Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие протеасом и альфа-РНП частиц с фибрилярным актином

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галкин, Витольд Эдуардович, Санкт-Петербург

институт цитологии российской академии наук

на правах рукописи

576.33:577.21?.34:577.353,23

Галкин Витольд Эдуардович

взаимодействие протеасом и а-рнп-частиц с фибриллярным актином

03.00.25-Клеточная биология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата билолгических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор Г.П. Пинаев Доктор биологических наук И.М. Константинова

Санкт-Петербург - 1999.

оглавление

с.

1. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................7

2.1. Строение и свойства малых рибонуклеопротеиновых омплексов........................7

2.1.1. Протеасомы.............................................................................................................7

2.1.1.1. Структура и свойства протеасом........................................................................8

2.1.1.2. Регуляция биологической активности протеасом............................................9

2.1.1.3. Участие протеасом в процессах клеточной регуляции..................................11

2.1.1.4. Взаимодействие протеасом с элементами цитоскелета в клетках млекопитающих..............................................................................................................13

2.1.2. а-Рибонуклеопротеиновый комплекс (а-РНП).................................................14

2.1.2.1. Структура и свойства а-РНП............................................................................14

2.1.2.2. Участие а-РНП в процессах контроля экспресси генов................................15

2.2. Актин и актин связывающие белки.......................................................................17

2.2.1. Структура и свойства молекулы актина.............................................................17

2.2.2. Структура и свойства фибриллярного актина...................................................18

2.2.3. Структура и свойства актинсвязывающих белков............................................20

2.2.3.1. Белки взаимодействующие с в-актином.......................................................20

2.2.3.2. Копирующие белки............................................................................................22

2.2.3.3. Белки связывающиеся вдоль нитей актина.....................................................23

2.2.4. Регуляция взаимодействия актина и актинсвязывающих белков....................26

2.2.5. Участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов....................27

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................................31

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................33

3.1. Культивирование клеток эпидермоидной карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека......................................................................33

3.2. Антитела используемые в работе...........................................................................33

3.3. Иммунофлюоресцентная микроскопия.................................................................34

3.4. Приготовление цитозоля клеток линии А431.......................................................35

3.5. Получение цитозоля клеток печени крыс..............................................................35

3.6. Выделение 268 комплекса......................................................................................35

3.7. Выделение 208-протеасом......................................................................................36

3.8. Выделение а-РНП-частиц из гепатоцитов крысы................................................37

3.9. Аффинная хроматография на колонках с иммобилизованным Б-актином........38

3.10. Взаимодействие 268-комплекса с Б-актином......................................................39

3.11. Взаимодействия 208-протеасом с Б-актином......................................................40

3.12. Взаимодействие а-РНП-частиц с Б-актином......................................................41

3.13. Электрофорез и идентификация белков протеасом и а-РНП-частиц...............41

4. РЕЗУЛЬТАТЫ............................................................................................................43

4.1. Изучение взаимодействия протеасом с Б-актином...............................................43

4.1.1. Распределение протеасом и актиновых структур в нормальных эмбриональных фибробластах человека.......................................................................43

4.1.2. Выявление взаимодействия протеасом гепатоцитов крысы и клеток эпидермоидной карциномы человека А431 с Б-актином методом аффинной хроматографии................................................................................................................48

4.1.3. 268-комплекс непосредственно взаимодействует с Е-актином.......................56

4.1.4. Исследование непосредственного взаимодействия 208-протеасом с Б-актином......................................................................................................................65

4.1.5. Исследование влияния эпидермального фактора роста (ЭФР) на способность протеасом клеток линии А431 взаимодействовать с Б-актином...........................76

4.2. Взаимодействие а-РНП-частиц с Е-актином.........................................................79

4.2.1. Распределение а-РНП-частиц и актиновых структур в нормальных эмбриональных фибробластах человека........................................................................79

4.2.2. Сравнительный анализ белкового состава а-РНП-частицы и 268-протеасомы, выделенных из гепатоцитов крысы................................................................................83

4.2.3. Непосредственное взаимодействие а-РНП-частиц с Б-актином.......................86

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................89

6. ВЫВОДЫ...................................................................................................................101

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................103

1.введение.

Одной из важных и активно развивающихся областей клеточной биологии является изучение молекулярных механизмов функционирования цитоскелета и его участие в регуляторных процессах. Цитоскелет играет важную роль в поддержании формы клетки и в осуществлении многих её двигательных реакций, обеспечивающих такие важные клеточные функции, как деление, эндо- и экзоцитоз, перемещение клеток в пространстве, контакт их с субстратом и с другими клетками (Bershadsky, Vasiliev, 1988). В последнее время появилось много работ свидетельствующих об участии цитоскелета в регуляции экспрессии генов и проведении сигнала с поверхности клетки на ядро (Bissel, Barcellos-Hoff, 1987). Было показано, что механические усилия, вызываемые взаимодействием лиганда с рецептором вызывают локальное перераспределение связанных с актиновыми филаментами рибосом м-РНК и изменение уровня трансляции, что вероятно необходимо для быстрой регуляции синтеза белка (Chicurel et al., 1998). Более того, предполагается, что взаимодействие м-РНК с актиновыми филаментами необходимо для стабилизации м-РНК и осуществления трансляции (Bassell, Singel, 1997). Малые ГТФ-азы активируемые при взаимодействии лиганда с рецептором могут изменять пространственную организацию актинового цитоскелета (Ridley et al., 1992; Chardin et al., 1989; Paterson et al., 1990) через актинсвязывающие белки (Lassing, Linberg, 1985; Yin, 1987), что может являться способом передачи сигнала в ядро, так как способность цитоскелета принимать различные формы пространственной организации может обеспечивать специфичность передаваемой информации (Puck et al., 1990). В некоторых клетках актиновый цитоскелет также принимает участие в транспорте определённых м-РНК из ядра в необходимые компартменты клетки (Sundell, Singer, 1991) и участвует в распределении м-РНК в кортикальной области цитоплазмы (Bassell, Singel, 1997).

В последнее время в многочисленных работах было показано, что, наряду с белок синтезирующей системой, в клетке функционирует система деградации белка в основе которой лежит убиквитин-зависимый протеолиз белков протеасомами (Ciechanover, 1994). Эта система, вероятно, необходима для

уничтожения неправильно синтезированных и денатурировавших белков, так как блокирование протеасом вызывает многократное увеличение синтеза белка теплового шока 70 (hsp70) (Goldberg, 1997). Другой предполагаемой функцией протеасом является участие в проведении сигнала путём изменения концентрации регуляторных клеточных молекул, (Tokumoto et al., 1997; Jariel-Encontre et al., 1997), или их активации (Coux, Goldberg, 1998; Palombella et al, 1994). Предполагается также участие протеасом в рефляции экспресии генов на уровне трансляции, так как протеасомы были впервые выделены в комплексе с нетранслируемой м-РНК (Scherrer et al., 1988), и была показана способность протеасом блокировать трансляцию м-РНК in vitro (Akhayat et al., 1987). Широкий спектр функций протеасом подразумевает наличие эффективной системы распределения этих частиц в клетке. Одной из наиболее вероятных систем распределения может являться актиновый цитоскелет, так как протеасомы, учитывая их функции, должны располагаться в непосредственной близости от областей проведения сигнала и белкового синтеза. Действительно, методом непрямой иммунофлюоресценции была показана солокализация распределения протеасом как с промежуточными филаментами цитоскелета в клетках линии PtKl и HeLa (Grossi de Sa et al., 1997; Scherrer et al., 1988), так и с актиновыми структурами в фибробластах и миобластах человека (De Konto et al., 1997; Arcangeletti et al., 1997). Однако, в литературе отсутствуют данные о способности протеасом к непосредственному взаимодействию с фибриллярным актином. Изучение взаимодействия протеасом с актиновым цитоскелетом является необходимым для выявления роли актиновых структур в регуляторных процессах. Поскольку, а-РНП-частицы обладают сходными с протеасомами биохимическими свойствами (Константинова и др., 1987; Konstantinova et al., 1988), и также предполагается их участие в регуляции экспрессии генов (Константинова, Петухова и др., 1996; Константинова и др., 1995; Константинова, Ветцкер и др., 1994), то вполне возможно участие актинового цитоскелета в распределении и функционировании этих частиц. Поэтому, целью настоящей работы являлось изучение взаимодействия протеасом и а-РНП-частиц с F-актином.

Проведённое исследование позволило получить ряд новых и принципиально важных результатов. Было показано, что в нормальных эмбриональных фибробластах человека распределение протеасом и а-РНП-частиц солокализуется с распределением актина в кортикальной области, в случае протеасом, и в местах расположения стресс-фибрилл, в случае а-РНП. Методом аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованным актином была продемонстрирована способность протеасом клеток печени крысы и клеток эпидермоидной карциномы человека (линии А431) специфически связываться с Б-актином. Поскольку, с Б-актином в этих опытах связывался ряд других актинсвязывающих белков, была исследована способность очищенных 268-комплекса (268-протеасом) и 208-протеасом (просом) непосредственно взаимодействовать с Б-актином. Было установлено, что 268-комплекс, состоящий из 208-протеасомы и 198-регуляторного комплекса, взаимодействует с фибриллярным актином АТФ-зависимо, а субъединицы 208-протеасомы способны к сборке на актиновых нитях. Также было продемонстрировано, что при действии на клетки линии А431 эпидермального фактора роста, способность протеасом этих клеток взаимодействовать с Б-актином не изменяется. В настоящей работе было показано, что в состав а-РНП-частиц и 268-комплекса входят идентичные по молекулярным массам и иммунологическим свойствам белки. Эти данные коррелируют со способностью а-РНП-комплекса, подобно 268-протеасомам, образовывать с Б-актином высокомолекулярный комплекс.

Совокупность данных, полученных в работе, указывает на наличие непосредственного взаимодействия протеасом и а-РНП-частиц с актиновыми структурами в клетке, что позволяет предполагать участие актинового цитоскелета в регуляции активности и/или распределении этих РНП-комплексов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 2.1. Строение и свойства малых рибонуклеопротеиновых комплексов.

В ядрах и цитоплазме эукариотических клеток выявлены различные классы малых рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП-комлексов). Помимо, наиболее хорошо изученных ядерных U-РНП-частиц, принимающих участие в сплайсинге, и цитоплазматических сигнал-узнающих частиц (SRP-частиц), участвующих в трансляции и транспорте белков через мембрану эндоплазматического ретикулюма (Dreyfuss, 1986), в последние десятилетия выявлено несколько новых классов малых РНП. Наиболее охарактеризованными являются La-РНП, Ro-РНП, протеасомы и а-РНП (Dreyfuss, 1986; Spohr et al., 1970; Konstantiniva, 1984). Протеасомы и а-РНП являются РНП-комплексами, содержащими короткую РНК, и обладают сходными физико-химическими, морфологическими и биохимическими свойствами. Поскольку, целью настоящей работы является изучение взаимодействия протеасом и а-РНП с актиновым цитоскелетом, то свойства этих частиц будут подробно обсуждаться в этом разделе.

2.1.1. Протеасомы

Протеасомы (просомы, 208-комплекс) - новый класс малых рибонуклеопротеиновых (РНП) частиц, были впервые обнаружены методом электронной микроскопии в клетках линии HeLa в 1970 году (см. обзор Scherrer, Bey, 1994). За последние 25 лет было показано, что протеасомы являются неотъемлемым компонентом эукариотической клетки. Протеасомы были обнаружены в растительных клетках (Kremp et al., 1986), дрожжах (Arrigo et al., 1987), в клетках амфибий (Kleinsschidt et al., 1983), насекомых (Arrigo et al., 1985; Schuldt, Kloetzel, 1985), птиц (Schmid et al., 1984) и млекопитающих (Narayan, Rounds, 1973). He так давно, протеасомы были выделены из архебактерий (Dahlmann et al., 1989; Maupin-Furlov, Ferry, 1995) и эубактерий (Tamura et al., 1995). В клетках эукариот протеасомы присутствуют не только в цитоплазме, но и в ядре (Domae et al., 1982; Hugle et al., 1983). Наличие протеасом в столь

различных организмах говорит о чрезвычайной важности и универсальности биологических механизмов в которых принимают участия протеасомы.

2.1.1.1. Структура и свойства протеасом.

20S-npoTeacoMa является очень стабильным комплексом с молекулярной массой около 720 кДа содержащим характерный набор белков с молекулярной массой 19-36 кДа (Kloetzel, 1987). Во многих работах показано наличие в протеасомах РНК длинной от 50 до 150 нуклеотидов (Schuldt, Kloetzel, 1985; Schmid et al., 1984), но некоторые авторы РНК не обнаружили (Kleinsschidt et al., 1983). Устойчивость комплекса к воздействию 1.5 M растворов солей одновалентных металлов, 1% раствору неионного детергента саркозила свидетельствует о высоком сродстве образующих частицу белков (Kloetzel, 1987). Протеасомы, выделенные из различных организмов, морфологически не различаются, и имеют вид цилиндров, сложенных из четырех колец, каждое из которых содержит семь субъединиц (Baumeister, Lupas, 1997). Прокариотические протеасомы, имеющие наиболее простую структуру, состоят из двух видов субъединиц - а, образующих внешние кольца, и ß, образующих внутренние. Эукариотические протеасомы обычно включают 14 различных белков, которые подразделяют на а и ß-типы (Tanaka, 1995; Puhler et al., 1994; Tamura et al., 1995; Coux et al., 1994). Количество составляющих частицу белков ограничивается количеством субъединиц, поэтому конститутивные белки ß-типа могут замещаться индуцибельными белками того же типа, что вероятно приводит к изменению субстратной специфичности и активности протеасом в ферментативных реакциях (Brown et al., 1993; , Akiyama et al., 1994; , Nandi et al., 1995). Так например, было показано значительное увеличение синтеза ß-белков LMP2, LMP7 и MESL1 при действии на клетку у-интерферона (Monaco, Nandi, 1995). Предполагается, что белки ос-типа участвуют в транслокации субстрата в активный центр протеасомы, образуемый двумя внутренними кольцами, состоящими из белков ß-типа, а также участвуют в присоединении регуляторных комплексов (Baumeister, Lupas, 1997).

Исследования протеолитических свойств протеасом показали, что этот ферментативный комплекс обладает трипсиновой, химотрипсиновой и пептидилглютамил гидролазной активностью и относится к недавно открытым N-терминальным нуклеофильным гидролазам (Ntn-гидролазам) (Branningan, 1995). Из четырнадцати субъедениц Р-типа, образующих внутренние кольца, только три обладают протеолитичской активностью (Seemuller, 1995). Функция остальных субъединиц остаётся неизвестной, но мутации в их аминокислотной последовательности приводят к утере протеолитической активности комплекса.

Как многие протеазы, белки р-типа синтезируются в виде неактивных предшественников. Удаление пропептидов, имеющих длину от 4 до 70 аминокислотных остатков, происходит при сборке частицы автокаталитически (Seemuller et al., 1996; Chen, Hocstrasser, 1996), что позволяет уберечь клеточные белки от неконтролируемого протеолиза. Для прокариотических протеасом было показано, что матрицей для сборки частицы являются самособирающиеся кольца, состоящие из а-субъединиц. Данные о сборке эукариотических протеасом крайне фрагментарны. Предполагается, что сборка частиц происходит в два этапа: вначале образуется частица-предшественник с константой седиментации 15S, представляющая собой половину протеасомы с незрелыми белками Р-типа, а затем, происходит объединение предшественников с образованием зрелой протеасомы (Fentzel, 1994). Важную роль в сборке эукариотических протеасом играют удаляемые впоследствии сигнальные последовательности (Chen, Hocstrasser, 1996).

2.1.1.2. Регуляция биологической активности протеасом.

Существует, по крайней мере, два основных пути регуляции протеолитической активности протеасом:

1.- регуляция синтеза предшественников субъединиц, часть которых является индуцибельными белками, и регуляция сборки частицы

2. - присоединение к зрелой протеасоме регуляторных комплексов. Эти пути тесно взаимосвязаны.

Наиболее изученными регуляторами протеасом являются 1 IS-комплекс (РА28) и 19S-KOMruieKC (РА700), присоединение которых зависит от белкового состава данной частицы и/или действия на клетку регуляторных молекул.

1 IS-комплекс, имеющий молекулярную массу 200 кДа, состоит из двух гомологичных полипептидных цепей, называемых РА28а �