% формальдегид, 0.5% глу-таровый альдегид на фосфатном буфере, содержащем 50 мМ KCl и 5 мМ MgCl2, pH 7.4). Дофиксацию проводили 1%-ным раствором ОвО^ на этом ко буфере. После этого образцы дегидратировали, проводя через спирты возрастающей концентрации и ацетон,, и заключали в Эпон 812. Ультратонкие срезы делали на ультрамикротоме LKB-3.

' Для выявления на срезах клеток локализации спектрина, поверхностный слой смолы удаляли смесью NáOH и этанола. Затем образцы инкубировали с антителами к спектрину и с белком А-золото (8 нм). Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и уранил-ацетатом и исследовали в электронном микроскопе jeu юов.

Солюбилизация лиганд-рецепторных комплексов на разных стадиях образования и перераспределения. В этих экспериментах использовали ЭФР, меченый с помощью Иодогена (Serva). На различных стадиях из суспензии клеток отбирали по. две равные пробы. К однЬй прибавляли лизирущий. буфер (Laridreth et al., 19851, содержащий 0.5% Тритон-Х100. Вторую пробу инкубировали в том же буфере, но без Тритона. По отношению радиоактивности проб судили о количестве ЛРК, связанных с цитоскелетом.

Для дезорганизации системы актиновых филаментов или микротрубочек клетки инкубировали при 37°С в присутствии цитохалазина В (10 мкг/мл, 3 ч£$са).или колцемида (1 мкг/мл, 1 час) соответст-венно^ - "

Электрофорез гомогената клеток А431 был выложен по методу Лэммли (Laemmli, -1970) в 10% полиакриламидном геле. Иимуноблот-тинг выполняли согласно методике, описанной Маргулисом (1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Перераспределение рецепторов ЭФР у клеток А431, находящихся в суспензии.

На клетках А431 эпидермоидной карщшомы человека кэпообра-зование до сих пор не изучалось, и поэтому первым этапом работы было исследование влияния условий проведения эксперимента на процесс перераспределения лиганд-рецепторных комплексов (ЛРК) у клеток А431.

1.1. Оптимизация условий проведения эксперимента по кзпообразо-ванию у клеток А4Э1.

Поскольку клетки А431 растут только в прикрепленном состоянии, монослойную культуру исследуемых клеток перед экспериментом подвергали обработке агентами, открепляющими клетки от субстрата - трипсин-версеном, версеном или резиновым скребком. Открепление клеток скребком или раствором с трипсином приводило к значительному понижению способности клеток А431 к переопределению ЛРК по сравнению с обработкой версеном, . по-видимому из-за повреждения либо самих рецепторов, либо каких-то других белковых компонентов поверхности. Поэтому в последующих экспериментах перевод клеток в суспензию осуществляли с помощью 0.02%-ного раствора версена.

При действии только одного ЭФР на открепленные клетки ни при каких условиях не происходило образования крупных агрегатов рецепторных комплексов, тем более кэпов. Кластеры ЛРК начинали формироваться при дополнительной обраСотке клеток антителами к ЭФР, но эффективность кэппинга была при этом невелика (10-15 %); кроме того, сами кластеры достаточно рыхлые, образования компактных кэпов на одном полюсе клетки не происходило. Наилучшие' результаты (до 50 %) были получены при последовательной обработке клеток антителами к ростовому фактору и затем штюидовой иммунной сывороткой, флуоресцентно меченой. Аналогичные результаты были получены, если в качестве первых антител использовали моно-клональные антитела 5А9 к рецептору ЭФР. Из этих экспериментов следует, что для образования кэпов, необходима некоторая начальная степень "склеенности" рецепторов поливалентными лигандами.

Для предотвращения как преждевременной интернализации ЛРК, так и кэпообразования, клетки на этапе последовательной обработки лигандами выдерживали на льду. При этом наблюдалось равномерное свечение всей поверхности клеток. Затем их переносили в среду с температурой: 40°С, +21°С или +37°С.

- а -

Ши о''С, - в точение первых 80 мин наошщшшаь кластеризация Л1К (пэтчннг). В течение 90-120 мин формировались кош. Доля клеток о кгшьми при этом была невелика (около 10%). При температуре среди 37°С каш образовывались ужо через 10 мин, но стадию пьт'шнга з<.фиксировать на удавалось, так как интернализация начиналась сразу ка параллельно с образованием кэпов, а через 2030 мин все ЛРК оказывались внутри клетки. В этих условиях было сложно получить достаточное количество клеток со сформированным! копами.

Температура среды 2оказалась оптимальной для изучения процесса кэпообразования. В таких условиях через 10 мин инкубации происходило образование отдельных кластеров на поверхности клетки. Через 20, 30, 40 мин на поверхности клеток формировались копы, а после 60 мин начиналась инторнализация ЛРК, и флуоресцентная метка была видна в виде отдельных пятен внутри клетки, без свечения мембраны. ,

Чтобы определить, находятся ЛРК на поверхности или под плазматической мембраной, клетки с образовавшимися кластерами обрабатывали трипсином. В том случав, когда кластеры находились на поверхности, они полностью разрушались под действием трипсина, и свечение исчезало. Интернализованные же комплексы не изменяли ни своего положения, ни свечения.

Таким образом, окончательная схема эксперимента для получения кэпов на клетках А431, находящихся в суспензии, состояла в переводе клеток в суспензионное состояние версеном, использовании специфических антител' в качестве поливалентных лигандов и инкубации при температуре 21-1°С. При этих условиях максимальная эффективность кэппинга достигала 50%.

1.2. Распределение актина при квпгшнге рецепторов ЭДР у клеток А431 в суспензии.

У клеток, не обработанных лигандами, а также у зафиксированных при 0°С, когда поверхностные ЛРК распределены равномерно по плазматической'мембране, родамин-фаллоидин, указывающий ■ на локализацию актина, окрашивал кортикальную область более или менее равномерно по всему периметру клетки.' По мере образования кластеров ЛРК актин также менял свое распределение, локализуясь непосредственно под областью копа, что указывает на взаимодействие микрофилпмонтов с рецепторами ЭФР в процессе перьраспредвле'-

шш ЛРК.

1.3. Экстрагируеыость рецепторов ЭФР на разных стадиях формирования и перераспределения ЛРК.

Ввиду того, что образование кластеров ЛГК сопровождалось перераспределением актина, можно было предполагать, что при »том происходит образование трансмембранной связи рецептора с элементами цитоскелета. Для того, чтобы проверить это предположение, были проведены эксперименты по экстрагируемости ЛРК из клеток А431 после обработки их детергентом. Клетки А431, обработанные 1^51-ЭФР и антителами, подвергали действию 0.5 % Тритона и по количеству метки 12о1-ЭФР, содержащейся в нерастворимой клеточной фракции до и после обработки детергентом, судили о степени солюбиличации лиганд-рецопторшх комплексов.

При 0°С по мере увеличения степени "склеенности" рецепгороь доля нерастворимых ЛРК увеличивалась от 10 %, при полном насыщении рецепторов только одним ЭФР, до 20 и 40 % - при взаимодействии с первыми и вторыми антителами соответственно. При переводе клеток в условия комнатной температуры, при которых идет последовательное образование пэтчей и кэпов, содержание нерастворимых ЛРК несколько повышалось - до 52 и 48 % соответственно.

Получению результаты свидетельствуют о том, что последовательные обработки лигандами приводят к увеличению количества нерастворимых ЛРК, которые, по-видимому, удерживаются в этом состоянии благодаря взаимодействию с цитоскелетом. Эти данные согласуются с результатами по перераспределению актина.

Таким образом, перераспределение рецепторов ЭФР у клеток А431, находящихся в суспензии, происходит аналогично перераспре-делешю поверхностных рецепторов у лимфоцитов (Не РеЬг1в, 1977), с такими же стадиями перераспределения: потчингом, кэптшгом и интерпелляцией. Взаимодействие с поливалентными лигандами так же ведет к увеличению числя рецепторов ЭФР, устойчивых к действию тритона, что, по-видимому, указывает на их взаимодействие со структурами подмомбранного цитосколетп. Подмембрпшше микрофила-ментн перераспределяйте'! вместо с л! К в процессе кзпгпяпга, это позволяет предположить их участие в этом процессе, аналогично кэшпшгу у лимфоцитов (Бош*£и1епоп, Вонп^Ндпоп, 1?Я4).

Ноо^г.одимо било вилсшть, кок хпр'жтор порораспродолепил

поверхностных, рецепторов зависит от формы клетки, ее контакта с субстратом, и какую роль играют в процессе перераспределения ЛРК различные части актинового цитоскелета. Для этого были проведены исследования перераспределения тех же рецепторов, а именно рецепторов ЭФР, но у клеток А431, распластанных на подложке. 2. Перераспределение ЛРК на поверхности клеток А431, прикрепленных к подложке.

В этих экспериментах мы использовали ту же схему эксперимента, как в случае клеток, находящихся в суспензии, а именно: обработка клеток на холоду поливалентными лигандами и затем инкубация при комнатной температуре (21^1°С). В качестве лигандов использовали ЭФР, антитела БА9 к рецептору ЭФР и антимышшше ан- • титела, флуоресцентно меченые.

2.1. Локализация актина и рецепторов ЭФР в клетках А431, прикреплениях к подложке, в норме и в условиях пониженной температуры.

Актиновый цитоскелет клеток А431 в нормальных ростовых условиях (37°С), выявляемый с помощью родамин-фаллоидина, содержит четыре основных типа структур: 1) пучки актиновых филаментов, радиально расходящиеся от кортикального'слоя и заполняющие мно- ■ гочисленные микроворсинки; 2) кольцевой мощный слой пучков филаментов по периметру распластанных клеток; иногда было видно, что этот подмембранный слой филаментов распадается на ряд паралель-ных концентрических пучков; 3) пучки филаментов, беспорядочно ориентированных, проходящих через всю клетку; по виду эти пучки напоминают стресс-фибриллы фибробластов, но не имеют строгой упорядоченной ориентации; 4) небольшое количество аморфных агрегатов', расположенных в центральной части цитоплазмы в некоторых клетках: - ' .

При переводе клеток, растущих при 37°С, в пониженную температуру (от 0 до 4°С) через 1-2 часа инкубации наблюдались следующие изменения в организации актинового цитоскелета: уменьшалось число микроворсинок; практически полностью исчезали стресс-фмбриллоподобные пучки; появлялись многочисленные мелкие агрегаты, беспорядочно распределенные то цитоплазме. При" этом кортикальный циркулярный слой микрофиламентов сохранялся.

Эти изменения в организации цитоскелета были обратимыми, то есть после повышения температуры происходило восстановление исходных актин-содержащих структр - стресС-фибриллоподобных .пучков

и исчезновение мелких агрегатов актина ь цитоплазме. При 20°С этот процесс начинался через 45 глин, и полное восстановление заканчивалось через два часа.

Обработка клеток ЭФР или антителами к рецептору ЭФР при 0°С не приводила к значительным изменениям в организации актшювого цитоскалета по сравнению с клетками, инкубированными на холоду без лигандов. При этом следует отметить, что в условиях низкой температуры перераспределения ЛРК нет, то ость они распределены равномерно по мембране.

2.2. Перераспределение рецепторов ЭФР и актина у клеток А431, прикрепленных к подложке.

При переводе клеток, обработанных лигандами при 0°С, в комнатную температуру, через 10 мин начинали образовываться кластеры окрашенного материала, напоминающие пэтчи, которые затем собирались в один агрегат на свободном краю клетки. Кластера никогда не образовывались на краях клеток, вовлеченных в межклеточные взаимодействия. Такие агрегаты ЛРК, по-видимому, являются аналогами кэпов у клеток, находящихся в суспензии. Перераспределение заканчивалось интернализацией ЛРК, и свечение наблюдалось в центральных областях клеток в вйде нечетких пятен. ■

В некоторых экспериментах клетки- обрабатывали только антителами 5А9 к рецептару ЭФР и вторыми антителами, без ЭФР. В этом случае также происходила кластеризация ЛРК с последующей интернализацией рецепторных комплексов, но процесс перераспределения шел чуть медленнее. Через 30 мин инкубации в.комнатной температуре на клетках обнаруживалось 2-3.кластера, а не один, как в случае обработю!-клеток ЭФР. с последующей обработкой антителами.. ЭФР также ускорял начало интернализации, она начиналась через 45-60 мин при использовании ЭФР, и через 90 мин в его отсутствие .

. Актин всегда сопутствовал кластерам ЛРК,значительно перераспределяясь в область кластеров. При этом в процессе перераспределения участвовали подмембранные циркулярные пучки микрофиламе-нтов. Что касается стресс-фибрилл, то их восстановление при 21°С начиналось позже, чем происходила кластеризация ЛРК, и требовало более длительного времени (1- 2 часа), тогда как процесс перераспределения заканчивался уже через 30-40 мин.* То есть, стресс-фибриллы в КЭПШНГ9. поверхностных ЛРК участия, не принимали.

2.3. Влияние колцемадэ на организацию актинового цитоскелета и на перераспределение поверхностных рецепторов.

Так как .разборка актиновых пучков в клетках А431 ха холоду явление необычное, не характерное для актиновых структур, мы предположили, что микрофиламенты в клетках А431 могут взаимодействовать с микротрубочками, и разборка микротрубочек но холоду (Ие1сеиЬег§, 1972) может вызывать дезорганизацию микрофиламен-тов. Оказалось, однако, что обработка клеток А431 колцемидом.-агентом, разрушающим микротрубочки, как в нормальных ростовых условиях (37°С), так и при обычных условиях опыта по перераспределению ЛРК, не приводила к изменениям ни в перераспределении рецепторов, ни в состоянии структур актина. Следовательно, во-первых, дезорганизация актиновых структур на холоду не связана с разборкой микротрубочек; и во-вторых, формирование кластеров рецепторов не зависит от микротрубочек. '

2.4. Перераспределение рецепторов к конканавалину А у распластанных клеток А431.

Поскольку формирование кластеров ЛРК на краю распластанных клеток до сих пор не было описано в литературе, необходимо было выяснить, зависит ли это явление от условий эксперимента или от типа выбранного лиганда. В связи с этим мы проследили за перераспре делением рецепторов к конканавалину А (Кон А), который обычно используется в подобных исследованиях (см., например т/авШет et а1., 1976). Рецепторы к конканавалину А, выявляемые с помощью иммунофлуоресценции, исходно распределены диффузно на поверхности клеток А431.

, Если обработку клеток Кон А, антителами к Кон А и вторыми антителами, флуоросцентно мочеными, проводили при 0°С, когда происходит дезорганизация стресс-фибрилл, то после перевода клеток в.условия комнатной температуры в течение 45 мин не удавалось зарегистрировать центростремительного перемещения ЛРК. Вместо этого наблюдали пэтчинг рецепторных комплексов на всей дор-зальной поверхности или только на краях клетки, и в редких случаях образование кластеров на краю клетки, напоминающих кэпы. Однако, в этом случае агрегации актина в области кэпа не обнаружено.

Инкубация ко клеток с Кон А и антителами при 20°С приводила к'тему, что ЛРК вначале собирались в пэтчи и затем перемещались

в центральную область отдельной клетки или клеточного остроыса. То есть перераспределение рецепторов к конканявплину А у клеток А431 при обработке клеток лигандами при комнатной температура происходило так же, как это было описано для фиОроОластов и они-телипльшх клеток (Уав1Ие\г вt а1., 1976). Вероятно, характер перераспределения ЛРК зависит от организации актинового цитоске-лета. .

2.5- Перераспределение рецепторов ЭФР у распластанных клеток А431 в условиях, когда в клетках присутствуют стресс-фибриллы.

Исходя из результатов экспериментов по перераспределению реподторов к Кон А, мы проворили возможность центростремительного перемещения рецепторов ЭФР в клетках, в которых присутствуют стресс-фибриллы. Для этого были поставлены следующие эксперименты: клетки А431 обрабатывали антителами 5А9 к рецептору ЭФР и Ёторыми флуоресцентными антителами при 20°С. При этом стресс-фибриллоподобше пучки актина были сохранены. Общее время инкубации с лигандами, смоете с отмывками, не превышало 60-70 мин, то есть ЛРК оставались на клеточной поверхности, так как интер-нализация при 20°С в отсутствие ЭФР начиналась через 90 мин.

' Оказалось, что в этом случае ЛРК собирались в пэтчи, а затем происходила центростремительная очистка ламеллярных областей. При этом иногда ЛРК собирались в центре островка клеток, как будто в центре одной большой клетки. Однако, очистка ламол-лярных областей клеток от рецепторов ЭФР происходила минее аффективно, чем рецепторов к Кон А, что указывает на то, что характер перераспределения зависит но только от организации цитоске-лета, но также .и от природа лиганда.

2.6. Влияние цитохалазина В (ЦВ) на перераспределение рецепторов ЭФР и конканавалина А у клеток А43Х, распластанных на подложке.

Известно, что ЦВ нарушает связь быстрорастущего конца мнк-рофиламентов с плазматической мембраной, что приводит к дезорганизации системы актиповых филаментов в клетке (Мез1ап<1 а1., 1981). Это его свойство широко используют для докозательстьа участия актинового цитоскелета в тех или иных двигательных клеточных процессах. Мы и;--учаш влияние 1® на процесс перераспределения ЛГК у клеток 3431.

Обработка клеток ЦВ в течение 3 часов при 37°С приводила к изменению формы клеток: юло клотки уменьшилось, и появлялись

многочисленные отростки. В цитоплазме никаких пучков актина не обнаруживалось, ни циркулярных подмембрашшх, ни стресс-фибрилл. Вместо них присутствовали мелкие агрегаты актина под мембраной по перимотру клетки и крупные агрегаты в центре, по-видимому, у ядра.

Когда клетки в присутствии ЦВ обрабатывали поливалентными лигандами для индукции перераспределения поверхностных рецепторов, то ни образования кэпов, ни центростремительной очистки поверхности не происходило. Вместо этого мы наблюдали образование мелких агрегатов рецепторов, и к ЭФР, и к Кон А; напоминающих пэтчи. Это имело место при инкубации клеток с лигандами при 20°С, а также в том случае, когда клетки инкубировали с лигандами при 0°С, а затем повышали температуру до комнатной.

При сравнении локализации поверхностных ЛРК и актина, было видно, что практически каждому агрегату'рецепторов ЭФР соответствует агрегат подмембранного актина, то есть мокно предположить, что существует связь между актином и рецептором ЭФР, устойчивая , к дойствию ЦВ.

Действие ЦВ было обратимым, после его удаления из среды происходило восстановление формы клеток и исходных актиновых структур, сопровождаемое перераспределением ЛРК. Причем вначале восстанавливались примембрашше пучки актина, в таких клетках происходило образование кэпов на краях клеток. По мере восстановления пучков актина в центральной части клетки поверхностные ЛРК начинали смещаться от края клетки по направлению к центру.

Таким образом, результаты, -представленные в этом разделе, говорят о том, что целостность актшювого цитоскелета важна для перераспределения поверхностных рецепторов. 3.Участие актин-связывапцих белков в процессе перераспределения рецепторов ЭФР.

Различные актин-связывающие белки могут принимать участие в прикреплении актиновых микрофиламентов к плазматической мембране и играть роль промежуточного звена во взаимодействии актина и трансмембранных рецепторов. Поскольку при кластеризации рецепторов ЭФР наблюдалось совпадение локализации актина и рецеторов, было важно выяснить, принимают ли участие в перераспределении рецепторов ЭФР некоторые актин-связывающие белки, осуществляющие прикреплению актиновых микрофиламентов к мембране. В данной ра-

боте било исследовано участие в кэппинге'рецепторов ЭФР белков: - спектрина, винкулина и кальпактина 2 (р35).

3.1. Локализация спектрина, винкулина и кальпактина в клетках А431 в нормальных ростовых условиях и в процессе кластеризации рецепторов ЭФР у распластанных клеток А431.

В клетках А431, зафиксированных при 37 или 20°С, антитела к спектрину окрашивали область плазматической мембраны, причем наиболее интенсивное свечение наблюдалось в местах межклеточных контактов и мембранных складок, раффлов, то есть в местах наибольшей концентрации мембранного материала. Сходную локализацию в области плазматической мембраны с увеличением концентрации в ме-■ стах межклеточных контактов и мембранных складок выявляли также антитела к винкулину и кальпактину и, кроме того, антитела к рецептору ЭФР. Однако, кроме плазматической мембраны, антитела к бктин- связывающим белкам окрашивали и центральную околоядерную часть клетки, включая ядро. Окрашивание центральной части клетки антителами к белкам примембранного цитоскелета. может отражать участие этих белков в прикреплении к дорзальной части, плазматической мембраны кортикального пласта микрофиламентов, который является составной частью цитоскелета распластанных клеток (Свиткина и др., 1983).

В некоторых клетках антитела к кальпактину выявляли сеть . филаментов в цитоплазме. Эти филаменты не были актиновыми фила-' ментами, на что указывало двойное иммунофлуоресцентноо окрашивание клеток антителами к кальпактину и родамин-фаллоидшюм.

Мы исследовали локализацию спектрина, кальпактина и винкулина при перераспределении рецепторов ЭФР. Перераспределение рецепторов ЭФР исследовали после инкубации клеток при 0°С, когда происходит образование кэпов на краю клетки." Все три актин-связывающих белка образовывали кластеры одновременно с рецептором ЭФР у клеток, распластанных на подложке. Следовательно, между рецептором и этими белками у распластанных клеток существует взаимодействие.

3.2. Локализация спектрина, винкулина и кальпактина у клеток А431 в суспензии в процессе кзппинга рецепторов ЭФР.

При окрашивании антителами к; выбранным актин-связывапцим белкам'клеток А431, находящихся в суспензии, оказалось, что только спектрин сохранил локализацию вдоль плазматической мембра-

iui. Тише распределении спектрина напоминало распределение акгп-на в суспензиошшх клетках (см. раздел 1.2). Винкулин и кальпактин в клетках, откреплешшх от субстрата, били распределены диф-фузно в цитоплазме; кроме того, антитола к кальпактину окрашивали ядерную мембрану. По-видимому, в клетках Д431,-находящихся в суспензии, винкулш и, кальпактин не связаны с плазматической мембраной.

В процессе кластеризации роцепторов ЭФР из трех актин-связывагощих белков только спектрин измешл локализацию, концентрируясь под мембраной в области кэпа; винкулин и кальпактин сохраняли диффузное распределение в цитоплазме. Таким образом, в кластеризации рецепторов ЭФР у клеток А431, находящихся в суспензии, винкулин и кальпактин не принимали участия.

При инкубации клеток при 20°С в течение 45 мин можно было найти клетки с кэпами рецепторов' ЭФР,1 в которых спектрин был распределен равномерно под плазматической мембраной, хотя актин при этом по-прежнему агрегирован в области кэпа. С помощью двойной ишуноэлектронгюй микроскопии клеток на разных стадиях riepe' распределения ЛРК, мы показали, что в клетке, зафиксированной в .первые минуты перераспределения ЛРК, агрегаты мелких частиц золота (8 нм), указывающие на места, 'обогащенные спектрином, локализованы в подмембранной области, вблизи от ЛРК, меченых частицами золота более крупного размера (15 нм). Если же клетку зафиксировать при более продолжительной инкубации при 20°С, то можно выявить начало интернализации. При этом в области кэпа обнаруживаются многочисленные эндоцитозныо везикулы с находящимися в них рецепторами ЭФР. На этой стадии перераспределения ЛРК становится заметным разделение в пространстве спектрина и рецепторов ЭФР.

По-видимому, после завершения процесса кластеризации, перед началом интернализации ЛРК, взаимодействие между рецептором и ' спектрином прекращается. Возможно, что в этом случае изменяется способ связи между рецептором и подмембранными микрофиламентами, это может быть непосредственное взаимодействие рецептора и актина или взаимодействие с участием других актин-связывакяцих белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в результате взаимо-дойстеия с поливалентными лигандами У клеток А431 происходит пе-

рерзспределениэ поверхностных рецепторов, в котором принимают участие актиновые микрофлламентн. Характер нерераспределения зависит от организащш актинового цитоскелота (рис. 2):

ОРГАНИЗАЦИЯ АКТШЮЕОГО ЦИТОСКЕЛЕТА

перераспределение поверх) юстшх ЛГК

клетки в суспензии

только кортикалыше микрофиламенты_

шк.чг

распластанные клетки „ (37 или 20 С)

краеше пучки и стресс-фибриллы

центростремительное перомед'.^ни е

распластанные летки

(А431)

клетки (дОС)

краевые пучки без стресс-фибри!ял

коппинг на краю клетки

ЦВ

(О или 20 ИЛИ 37 С)

агрегаты актина

пзтчипг па ¡сраы клетки

Рис.. 2. Схематическое изображение полученных в работе результатов .о зависимости характера перераспределения ЛГК ни клеточной поверхности от организации актшювого цнтоскелета.____

У суспензионных клеток, у которых имеется только подмембрашше микрофиламенти, поливалентные лиганды индуцируют кэгптанг поворх-ностшх "рецепторов. У клеток, распластанных на подложке, в условиях, когда в цитоплазме клеток присутствуют стресс-фибриллопо-добныв пучки октиновых филаментов, взаимодействие клетки с поли-

валентными лигандами индуцирует центростремительную очистку ла-меллярных областей от ЛРК. В том случае, если имеет место дезорганизация цитоплазматических пучков микрофиламентов, как это происходит в клетках А431 после инкубации при 0°С, центростремительное перемещение ЛРК отсутствует, вместо, этого наблюдается кластеризация поверхностных рецепторов на краю клетки, напоминающая образование кэпов' у суспензионных клеток. При деструкции всего актинового цитоскелета под действием ЦВ- не происходит ни агрегации рецепторных комплексов на краю клетки, ни центростремительного перемещения ЛРК. Указанные закономерности справедливы как для рецепторов к ЭФР, так и для рецепторов к Кон А.

. Существуют, однако, и особенности перераспределения поверхностных рецепторов 'при взаимодействии с различными лигандами. Для рецепторов к ЭФР более характерно образование кэпов. на краю клетки, чем для рецепторов к Кон к', а для последних более характерно центростремительное перераспределение. Кроме того, в местах агрегации рецепторов ЭФР наблюдалось концентрирование под, мембранных актиновых филаментов, отсутствовавшее при агрегации рецепторов к Кон А. Зависимость характера перераспределения ЛРК от природы лиганда может отражать различия во взаимодействии разных поверхностных рецепторов со структурами подмембранного цитоскелета.

Участие актина и актин-связывающих белков в процессе клас-' теризации рецепторов ЭФР у клеток А431 суммировано в таблице: Участие белков цитоскелета в кластеризации рецепторов ЭФР у клеток А431.

исследованные белки цитоскелета клетки, прикрепленные к подложке клетки в суспензии

начало кластеризации конец кластеризации

актин + + +

спектрин + + -

винкулин + . - -

кальпактин + - -

ВЫВОДЫ:

1.Впервые получен кэппинг рецепторов ЭФР у клеток эпидермоидной 'карциномы человека лшши А431. Показано, что для формирования кэпов необходима обработка клеток поливалентными лигандами

(специфическими антителами) при 0°С с последующей инкубацией при 20°С.

2.В клетках А^31 обнаружено ранее не описанное явление обратимой деструкции стресс-фибриллоподобных пучков актина при 0°С.

3.Показано, что агрегация рецепторов ЭФР всегда сопровождается перераспределением подмембранного актина в область кэпа. В распластанных клетках в агрегацию рецепторов ЭФР вовлечены также спектрин, винкулин и кальпактин, а в клетках в суспензии - только спектрин на начальных этапах формирования кэпа.

4.Взаимодействие с поливалентными 'лигандами приводит к увеличению связанных с цитоскелетом рецепторов ЭФР. Вместе о данными о перераспределении актина и актин-связывающих белков это указывает на образование трансмембранной связи между рецепторами ЭФР и актиновыми микрофиламентами. . 1

6.В отличив от рецепторов ЭФР агрегация рецепторов Кон А на краю клетки наблюдается редко и не сопровождается агрегацией актина, что указывает на различия в характере перераспределения и взаимодействия с микрофиламентами поверхностных рецепторов для разных лигандов.

6.Дигидроцитохалазин В ингибирует' как образование кэпов на краю клетки, так и центростремительное перемещение рецепторов ЭФР и Кон А, что свидетельствует об участии актиновых филаментов в этих процессах.

7.Характер перераспределения поверхностных рецепторов при взаимодействии с поливалентными лигандами зависит от организации актинового цитоскелета: у клеток, .находящихся в суспензии, формируются типичные кэш, у распластанных клеток происходит, центростремительная очистка. ламёллярных областей при наличии стресс-фибрилл и образование агрегатов на краю клетки при их деструкции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .1. ХробТукова И.А., Никольская А.Н., Пинаев Г.П., Соркин А.Д. Кэппинг у клеток А431, индуцированный эпидермальным фактором роста и. антителами к этому фактору // Цитология, i987. Т.29. N 9. С.' 1109-1110. . .

2.'Pinaev G.P., Klirebtukovä I.A., Diakonov I.A. The epeoi-fity of interaction of ligand-receptor oomplexes and oytoekele-ton // Molecular Organization of Biological Struoturea: Intern.

Syrnpos. Abotraot Book. Vol.2. Mosoow, 1989. P. 173.

3. Хребтукова M.A., Никольская A.H., Соркин А.Д., Сорокин А.Б., Пинаев ,Г.П. Кэппинг рецепторов к эпидермальному фактору роста и участие цитоскелета в этом процессе у клеток А431 // Цитология. 1989. Т.31. N 10. С. 1211-1220.

4. Kwiatkowska К., Sobota A., Khrebtukova I.A. Aotin-binding proteins involved in association of epidermal growth fa-otor receptor with oytoskeleton in human carcinoma A431 cells // Abstr. of Sixth Meeting of the European Cytoskeletal Club: Denmark, 1989. P.25. ,

Б. Khrebtukova I.A., Pinaev G.P. Aotin reorganization after 1 interaction of A431 oella with the Uganda to the EGF reoeptor // Abstr. of 38th Annual Meeting of ETCS: London, 1990. P.58.

6. Khrebtukova I.A., Kwiatkowska K., Gudkova D.A.,.Sorokin А.В., Pinaev G.P. The role of microfilaments in the oapping of epidermal growth faotor reoeptor in A431 oells // Exp. Cell Res. 1991. Vol.194. P. 48-55.

7.'Khrebtukova I.A., Korohagina D.A., Korenbaum E.S., Pinaev G.P. Role of different parts of aotin oytoskeleton' in the oell surfaoe reoftptors redistribution // Structural and Motile Proteins of the Nucleus and Cytoplasm: TEBS/EMBO Winter Sohool Abstr. Book. Sohladming/Austria, 1991. Th 7.

8. Pinaev G.P., Khrebtukova I.A., Goncharova E.I., Diakonov I-.A. The speoifity of oytoskeleton interaction with different surfaoe reoeptore // Abstr. of 39th Annual Meeting of ETCS: Krakow, 1991. P.39.

, 9. Khrebtukova I.A., Pinaev G.P. Dependence of surfaoe reoeptor redistribution on state of aotin oytoekeleton // Abstr. of 39th Annual Meeting of ETCS: Krakow, 1991. P.40. ■

10. Kwiatkowska K., Khrebtukova I.A., Sobota A., Gudkova D.A., Pinaev G.P. Aotin-binding proteins involved in the oapping of epidermal growth'faotor receptors in A431 oells // Exp. Cell Res. 1991. Vol. 196. P. 255-263.

11. Kwiatkowska K., Khrebtukova I.A., .Sobota A. Partioipa tion of membrane skeleton proteins in aggregation of epidermal growth faotor reoeptore in A431 cells // Acta Biochimioa Poloni-ca. 1991. Vol.38. P. 201-210.