Участие альфа-актинина 4 в регуляции экспрессии генов и контроле сплайсинга мРНК

Аксенова, Василиса Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие альфа-актинина 4 в регуляции экспрессии генов и контроле сплайсинга мРНК
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Участие альфа-актинина 4 в регуляции экспрессии генов и контроле сплайсинга мРНК"

На правах рукописи

о Л

АКСЕНОВА ( Василиса Юрьевна п^

УЧАСТИЕ АЛЬФА-АКТИНИНА 4 В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И КОНТРОЛЕ СПЛАЙСИНГА мРНК

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2013

Санкт-Петербург 2013

005058765

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Тентлер Дмитрий Генрихович Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Корнилова Елена Сергеевна Институт цитологии РАН

кандидат биологических наук Голубкова Елена Валерьевна Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Ведущая организация:

Федеральный центр крови, сердца и эндокринологии им. В.А. Алмазова

Защита диссертации состоится «31» мая 2013 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Адрес электронной почты Института: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ni Сайт: http://www.cvtspb.rssi.ru Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан <29 > апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы

Изучение роли актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов представляет собой одно из наиболее актуальных направлений в современных исследованиях механизмов передачи сигнала в клетке. За последние несколько лет появилось большое количество экспериментальных данных, описывающих ранее неизвестные функции белков актинового цитоскелета. Эти данные ставят под сомнение прежние представления о том, что цитоскелет выполняет лишь структурные функции. Тем не менее, механизмы, посредством которых белки цитоскелета вовлечены в регуляцию экспрессии генов и механизмы передачи сигнала в клетке, пока недостаточно хорошо изучены.

Актин и актин-связывающие белки, как основные компоненты цитоскелета, являются ключевыми элементами клетки, обеспечивающими поддержание формы клетки, клеточную адгезию, подвижность клетки, активность ионных каналов, секрецию, апоптоз и выживание клеток (Papakonstanti, Stournaras, 2008). К настоящему моменту многие из белков цитоскелета обнаружены в ядре. Показано, что актин принимает участие в процессе элонгации транскрипции, сборке пре-инициирующего комплекса, связывается с первичными транскриптами РНК и участвует в регуляции экспрессии генов (Percipalle, 2013). Актин-связывающие белки, такие как гельзолин, профилин, кофилин, спектрин, филамин, альфа-актинин 4 и некоторые другие, взаимодействуют с транскрипционными факторами и принимают участие в регуляции экспрессии генов, созревании и экспорте мРНК, репарации ДНК, митозе и реорганизации хроматина (Gettemans et al., 2005). Механизмы участия актина и актин-связывающих белков в данных процессах, протекающих в ядре, широко исследуются, что, в свою очередь, помогает продвинуться в понимании основных этапов передачи сигнала от поверхности клетки в ядро.

Альфа-актинин 4 (ACTN4) является актин-связывающим белком спектринового суперсемейства. Он принимает участие в формировании актинового цитоскелета и, как следствие, играет важную роль в формировании фокальных контактов, процессе миграции клеток и цитокинезе (Honda et al., 1998; Jayadev et al., 2012). Наследственные мутации в последовательности гена ACTN4 приводят к специфическому нарушению развития почек у человека (Weins et al., 2005). Наличие одного из сплайсинговых вариантов ACTN4 связывают с развитием мелкоклеточной формы рака легкого (Honda et al., 2004). Изменение уровня экспрессии ACTN4 отмечено в опухолевых клетках поджелудочной железы (Kikuchi et al., 2008), яичников (Barbolina et al., 2008), мочевого пузыря (Koizumi et al., 2010) и многих других типах раковых клеток.

Полученные ранее данные свидетельствуют о том, что ACTN4 вовлечен в процесс регуляции активности ряда транскрипционных факторов, таких как NF-кВ (Babakov et al., 2008), MEF2 (Chakraborty et al., 2006) и NF-Y (Poch et al., 2004), а также играет роль коактиватора ядерных рецепторов эстрогена, рецептора активации пероксисом и рецептора ретиноивой кислоты (Khurana et al., 2011, 2012). Эти транскрипционные факторы, в свою очередь, регулируют экспрессию больших групп генов и участвуют в таких процессах, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз. Кроме того, ранее было показано, что ACTN4 входит в состав ядерных белковых комплексов, образованных белками рибонуклеопротеинового семейства hnRNP А2/В1, Al, К, Ml-4, С1/С2 (Khotin et al., 2010). Эти белки принимают участие во многих этапах процесса созревания мРНК, таких как полиаденилирование, контроль сплайсинга, поддержание стабильности и экспорта мРНК из ядра, а также процессах рекомбинации, регуляции транскрипции и стабилизации структуры теломер (Dreyfiiss et al., 2002).

На сегодняшний день остается открытым вопрос о роли ACTN4 в составе вышеуказанных белковых комплексов и участия в процессах, протекающих в ядре и контролируемых этими

комплексами. Эти и многие другие вопросы, связанные с неканоническими функциями ACTN4, определили направление наших исследований.

В экспериментах in vitro по коиммунопреципитации было показано взаимодействие ACTN4 с RelA/p65 субъединицей NF-кВ (Babakov et al., 2008), а также, что он связывается с консенсусной последовательностью ДНК, регулируемой траскрипционным фактором NF-кВ (Большакова, 2009). Эти ранее полученные данные легли в основу более детального исследования функций ACTN4 в регуляции экспрессии генов, регулируемых RelA/p65.

Выявление ACTN4 в составе белковых комплексов с гетерогенными ядерными рибонуклеопротеинами инициировало исследования, связанные с идентификацией процесса, в котором ACTN4 может принимать участие вместе с данной группой белков.

Остается также нерешенным вопрос об импорте ACTN4 в ядро, ввиду отсутствия в структуре ACTN4 классического сигнала ядерной локализации. Это легло в основу третьего направления исследований этой работы, а именно, уточнения механизмов транспорта ACTN4 в ядро и из ядра.

1.2 Цели и задачи работы

Цель данной работы заключалась в выявлении роли ACTN4 в процессах, протекающих в ядре и регулируемых RelA/p65 субъединицей NF-кВ и гетерогенными ядерными рибонуклеопротеинами А2/В1 и А1.

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:

1. Создать экспрессионные конструкции, кодирующие варианты ACTN4 с делециями N-, С-концевых участков и спектриновых доменов белка.

2. Сравнить ядерно-цитоплазматическое распределение экзогенных вариантов ACTN4 с N- и С-концевыми делециями и делецией спектриновых повторов в условиях длительного культивирования и при распластывании клеток на белке внеклеточного матрикса фибронектине.

3. Исследовать влияние ACTN4 на степень активации минимального промотора мышиного гена с-fos при взаимодействии с RelA/p65 субъединицей NF-kB.

4. Провести анализ экспрессии RelA/p65-3aBHCHMbix генов при оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65 субъединицы NF-kB.

5. Определить влияние N-концевых делеций и делеции спектриновых повторов ACTN4 на регуляцию экспрессии генов, контролируемых RelA/p65 субъединицей NF-kB.

6. Исследовать влияние ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга мРНК генов РКМ1/РКМ2 и SMN1/SMN2.

7. Проверить наличие сплайсинговой изоформы ACTN4 с делецией кальпониновых доменов белка в нормальных и злокачественных клетках человека.

1.3 Основные положения, выносимые на защиту

1. Ядерно-цитоплазматический транспорт ACTN4 определяется более чем одним доменом в структуре белка.

2. Спектриновые повторы, N- и С- концевые домены ACTN4 существенны для его взаимодействия со структурами актинового цитоскелета.

3. ACTN4 является коактиватором RelA/p65 субъединицы NF-kB.

4. Димеризация и взаимодействие ACTN4 с актином не является необходимым для его функций как коактиватора RelA/p65 субъединицы NF-kB.

5. ACTN4 не является необходимым элементом комплекса, регулирующего сплайсинг мРНК генов РКМ1/РКМ2 и SMNI/SMN2.

6. Изоформа ACTN4 с делецией кальпонин-гомологичных доменов белка является специфичной для клеток линии А431.

1.4 Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые представлены данные о регуляции экспрессии RelA/p65-зависимых генов, таких как c-fos, металлопротеиназы 3-го (ММР-3) и 1-го (MMP-I) типов, посредством актин-связывающего белка альфа-актинина 4 (ACTN4). Проведен анализ влияния делеционных вариантов ACTN4 на экспрессию гена ММР-3 в сравнении с полноразмерным вариантом ACTN4. Показано, что ACTN4 с делецией спектриновых и кальпониновых доменов сохраняет способность регулировать экспрессию гена ММР-3, что, в свою очередь, позволяет сделать предположение о том, что ACTN4 в ядре потенциально может функционировать в виде мономера. Впервые проведен анализ влияния ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга генов РКМ1/РКМ2 и SMN1/SMN2, регуляция сплайсинга которых опосредована hnRNP А2/В1 и Al. Показано, что делеции спектриновых повторов белка и N-концевого участка, включающего домены связывания с актином, не препятствуют перемещению ACTN4 в ядро, а для экспорта ACTN4 из ядра достаточно одной из двух идентифицированных NES-последовательностей в ACTN4.

1.5 Теоретическое н практическое значение работы

Полученные результаты имеют фундаментальное значение для понимания механизмов участия белков цитоскелета в процессах, протекающих в ядре, таких как, регуляция транскрипции и сплайсинг пре-мРНК. В связи с тем, что мутации в гене ACTN4 приводят к развитию фокально-сегментарного гломерулосклероза - заболевания, связанного с нарушением нормального функционирования подоцитов, а оверэкспрессия ACTN4 отмечена при многих злокачественных заболеваниях, исследование функций ACTN4 приобретает не только фундаментальный, но и прикладной характер. Кроме того, данные, полученные в ходе исследовательской работы, могут быть использованы для включения их в учебные пособия и курсы лекций Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербургского государственного технологического университета, Санкт-Петербургского государственного политехнического университета и других вузов с факультетами биологического профиля.

1.6 Личный вклад автора

Все исследования, проведенные в работе, в том числе обработка результатов, выполнены лично автором. Анализ изоформ ACTN4 в клетках А431 и ядерно-цитоплазматического распределения RelA/p65 субъединицьг NF-кВ в клетках линии НЕК293Т проведено совместно с Хотиным М.Г. Во всех совместных работах вклад автора был определяющим. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

1.7 Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VIII Международном конгрессе медицинских наук (ICMS) (София, 2009), Международном молодежном симпозиуме и конгрессе FEBS (Гетеборг, 2010), 2-ой Молодежной конференции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010), 3-ей Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012).

1.8 Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2013), РФФИ (мол а 12-04-32194, 13-04-00497 А2013), Европейского биохимического общества Collaborative Experimental Scholarship for Central & Eastern Europe, Carl Zeiss, гранта Правительства Российской Федерации № 11 .G34.31.0069 и программы Visby Шведского института.

1.9 Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из которых 4 статьи в рецензируемых журналах и 7 тезисов.

1.10 Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 источника. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал содержит 18 рисунков и 7 таблиц.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Клеточные культуры

Клетки эпидермоидной карциномы А431 были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Клетки эмбриональной почки человека НЕК293Т любезно предоставлены д.б.н. А.Н. Томилиным (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия). Описанные типы клеток культивировали в среде DMEM (Биолот) с добавлением 10 % телячьей сыворотки (Sigma), L-глутамина (Gibco), 200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина (Gibco) (далее по тексту - полная среда культивирования) в атмосфере 5 % С02 при 37 С.

Первичная культура кератиноцитов, полученных по методу Рейнвальда с модификациями (Блинова и др., 2002), и фибробластов, полученных методом миграции клеток из фрагментов нормальной кожи взрослых доноров (Юдинцева и др., 2008), были любезно предоставлены группой клеточной биотехнологии к.б.н. М.И. Блиновой.

Клеточный материал для получения белковых лизатов линий SK-MEL5, А375, А375Р, WM2664, SK.-MEL28, HS-695T, UMUC-3, J82, Н522, А549, Н520, Н1299, Н1650, Н358, Н23, Н460, MCF7, MDA-468, MDA-MB-231, ВхРС-3, PANC-1, MIA РаСа-2, AsPC-1 были любезно предоставлен доктором Е. Тульчинским (Университет г.Лестер, Великобритания).

2.2 Генетические конструкции

Плазмида pCX-EGFP - 5510 п. о. (любезно предоставлена д.б.н. А.Н.Томилиным (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия), содержит ген eGFP под контролем CMV промотора; ген устойчивости к ампициллину.

Генетические конструкции, кодирующие RelA/p65 и р50 под контролем CMV промотора, и pfLUC кодирующая ген люциферазы под контролем минимального промотора (с -56-го по +109-ое положение относительно начала инициации транскрипции) мышиного гена c-fos и pcDNA3.0, были любезно предоставлены доктором Е. Тульчинским (Университет г. Лестер, Великобритания).

Плазмида pCMV-LacZ содержит ген, кодирующий бета-галактозидазу под контролем CMV промотора, и ген устойчивости к ампициллину (любезно предоставлена д.б.н. Н. А. Барлевым, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия).

Плазмида pCS2MT - 4352 п. о. (любезно предоставлена д.б.н. А.Н. Томилиным (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия), содержит CMV промотор, ген устойчивости к ампициллину, 6 раз повторенную последовательность MYC-Tag. На основе вектора pCS2MT были сконструированы экспрессионные плазмиды pCS2MT-ACTN4Fl, pCS2MT-ACTN4delCHl-2, pCS2MT-ACTN4delSR 1 -4, pCS2MT-ACTN4delN, pCS2MT-ACTN4delC и pCS2MT-ACTN4delEF2. Клонирование фрагментов, кодирующих различные домены ACTN4, в вектор pCS2MT проводили по сайтам рестрикции EcoRI и Xbal, с расположением последовательности, кодирующей маркерный пептид Мус, на N-конце всех вариантов кДНК. Клонирование полноразмерного ACTN4 проводили с помощью кДНК, предварительно полученной в ходе реакции обратной транскрипции с помощью олиго(йТ)праймеров из тотальной РНК клеток эпидермоидной карциномы А431. Реакцию обратной транскрипции проводили согласно протоколу фирмы-производителя для набора Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва). Амплификация фрагментов ACTN4 была произведена с помощью метода ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы. Полученные варианты кДНК были секвенированы с помощью набора для секвенирования DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amercham Pharmacia Biotech) на приборе GE Amersham MegaBACE 1000.

2.3 Анализ экспрессии генов, регулируемых RelA/p65 субъединицей NF-кВ

Для анализа уровня экспрессии генов был использован метод полуколичественной ОТ-ПЦР (обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция).

Клетки линии НЕК293Т трансфицировали экспрессионными плазмидами, кодирующими RelA/p65 и ACTN4. Трансфекцию проводили в 6-луночных планшетах (Nunc). За день до проведения трансфекции клетки рассевали в плотности 2.4х 105 кл./лунку в полной среде культивирования. За два часа до проведения трансфекции проводили смену культуральной среды на свежую. Процедуру трансфекции проводили при помощи реагента Turbofect (Thermofïsher) согласно рекомендациям фирмы-производителя. На следующий день после проведения трансфекции снова проводили смену среды на свежую. Через 67 ч после проведения трансфекции удаляли среду для культивирования, клетки промывали буфером PBS и выделяли тотальную РНК с последующим получением кДНК, как было описано ранее. В реакцию обратной транскрипции брали 2500 нг РНК. Анализ качества и количества выделенной РНК проводили при помощи спектрофотометра NanoDrop (Thermofïsher) и методом ПЦР с помощью праймеров к мРНК гена I8S рибосомной РНК и мРНК гена GAPDII. Реакцию ПЦР проводили согласно протоколу, предлагаемому компанией Fermentas, в однократном реакционном буфере для Taq ДНК-полимеразы, с содержанием 0.2 мМ dNTP, 2 мМ MgCl2, 1 мкМ каждого праймера и 0.1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы. Продукты ОТ-ПЦР разделяли методом горизонтального агарозного электрофореза с последующей визуализацией на приборе Chemidoc XRS (BioRad) и при помощи пакета программного обеспечения Quantity One 1-D. Статистическое сравнение средних трех и более независимых экспериментов проводили с помощью /-теста Стьюдента.

2.4 Иммунофлуоресцеиция

Трансфицированные экспрессионными конструкциями, клетки линии НЕК293Т в количестве 1.6х 105 кл./мл наносили на покровные стекла, покрытые поли-О-лизином (Р7280, Sigma) или силиконизированные, покрытые белком внеклеточного матрикса фибронектином (F0895, Sigma).

Трансфекцию клеток НЕК293Т проводили при помощи реагента Turbofect (Thermofïsher) согласно рекомендациям производителя. Через 24 ч после проведения трансфекции, клетки снимали раствором трипсин-версена (1:3) (Биолот) и культивировали в течение 24 ч на стеклах,

покрытых поли-Б-лизином, или в течение 1 ч на стеклах, покрытых фибронектином, при 37 С в атмосфере 5 % ССЬ. Далее клетки фиксировали в 10 %-ном растворе формалина, приготовленном на PBS, в течение 15 мин и проводили пермеабилизизацию в 0.1 %-ном растворе тритона Х-100, приготовленном на PBS, в течение 6 мин. Перед инкубированием препаратов со специфическими антителами, стекла обрабатывали 2 %-ным раствором BSA (Sigma) в течение 30 мин для уменьшения неспецифического связывания. Выявление локализации экзогенных вариантов ACTN4 проводили с помощью мышиных моноклональных антител против маркерного пептида MYC (М4439, Sigma) и вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем FITC, против иммуноглобулинов мыши (А21200, Invitrogen). Инкубирование с антителами проводили в течение 40 мин при комнатной температуре. По истечении этого времени клетки промывали три раза раствором PBS, содержащем 0.1 % Tween-20. Цитоскелет окрашивали 20 %-ным раствором родамин-фаллоидина, ядра - раствором DAPI (1 мкг/мл). Фиксацию препаратов осуществляли в заключающей среде Mounting Medium (Vector Laboratories). Препараты исследовали с помощью лазерного конфокального микроскопа TOS SP5 (Leica). Применяли раздельное сканирование сигналов для FITC (488 нм), родамин-фаллоидина (543 нм) и DAPI (405 нм) с последующим совмещением сигналов при поддержке программного обеспечения Leica TCS. Изображения получали, используя масляный инвертированный объектив с увеличением ЮОх.

2.5 Люниферазный тест на активность RelA/p65

Клетки А431 рассовали в плотности 6x104 кл./лунку в 24-х луночном планшете за день до проведения трансфекции. Клетки культивировали при 37 С в атмосфере 5 % СО2 до достижения 90-95 % монослоя на полной среде культивирования. Трансфекцию клеток А431 проводили при помощи реагента Lipofectamine 2000 (11668-027, Invitrogen) согласно рекомендациям фирмы-производителя. В связи с токсичностью реагента для клеток А431 трансфекцию проводили на среде Opti-MEM (Gibco) без антибиотиков и через 6 ч после проведения трансфекции проводили смену среды на свежую полную среду. Общее количество ДНК при проведении трансфекции составляло 3000 нг/лунку, экспрессионный вектор pcDNA3.0 был использован для поддержания одинаковой нагрузки ДНК во всех лунках. Анализ влияния ACTN4 на активность RelA/p65 субъединицы NF-кВ проводили с помощью вектора pfLUC, содержащего ген люциферазы под контролем минимального мышиного промотора гена c-fos (-56-го по +109-ое положение относительно старта инициации транскрипции). Через 30 ч после проведения трансфекции, клетки лизировали в однократном лизирующем буфере (6.25 мМ Трис-HCl pH 7.8, 10 мМ ДТТ, 10 мМ ЭДТА, 50% глицерол, 5% Тритон Х-100). Активность люциферазы определяли с помощью набора Luciferase assay (К801-200, BioVision). Реакцию проводили из расчета 100 мкл субстрата А (входит в состав набора) и 100 мкл субстрата В (входит в состав набора) на 20 мкл лизата. Активность люциферазы определяли при помощи люменометра Victor Х5 (Perkin Elmer). Результаты люциферазного теста нормализовали относительно экспрессии бета-галактозидазы. Активность бета-галактозидазы измеряли при длине волны 405 нм после предварительной инкубации в течение 15 мин при 37 С 80 мкл лизата и 100 мкл буфера для бета-галактозидазы (60 мМ Na2HP04, 40 мМ NaH2P04, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0.35% бета-меркаптоэтанол, 0.2 % о-нитрофенил-р-галактопиранозид).

2.6 Выделение белков

Экстракты из культур клеток А431, НЕК293Т, SK-MEL5, А375, А375Р, WM2664, SK-MEL28, HS-695T, UMUC-3, J82, Н522, А549, Н520, Н1299, Н1650, Н358, Н23, Н460, MCF7, MDA-468, MDA-MB-231, ВхРС-3, PANC-1, MIA РаСа-2, AsPC-1 получали путем лизиса клеток в буфере, содержащем 6.25 мМ Трис-HCl pH 7.8, 10 мМ ДТТ, 10 мМ ЭДТА, 50% глицерол, 5 %

Тритон Х-100 и ингибиторы протеаз 1:50 (04 693 132 001, Roche), в течение 20 мин при +4 °С и двух последующих этапов замораживания-оттаивания при -80 С/+4 С. Экстракты белков смешивали с пятикратным буфером Laemmli (60 мМ Трис-НС1, 2 % SDS, 10 % глицерол, 5 % ДТТ, 0.01 % бромфенол) в соотношении 1:5 и проводили денатурацию в течение 7 мин при 98 С.

Для получения цитоплазматических и ядерных лизатов клетки, перед снятием с флаконов, промывали буфером PBS, нагретым до 37 С, для удаления остатков среды. Затем клетки снимали при помощи резинового скребка и отмывали в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl pH 8.0, 0.32 М сахарозы, 20 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТЛ, 1 мМ ДТТ, 0.05 мМ PMSF и ингибиторы протеаз (Бабаков и др., 2004). После центрифугирования клетки ресуспендировали в том же буфере и инкубировали 20^t0 мин (до момента лизиса) во льду. Для выделения и очистки ядер клеточный лизат 20 раз пропускали через иглу 21G. Ядра осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 3000 g и 4 С, ресуспендировали и очищали, осаждая в 0.5 М сахарозе при тех же условиях. Сохранность, чистоту и количество ядер контролировали под микроскопом в камере Горяева. Выделение ядерной белковой фракции, содержащей транскрипционные факторы, проводили в течение 30 мин при температуре 4 "С в буфере, содержащем 400 мМ NaCl, 20 мМ HEPES pH 7.9, 25 % глицерина, 1.5 мМ MgCb, 0.4 мМ ЭДТА, 0.4 мМ PMSF, 1 мМ ДТТ и ингибиторы протеаз, с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 10 000 g. Экстракты белков смешивали с пятикратным буфером Laemmli (60 мМ Трис-HCl, 2% SDS, 10% глицерол, 5% ДТТ, 0.01 % бромфенол) в соотношении 1:5 и проводили денатурацию в течение 7 мин при 98 С.

2.7 Иммуиопрецнинтация

К цитоплазматическим лизатам, полученным как описано выше, добавляли протеин G-сефарозу (GE Healthcare) и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 2 ч при 4 °С для удаления из пробы белков, неспецифически связывающихся с сефарозой. Затем сефарозу осаждали (2000 g, 3 мин, 4 С), а супернатант переносили в новые пробирки и инкубировали с антителами к RelA/p65 субъединице NF-kB, коньюгированными с протеин G-сефарозой (sc-8008 АС, в соотношении 1:200), в течение ночи. На следующий день, иммунопреципитаты отмывали 4 раза буфером PBS, содержащим ингибиторы протеаз, на льду, смешивали с пятикратным буфером Laemmli (60 мМ Трис-HCl, 2 % SDS, 10 % глицерол, 5 % ДТТ, 0.01 % бромфенол) в соотношении 1:5 и проводили денатурацию в течение 7 мин при 98 С.

2.8 SDS-электрофорез и иммуиоблоттинг

Белковые пробы разделяли в ПААГ, содержащем 10% SDS, при силе тока 100мА/см2 в течение 1-2 ч в однократном трис-глициновом буфере с 0.1 %-ным содержанием SDS. Гель, после проведения электрофореза, инкубировали в однократном буфере для переноса pH 8.3 с 10 %-ным содержанием метанола в течение 1 ч. Перенос белков с геля на мембрану PVDF (Millipore) проводили в течение ночи в трис-глициновом буфере при силе тока 20 мА/см2. Предварительно мембрану фиксировали в метаноле в течение 1 мин и высушивали при комнатной температуре. Перед инкубированием мембраны с антителами ее предварительно инкубировали в течение 1 ч в 5 %-ном растворе молока, приготовленного на буфере PBST (PBS, содержащий 0.1 % Tween-20). После этого мембрану отмывали буфером PBST и инкубировали в течение ночи со специфическими первичными антителами при 4 С. Далее мембрану трижды отмывали буфером PBST, инкубировали 1 ч со специфическими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, проводили шестикратную отмывку буфером PBST и визуализировали с помощью люминофора ECL (1.25 мМ люминол, 0.2 мМ паракумаровая кислота и 0.01 % Н202 в 150 мМ Трис-HCl рП 8.8). Хемилюминисценцию регистрировали на приборе Chemidoc XRS (BioRad).

Моноклональные мышиные антитела к маркерному пептиду MYC (М4439, Sigma) разводили в соотношении 1:2000; кроличьи поликлональные антитела к р65 субъединице транскрипционного фактора NF-кВ (sc-372, Santa Cruz Biothechnology) - 1:300; мышиные моноклональные антитела к актину (АС-17; Sigma) - 1:1000; кроличьи поликлональные антитела к ACTN4 (IG701, ImmunoGlobe); кроличьи моноклональные антитела к GAPDH (14С10, Cell Signaling) - 1:1000; антитела против иммуноглобулинов мыши (А9044, Sigma) и кролика (А0545, Sigma), коньюгированные с пероксидазой хрена, - 1:10000; антитела против иммуноглобулинов мыши (А21200, Invitrogen) и кролика (Al 1008, Invitrogen), коньюгированные с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488, - 1:350.

2.9 Анализ влияния оверэкспрессии ACTN4 на процесс сплайсинга генов РКМ1/РКМ2 и SMN1/SMN2

Анализ влияния оверэкспрессии ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга генов РКМ1/РКМ2 и SKÍN1/SMN2 проводили методом ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом полученных фрагментов. Трансфекцию клеток НЕК293Т и А431 проводили при помощи реагента для трансфекции Lipofectamin 2000 (Invitrogen), согласно протоколу фирмы-производителя, выделение РНК и клеточных экстрактов - методом, описанным выше. Качество и количество полученной с помощью олиго(с1Т)праймеров кДНК до проведения ПЦР оценивали с помощью праймеров к мРНК гена GAPDH.

Для проведения ПЦР кДНК гена РКМ были использованы пары праймеров F PKM 5' CTGAAGGCAGTGATGTGGCC 3' (прямой) и R PKM 5' ACCCGGAGGTCCACGTCCTC 3' (обратный) (Chen et al., 2010). Далее, полученный фрагмент размером 442 п.н. обрабатывали рестриктазой Pst] и анализировали соотношение фрагментов, соответствующих РКМI варианту (442 п.н.) и PKU2 варианту (246 п.н., 196 п.н.).

Для проведения ПЦР кДНК гена SMN были использованы пары праймеров F SMN 5' CTCCCATATGTCCAGATTCTCTT 3' (прямой) и R SMN 5' CTACAACACCCTTCTCACAG 3' (обратный). После проведения ПЦР полученные фрагменты размером 505 п.н. (SMN1/2) и 451 п.н. (SKÍN2) обрабатывали рестриктазой Ddel и анализировали соотношение фрагментов 505 п.н., соответствующих SMN1 варианту, 382 пл., 123 п.н., соответствующих полиоразмерному SMN2 варианту и 328 п.н., 123 п.н., соответствующих укороченному SA4N2 варианту.

Анализ продуктов амплификации и рестрикцпонных фрагментов проводили методом электрофореза в 6 %-ном ПААГ в однократном трис-боратном (TBE) буфере. Подтверждение оверэкспрессии ACTN4F1 проводили методом иммуноблот-анализа с антителами против маркерного пептида МУС.

2.10 Статистическая обработка данных люциферазного теста, электрофореграмм, нммуноблоттинга

Результаты люциферазного теста на активность RelA/p65 выражали как отношение люминисценции к активности бета-галактозидазы. Данные трех и более повторностей каждого эксперимента приводили как среднее значение ±SD (стандартное отклонение). Статистическую значимость разницы между средними определяли с помощью ¿-теста Стьюдента.

Результаты нммуноблоттинга и электрофореграмм после ПЦР анализировали методом денситометрического анализа с помощью пакета программного обеспечения Quantity One 1-D прибора Chemidoc XRS (BioRad).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Делециоцпое картирование ACTN4

ACTN4 как белок актииового цитоекелета играет ключевую роль в процессе перестройки актинового цитоекелета, формировании выпячиваний и адгезии клеток к внеклеточному матриксу. Преимущественно, ACTN4 локализован в цитоплазме, однако в некоторых типах раковых клеточных линий отмечена его ядерная локализация (Honda et al., 1998; Нага et al., 2007; Khotin et al., 2010). Кроме того, перемещение ACTN4 в ядро происходит при обработке клеток цитохолазином Д - агентом, подавляющим полимеризацию мономеров актина, и ингибиторами Р13-к»назы (Honda et al., 1998; Бабаков и др., 2004). Следует также отметить, что ACTN4 не содержит классического сигнала ядерной локализации, и механизмы его транспорта в ядро исследованы не полностью. В связи с этим одной из задач данной работы было выявление участков ACTN4, которые могут участвовать в ядерных функциях белка и отвечать за его перемещение в ядро. Выбор участков для проведения делеционного картирования ACTN4 проводили на основании данных о функциях ACTN4 в цитоплазме, а также данных по взаимодействию ACTN4 с его ядерными белковыми партнерами.

Клонирование кДНК полноразмерного ACTN4, так же, как и создание делеций в последовательности ACTN4, было выполнено методом ПЦР, с помощью специфических пар праймеров. В ходе клонирования ACTN4 в клетках А431 была идентифицирована новая изоформа мРНК (рис. 1, А, Б, В, Г). Методом секвенирования была установлена нуклеотидная последовательность данной изоформы и было выявлено, что она образуется в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена ACTN4 путем вырезания участка со 2-го по 8-й экзон включительно (рис. 1, Д). Данные о структуре выявленной изоформы ACTN4 были внесены в единый реестр базы данных NCBI, которому был присвоен персональный идентификационный номер GeneBank GU 987085 (Аксенова и др., 2012).

Отсутствие кальпониновых доменов в структуре обнаруженной нами изоформы, в свою очередь, определило ее последующее изучение в качестве делеционного варианта ACTN4, потенциально не способного взаимодействовать с F-актином.

Таким образом, в ходе работы были созданы экспрессионные конструкции: pCS2MT-ACTN4F1, pCS2MT-ACTN4delCH 1 -2 (ACTN4 с делецией кальпониновых доменов белка), pCS2MT-ACTN4FldelN (деления 1-го - 294-й а.о.), pCS2MT- ACTN4FldelC (делеция 753-го -911-й а.о.), pCS2MT- ACTN4FldelEF2 (делеция 806-го - 911-й) и pCS2MT-ACTN4FldelSRl-4 (делеция 293-го - 752-й а.о.). Анализ нуклеотидной последовательности, точность встраивания и отсутствие сдвига рамки считывания проверяли методом ПЦР и секвенированием, с последующим анализом спектра нуклеотидной последовательности в программном обеспечении Sequence Scanner (Applied Biosystems) и NCBI Blast. Теоретическое определение молекулярной массы экзогенных вариантов ACTN4 проводили с помощью ExPASy Proteomics Server, Science Gate Protein Molecular Weight Calculator. Подтверждение экспрессии полноразмерного и делеционных вариантов ACTN4 проводили с помощью SDS-ПААГ электрофореза и иммуноблоттинга с антителами против маркерного пептида МУС, расположенного с N-конца относительно последовательности ACTN4.

Полиара мерный ACTN4

141 н.к. | 819 и.к.

I '

I I м 11 м I I I I [ I I I I I 1 I _I_I РИК

19 21 экзоны

48 а.о. | 273 а.о.

polyOly CHI СН2 SRI SR2 SR3 SR4 EFI EF2 домены

Силаисиипшя и шформа ACT1S4

^ Л 2-8 зкзонов

I | I I II iir

РНК

1 9

ДСН1.СН2

21 "ЖКШЫ

3 Белок

polyOly SRI SR2 SR3 SR4 EFI EF2 домены

Делецшшные варианты ACTN4

МУС МУС

CHI СН2 SRI SR2 SR3 SR4 EFI EF2 SRI SR2 SR3 SR4 EFI EF2

MYC MYC MYC MYC

CHI Clt2

SRI SR2 SR3 SR4 EFI EF2

EFI EF2

CHI CH2 SRI SR.; SR3 SR4 CHI CH2 SRI SR2 SR3 SR4 EFI

ACTN4F1 ACTN4<le!N

ACTN4deICI11.2 ACTN4delSR 1 -4 ACTN4delC ACT N4delEK2

кДа 104 — j 80 —>

И.о. А431

,уЛ

Ai'S I >'S Ala (Ли Ihr

KQORKAE'TAANR

i vs ^ 'Пн- 1>Ь,-

^ДлДАллш L I \ л Л Л il

ЙШ' tu mmfl

кК(Д?1<КН - ЧУМ

Рис. 1. Структура полноразмерной и сплайсинговой изоформ АСТЖ (А) и делеционных вариантов АСТЖ (Б). (В) иммуноблоттинг ядерного лизата клеток А431 с антителами против АСТШ, стрелками указаны полноразмерная и укороченная изоформы. (Г) ОТ-ПЦР с кДНК гена АСТЫ4 в клетках А431; стрелками указаны полосы на дорожках, соответствующие полноразмерной АСТЫ4Р1 (2736 и.о.) и укороченной изоформе АСТЫ4Ьо (2079 п.о.). (Д) спектры, соответствующие району делеции в АСТЫ4Р1 и АСТМ41во.

3.2 Ядерно-цитоплазматическое распределение экзогенных вариантов АСТМ

Внутриклеточную локализацию экзогенных вариантов АСТЖ определяли методом иммунофлуоресценции с помощью специфических антител против маркерного пептида МУС. Клетки НЕК293Т после проведения трансфекции культивировали на покровных стеклах, предварительно покрытых поли-О-лизином и белком внеклеточного матрикса - фибронектином.

Согласно полученным результатам, внутриклеточное распределение экзогенного АСТЫ4Р1 соответствовало локализации эндогенного АСТЖ (рис. 2, ряд А, поли-О-лизин). Делеция двух кальпониновых доменов белка, Ы-конца и БЯ-доменов приводила к значительному накоплению белка в ядре и нарушению взаимодействия со структурами актинового цитоскелета (рис. 2, ряд Б, В, Г, поли-О-лизин). Внутриклеточное распределение вариантов АСТЫ4 с делецией ЕР2 и делецией всего С-концевого домена было сходным с внутриклеточным распределением полноразмерного АСТЫ4Р1, с небольшим отличием в том, что оба делеционных варианта частично взаимодействовали с актиновым цитоскелетом и частично имели диффузное распределение в цитоплазме (рис. 2, ряд Д, Е).

Поскольку АСТЫ4 является одним из ключевых элементов в процессе формирования фокальных контактов, распластывания клеток и их пролиферации, то перевод клеток в суспензионное состояние, изменение условий культивирования или смена типа субстрата для распластывания могут влиять на характер внутриклеточного распределения АСТМ. Чтобы понять, является ли выявленная нами внутриклеточная локализация делеционных вариантов АСТМ при культивировании клеток на поли-О-лизине универсальной или же делеционные варианты АСТМ могут иметь другое ядерно-цитоплазматическое распределение, клетки, после проведения трансфекции, распластывали на фибронектине. Результаты анализа иммунофлуоресценции показали, что для ряда делеционных вариантов при распластывании клеток на фибронектине внутриклеточное распределение АСТМ сильно меняется. При анализе внутриклеточного распределения делеционных вариантов АСТМсЫЫ, АСТЖ<1е1СН1-2 и АСТМёеКК 1 -4 (рис. 2, ряд Б, В, Г, фибронектин) было показано, что их локализация стала цитоплазматической вместо ядерной, а варианты АСТМёеЮ и АСТМёе1ЕР2 (рис. 2, ряд Д, Е, фибронектин) сохранили прежнюю локализацию. Это говорит о том, что выявленная нами ранее внутриклеточная локализация делеционных вариантов АСТМ при условии культивирования клеток на поли-О-лизине не является универсальной и может изменяться при распластывании на белках внеклеточного матрикса.

Стоит отметить, что, несмотря на сохранение кальпониновых доменов, при делеции спектриновых доменов функции АСТЫ4 как актин-связывающего белка нарушаются практически полностью, в отличие от С-концевых делеций. Этот факт, по всей видимости, связан с тем, что АСШ4 в цитоплазме работает в виде димера, и делеция доменов, обеспечивающих его формирование, является критичной для взаимодействия с фибриллярным актином (Аквепоуа е1 а!., 2013).

3.3 Влияние АСТМ на степень активации минимального промотора мышиного гена с-/оя Яе1А/р65 субъединицей ОТ-кВ

Для того чтобы определить влияние АСТМ на Яе1А/р65 в отношении активации им минимального промотора мышиного гена о/оя, нами была проведена трансфекция клеток линии А431. Клетки трансфицировали репортерной конструкцией, кодирующей ген люциферазы под контролем мышиного промотора гена о/о.? (с -56-го по 109-ое положение) отдельно и в сочетании с плазмидами, кодирующими Яе1А/р65 и р50 субъединицы ОТ-кВ, АСТМ и бета- галактозидазу, с последующим анализом уровня люминисценции через 30 ч после проведения трансфекции.

F-актин

поли-й-лтин фибронектин

MYC Ядро Совмещение F-актин MYC Ядро Совмещение

8 7

J y^rfy

р- j ■ sf v \ 1 1) Г'

xV""'' 'ii 1

Г V v \ . ' J

-fV

A Л 1

( A • Aj y

W - ' m\

ACTN4FI (А)

ACTN4dclN (Б)

ACTN4delCHl-2 (В)

ACTN4delSRI-4 (Г)

ACTN4delC (Д)

ACTN4delEF2 (Е)

Рис. 2. Локализация актинового цитоскелета и пептида МУС в трансфицнрованных клетках НЕК293Т. Культивирование клеток после проведения трансфекции на поли-О-лпзине составило 24 ч, распластывание на фибронсктине - I ч. Ядра окрашены - ПАР! (синий), акгиновый цитоскелет -раствором родамин-фаллоидина (красный), ACTN4 с помощью первичных антител против MYC и вторичных Alexa Fluor 488 (зеленый). Масштабированный отрезок на изображениях 10 мкм (поли-0-лизин) и 25 мкм (фибронектин).

Согласно полученным результатам, оверэкспрессия RelA/p65 приводила к значительному увеличению уровня люминисценции, интенсивность которой служила показателем степени активации промотора. В то время как при совместной оверэкспрессии RelA/p65 субъединицы с р50 субъединицей NF-кВ происходило существенное снижению уровня люминисценции (рис. 3, А). Оверэкспрессия ACTN4 не приводила к активации промотора гена c-fos, однако оверэкспрессия ACTN4 совместно с RelA/p65 способствовала активации промотора и увеличению интенсивности люминисценции в сравнении с оверэкспрессией одного RelA/p65 (Р<0.02). Подтверждение оверэкспрессии ACTN4 проводили методом иммуноблоттинга клеточных лизатов, после разделения их в SDS-ПААГ, с антителами против маркерного пептида MYC (рис. 3, А, нижняя панель). Таким образом, данные результаты свидетельствуют о том, что ACTN4 может играть роль коактиватора RelA/p65 в отношении минимального промотора мышиного гена c-fos (Aksenova et al., 2013).

3.4 Анализ воздействия оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65 субъединицы NF-кВ на экспрессию Ке1А/р65-зависимых генов

Исходя из того, что ACTN4 принимает участие в ReíА/р65-зависимой регуляции экспрессии мышиного гена c-fos, нами было принято решение проанализировать влияние совместной оверэкспрессии обоих генов на другие, регулируемые RelA/p65, гены, а именно, TNC, ВАХ, FN1, FGF8, ICAM1, PTGS2 и ММР-3, относящиеся к различным путям сигнальной трансдукции. Анализ оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65 проводили на клетках линии НЕК293Т, через 67 ч после проведения трансфекции, методом ОТ-ПЦР.

Мы выявили, что уровень мРНК генов, регулируемых RelA/p65, 1САМ1, TNC и, в меньшей степени ММР-3, FGF8 и FN1, возрастает при оверэкспрессии RelA/p65 (рис. 3, Б, Г), тогда как уровень экспрессии ВАХ и PTGS2, при тех же условиях, остается неизменным. Оверэкспрессия ACTN4 не приводила к значительным изменениям уровня экспрессии мРНК исследованных генов, тогда как совместная оверэкспрессия ACTN4 и RelA/p65 приводила к значительному увеличению уровня мРНК металлопротеиназы ММРЗ (рис. 3, Б, нижняя панель). Исходя из того, что оверэкспрессия ACTN4 и RelA/p65 приводила к активации ММР-3, нами было сделано предположение о возможном изменении уровня экспрессии других типов металлопротеиназ, а именно, ММР-2, ММР-9 и ММР-1. Согласно результатам ОТ-ПЦР, уровень мРНК металлопротеиназ ММР-2 и ММР-9 не изменялся при оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65, тогда как для ММР-1 было отмечено увеличение уровня мРНК (рис. 3, Б, нижняя панель). Подтверждение оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65 проводили, как и в случае люциферазного теста, методом иммуноблоттинга с антителами против маркерного пептида MYC, RelA/p65 и GAPDH, а также методом ОТ-ПЦР со специфическими парами праймеров к кДНК генов ACTN4, RelA/p65, 18S и GAPDH.

Таким образом, данные люциферазного теста и ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что ACTN4 потенциально может участвовать в регуляции не только RelA/рбЗ-опосредованной экспрессии мышиного гена c-fos, но также и человеческих генов ММР-3 и ММР-1 (Aksenova et al., 2013).

Исходя из полученных данных, нами также была проанализирована регуляция экспрессии гена ММР-3 через 30, 48 и 67 ч после проведения трансфекции с плазмидами, кодирующими RelA/p65 и ACTN4. Было показано, что уровень мРНК увеличивается в зависимости от времени совместной оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65 (Аксенова и др., 2013). Так, при снятии клеток через 30, 48 и 67 ч после проведения трансфекции уровень мРНК, кодирующей ММР-3, возрастал (рис. 4).

Ие1А/р65 р50

/\CTN4F1

^ = »0000 5. 1 ,к*м

г 5 11

WB апи-МУС WB апи-зс^п

Яе1А/рб5 АСТК4П

/САМ1/САРОИ

ВАХ/САРОН

Яе1А/р65 ACTN4FI

12 3 4

ТЫС/оарон

РвП/СЛ РйН

ММР-З/вАРОН

ммр-1/аАРОн

I 2 3 4

ГЫ!/САРЬН

Ш ¡11

Р Тй 52/С АРОН

12 3 4

ммр-2/алрон

ММР-9/СА РОН

Рис. 3. Оверэкспрессия АСТМ усиливает транскрипционную активность ЫР-кВ. (А) Люциферазный тест на активность Яе1АУр65. Результаты представлены как отношение люминисценции к активности бета-галактозидазы в виде среднего значения трех и более повторностей одного эксперимента ±БО. *Р < 0.02 для оверэкспрессии АСТЫ4 и Ке1А/р65 против оверэкспрессии Ке1А/р65. (Б) ОТ-ПЦР ЫР-кВ регулируемых генов. (В) Иммуноблоттинг лизатов клеток, трансфицированных АСТЖ и И.е1А/р65. (Г) Данные количественной обработки результатов ОТ-ПЦР нетрансфицированных клеток НЕК293Т {линия 1) и клеток, трансфицированных по-отдельности АСТИ4 (линия 2) и Ке1А/р65 (пиния 3) и совместно {линия 4). Данные представлены как отношение уровня мРНК исследуемого гена к уровню мРНК гена САРОН. Знаками +/- отмечено наличие/отсутствие оверэкспрессии.

48 ч 67 •

Rc!A/p6S ACTN4

GA PIM

RelA/pAS

MMP-3

Рис. 4. Экспрессия гена ММР-3 возрастает при совместной оверзкспрессии ACTN4 и RelA/p65. ОТ-ПЦР анализ мРНК генов 18S, GAPDH, ACTN4, RelA/p65, ММР-3, через 30, 48 и 67 ч после проведения трансфекции. Знаками +/- отмечена оверэкспрессия ACTN4 и RelA/p65.

Эти данные также свидетельствуют в пользу того, что ACTN4 усиливает транскрипционную активность RelA/p65 при связывании с промотором гена ММР-3 и влияет на накопление мРНК гена ММР-3,

а не на ее стабильность.

3.5 АСТМ не влияет на перемещение Яе1А/р65 в ядро

Ввиду того, что АСТМ и Яе1А/р65 солокализуются в цитоплазме с И-актином, увеличение транскрипционной активности ОТ-кВ может быть опосредовано влиянием АСТМ на транспорт Яе1А/р65 в ядро и, соответственно, на активацию белка. Чтобы проверить данное предположение, была проведена оверэкспрессия АСТМ в клетках НЕК293Т, где Яе1А/р65 преимущественно находится в цитоплазме в комплексе с 1кВа.

Методом иммунопреципитации удалось подтвердить, что экзогенный АСТМР1 и Ке1А/р65 находятся в составе единых белковых комплексов в цитоплазме клеток НЕК293Т (рис. 5, А). Далее мы провели трансфекцию клеток плазмидой, кодирующей АСТМР1 и выполнили разделение фракций цитоплазма-ядро с последующим иммуноблоттингом со специфическими антителами против МУС, Яе!А/р65 и ЬпЯЫР А2/ВI. Согласно полученным результатам, оверэкспрессия АСТМ не влияла на перемещение Яе1А/р65 в ядро (рис. 5, Б). Таким образом, мы можем сделать вывод, что АСТМ способствует усилению транскрипционной активности Яе1А/р65 в ядре, а не влияет на его комплексы с 1кВа в цитоплазме (Аквепоуа е1 а!., 2013).

il» Ке1А/р65

\VB anti-MYC

WB RelA/p65

Цитоплазма

Ядро

WB anti-MYC

WB RelA/p65

WB hnRNP A2/BI

Рис. 5. ACTN4 не влияет на активацию и перемещения Яе1А/р65 в ядро. (А) Иммунопреципитация Яе1АУр65 из цитоплазматических белковых лизатов клеток НЕК293Т с последующим иммуноблоттингом со специфическими антителами против Ке1А/р65 и МУС. Специфический сигнал наблюдали только в пробе с оверэкспрессированным АСТЫ4Р1 при иммуноблоттинге с антителами против МУС и не наблюдали в контрольных клетках и лизатах без добавления специфических антител. (Б) Иммуноблоттинг цитоплазматических и ядерных лизатов со специфическими антителами против маркерного пептида МУС, Яе1А/р65 и ИпЯЫРА2/В в контрольных клетках НЕК293Т и после трансфекции АСШ4Р1.

/у

3.6 Димеризация ACTN4 и его связывание с Г-актином не являются необходимыми для участия АСТМ в регуляции работы 1*е1А/р65

Основные функции АСТШ в цитоплазме определяются его способностью связывать филаменты актина в единую фибриллярную сеть за счет формирования антипараллельных гомодимеров между двумя молекулами АСТМ. Тем не менее, на сегодняшний день остается

открытым вопрос о взаимодействии АСТМ с ¿г актином в ядре, а также о том, функционирует

ли АСТМ в ядре в виде димера или же нет. Исходя из того, что АСТМ способен усиливать транскрипционную активность Яе1А/р65, мы решили проверить, насколько необходимо для выполнения данной функций взаимодействие АСТМ с актином и формирование димера между двумя молекулами АСТМ. Для решения поставленной задачи была проведена оверэкспрессия делеционных вариантов АСТМ в клетках линии НЕК293Т с последующим анализом экспрессии гена ММР-3.

На основе данных, полученных методом непрямой иммунофлуоресценции, были выбраны два варианта белка, АСТМёе1Ы и АСТМс1е18КЛ-4. Оба описанных выше делеционных варианта способны перемещаться в ядро, но не содержат участков, ответственных за взаимодействие с Р-актином (АСТМёеМ), и не способны формировать димеры (АСТМёе^Я 1 -4).

ЫА/рМ

ММР-3

¡С

ММР~3/<1АР1>Н

Кс(Аф65

йс1А/(|65 - + пептида МУС и актина.

»'В ¡«¡-МУС

\УВ апп-ас!)!!

Рис. 6. Влияние делеционных вариантов АСТХ4 на 11е1А/р65-опосредованную регуляцию экспрессии гена ММР-3. (А) ОТ-ПЦР анализ генов вАРОН, 1*е1А/р65, 1САМ1 и ММР-3 через 67 ч после проведения трансфекции плазмидами, кодирующими Яе1А/р65, АСТМИ, ACTN4delN, АСТЖае^ЯМ. (Б) Данные количественной обработки результатов ОТ-ПЦР нетрансфицированных клеток НЕК293Т и клеток, трансфицированных Яе1А/р65 и 1*е1А/р65 совместно с АСЛШЙ, АСТЫ4ае1Ы, АСТЖае131?1-4. Данные представлены как отношение мРНК исследуемого гена к мРНК гена СЛРВИ. Знаками +/- отмечено наличие/отсутствие оверэкспрессии. (В)

Иммуноблоттинг клеточных лизатов НЕК293Т со специфическими антителами против маркерного

Способность данных делеционных вариантов участвовать в регуляции экспрессии гена ММР-3 сравнивали с активностью полноразмерного варианта белка. Клетки линии НЕК293Т были трансфицированы экспрессионными конструкциями, кодирующими собственно RelA/p65 или ACTN4F1, ACTN4delSRl-4, ACTN4delN совместно с RelA/p65 субъединицей NF-кВ, с последующим анализом экспрессии методом ОТ-ПЦР генов GAPDH, RelA/p65, ICAM1 и ММР-3 (рис. 6, А, Б). Для подтверждения оверэкспрессии делеционных вариантов ACTN4 проводили иммуноблоттинг клеточных экстрактов после проведения трансфекции теми же экспрессионными плазмидами (рис. 6, В). Согласно полученным данным, делеционные варианты ACTN4delSRl-4 и ACTN4delN усиливали Ке1А/р65-зависимую экспрессию гена ММР-3, но в меньшей степени, чем полноразмерный ACTN4F1 (рис. 6, А, Б). Эти данные позволяют предположить, что ACTN4 в ядре сохраняет способность коктивировать RelA/p65 без образования димера и взаимодействие ACTN4 с актином также не является критичным для данной функции белка (Aksenova et al., 2013).

3.7 Участие ACTN4 в регуляции сплайсинга мРНК

Ранее нами было показано, что ACTN4 в ядре ассоциирован с белками, функции которых связаны с метаболизмом мРНК (Хотин и др., 2009; Khotin et al., 2010). Наиболее многочисленной группой белков, среди идентифицированных, были белки, относящиеся к семейству гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNP А2/В1, Al, A3, K/J, L, Ml-4). Поскольку участие гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов в процессе сплайсинга мРНК является одной из наиболее исследованных функций, то было принято решение проверить влияние ACTN4 на регуляцию процесса сплайсинга мРНК. В качестве модельных систем были выбраны ген пируваткиназы (РКМ) и ген выживания моторных нейронов (SMN), альтернативный сплайсинг которых контролируется hnRNP Al и А2.

3.7.1 Исследование влияния ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга гена РКМ1/РКМ2

Альтернативный сплайсинг РКМ играет важную роль в ходе изменений метаболизма клеток млекопитающих. Известно, что экспрессирующаяся в эмбриогенезе изоформа РКМ -РКМ2 синтезируется также в раковых клетках и обеспечивает процесс аэробного гликолиза. Изоформа РКМ1, экспрессируется в тканях взрослого организма и обеспечивает процесс окислительного фосфорилирования.

Обе изоформы являются продуктом одного гена и образуются в результате альтернативного сплайсинга, в результате которого мРНК РКМ1 и РКМ2 содержат два альтернативных экзона, 9-й экзон в случае РКМ1 и 10-й экзон в случае в РКМ2 (рис. 7, А). Недавно было показано, что альтернативный сплайсинг данного гена контролируется белками hnRNP Al, hnRNP А2 и белком РТВ (Polypyrimidine Tract Binding) путем непосредственного связывания с последовательностями, регулирующими включение экзона 10 (Chen et al., 2010). hnRNP A2/B1 и Al выступают в качестве супрессоров, подавляя включение 9-го интрона в РКМ1. ACTN4 в составе данных комплексов потенциально может как подавлять активность hnRNP А2/В1 и А1 (быть супрессором), так и усиливать их активность (быть активатором). Соответственно, при супрессорной функции ACTN4 наблюдалось бы накопление изоформы РКМ1, а при активирующей - полное переключение на синтез РКМ2. Исследование влияния ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга мРНК РКМ1/РКМ2 проводили на нетрансфицированных клетках А431 и НЕК293Т, а также трансфицированных ACTN4F1, методом ОТ-ПЦР с последующей обработкой ПЦР-продуктов ферментом Pstl. На рис. 7 (А и Г) приведена структура анализируемого участка гена и схема электрофореграмм.

rmi

PKM2

Используя описанные выше методы, мы показали, что нетрансфецированные клетки культур НЕК293Т и А431 преимущественно экспрессируют пируваткиназу 2-го типа (75-87 %) и 13-25% пируваткиназы 1-го типа (рис. 7, В).

При оверэкспрессии АСТЫ4Р1, которая была подтверждена с использованием антител против АСТЫ4 (рис. 7, Б), было показано, что соотношение мРНК гена РКМ1/РКМ2 не отличается в контрольных клетках и клетках с оверэкспрессированным АСТМИ. Эти данные позволяют предположить, что АСТЫ4, скорее всего, не влияет на процесс альтернативного сплайсинга гена РКМ1/РКМ2.

tu Щм

Hl-,

U5 щДа 104 «Да 90 вДа

НЕК293Т

А431

ACTH4FJ

ACTN4

AC'TN4Iso

WB Brti-АСТЖ

Ü?

ект LJ у • ifcsstfl•• Imffli : :■'■'. Шш!

РКМ2 | Ш рз ту l"! 1,1«

A43I

Рис. 7. Влияние ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга гена РКМ. (А) Схема структуры с 8-го по 11-й экзон гена PKMIIPKM2. Указано положение праймеров для проведения ПЦР-анализа (горизонтальные стрелки) и расположение сайта рестрикции для Pst I (вертикальная стрелка). (Б) Оверэкспрессия ACTN4 в клетках линии HEK293T и А431. (В) Электрофореграмма продуктов ПЦР и рестрикции. Для каждого типа клеток представлен ПЦР-продукт (дорожка 1) и равный объем ПЦР-продукта, обработанного рестриктазой Pst I (iдорожка 2). Контроль - нетрансфицированные клетки НЕК293Т и A43I; ACTN4FI - клетки НЕК293Т и А431, трансфицированные полноразмерным ACTN4. (Г) Схема возможных вариантов элетрофореграммы, наблюдаемой после обработки ПЦР-продукта рестриктазой Pstl.

PMII

ект

3.7.2 Исследование влияния АСТМ на процесс альтернативного сплайсинга генов

"**"*' В качестве другой модельной системы был

выбран альтернативный сплайсинг генов ЗМЫ1/5МЫ2. Регуляция процесса альтернативного сплайсинга при образовании полноразмерного и укороченного вариантов мРНК, кодируемых генами 5АШ1 и 8ММ2, осуществляется при участии гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов, а именно ЬпЮЧР А1, Ьп1УЧР С1/С2 и 1та1ЮТ О и некоторых других белков. В норме, в результате процессов транскрипции и трансляции гена 5МИ1, образуется полноразмерный белок ЭМЫ, участвующий в биогенезе эиКИР и обеспечивающий нормальное функционирование моторных нейронов УосЫка й а1., 2010). Ген БМЫ в геноме человека дуплицирован. С теломерной копии гена (5!МЫ1) образуется полноразмерный белок, тогда как с центромерной (5М/У2) - укороченный (рис. 8, А). Основное различие между генами ЗМ/У./ и 5Л-/Д'2 состоит в замене цитозина на тимин в 7-ом экзоне гена БМЫ2, которая приводит к вырезанию 7-го экзона и образованию укороченного варианта белка БМЫ (Бтагс! е1: а1., 2007). Предполагается, что 1т1ШР А1 играет ключевую роль в контроле сплайсинга 7-го экзона гена 5М?/2. Оценку влияния АСТЖ на соотношение мРНК,

укороченный вариант бедка SMN * «т

соответствующих полноразмерному и укороченному варианту мРНК гена SMN. проводили методом ОТ-ПЦР и последующей рестрикции ПЦР-продукта рестриктазой Dde I. Подтверждение оверэкспрессии ACTN4F1 проводили методом иммуноблоттинга с антителами против ACTN4 (рис. 8, Б).

ОТ-ПЦР анализ нетрансфицированных клеток НЕК293Т показал, что в этих клетках присутствует как полноразмерный вариант мРНК, который кодируется генами SMN1 и SMN2, так

и укороченный вариант мРНК преимущественно образующийся в результате альтернативного сплайсинга гена SMN2 (рис. 8, В). Продукты альтернативного сплайсинга, образующиеся с генов SMN1 и SMN2, различаются по уникальному сайту рестрикции, который расположен в 8-ом экзоне гена SMN2. Исследование влияния ACTN4 на сплайсинг генов SMN1/SMN2 проводили на контрольных клетках НЕК293Т и клетках НЕК293Т, трансфицированных ACTN4F1. ОТ-ПЦР анализ генов SMN1 и SMN2 показал, что между контрольными клетками и клетками с оверэкспрессированным ACTN4FI нет существенных различий в соотношении мРНК, соответствующих полноразмерному (505 п.н.) и укороченному (451 п.н.) варианту мРНК (рис. 8, В). Анализ длин рестрикционных фрагментов, который позволяет различить мРНК генов SMN1 и SMN2, также не показал разницы между контрольными клетками и клетками с оверэкспрессированным ACTN4F1 (рис. 8, Г).

«одноразмерный вариант белка SMN

„у

i 15 кДа 104 к Да 90 кДа

НЕК293Т

ACTN4I1

ACTN4

ACTN4IS0

WB anti-ACTNW

505 п.н. 45! cj.il.

SMNJ 505 пл.

- SMNI/SMN2 " SMN?.í!c!? жзона

Рис. 8. Влияние АСТМ на альтернативный сплайсинг генов 5А//Д'7/^'А'/Л;,2. (А) Схема и относительное расположение генов и на 5-ой хромосоме

человека {рисунок из статьи ,1ос1е1ка е! а1., 2010 с изменениями). (Б) Иммуноблоттинг клеточных экстрактов НЕК293Т с антителами против АСТЖ. (В) ПЦР-анализ участка 6-8 экзонов генов 5А/Л7 и 5МУ2 в клетках линии НЕК293Т. (Г) Продукты ферментативного гидролиза при обработке ОТ-ПЦР-продукта ферментом Ос1е1.

Таким образом, эти данные и данные по альтернативному сплайсингу, полученные для гена РКМ. позволяют предположить, что АСТЖ, входящий в состав белковых комплексов с 1ш1УМР А1 и А2/В1, скорее всего не участвует в контроле сплайсинга рассмотренных генов, но, возможно, играет роль на других этапах метаболизма мРНК (Аксенова и др., 2013).

3.8 Эндогенный вариант ACTN4 с делецией кальпониновых доменов белка в нормальных и злокачественных клетках человека

В клетках линии А431 в ходе клонирования полноразмерного варианта ACTN4 была выявлена его нативная изоформа, содержащая делецию кальпониновых доменов белка. Наличие данной изоформы белка в клетках линии А431 может значительно влиять на функции полноразмерного белка за счет образования гетеродимеров полноразмерного и укороченного вариантов белка, что, в свою очередь, может сказаться на способности ACTN4 взаимодействовать со структурами актинового цитоскелета. Исходя их данного предположения мы решили проверить наличие данной изоформы в других типах клеточных культур, помимо А431. На рис. 9 (А, Б, В) приведен скрининг белковых лизатов различных клеточных культур, таких как меланомы (SK-MEL5, А375, А375Р, WM2664, SK-MEL28, HS-695T); клеточные культуры рака легкого (Н522, А549, Н520, Н1299, Н1650. Н358, Н23, Н460); клеточные культуры рака поджелудочной железы (ВхРС-3, PANC-1, MIA РаСа-2, AsPC-1); клеточные культуры рака молочной железы (MDA-MB-231, MCF-7, MDA-468); клеточные культур рака мочевого пузыря (UMUC-3, J82). На рис.9 Г приведены результаты ОТ-ПЦР с кДНК нормальных кератиноцитов и фибробластов человека, а также клеток НЕК293Т.

рак мшечюго ¡р,':и.(ря меланома

Рис. 9. Иммуноблоттинг и ОТ-ПЦР анализ нормальных и раковых клеток человека. (А) иммуноблоттинг клеточных культур рака легкого с антителами против АСТЫ4; (Б) иммуноблоттинг клеточных культур рака поджелудочной железы и рака молочной железы с антителами против АСТ^; (В) иммуноблоттинг клеточных культур рака мочевого пузыря и меланом с антителами против АСТЖ; (Г) ОТ-ПЦР анализ кДНК нормальных кератиноцитов (КЦ), фибробластов (ФБ) и трансформированных эмбриональных клеток почки человека (НЕК293Т) с праимерами к полноразмерному ЛСТМ4.

Согласно результатам исследования, данная изоформа белка была обнаружена только в клетках эпидермоидой карциномы А431 и не была обнаружена в других 23 раковых клеточных линиях и 2 нормальных первичных культурах клеток человека (фибробласты и кератиноциты), а также трансформированных клетках НЕК293Т. Данные результаты позволяют предположить, что

описанная нами изоформа ACTN4 является специфичной для клеток линии А431 и не является

маркерной для других проанализированных клеточных линий, а также не встречается в норме в

нормальных кератиноцитах и фибробластах человека.

4. ВЫВОДЫ

1. Транспорт ACTN4 в ядро и из ядра регулируется наличием в аминокислотной последовательности белка, с 1-го по 753-й остаток, двух или более последовательностей, необходимых для его транспорта в ядро. Как для ядерной локализации, так и для цитоплазматической локализации ACTN4 наличие одной функциональной последовательности является достаточным.

2. Делеции с 1-го по 295-й, с 48-го по 273-й и с 293-го по 753-й аминокислотный остаток приводят к полному нарушению взаимодействия ACTN4 со структурами актинового цитоскелета и к перемещению белка в ядро. Делеции с 753-го по 911-й и с 806-го по 911-й аминокислотный остаток влияют на взаимодействие ACTN4 с F-актином, но не существенны для импорта ACTN4 в ядро.

3. Внутриклеточное распределение вариантов ACTN4 при делеции с 1-го по 295-й, с 48-го по 273-й и с 293-го по 753-й аминокислотный остаток белка изменяется при длительном культивировании и при кратковременном распластывании клеток.

4. Актин-связывающий белок ACTN4 принимает участие в регуляции экспрессии генов c-fos, ММР-3 и ММР-1 опосредованной RelA/p65 субъединицей NF-кВ, и не принимает участия в регуляции экспрессии генов ICAMI, FGF8, TNC, FN1, PTGS2, ВАХ.

5. ACTN4 принимает участие в регуляции активности RelA/p65 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ на уровне транскрипции, не влияя на ядерно-цитоплазматический транспорт RelA/p65. Димеризация и взаимодействие ACTN4 с актином в ядре не являются необходимыми для RelA/p65-oriocpc\no[iaHHoii активации экспрессии гена ММР-3.

6. ACTN4 не является необходимым элементом комплексов, регулирующих сплайсинг генов РКМ и SMN1/SMN2.

1. В клетках эпидермоидной карциномы А431 присутствует сплайсинговая изоформа ACTN4 с делецией кальпониновых доменов белка. Данная изоформа не выявляется в злокачественных клетках меланомы, рака мочевого пузыря, клетках рака легкого, поджелудочной железы и молочной железы, а также в нормальных фибробластах и кератиноцитах человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хотин М., Туроверова J1., Подольская Е., Краснов И., Соловьева А., Аксенова В., Магнуссон К.-Э., Пинаев Г., Тентлер Д. (2009) Исследование ядерных белковых комплексов апьфа-актинина-4 методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Цитология.Т.51 (8): 684-690.

2. Aksenova V., Khotin М., Turoverova L., Pinaev G., Tentler D. (2009) Investigation of nuclear functions of actin-binding protein a-actinin-4. VIII'1' International Congress of Medical Science (ICMS) for students and young doctors. 7-10 May, Sophia, Bulgaria. C.56.

3. Аксенова В.Ю., Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. (2009) Исследование ядерных функций актин-связывающего белка альфа-актинина 4 и его участия в регуляции экспрессии генов. V Съезд Вавтовского общества генетиков и селекционеров. 21-28 июня, Москва, Россия. Часть II, С.41.

4. Аксенова В., Хотин М., Туроверова Л., Пинаев Г., Тентлер Д. (2010) Изоформы актин-связывающего белка альфа-актинина 4 (ACTN4) в клетках эпидермоидной карциномы человека

(А431). II Молодежная конференция Института цитологии РАН. 15-16 февраля, Санкт-Петербург, Россия. Т.52 (6): 493.

5. Aksenova V., Khotin М., Turoverova L., Pinaev G., Magnusson E.-E., Tentler D. (2010) Structure and functional specifity of alpha-actinin 4 (ACTN4) isoforms. Young Scientific Forum 23-26 June and FEBS Congress. 26 June - 01 July, Gothenburg, Sweden. FEBS Journal. T.277: 273.

6. Khotin M., Aksenova V., Turoverova L., Magnusson E.-E., Pinaev G., Tentler D. (2010) Alpha-actinin 4 interacts with nuclear proteins, involved in mRNA splicing, transport and stability. Young Scientific Forum 23-26 June and FEBS Congress. 26 June - 01 July, Gothenburg, Sweden. FEBS Journal. T.277: 287.

7. Аксенова В., Хотин M., Туроверова J1., Пинаев Г., Тентлер Д. (2010) Выявление доменов актин-связывающего белка альфа-актинина 4 (ACTN4), ответственных за его локализацию и функционирование в ядре. XVI Симпозиум структура и функции клеточного ядра. 5-7 октября, Санкт-Петербург, Россия. Т.52 (8): 693-694.

8. Khotin М, Turoverova L, Aksenova V, Barlev N, Borutinskaite VV, Vener A, Bajenova O, Magnusson KE, Pinaev GP, Tentler D. (2010). Proteomic analysis of ACTN4-interacting proteins reveals it's a putative involvement in mRNA metabolism. Biochem Biophys Res Commun 397 (2): 192-196.

9. Аксенова В., Хотин M., Туроверова JI.B., Юдинцева Н., Магнуссон К.-Э., Пинаев Г., Тентлер Д. (2012). Новая сплайсинговая изоформа актин-связывающего белка альфа-актинина 4 в клетках эпидермоидой карциномы А431. Цитология 54 (1): 25-32.

10. Аксенова В.Ю., Хотин М.Г., Туроверова JI.B., Барлев Н.А., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. (2013). Участие альфа-актинина 4 в регуляции экспрессии генов и контроле сплайсинга мРНК. Сборник трудов VI международной заочной научно-практической конференции. Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии, Москва. С.91-101.

11. Aksenova V., Turoverova L., Khotin M., Magnusson K.-E., Tulchinsky E., Melino G., Pinaev G.P., Barlev N., Tentler D. (2013) Actin-binding protein alpha-actinin 4 (ACTN4) is a transcription co-activator of RelA/p65 sub-unit of NF-кВ. Oncotarget 4 (2): 362-372.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Петухова О.А., Туроверова JI.B., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пннаев Г.П. 2004. Цитология. Т.46 (12): 1064-72. Блинова М.И.. Юдинцева II.M., Калмыкова II.В., Кузьминых Е.В., Юрлова Н.А., Овчинникова О.А. 2002. Цитология. Т.44 (В): 780-787. Большакова А.В. 2009. Кандидатская диссертация: 1130. Юдинцева Н.М., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2008. Цитология. Т.50 (10): 861-867. Babakov V.N., Petukhova О.А., Turoverova L.V., Kropacheva I.V., Tentler D.G., Bolshakova A.V., Podolskaya E.P., Magnusson K.-E., Pinaev G.P. 2008. Exper.Cell Res. V.314: 1030-1038. Barbolina M.V., Adley B.P., Kelly D.L., Fought A.J., Scholtens D.M., Shea L.D., Stack M.S. 2008. Laboratory Investigation. V.88: 602-614. Chen M„ Zhang J., Manley J.L. 2010. Cancer Res. V.70: 8977-8980. Chakraborty S., Reineke E.L., Lam M., Li X., Liu Y., Gao C., Khurana S., Kao H.Y. 2006. J. Biol. Chem. V.281: 35070-35080. Dreyfuss G., V. Kim N.. Kataoka N. 2002. Mol. Cell Biol. V.3: 195-205. Gettemans J., Van Impe K., Deianote V., Hubert Т., Vandekerckhove J., De Corte V. 2005. Traffic. V.6 (10): 847-57. Нага Т., Honda K., Shitashige M., Ono M., Matsuyama H„ Naito K., Hirohashi S., Yamada T. 2007. Mol. Cel. Prot. V.6: 479-491. Honda K., Yamada Т., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H„ Hirohashi S. 1998. J. Cell Biol. V.140 (6): 1383-1393. Honda K., Yamada Т., Seike M., Hayashida Y., Idogawa M., Kondo Т., Ino Y., Hirohashi S. 2004. Oncogene. V.23: 5257-5262. Jayadev R., Kuk C.Y., Low S.H.. Hori M.M. 2012. Cell Cycle. V.l 1: 1929-1937. Jodelka F.M.. Ebert A.D., Duelli D.M., Hastings M.L. 2010. Hum. Mol. Gcnetics. V.19 (24): 4906-4917. Koizumi Т., Nakatsuji H., Fukawa Т., Avirmed S., Fukumori Т., Takahashi M., Kanayama H. 2010. Urology. V.75: 357-364. Kikuchi S., Honda K., Tsuda H., Hiraoka N., Imoto I., Kosuge Т., Umaki Т., Onozato K., Shitashige M., Yamaguchi U., Ono M., Tsuchida A., Aoki Т., Inazawa J., Hirohashi S., Yamada T. 2008. Clin Cancer Res. V.14: 5348-5356. Khotin M., Turoverova L., Aksenova V., Barlev N., Veronika Borutinskaite V., Vener A., Bajenova O., Magnusson K-E., Pinaev G. P., Tentler D. 2010. V.397: 192-196. Khurana S., Chakraborty S., Cheng X., Su Y-T., Kao H-Y. 2011. J Biol. Chem. V.286 (3): 1850-9. Khurana S, Chakraborty S, Zhao X, Liu Y,Guan D, Lam M, Huang VV, Yang S, Kao HY. 2012. J Biol. Chem. V.287 (42): 3541829. Papakonstanti E.A., Stournaras C. 2008. FEBS Letters V.582: 2120-2127. Percipalle P. 2013. Nucleus 4 (1): 43-52. Poch M. Т., Al-Kassim L., Smolinski S.M., Hines R.N. 2004. Toxicol. App. Pharmacol. V.199: 239-250. Simard L.R., Be'langer M.-C., Morissette S., VVride M„ Prior T.W., Swoboda K.J. 2007. Neurology. V.68: 451-456. Weins A., Kenlan P., Herbert S., Le T.C., Viliegas I., Kaplan B.S., Appel G.B., Pollak M.R. 2005. J.Am.Soc.Nephrol. V. 16: 3694-3701.

Подписано в печать 24.04.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10597Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аксенова, Василиса Юрьевна, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201358961

АКСЕНОВА Василиса Юрьевна

УЧАСТИЕ АЛЬФА-АКТИНИНА 4 В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И

КОНТРОЛЕ СПЛАЙСИНГА мРНК

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с., руководитель группы Тентлер Дмитрий Генрихович

Санкт-Петербург 2013

на правах рукописи

/ О I

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 5

1.1 Актуальность темы исследования и степень ее разработанности 5

1.2 Цели и задачи работы 6

1.3 Научная новизна 7

1.4 Теоретическая и практическая значимость работы 7

1.5 Методы исследования 8

1.6 Основные положения, выносимые на защиту 8

1.7 Апробация работы 8

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

2.1 Актиновый цитоскелет 9

2.1.1 Основные компоненты актинового цитоскелета 9

2.1.2 Типы структур, образуемые актиновым цитоскелетом 10

2.2 Актин и актин-связывающие белки в ядре 11

2.2.1 Открытие актина и его функций в ядре 11

2.2.2 Регуляция полимеризации цитоплазматического и ядерного актина 12

2.2.3 Актин как компонент оболочки ядра и элемент комплексов ремоделирования хроматина 13

2.3 Участие актина и актин-связывающих белков в регуляции транскрипции и контроле экспрессии генов 17

2.3.1 Взаимодействие с РНК-полимеразами 17

2.3.2 Взаимодействие актина и актин-связывающих белков с транскрипционными факторами 20

2.4 Участие актина и актин-связывающих белков в биогенезе пре-мРНК 22

2.5 Альфа-актинины 28 2.5.1 Альфа-актинин-4 29

2.6 АСТЫ4 в регуляции экспрессии генов и сплайсинге пре-мРНК 39

2.6.1 Взаимодействие АСТЫ4 и транскрипционного фактора ОТ-кВ 39

2.6.1.1 Пути активации транскрипционного фактора №-кВ 39

2.6.1.2 Гены-мишени Яе1А/р65 субъединицы ЫР-кВ 42

2.6.2 Альтернативный сплайсинг с участием белков семейства ИпЮЧР 45

2.6.2.1 Участие ИпИ^Р в альтернативном сплайсинге пре-мРНК гена РК 45

2.6.2.2 Участие ЬпИЛ^Р в альтернативном сплайсинге пре-мРНК гена БМЫ 47

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 49

Материалы 49

3.1 Генетические конструкции 49

3.2 Клеточные культуры 50

3.3 Реактивы 50

3.4 Праймеры 51 Методы 51

3.5 Получение генетических конструкций 51

3.6 Секвенирование фрагментов кДНК гена АСТМ 54

3.7 Анализ экспрессии генов, регулируемых Яе1А/р65 субъединицей №-кВ 55

3.8 Иммунофлуоресценция 56

3.9 Люциферазный тест на активность Ле1А/р65 57

3.10 Выделение белков 58

3.11 Иммунопреципитация 59

3.12 БОЗ-электрофорез и иммуноблоттинг 59

3.13 Анализ влияния оверэкспрессии АСШ4 на процесс сплайсинга пре-мРНК генов РКМ1/РШ2 и 8Ш1/8Ш2 60

3.14 Статистическая обработка данных люциферазного теста, электрофореграмм, иммуноблоттинга 61

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 62

4.1 Ядерно-цитоплазматический транспорт АСШ4 62

4.1.1 Делеционное картирование АСТЫ4 62

4.1.2 Ядерно-цитоплазматическое распределение экзогенных вариантов АСТЫ4 66

4.2 Участие АСТЫ4 в регуляции экспрессии генов 70

4.2.1 Влияние АСШ4 на степень активации минимального промотора мышиного гена с/ох 11е1А/р65 субъединицей №-кВ 70

4.2.2 Анализ воздействия оверэкспрессии АСТЖ и Яе1А/р65 субъединицы ЫР-кВ на экспрессию Яе1А/р65-зависимых генов 72

4.2.3 АСТТМ4 не влияет на перемещение Яе1А/р65 в ядро 73

4.2.4 Димеризация АСТЫ4 и его связывание с Р-актином не являются необходимыми для участия АСТЫ4 в регуляции работы Яе1А/р65 74

4.3 Участие АСТЖ в регуляции сплайсинга пре-мРНК 76

4.3.1 Исследование влияния АСТТЧ4 на процесс альтернативного сплайсинга пре-мРНК

гена РКМ1/РКМ2 76 4.3.2 Исследование влияния АСТТМ4 на процесс альтернативного сплайсинга пре-мРНК

генов 5'Л#///5Л#/2 78

4.4 Эндогенный вариант АСТТЧ4 с делецией кальпониновых доменов белка в нормальных

и злокачественных клетках человека 80

5. ОБСУЖДЕНИЕ 82

5.1 Ядерно-цитоплазматический транспорт АСТТЧ4 82

5.2 Участие АСТЖ в регуляции экспрессии 11е1А/р65-зависимых генов 86

5.3 Участие АСТЫ4 в регуляции сплайсинга пре-мРНК 89

5.4 Анализ изоформ АСТЫ4 в культурах клеток человека 91

ВЫВОДЫ 93

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 94

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 96

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 109

ПРИЛОЖЕНИЕ 110

Приложение 1. 110

Приложение 2 113

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Изучение роли актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов представляет собой одно из наиболее актуальных направлений в современных исследованиях механизмов передачи сигнала в клетке. За последние несколько лет появилось большое количество экспериментальных данных, описывающих ранее неизвестные функции белков актинового цитоскелета. Эти данные ставят по сомнение прежние представления о том, что цитоскелет выполняет лишь структурные функции. Тем не менее, механизмы, посредством которых белки цитоскелета вовлечены в регуляцию экспрессии генов и механизмы передачи сигнала в клетке, пока недостаточно хорошо изучены.

Полученные ранее данные свидетельствуют о том, что ACTN4 вовлечен в процесс

регуляции активности ряда транскрипционных факторов, таких как NF-кВ (Babakov et al.,

2008), MEF2 (Chakraborty et al., 2006) и NF-Y (Poch et al., 2004), а также играет роль коактиватора ядерных рецепторов эстрогена, рецептора активации пероксисом и рецептора ретиноивой кислоты (Khurana et al., 2011, 2012а, б). Эти транскрипционные факторы, в свою очередь, регулируют экспрессию больших групп генов и участвуют в таких процессах, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз. Кроме того, ранее было показано, что ACTN4 входит в состав ядерных белковых комплексов, образованных белками рибонуклеопротеинового семейства hnRNP А2/В1, AI, К, Ml-4, С1/С2 (Khotin et al., 2010). Эти белки принимают участие во многих этапах процесса созревания пре-мРНК, таких как полиаденилирование, контроль сплайсинга, поддержание стабильности и экспорта мРНК из ядра, а также процессах рекомбинации, регуляции транскрипции и стабилизации структуры теломер (Dreyfuss et al., 2002).

На сегодняшний день остается открытым вопрос о роли ACTN4 в составе вышеуказанных белковых комплексов и участия в процессах, протекающих в ядре и контролируемых этими комплексами. Эти и многие другие вопросы, связанные с неканоническими функциями ACTN4, определили направление наших исследований.

1.2 Цели и задачи работы

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:

2. Сравнить ядерно-цитоплазматическое распределение экзогенных вариантов

ACTN4 cN-и С-концевыми делециями и делецией спектриновых повторов в условиях длительного культивирования и при распластывании клеток на белке внеклеточного матрикса фибронектине.

3. Исследовать влияние ACTN4 на степень активации минимального промотора мышиного гена c-fos при взаимодействии с RelA/p65 субъединицей NF-kB.

4. Провести анализ экспрессии Яе!А/р65-зависимых генов при оверэкспрессии ACTN4 и RelA/p65 субъединицы NF-kB.

6. Исследовать влияние ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга мРНК генов РКМ1/РКМ2 и SMN1/SMN2.

1.3 Научная новизна В настоящей работе впервые представлены данные о регуляции экспрессии Яе1А/р65-зависимых генов, таких как c-fos, металлопротеиназы 3-го (ММР-3) и 1-го (ММР-7) типов, посредством актин-связывающего белка альфа-актинина 4 (ACTN4). Проведен анализ влияния делеционных вариантов ACTN4 на экспрессию гена ММР-3 в сравнении с полноразмерным вариантом ACTN4. Показано, что ACTN4 с делецией спектриновых и кальпониновых доменов сохраняет способность регулировать экспрессию гена ММР-3, что, в свою очередь, позволяет сделать предположение о том, что ACTN4 в ядре потенциально может функционировать в виде мономера. Впервые проведен анализ влияния ACTN4 на процесс альтернативного сплайсинга генов РКМ1/РКМ2 и SMN1/SMN2, регуляция сплайсинга которых опосредована hnRNP А2/В1 и Al. Показано, что делеции спектриновых повторов белка и N-концевого участка, включающего домены связывания с актином, не препятствуют перемещению ACTN4 в ядро, а для экспорта ACTN4 из ядра достаточно одной из двух идентифицированных NES-последовательностей в ACTN4.

1.4 Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты имеют фундаментальное значение для понимания механизмов участия белков цитоскелета в процессах, протекающих в ядре, таких как, регуляция транскрипции и сплайсинг пре-мРНК. В связи с тем, что мутации в гене ACTN4 приводят к развитию фокально-сегментарного гломерулосклероза - заболевания, связанного с нарушением нормального функционирования подоцитов, а оверэкспрессия ACTN4 отмечена при многих злокачественных заболеваниях, исследование функций ACTN4 приобретает не только фундаментальный, но и прикладной характер. Кроме того,

данные, полученные в ходе исследовательской работы, могут быть использованы для включения их в учебные пособия и курсы лекций Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербургского государственного технологического университета, Санкт-Петербургского государственного политехнического университета и других вузов с факультетами биологического профиля.

1.5 Методы исследования В данной работе были использованы различные методы молекулярной и клеточной биологии, такие как культивирование клеточных линий, полимеразная цепная реакция и полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, выделение РНК и белков, иммунопреципитация, разделение белков в денатурирующем полиакриламидном геле, иммуноблот анализ, получение генетических конструкций, иммунофлуоресцентный анализ, люциферазный тест и метод рестрикционного анализа.

1.6 Основные положения, выносимые на защиту

1. Ядерно-цитоплазматический транспорт ACTN4 определяется более чем одним доменом в структуре белка.

3. ACTN4 является коактиватором RelA/p65 субъединицы NF-kB.

5. ACTN4 не является необходимым элементом комплекса, регулирующего сплайсинг мРНК генов РКМ1/РКМ2 и SMN1/SMN2.

6. Изоформа ACTN4 с делецией кальпонин-гомологичных доменов белка является специфичной для клеток линии А431.

1.7 Апробация работы Материалы диссертации были представлены на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VIII Международном конгрессе медицинских наук (ICMS) (София, 2009), Международном молодежном симпозиуме и конгрессе FEBS (Гетеборг, 2010), 2-ой Молодежной конференции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010), 3-ей Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Актиновый цитоскелет

Цитоскелет представляет собой обширную сеть микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных филаментов (Албертс и др., 1994). Эти компоненты цитоскелета образуют в клетке разнообразные типы структур, каждая из которых представляет собственную систему, сформированную своими мажорными и минорными белками. Микротрубочки по своей структуре представлены полыми цилиндрами диаметром 25 нм, стенка которых образована протофиламентами, ориентированными вдоль их оси. Основным структурным белком микротрубочек является тубулин. Более плотную структуру имеют промежуточные филаменты, они представляют собой фибриллы 8-12 нм, сформированные различными классами тканеспецифичных белков, таких как виментин, десмин, глиальный фибриллярный кислый белок, ламины, кератины и белки нейрофиламентов. Наиболее тонкими (6-8 нм) структурами цитоскелета являются актиновые филаменты, сформированные в результате полимеризации мономеров глобулярного актина (G-актина). Они выполняют ключевую функцию в сократительном аппарате мышечных и немышечных клеток и принимают участие во многих клеточных процессах (Ananthakrishnan, Ehrlicher, 2007; Percipalle, 2007), которые более подробно будут рассмотрены далее.

2.1.1 Основные компоненты актинового цитоскелета

Основным компонентом актинового цитоскелета, как было указано выше, является актин. Он является одним из наиболее многофункциональных белков в клетке (Vartianen, 2008). Выделен и охарактеризован актин в 1942 году Бруно Страубом в лаборатории Альберта Сцента-Джиоржиса в Венгрии (Straub, Feuer, 1950). Впервые актин был описан как главный сократительный белок скелетной мускулатуры и до сих пор остается наиболее известным филаментым белком, вовлеченным в процесс мышечного сокращения (Hoffman, 2009). Присутствие актина в немышечных клетках впервые было продемонстрировано у миксомицета Physarum polycephalum группой японских ученых Садаши Хатано (Hatano, Oosawa, 1966; Hatano, Tazawa, 1968). В клетке актин представлен в двух формах: глобулярной - G-актин, и в фибрилярной - F актин (Winder, Ayscough, 2005).

Фибриллярный актин образуется из мономерных форм актина в процессе полимеризации-деполимеризации, формируя обширную сеть актиновых филаментов (Wu, Crabtee, 2007). Процесс полимеризации-деполимеризации является АДФ/АТФ зависимым и осуществляется при участии ряда актин-связывающих белков (Winder, Ayscough, 2005).

Актин-связывающие белки, участвующие в связывании, образовании, фрагментации и сшивании актиновых филаментов, можно подразделить на несколько групп. Первая группа белков участвует в процессе сборки и разборки актиновых филаментов, это так называемые «кэпирующие белки» - профилин, тропомиозин, гельзолин и другие. Они избирательно связываются с плюс-концами актиновых филаментов (где происходит процесс полимеризации актина), удерживают их вблизи плазматической мембраны и регулируют присоединение новых мономеров актина. Ко второй группе относятся актин-связывающие белки, формирующие плотные пучки актина - фимбрин, ф�

Информация о работе

Аксенова, Василиса Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Участие альфа-актинина 4 в регуляции экспрессии генов и контроле сплайсинга мРНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы