Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Созревание индуцируемых интерферонами npe-мРНК гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Созревание индуцируемых интерферонами npe-мРНК гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека"

На правах рукописи

СОКОЛОВА Ирина Валерьевна

СОЗРЕВАНИЕ ИНДУЦИРУЕМЫХ ИНТЕРФЕРОНАМИ пре-мРНК ГЕНА ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН при финансовой поддержке ГНТП "Геном человека" и Российского фонда фундаментальных исследований

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, профессор

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт молекулярной генетики РАН

О/ //")с°

Защита состоится "А'" ШОЩ 1997г. ъ Л/ часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной

биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу:

117984, Москва В-334, ул.Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан "3' /¡¿СУ 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Л.Л.Киселев К.Т.Турпае*

П. М. Рубцов О.О.Фэворов;

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Трипгофанил-тРНК-синтетаза (КФ 6.1.1.2., TrpRS) осуществляет присоединение триптофана к соответствующей тРНК и. наряду с другими аминоацил-тРНК-синтетазами, катализирует первый этап биосинтеза белков. Поскольку триптофан входит в состав подавляющего большинства клеточных белков. TrpRS входит в число незаменимых ферментов. Ген TrpRS рассматривали как один из конститутивных генов, отвечающих за поддержание жизни клетки (house-keeping). Однако в 1991г. независимо в трех лабораториях было показано, что дополнительная экспрессия этого гена индуцируется интерферонами (ИфН). Следовательно, ген TrpRS относится к числу конститутивных и индуцибельных одновременно. В работах нашей лаборатории интерферон-зависимые регуляторные элементы были обнаружены в промоторной области гена TrpRS.

ИФН регулируют активность клеток иммунной системы, клеточный эост,' участвуют в процессах гематопоэза и эмбрионального развития, обладают антивирусным и противоопухолевым эффектом. Известно более Ю ИФН-индуцируемых генов. Для многих из них доказано участие в зеализации ответа клеток на действие ИФН, но роль гена TrpRS в этом >твете остается неясной.

Ген TrpRS человека состоит из 12 экзонов, разделенных 11 1нтронами и занимает более 35 т.п.н. Кодирующая область гена расположена в экзонах II - XI. В нашей и других лабораториях показано, то нетранслируемые экзоны 1А и 1В и часть экзона II подвергаются льтернативному сплайсингу, образуя несколько изоформ мРНК гена rpRS, различающихся в 5'-нетранслируемой области. В настоящее время астет число сообщений о том, что структура этого района влияет

на эффективность трансляции мРНК. Возможно, изоформы мРНК ТгрЯБ транслируются с разной эффективностью.

Взаимосвязь между полиморфизмом мРНК ТгрЯБ и индукцией этих мРНК ИФН не изучена. Исследование процесса созревания и определение первичных структур изоформ мРНК ТгрЯв может способствовать пониманию биологической роли ИФН-зависимой индукции "конститутивного" гена ТгрПБ. Цель работы

Цель настоящей работы состояла в изучении полиморфизма мРНЬ гена ТгрИЭ человека и в исследовании влияния ИФН-зависимой индукцт на соотношение изоформ мРНК ТгрИБ в клетках.

Исходя из поставленной цели, задачи исследования заключались I следующем:

1. Определить основные участки начала транскрипции гена ТгрПБ.

2. Определить первичную структуру полиморфных участков мРН этого гена.

3. Выяснить роль альтернативного сплайсинга при образовани изоформ мРНК ТгрЯБ и выявить фрагмент(ы) пре-мРНК гена ТгрЯ£ регулирующий(е) альтернативный сплайсинг.

4. Исследовать соотношение изоформ мРНК ТгрНБ в культуре клеток различных типов.

5. Исследовать влияние обработки клеток ИФН на соотношение эть изоформ в различных клеточных линиях.

Научная новизна и практическое значение работы

В настоящей работе впервые исследован механизм созревания пр мРНК гена ТгрЯБ человека, синтезированных с двух основных участк« начала транскрипции. Определены координаты этих участке Установлено, что один из первичных транскриптов подвергает альтернативному сплайсингу и выяснен механизм образован альтернативно сплайсируемых изоформ мРНК. В экзоне 1А гена Тгр!

обнаружен фрагмент. который. по-видимому, контролирует альтернативный сплайсинг. Установлено, что ИФН типа I и II. являясь индукторами экспрессии гена ТгрИЭ. не влияют на соотношение изоформ мРНК этого гена.

ИФН-зависимая индукция и полиморфизм мРНК в 5'-нетранслируемой области нетипичны для конститутивно экспрессирующихся генов, отвечающих за основные функции клетки. Тем не менее, ген ТгрЯЭ обнаруживает такие свойства. После наших работ полиморфизм мРНК был выявлен у гена изолейцил-тРНК-синтетазы. В промоторной области этого гена также обнаружены ИФН-зависимые регуляторные элементы. При дальнейших исследованиях в этом направлении могут быть выявлены новые взаимодействия и связи белок-синтезирующего аппарата с другими функциями клетки. Изучение ИФН-зависимой индукции генов аминоацил-тРНК-синтетаз перспективно также как часть исследований механизма действия ИФН на клеточном уровне, которые необходимы для поиска новых путей лечения заболеваний человека, затрагивающих иммунную систему. Публикации

По материалам диссертации опубликованы 2 работы и сделаны доклады на общероссийской и международной конференциях. Объем и структура диссертации

Работа изложена на 81 странице машинописного текста. Она зключает введение, обзор литературы, методическую часть, результаты и 1х обсуждение, выводы и список цитированной литературы, содержащий 106 ссылок. Диссертация содержит 18 рисунков и 2 таблицы.

Содержание работы

Мы начали исследование образования изоформ мРНК гена ТгрИБ с пределения оптимальных условий индукции мРНК ТгрРЭ ИФН альфа и

гамма в культурах клеток J-41. J-96. Н-9. СК-27. СЕМ. МТ-4 и CaOv методом гибридизации выделенной из обработанных ИФМ клеток РНК с меченным [ Í2P] ДНК-зондом, соответствующим фрагменту ДНК экзона III гена TipRS. РНК выделяли по методу Chomczynski & Sacchi. (1987). Е соответствии с оптимальными условиями индукции, в последующи* опытах для всех исследуемых культур применялась стандартна? процедура обработки интерфероном: ИФНальфа - при концентрации 100С ед./мл в течение 5 часов, ИФНгамма - при концентрации 100 ед./мл i течение 24 часов.

Затем мы определили соотношение изоформ мРНК гена TrpRS i разных типах клеток и соотношение изоформ мРНК в клетка* обработанных ИФН. Поскольку соотношение изоформ не обнаруживав гканеспецифичности и не меняется при обработке клеток ИФН I и II. mi предположили, что 1А- и IB-содержащим изоформам предшествуе общий первичный транскрипт. В связи с этим мы определили положени участков начала транскрипции методом удлиннения затравки и уточнил определенную ранее структуру изоформ мРНК TrpRS методом обратно транскрипции и сопряженной с ней полимеразной цепной реакции (R" PCR). В результате этих опытов мы выяснили механизм образовав четырех изоформ мРНК гена TrpRS.

Конститутивная экспрессия и соотношение изоформ мРНК reí TrpRS в различных линиях клеток.

Сопоставление уровней конститутивной экспрессии и соотношен! изоформ мРНК TrpRS в культурах моноцитов (J-96, J-41), лимфоцип (Н9) и фибробластов (СК-27) мы провели, применив метод RT-PCR. П| определении содержания искомой мРНК в клетках методом Р( предварительно подбирали такие условия (22 цикла денатурации (92°С мин), отжига (60°С. 1 мин), наращивания затравки (72°С, 1 мин)), п которых количество амплифицированного продукта пропорциональ количеству вносимой в реакционную смесь кДНК. PCR проводили

загравками А4 (экзон 1А), В2 (экзон 1В) и С1 (антисмысловая в экзоне II, см. рисунок 1), что позволяло получить соответствующие 1А- и 1В-содержащим изоформам мРНК ТгрЯЭ продукты определенной длины. Р1 рг

Сумная

M12 Л). 82 [1 Г.: 01 02

t-s 4 *

Рисунок 1. Схема 5'-концевого участка гена TrpRS. Экзоны обозначены черными прямоугольниками. Стрелками под линией, обозначающей ДНК, показаны участки, которым соответствуют олигонуклеотидные затравки при PCR. Р1 и 92 - основные старты транскрипции.

Для оценки общего количества РНК в реакционную смесь вносили затравки G1 и G2, выявляющие мРНК гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPD). На рисунке 2 приведены радиоавтографы, характеризующие содержание двух изоформ мРНК гена TrpRS в культурах клеток J-96, J-41, Н9 и СК-27, не обработанных ИФН.

Н-9 J-96 J-41 J-96 СК-27 J-96

Рисунок 2. Содержание изоформ мРНК TrpRS в клетках различных линий, че обработанных ИФН. Негативные снимки с радиоавтографов электрофоретически разделенных в 5% ПААГ продуктов количественной ПЦР. эазмеры фрагментов ДНК, амплифицированных по кДНК гена GAPD, 1А- и 1В-:одержащих изоформ кДНК гена TrpRS равны соответственно 161, 139 и 119 1.н. При проведении PCR инкубационная смесь содержала затравки A4, В2, С1, 31 и G2.

Видно, что уровень синтеза относительно мРНК йАРО индивидуалее для каждой из культур: в фибробластах СК-27 он наиболее велик, е лимфоцитах Н-9 ниже, а в двух моноцитарных культурах (J-96. Л-41 наиболее низок. Однако соотношение изоформ. содержащих выявляемы* используемыми затравками экзоны 1А и 1В близко к эквимолярному в( всех четырех исследованных культурах.

Уровень индуцированной ИФН экспрессии 1А- и 1 В-содержащи изоформ мРНК гена ТгрЯБ в различных культурах клеток.

На рисунке 3 приведены результаты определения концентрации 1А и 1В-содержащих изоформ мРНК ТгрЯЭ в культурах эпителиальных клето СаОу. Т-лимфоцитов МТ-4 и СЕМ, моноцитов и-96 человека методо! Мог1Иегп-гибридизации. Исследовали обработанные ИФН I, ИФН II и н обработанные ИФН клетки. Использовали комплементарны последовательности экзона 1А. либо экзона 1В меченные [32Р1 РНК зонды. В исследованных культурах моноцитов ^96 и ..1-41. лимфоцитов Н 9 и фибробластов СК-27 ИФН гамма индуцирует синтез содержаии экзоны 1А и 1В изоформ мРНК ТгрЯБ сильнее, чем ИФН альфа. Эт согласуется с данными Б^еЫом е1 а1. (1993) и БеедеП е1 а1. (1994) Д) шести культур нелимфоидных клеток человека. В культуре элителиальт клеток СаОч только ИФН гамма индуцирует мРНК ТгрЯЭ (см. рис. 3 и ^ Для культуры В-лимфоцитов ОаисП описан единственный случай, коп только ИФН альфа является индуктором мРНК ТгрЯв [Р1ескпег е1 а 1995].

Количественное соотношение изоформ мРНК ТгрЯБ, как видно результатов МогШегп-блоттинга. не изменяется в зависимости от ти ткани и типа ИФН, тогда как общий уровень индукции мРНК Тгр1 зависит от типа ИФН и проявляет тканевую специфичность (см. рис. Показанные на рис. 4 результаты исследования мРНК ТгрНЭ в моноцит *]-96 методом количественной РСР согласуются с данными №>|Ите

гибридизации: индукция обоими типами ИФН не меняет соотношение 1А- и 1В-содержащих изоформ.

А.

МТ-4

285-

18Б-

Й к оС Ь

1 А 1 А

* «С к к о< 1

о О - - -г»

ОС. к к оС $

? -

1 В СЕМ

1 В 1 А

Рисунок 3. Индукция изоформ мРНК ТгрЯЭ в разных клеточных линиях под действием ИФН. А - блот-гибридизация РНК из клеток МТ-4 и СаОм. Б - блот-ибридизация РНК из клеток »ЬЭб и СЕМ. К - без ИФН, <т( - обработка клеток 1ФНальфа, ^ - обработка клеток ИФНгамма, 1А— РНК-зонд на экзон 1А; 1В — 'НК-зонд на экзон 1В.

ИФН также не влияет на стабильность мРНК ТгрЯЭ [Яескпег et а!., 995]. Следовательно, эффект ИФН состоит не в изменении оотношения изоформ мРНК этого гена, а а увеличении общего оличества мРНК ТгрИЗ в клетках, а отсюда и увеличение концентрации грЯБ. Действительно, как показано в нашей лаборатории [\/аг1ап1ап е1 I., 1996], в культурах клеток человека уровень активности ТгрЯЗ озрастает через 6-8 часов после их обработки ИФН и достигает аксимума через 36 часов.

J - 96

без ИФН

ИФН альфа

ИФН гамма

GAPD -1А -1Б -

-GAPD

- 1А

- 1В

Рисунок 4. Индукция 1А- и IB-содержащих изоформ мРНК TrpRS в клетках J-96 под действием ИФН. Негативные снимки с радиоавтографов злектрофоретически разделенных в 5% ПААГ продуктов количественной PCR. Инкубационная смесь содержала затравки A4, В2, С1, G1 и G2, что позволило выявить уровень экспрессии 1А- и 1В-содержащих изоформ мРНК гена TrpRS относительно количества мРНК гена GAPD. Размеры фрагментов ДНК, амплифицированных по кДНК гена GAPD, 1А- и IB-содержащих изоформ кДНК гена TrpRS равны соответственно 161, 139 и 119 п.н.

Можно предположить, что участие ИФН в защите от внутриклеточны) паразитов реализуется через увеличение активности TrpRS поел« обработки клеток ИФН [Carlin et al., 1989]. Показано [Taylor et al., 1991] что при заражении клеток Toxoplasma gondii и Chlamydia psitacci ИФ!^ индуцирует в этих клетках индоламин-2,3-диоксигеназу (ЮО) - фермент катализирующий первую стадию разложения триптофана, лимитирующук по времени. В результате такой индукции количество триптофана клетке-хозяине уменьшается до уровня, при котором останавливаете рост и развитие этих паразитов. Показано также, что индукция Ю< связана с антипролиферативным эффектом ИФНгамма [Feng et al 1989]. В культурах человеческих фибробластов FS 4 и эпителиальнь клеток HeLa кинетики ИФН-зависимой индукции TrpRS и ЮО практическ совпадают (активность IDO в клетках возрастает через 6-8 часов посг обработки ИФН и достигает максимума через 12-24 часа) [Fleckner et а 1995]. Возможно, TrpRS индуцируется для того, чтобы поддержа

синтез клеточных белков в условиях вызванного индукцией IDO уменьшения концентрации триптофана.

ИФН-зависимая индукция TrpRS может быть также связана и со способностью этого фермента в присутствии l-триптофана. АТР-Мд2' и ADP синтезировать диаденозинтрифосфат (АрзА) [Kisselev et al.. 1993]. в то время как большинство аминоацил-тРНК-синтетаз в таких условиях m vitro синтезируют диаденозинтетрафосфат (АрдА) (см. обзор [Remy, 1992]). В нашей лаборатории показано (Vartanian et al., 1996], что в культуре моноцитов J-96 при обработке ИФНгамма параллельно с увеличением активности TrpRS возрастает уровень АрзА. Выдвинуты также и другие гипотезы относительно возможной роли TrpRS в ответе клеток на действие ИФН [Kisselev et al., 1993].

Определение участков начала транскрипции гена TrpRS методом удлиннения затравки.

Наблюдаемая синхронность в индукции образования 1А- и 1В-;одержащих изоформ позволяет препдположить, что изоформы мРНК шеют общее происхождение и общий старт транскрипции. В связи с >тим мы определили положение участков начала транскрипции методом длиннения затравки (primer extension assay). Исследовали РНК, ыделенную из клеток CaOv и МТ-4. В качестве затравок использовали лигонуклеотиды А5 и А6, комплементарные нуклеотидным оследовательностям в начале и в конце экзона 1А (см. рис. 1). асстояние между ними равно 70 нуклеотидов. На рис. 5а показано, что с правкой А6 получено два фрагмента кДНК длиной 41 и 131 нуклеотид. олее легкий продукт соответствует обнаруженному ранее [Strehlow et .,1993; Tolstrup et al., 1995] участку начала транскрипции. Отметим, что » расстоянии 24 н.п. перед этим стартом транскрипции находится зтенциальный ТАТА-бокс ТАТТААА. На рис. 1 этот участок начала !анскрипции обозначен Рг. Тяжелый продукт соответствует юположенному на 90 н.п. выше старту транскрипции. На рис. 1 он

обозначен как P^. На расстоянии 30 н.п. перед ним находится последовательность ТТТАТАА, потенциальный ТАТА-бокс.

Рисунок 5. Определение старта транскрипции гена ТгрПБ методо удлиннения затравки. Стрелками показаны полосы, соответствуют обнаруженным стартам транскрипции. А - опыт с затравкой А6. В качесп стандарта размера фрагментов использовали ДНК фага лямбда, расщеплен^ Р\л/1/ и ДНК плазмиды рВЯ, расщепленную А1и1 ; размеры фрагментов в п. указаны справа. 1 - клетки СаОу, обработанные ИФНгамма; 2 - клетки МТ-обработанные ИФНгамма. Б - опыт с затравкой А5 на клетках СаС обработанных ИФНгамма. В качестве стандарта использовали ДНК фа лямбда, расщепленную РшИ и ДНК плазмиды рВЯ, расщепленную ШпП.

Затравка А5 комплементарна нуклеотидной последовательности, расположенной выше старта транскрипции Р2. На рис. 55 виден продукт удлиннения затравки, его длина 61 нуклеотид. что соответствует мРНК. синтезированной со старта транскрипции Р1 (расстояние между участками отжига праймеров равно 50 нуклеотидов. а длина затравки равна 20 нуклеотидам). Относительно более слабая полоса на этом радиоавтографе соответствует продукту длиной 49 нукл. и указывает на существование минорного старта транскрипции между Р\ и Р2 на расстоянии 12 п.н. от участка Р1. В работе БиеМоуу е! а1.. (1993) упоминаются минорные старты транскрипции, примыкающие слева к старту Р2.

Транскрипт, инициированный в участке Р1 далее будет называться лре-мРНК I. а синтезированный со старта 92 - пре-мРНК 2. Опыт с удлиннением затравки показал, что транскрипция, инициированная в участке Р2. идет более эффективно, т.к. пре-мРНК 2 синтезируется в большем количестве, чем лре-мРНК 1 (см. рис. 5А)„

Между точками инициации транскрипции Р1 и Р,2 расположен ИФН I-ивисимый элемент (БИЕ. С помощью делёционного анализа в чскусственных конструкциях установлено [введей е1 а1., 1994; ТоЫгир е1 )1.. 1995], что он неактивен, а ИФН-зависимую индукцию транскрипции ГгрЯБ контролирует элемент ОАЭ. расположенный выше точки Р1. :оторый отвечает на стимуляцию обоими типами ИФН [РгоЮуэ е( а1.. 1993; \1геЫаме1 а!.. 1993].

Альтернативный сплайсинг транскриптов гена ТгрЯЭ.

а. 1В-содержащая изоформа мРНК ТгрйЭ.

Поскольку 1А-содержащие и 1В-содержащие изоформы мРНК ТгрИБ одинаковой степени индуцируются ИФН, мы предположили, что они бразуются при альтернативном сплайсинге единого первичного ранскрипта и должны иметь общий 5'-фланкирующий участок. Для бнаружения этой нуклеотидной последовательности РНК из

обработанных ИФНгамма клеток CaOv анализировали методом RT-PCR. Антисмысловая затравка В1 расположена на З'-конце экзона 1В, а прямые затравки расположены (см. рис. 1) между стартами транскрипции Pi и Рг (А1 и А2) или ниже старта Р2 (A3 и A4). На рис. 6 показано, что при сочетании затравок А1/В1, либо А2/В1 продукт PCR отсутствует, при реакции с парой затравок АЗ/В1 образуется продукт длиной 180 н.п., а при реакции с затравками А4/В1 - продукт длиной 160 н.п. Аналогичный результат получен и с РНК из клеток МТ-4.

CaOv

бЯННЯИНН

636 — ¡РЧнЯН^^^^Н

532—-¡Е^ЯНЯД^^^ДИ 468—^^^НвЩ^Н^^мВ

343 — ¡О^^ИНпЯ^Н^

211 —

141 —

А1 А2 A3 A4 затравки: bi В1 в 1 В1

Рисунок 6. Альтернативный сплайсинг экзона 1В. Исследование методо обратной транскрипции с последующей PCR мРНК TrpRS из обработаннь ИФНгамма клеток CaOv. Стрелкой показаны продукты PCR. К - Рш/Агидролиз? ДНК фага лямбда.

Следовательно, 1 B-содержащая изоформа мРНК TrpRS включает праву часть экзона 1А. Можно сделать вывод, что 1В-содержащая изофорл мРНК TrpRS (она обозначена как изоформа 3, см. рис. 8) синтезируется точки инициации транскрипции Р2. Продукт PCR длиной 180 н.п. 6t секвенирован с использованием затравок A4 и В1. Донорный ca¡ сплайсинга расположен на З'-конце экзона 1А, а акцепторный сайт -

106 н.п. выше 5'-конца затравки В1. Следовательно, изоформа 3 включает 130 нуклеотидов экзона 1В.

Экзон 1В присутствует только в изоформе 3. Впервые этот экзон был обнаружен в клоне 9 кДНК TrpRS [Frolova et al.. 1991], где его длина равна 251 н.п. Третья изоформа мРНК TrpRS содержит фрагмент длиной 130 нуклеотидов, совпадающий с З'-концевым участком экзона 1В из клона 9. Возможно, кДНК клона 9 транскрибирована с незрелого РНК-предшественника изоформы 3. IB-содержащую изоформу находили среди мРНК TrpRS эпителиальных клеток HeLa и амниотических клеток AMA [Tolstrup et al., 1995]. Наши данные показывают присутствие этой изоформы во всех исследованных культурах клеток: J-96. J-41. Н-9, СК-27, СЕМ, МТ-4, CaOv, поэтому 1В-изоформу нельзя считать гканеспецифической.

б. Изоформа мРНК TrpRS, не содержащая экзона Н.

РНК из клеток CaOv и МТ-4 анализировали методом RT-PCR. Ангисмысловая затравка D1 расположена в экзоне III, прямые затравки А1 - А4 соответствуют структуре экзона 1А, а прямая затравка В2 соответствует экзону 1В. При амплификации с парой затравок A1/D1 образовался продукт длиной около 370 н.п.. с парой A2/D1 - длиной около 340 н.п. Амплификация с затравками A3/D1 привела к образованию двух продуктов длиной около 320 н.п. и около 140 н.п., также два продукта PCR длиной около 300 н.п. и около 120 н.п. выявлены при реакции с парой затравок A4/D1 (см. рис. 7).

Фрагменты ДНК длиной около 370, 340, 320 и 300 н.п., вероятно, синтезированы на матрицах кДНК, синтезированных по первой и второй изоформам мРНК TrpRS (см. схему сплайсинга на рис. 8), эти две изоформы содержат экзон 1А (либо полноразмерный, либо его часть), экзоны II и III. Ожидаемые размеры этих продуктов PCR равны соответственно 378, 345, 318 и 301 н.п., следовательно, с разными

смысловыми затравками А1-А4 образуются продукты, размеры которых точно соответствуют схеме сплайсинга (рис. 8).

А Б

636 -532 -468 -

343 -

211 -

141 ~

Рисунок 7. Альтернативный сплайсинг экзона И. Исследование методам-. RT-PCR мРНК TrpRS из обработанных ИФНгамма клеток CaOv и МТ-4. А. Клетки CaOv. 1 - в качестве стандарта размера фрагментов - ДНК фага лямбда, расщепленная PvuH. Стрелками показаны продукты П1ДР: 2 - праймеры A1/D1; 3 - лраймеры A2/D!; 4 - лраймеры A3/D1; 5 - праймеры A4/DI; 6-праймеры B2/D1. Б. Клетки МТ-4. 1 - стандарт размера фрагментов. Стрелками показаны продукты ПЦР: 2 - праймеры A1/D1; 3 - праймеры A2/D1; 4- праймеры A3/D1; 5 - праймеры A4/D1; 6 - праймеры B2/D1.

На дорожках 4 и 5 (рис. 7 А.Б) видны также короткие продукты PCR длиной около 140 и около 120 н.п. Мы предположили, что они синтезированы на матрице кДНК-копии четвертой изоформы мРНК TrpRS (см. рис. 8), в которой отсутствует экзон II. Учитывая, что длина второго экзона равна 172 н.п., ожидаемая длина этих двух фрагментов должна быть равна 146 и 129 н.п.. соответственно. Чтобы подтвердить описанную схему сплайсинга, продукт PCR длиной 140 н.п. секвенировали, используя праймеры A4 и D1. Расшифрованная первичная структура подтвердила, что З'-конец экзона 1А соединяется с 5'-концом экзона III, при этом экзон II выщепляется как интрон. РНК-

предшественник изоформы 4 синтезируется только со старта транскрипции Р2, т.к. расположенные ниже старта транскрипции Р2 праймеры A3 и А4 дают ожидаемый продукт PCR, а продукты амплификации с праймерами A1/D1 и A2/D1 (их ожидаемый размер 206 и 173 н.п. соответственно) в нашем исследовании не выявлены (см. рис. 7 А,Б , дорожки 2 и 3).

Согласно нашим данным, со старта транскрипции Р2 синтезируются 2-ая, 3-я и 4-ая изоформы мРНК TrpRS (см. рис. 8). Вероятно, этим трем изоформам мРНК предшествует одинаковый первичный транскрипт -пре-мРНК 2, который подвергается альтернативному сплайсингу. Образующаяся при его созревании изоформа 2 включает укороченный экзон 1А (без участка Pi - Р2), присоединенный ко ll-му экзону и соответствует ранее обнаруженному клону 13.13 кДНК TrpRS [Strehlow et al., 1993]. Третья (IB-содержащая) изоформа мРНК описана выше. В 4-ой изоформе мРНК TrpRS экзон 1А присоединяется к экзону 111. Эта изоформа не имеет кодона-инициатора трансляции, расположенного во II экзоне, а в III экзоне расположены два потенциальных инициаторных кодона AUG, соответствующих Met42 и Met48 TrpRS. Существование транслированой с укороченной открытой рамкой считывания (ОРС) формы TrpRS подтверждается данными Tolstrup et al., (1995): при электрофоретическом анализе индуцируемых ИФНгамма белков выявлен белок с мол. массой 48 кДа, имеющий активность TrpRS. Вероятно, это укороченная форма TrpRS, транслированная с AUG-кодона, соответствующего Met48 полноразмерной TrpRS человека, имеющей мол. массу 54 кДа [Frolova et al., 1991]. Такие различия в N-концевой области не сказываются на способности фермента аминоацилировать тРНК, т.к. она определяется кодируемым V - XI экзонами "коровым" доменом [Frolova et al., 1993].

Для синтезированной со старта транскрипции Р1 пре-мРНК 1 существует только один вариант сплайсинга, при котором

полноразмерный зкзон 1А (159 н.п.) присоединяется к экзону II, формируя первую изоформу мРНК TrpRS, которая соответствует ранее обнаруженому клону 3 кДНК TrpRS [Frolova et al., 1991].

Для проверки предположения о существовании изоформы мРНК TrpRS, содержащей зкзоны 1В и III, но не содержащей экзона II, мы провели RT-PCR с затравками B2/D1 (см. рис. 7 А,Б , дорожка 6). Выявлен только один продукт длиной около 280 н.п., который соответствовал 3-ей изоформе мРНК TrpRS, содержащей экзоны 1В, II и III (расчетная длина продукта равна 281 н.п.). Продукт с ожидаемой длиной 109 н.п., соответствующий изоформе, не содержащей II экзона, не обнаружен.

2 ггз_________

* СZZ3________________.', —I___

ИЗОСВОРМЫ мРНК

Рисунок 8. Схема сплайсинга 5'-концевых экзонов первичных транскриптов гена TrpRS человека. Экзоны обозначены прямоугольниками, пре-мРНК 1 и схема ее сплайсинга - серым, пре-мРНК 2 и схема ее сплайсинга - черным, точки начала транскрипции Р1 и Р2 обозначены стрелками. Изоформы мРНК обозначены цифрами.

По результатам количественной PCR (см. рис. 2 и 4) содержание 3-ей изоформы мРНК TrpRS в культуре моноцитов J-96 примерно равно общему количеству 1А-содержащих изоформ (1-ой, 2-ой и 4-ой). Для других исследованных клеточных культур по результатам Northern-гибридизации можно сделать аналогичный вывод (см. рис. 3), но следует

учитывать, что 3-я изоформз содержит 71 нуклеотид из экзона 1А. и РНК-зонд, выявляющий 1А-содержащие изоформы. может гибридизоваться и с ней.

Таблица 1. Структура участков сплайсинга в альтернативных экзонах гена ТгрЯЭ. Прописными буквами показаны нуклеотиды в составе экзонов, строчными - нитронов.

Экзон Акцепторный Донорный Размер экзона

участок сплайсинга участок сплайсинга (н.п.)

1 А АССТвСдтаТд! 158 (старт транскр. Р1)

71 (старт транскр. Р2)

1 В тсадАОТСТА ССАААСдоада 130

II ссссадТСГГСА ТСАААСдОса! 172

III йсадСЗАТСАА СТСАТТд1асд1 213

Фрагмент экзона 1А, регулирующий альтернативный сплайсинг.

Схема сплайсинга транскриптов ТгрЯБ (см. рис. 8) наводит на мысль, что входящий в пре-мРНК 1 фрагмент между точками Р1 и Р2 препятствует сплайсингу 5'-концевого экзона 1В и еыщеплению экзона II. Известно, что вторичная структура пре-мРНК может влиять на альтернативный сплайсинг [иЬп е1 а1., 1991]. Возможно, это происходит при сплайсинге пре-мРНК 1. Для проверки этого предположения в нашей лаборатории проведено построение вторичных структур транскриптов 5'-концевых экзонов гена ТгрйБ [Турпаев и др., 1996]. Расчеты были основаны на выборе равновесных конформаций РНК, имеющих минимальную свободную энергию взаимодействия нуклеотидов. Вероятная вторичная структура 5'-конца пре-мРНК 1 приведена на рис. 9.

с с и а

с.д

а а с д«*

а с

д ис а

Д 9"

р'ги ч

Ч с Ч с д с и а

„С=-93ккал/моль с

дсод дс и а ис о и Т иа и с д

уиааадас 9 лидадаац с 9 с

и «5 д с и да

ас

д с

о1 аи

' 1. с ? 9 с « сс

Г*" а и ч С а и

с<|'„ у сдааа ид— с.цдд1а(д1а^

3 1 «д а и а „ I

^ а иа э,зон '^¡нгрои 1а

Рисунок 9. Предполагаемая вторичная структура 5'-концевого участка пре-мРНК 1. Обозначены старты транскрипции Р1 и Р2, граница экзона 1А и интрона 1а. (Взято из работы Турпаева и др., (1996).)

Согласно проведенным расчетам. 5'-концевой участок экзона 1А может образовывать триплексную структуру, состоящую из двух параллельнх лолипуриновых и одной антипараллельной им полипиримидиновой последовательности. Остальную часть транскрипта экзона 1А можно представить как шпильку, левую часть которой составляют нуклеотиды участка Р1-Р2. а комплиментарную им часть -основания, расположенные правее участка инициации Р2. В пре-мРНК 2. которая не содержит участка Р1-Р2, образование подобной двухспиральной структуры невозможно. 5'-концевая полипуриновая последовательность, расположенная в пре-мРНК 1, стабилизирует двухспиральную структуру в экзоне 1А, что затрудняет взаимодействие 3-концевого участка экзона 1А с комплиментарными участками в экзонах

1В и ill. Возможно поэтому при созревании пре-мРНК 1 не образуются изоформы 3 и 4. Эти расчеты объясняют полученную схему сплайсинга, хотя и не учитывают взаимодействие пре-мРНК с мяРНП и регуляторными белками.

Необходимо отметить, что решающее значение в определении вариантов сплайсинга имеет взаимодействие пре-мРНК со специфическими белковыми факторами [Del Gatto & Breathnach, 1995). Последовательность 5'GAAAGAAAGAGGGGAAGAG3'. находящаяся внутри участка Р1-Р2 пре-мРНК 1. на 79% гомологична последовательности полипуринового энхансера сплайсинга (ESE-элемента), представляющего собой набор трехнуклеотидных фрагментов GAR. ESE-элемент встречается, например, в экзонах генов фибронектина [Caputi et al., 1994] и кальдесмона [Humphrey et al., 1995] человека, гена dsx Drosophyk) melanogaster [Linch & Maniatis. 1995]. гена гормона роста быка |Dirksen et al.. 1995]. ESE-элемент является участком связывания RS-факторов и мяРНП Ü1 [Staknis & Reed. 1994]. В пре-мРНК бета-тропомиозина крысы ESE-элемент влияет на выбор альтернативного 3'-сайта сплайсинга [Tsukahara et al.. 1994]. Аналогичным образом он мог бы действовать и в пре-мРНК 1 TrpRS. Во всех приведенных примерах ESE-элементы влияют на сплайсинг как позитивные регуляторы, только в пре-мРНК гропомиозина ESE-элемент действует как негативный регулятор. В пре -мРНК 1 TrpRS он потенциально может также играть роль негативного регулятора. Без проведения опытов с делецией этого участка делать выводы о регуляторной активности различных нуклеотидных последовательностей в составе участка Р1-Р2 преждевременно. Однако, учитывая расположение минорных стартов транскрипции, можно предположить, что препятствующий сплайсингу экзона 1В и выщеплению экзона II элемент находится ниже этих стартов. Если бы этот регуляторный элемент находился выше, при RT-PCR с затравками А1 и А2 выявились бы изоформы мРНК. идентичные по

структуре изоформам 3 и 4. но имеющие на 5'-конце соответствующие фрагменты экзона 1А. В наших опытах подобные продукты PCR не обнаружены (рис. 6 и 7). Следовательно, регуляторный элемент находится на участке -51/-1 (координата -1 соответствует точке начала фанскрипции Р2). Именно в этом районе расположена предполагаемая последовательность ESE. ее координаты -43/-25.

Изоформы мРНК TrpRS, вероятно, транслируются с разноi эффективностью.

Все возникающие в результате альтернативного сплайсинга изоформь мРНК TrpRS. за исключением четвертой, имеют идентичны« последовательности в области основной открытой рамки считыванж (ОРС) и различаются по последовательности 5'-нетранслируемогс участка. Доказано влияние таких участков на эффективность трансляцт мРНК [Jackson, 1993]. В частности, есть данные о том. чтс расположенные в этих районах короткие, иногда перекрывающиеся. ОРС ослабляют эффективность трансляции основной ОРС [Zimmer et al., 1994 Chu et al.. 1995]. В 1-ой и 2-ой изоформах мРНК TrpRS таки< дополнительные ОРС отсутствуют. Четвертая изоформа на расстоянии Т. нуклеотидов от старта транскрипции имеет дополнительную короткун ОРС, кодирующую 6 аминокислот. Ее терминирующий кодон UAy расположен на расстоянии 2 нуклеотидов от возможного инициирующеп кодона AUG (Met42 в полноразмерной TrpRS) основной ОРС этой мРНК Третья изоформа имеет две дополнительных ОРС, совпадающих по фаз< с основной ОРС. Первая расположена на расстоянии 121 нуклеотида о старта транскрипции и кодирует всего 8 аминокислот, втора расположена на расстоянии 160 нуклеотидов от старта и кодирует 2 аминокислоты. Возможно, 3-я и 4-ая изоформы мРНК TrpRS имеют боле низкую эффективность трансляции, чем изоформы 1 и 2. Эт предположение требует экспериментального подтверждена Существование двух различающихся по эффективности трансляци

изоформ мРНК описано для изолейцил-тРНК-синтетазы человека. Содержащая более длинную 5'-концевую область изоформа мРНК имеет одну короткую ОРС выше первого кодона основной ОРС [Nichols et al., 1995].

выводы:

1. Выявлены два основных старта транскрипции гена TrpRS человека, один из которых соответствует обнаруженному ранее [Tolstrup et al., 1У95].

2. Установлено, что сплайсинг двух синтезированных со стартов транскрипции Pi и Р2 npe-мРИК гена TrpRS протекает по-разному: при созревании пре-мРНК 1 образуется одна изоформа мРНК, а при альтернативном сплайсинге пре-мРНК 2 - три изоформы.

3. Установлено, чго содержащие экзон 1А изоформы мРНК TrpRS и содержащая экзон 1В изоформа мРНК образуются во всех исследованных линиях клеток человека (моноциты J-41 и J-96. Т-лимфоциты СЕМ. Н9 и МТ-4. диплоидные фибробласты СК-27 и эпителиальные клетки CaOv). Соотношение изоформ в каждой из клеточных линий постоянно.

4. Обнаружено, что интерфероны альфа и гамма стимулируют синтез мРНК TrpRS во всех перечисленных выше клеточных линиях. Соотношение 1А- и IB-содержащих изоформ мРНК при индукции не изменяется.

5. Обнаружен фрагмент пре-мРНК длиной 50 нуклеотидных пар, регулирующий альтернативный сплайсинг пре-мРНК TrpRS in vivo.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. К.Т.Турпаев, И.В.Соколова (1994) Экспрессия двух изоформ мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы в обработанных интерфероном клетках. Тезисы 4-ой конференции "Геном человека". Черноголовка, март 1994., стр. 95.

2. A.N.Narovlyansky, K.T.Turpaev. A.M.Amchenkova, I.V.Sokolova, E.G.AIimov.V.V.Parfenov. L.L.Kisselev & F.I.Yershov (1994) Expression of the

interferon-induced isoforms of the tryptophanyl-tRNA synthetase mRNA in cell lines with different sensitivity to interferons. Annual Meeting of the ISICR, Budapest, Hungary, J. Interferon Research 14, 101.

3. И.В.Соколова, А.Н.Наровлянский, А.М.Амченкова, К.Т.Турпаев (1996] Альтернативный сплайсинг 5'-концевых экзонов гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека. Мол. биология т.30 N2, 317-329.

4. K.T.Turpaev, V.M.Zakhariev, I.V.Sokolova, A.N.Narovlyansky A.M.Amchenkova, J.Justesen, L.Yu.Frolova (1996) Alternative processing of the tryptophanyl-tRNA synthetase mRNA from interferon-treated human cells Europ. J. Biochem. 240, 732-737.

Список цитированной литературы:

1. Caputi M., Casari G., Guenzi S., Tagliabue R.. Sidoli A., Meló C.A. & Baralle F.E (1994) A novel bipartite splicing enhancer modulates the differential processing of the humai fibronectin EDAexon, Nucleic Acids Res. 22, 1018-1022.

2. Carlin J.M., Borden E.C. & Byrne G.I. (1989) Interferon-induced ¡ndolearníne 2,3 dioxygenase activity inhibits Chlamydia psittaci replication in human macrophages, u Interferon fíes. 9, 329-337.

3. Chomczynski H. & Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acic guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction, Anatyt. Biochem. 102, 156-159.

4. Chu Sh.C., Wu H.P., Banks T.C., Bssa N T. & Moss J. (1995) Structural diversity ii me 5'-untranslated region of cytokine-stimulated human inducible nitric oxide synthasi mRNA, J. Biol. Ctiem. 270, 10625-10630.

5. Del Gatto F. & Breathnach R. (1995) Exon and intron sequences, respectively repress and activate splicing of a fibroblast growth factor receptor 2 alternative exon, Mo Cell Biol. 15, 4825-4834.

6. Dirksen W.P., Sun Q. & Rottman F.M. (1995) Multiple splicing signals contrc alternative intron retention of bovine growth hormone pre-mRNA, J. Biol. Chsm. 270, 5346 5352.

7. Feng G.S. & Taylor M.W. (1939) Interferon gamma - resistant mutants are defectiv in the induction of indoleamine 2,3-dioxygenase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7144-7148.

8. Fleckner J., Martensen P.M., Tolstrup A.B., Kjeldgaard N.O. & Justesen J. (1995 Differential regulation of the human, interferon inducible tryptophanyl-tRNA synthetase b various cytokines in celJ lines, Cytokine 7, 70-77.

9. Frolova L.Y., Sudomoina M.A., Grigorieva A.Y., Zinovieva O.L. & Kisselev L.L. (1991 Cloning and nucleotide sequence of ¡he structural gene encoding for human tryptophanyl tRNA synthetase, Gene 109, 291-296.

10. Frolova L.Y., Grigorieva A.Y., Sudomoina M.A. & Kisselev L.L. (1993) The huma gene encoding tryptophanyl-tRNA synthetase: interferon-response elements and exon-intro organization, Gene 128, 237-245.

11. Humphrey M.B., Bryan J., Cooper Т.Д. & Berget S.M. (1995) A 32-nucleotide exon-splicing enhancer regulates usage of competing 5'splice sites in differential internal exon. Mol. Cell Biol. 15, 3979-3988.

12. Kisselev L.L., Frolova L.Y. & Haenni A.-L. (1993) Interferon inducibility of mammalian tryptophanyl-tRNA synthetase: new perspectives, Trends Biochem. Sci. 18, 263-267.

13. Jackson R.J. (1993) Cytoplasmic regulation of rnRNA function: the importance of the З'-untranslated region, Cell 74, 9-14.

14. Libri D.. Piseri A. & Fiszman М.У. (1991) Tissue-specific splicing in vivo of the beta-tropomyosin gene: dependence on an RNA secondary structure. Science 252. 1842-1848.

15. Lynch K.W. & Maniatis T. (1995) Synergistic interactions between two distinct elements of a regulated splicing enhancer, Genes Dev. 9, 284-293.

16. Nichols R.C., Raben N.. Boerkoel C.F. & Plotz P H. (1995) Human isoleucyl-tRNA synthetase: sequence of the cDNA, alternative rnRNA splicing, and the characteristics of an unusually long C-terminal extension, Gene 155, 299-304.

17. Seegert D., Strehlow I., Klose В., Levy D.E., Shindler C. & Decker T. (1994) A novel interferon-alpha-regulated, DNA-binding protein participates in the regulation of the IFP 53/tryptophanil-tRNA synthetase gene, J. Biol. Chem. 269, 8590-8595.

18. Remy P. (1992) Ap4A and other dinudeoside polyphosphates, McLennan A G. Ed. Boca Raton, F.L.: CRC Press

19. Staknis D. & Reed R. (1994) SR proteins promote the first specific recognition of pre-mRNA and are present together with the U1 small nuclear riDonucleoprotein particle in a general splicing enhancer complex, Mot. Cell Biol. 14, 7670-7682.

20. Strehlow I., Seegert D., Frick C., Bange F.-C., Shindler C., Bottger E.C. & Decker T. (1993) The gene encoding IFP53\tryptopnanyl-tRNA synthetase is regulated by the gamma-interferon activation factor, J. Biol. Chem. 268, 16590-16595.

21. Taylor M.W. & Feng G.S. (1991) Relationship between interferon-gamma, indoleamine 2,3-dioxygenase, and tryptophan catabolism, Faseb. J. 5, 2516-2522.

22. Tolstrup А.В., Bejder A., Fleckner J. & Justesen J. (1995) Transcriptional regulation of the interferon-gamma-inducible tryptophanyl-tRNA synthetase includes alternative splicing, J. Biol. Chem. 270, 397-403.

23. Tsukahara Т., Casciato C. & Helfman D.M. (1994) Alternative splicing of beta-tropomyosin pre-mRNA: multiple c/s-elements can contribute to the use of the 5'- and 3'-splice sites of the nonmuscle/smooth muscle exon 6, Nud. Acids Res. 22, 2318-2325.

24. Турпаев K.T., Блинов B.M., Киселев Л.Л. (1996) Короткая 5'-концевая последовательность пре-мРНК тригттофанил-тРНК синтетазы подавляет сплайсинг альтернативных экзонов, Доклады Академии Наук 349, 698-700.

25. Vartanian К., Naroviansky A., Amctienkova A., Turpaev К. & Kisselev L. (1996) Interferons induce accumulation of diadenosine triphosphate (АрЗА) in human cultured cells, FEBS Letters 381, 32-34.

26. Zimmer A., Zimmer A.M. & Reynolds K. (1994) Tissue specific expression of the retinoic acid receptor-beta2: regulation by short open reading frames in the 5'-noncoding region, J. Cell. Biol. 127, 1111-1119.