Аминоацил-т-РНК-СИНТЕТАЗЫ: комплексообразование С тРНК и иммунохимический анализ

Берестень, Сергей Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аминоацил-т-РНК-СИНТЕТАЗЫ: комплексообразование С тРНК и иммунохимический анализ
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Аминоацил-т-РНК-СИНТЕТАЗЫ: комплексообразование С тРНК и иммунохимический анализ"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

УДК 547.963.3 577.123

БЕРЕСТЕНЬ Сергей Федорович

АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ: КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ С тРНК И ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

03.00.03. — молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада

Москва —1992

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (заведующий лабораторией член-корреспондент РАН, профессор JT. JI. Киселев) и в отделе молекулярной биофизики и биохимии Йельского Университета, США (заведующий лабораторией профессор D. Söll).

члеи-корреспонденг РАН, доктор химических наук, профессор А, А. Богданов

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор В. В. Власов доктор биологических наук, профессор О. Л. Поляновский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт молекулярной биологии и генетики АН Украины

Защита состоится « 1992 г. в часов на засе-

дании Специализированного совета Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан: « ЪО » 1992 г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Проблема биосинтеза белков сформулирована в середине 50-х годов, когда были открыты тРНК, аминоацил-тРНК синтетазы, рибосомалъныя синтез белков, предложена адапторная гипотеза белкового синтеза. Открытия последующих десятилетия привели к значительному прогрессу в решении этой проблемы. Были расшифрованы кодоны для всех аминокислот, открыты мРНК, информосомы, доказана адапторная функция тРНК, расшифрованы нуклеотидные последовательности тРНК, определены первичные структуры ряда аминоацил-тРНК-синтетаз, определены пространственные структуры тРНК и аминоацил-тРНК.-синтетаз, выяснены основные принципиальные этапы биосинтеза белков в рибосомах: инициация, элонгация, выделены факторы терминации. Однако все это не дает достаточного знания о глубинных основах биосинтеза белков.

Самую многочисленную группу ферментов, участвующих в реализации генетической информации, образует аминоацил-тРНК-синтетазы (КФ 6.1.1. ). Они привлекает к себе пристальное внимание и служат объектом интенсивных исследований в течение многих лет (см. Schirme1 & Söll, 1979; Киселев и др., 1964; Schimmel, 1967; Söll, 1990). Основная функция этих ферментов - активация аминокислот и перенос их на специфичные тРНК.. Процёсс образования высокоспецифичных комплексов между тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазами лежит в основе протекания точности всего этапа трансляции. Механизм этого процесса до сих пор остается во многом неясным, несмотря на значительные усилия, направленные на его выяснение.

Помимо основных, аминоацил-тРНК-синтетазы выполняют и

Принятые сокращения: АТР - аденозинтрифосфорная кислота, DS-Na - додецилсульфат натрия, AT - антитела, моноАТ -моноклональные антитела. полиАТ - поликлональные антитела, Ар,А -

1 4

5,5'-Р ,Р - ди(5'-аденозил )тетрафосфат, ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, КД - круговой дихроизм, РР1 - пирофосфат, ПААГ - полиакриламидный гель, ORS или GlnRS - глутаминил-тРНК-синтетаза, тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота, тРНКС1п-глутаминиловая тРНК, тРНКГгр- триптофаниловая тРНК, WRS -триптсфанил-тРНК синтетаза.

дополнительные функции. Так, некоторые из этих ферментов

1 4

катализируют также реакции синтеза 5,5'-Р ,Р -ди(5'-аденозил) тетрафосфата (Ар^А), необычного нуклетидного производного, которое, как предполагают некоторые исследователи, участвует в контроле клеточной пролиферации (гавесШк. 1983). Триптофанил-тРНК-синтетаза (ШБ) может катализировать образование Ар3А, не катализируя синтеза Ар^А (Ковалева и др., 19В8). Кроме того, синтетазы участвуют и в других регуляторных процессах, в частности в регуляции биосинтеза аминокислот, что было показано на мутантных клетках с температурночувствительными аминоацил-тРНК синтетазаыи (МеББеп^у et а1.( 1976; АпсШШб ег а1., 1979). Аналогичным образом показано участие этих ферментов в регуляции транспорта аминокислот (Мооге ег а1., 1977).

К наиболее охарактеризованным аминоацил-тРНК-синтетазам млекопитающих и вообще многоклеточных относится триптофанил-тРНК -синтетаза из поджелудочной железы крупного рогатого скота (К1е£е1еу ег а1., 1979а; Ма.1у£1п & 1982; Киселев и др.,

1984; К1еве1еу а Коуа1еуа, 1987; Киселев, 1990). таб состоит из двух идентичных субъединиц с Мг 60 кДа каждая, содержит ион 2п*+, необходимый для поддержания нативноя структуры и ферментативной активности (К1£Бе1е\> ег а1., 1981). ТОБ образует ковалентные производные со своими лигандами, а именно с триптофаном (К1£зе1еу ■ ег а1., 1979Ы, пирофосфатом (Коуа1еуа ег а1., 1983; К1Еге1еу & Коуа1еу&, 1987) и с АМР (Меркулова и др., 1987).

Использование иммунохимического подхода позволяет получить новую ценную информацию о структуре ферментов, а также расширяет возможность изучения дополнительных функция аминоацил-тРНК-синтетаз.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа, во-первых, посвящена изучению комплексов тРНК. с аминоацил-тРНК-синтетазами различными методами для выявления информационных изменений в тРНК при взаимодействии с синтетазой и изучению роли модифицированных основании в этом процессе. Во-вторых, работа посвящена иммунохимическому изучению с помощью полиАТ и моноАТ ряда аспектов молекулярной биологии триптофанил-тРНК-синтетазы, главным образом, из млекопитающих.

Е ходе исследований мы стремились: а) разработать методы по

выявлении воэмояных информационных изменений в тРНК при специфическом комплексообраэовании с синтетазой; б ) получить транскрипт молекулы тРНК ; в) сравнить комплексы синтетазы с транскриптом и зрелой гомологичной тРНК; г ) сравнить комплексы синтетазы со зрелыми специфичной и неслецифичной тРНК; д) сравнить комплексы синтетазы с транскриптом и ыутантными гомологичными транскриптами тРНК.; е) получить полиАТ и моноАТ к бычьей WRS; ж) разработать быстрые методы выделения фенилаланил- и тирозил-тРНК-синтетаз высших эукариот; з) получить моноАТ к фенилаланил- и тирозил-тРНК-сингетазам, а также к мультиферменгному комплексу аминоацил-тРНК-синтетаз; и) выявить уникальные и эволюционно консервативные антигенные детерминанты в VR5; к) локализовать WRS в клетках про- и эукариот; л) выявить белки, способные компартментализовать WRS с рибосомами; м) разработать метод локализации антигенных детерминант на полипептидах с неизвестной первичной структурой.

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода структурного картирования тРНКТгр в комплексе с WHS РНКазоя VI показано, что тРНК при комплексообраэовании подвергается конформационноыу напряжение).

Установлено, что посттранскрипционная модификация нуклеозидов в тРНК является решавшим фактором в стабилизации пространственной структуры и компенсации напряжения в молекуле тРНК при комплексообраэовании. Отсутствие модификации приводит к Mg++- и спермин-зависимому расщеплению определенных фосфодиэфирных связей тРНКС1п E.coll, индуцированных гомологичной синтетазой при образовании комплекса.

Показано, что в случае "несвоея" модифицированной тРНК напряжение в некорректном- комплексе с синтетазой приводит к разрыву фосфодиэфирных связей ряда участков структуры молекулы тРНК. Предполагается, что это дополнительный механизм зашиты от использования ошибочно аминоацилированноя тРНК при трансляции.

Предполагается, что молекула тРНК потенциально обладает рибозимоподобной активностью, которая обнаруживается при достижении определенной конформации молекулы тРНК при комплексообраэовании с :интетазоя, а роль посттранскрипционных модификаций состоит в том,

чтобы блокировать эту потенциальную активность.

WRS быка является первым среди аминоацил-тРНК- синтетаз ферментом, изученным иммунохимическими методами. Показана эволюционная консервативность антигенной детерминанты для полипептидов WRS, находящейся за пределами активного центра фермента. Для локализации этого консервативного зпитопа в молекуле WRS разработан метод определения антигенных детерминант линейного типа на полипептидах с неизвестной первичной структурой. Показано, что консервативная антигенная детерминанта расположена на фрагменте 5 кДа с NHj-KOHua молекулы синтетазы.

Использован метод радиоиммуноблотгинга для изучения белок-белковых взаимодействии. Показано, что WRS в клеточном лизате линий Р/3 AgS 653 и К 562 взаимодействует с полипептидом с Mr 37 кДа. Показано, что in vitro WRS взаимодействует с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (ГАФД, Mr 37 кДа). Е присутствии ГАФД WRS способна взаимодействовать с рРНК через образование тройного комплекса: WRS - ГАФД - рРНК. С помощью моноАТ установлено, что во взаимодействие с ГАФД вовлекается несущественный для ферментативной активности ЬЛ^-концевой домен WHS, где локализована консервативная антигенная детерминанта.

Проведено исследование внутриклеточной локализации WES в клетках высших эукариот методом иммуноэлектроннои микроскопии: установлено наличие WRS как в цитоплазме, так и в ядре клеток. Показано, что в цитоплазме WRS локализуется преимущественно в зоне скопления полирибосом и в митохондриях, а в ядре - в зонах диффузного хроматина. Изучали также локализацию WRS в клетках E.coli. Основной особенностью в распределении синтетазы в прокариотической клетке является ее почти полное отсутствие в области нуклеоида.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Макромолекулы клетки. Структура, функции, взаимодействия" (Москва, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Реализация наследственной информации" (Паланга, 1980), Международной конференции "Биологическое значение белково- . нуклеиновых взаимодействий" (Польша, I960), Международных совевания; по тРНК (Франция, 1980; Япония, 1983; Германия, 1965;' Швеция, 1987;

Канада, 1989; Польша, 1991), IX Международном совещании "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Пущино, 1987), IX симпозиуме СССР - Франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот" (Франция, 1988), VI симпозиуме СССР -Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Ленинград, 1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Международной конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурные изменения тРНКТгР в комплексе с WHS

Круговой дихроизм комплекса тРНКТгР с трипто<&анил-тРНК-син-тетазой. Мы сравнивали с-пектры КД бычьей тРНК^г^ в присутствии и в отсутствие гомологичной WRS. Спектры КД тРНКТгР в комплексе с синтетазоя во всех случаях получали вычитанием спектра КД свободного фермента из спектра КД смеси тРНК и WRS. Оптическая активность фермента в использованной концентрации очень мала: при 255-320 нм она близка к нуле и только в области менее 255 нм становится заметной (рис.1, кривая 3). Полученные спектры после усреднения трех независимых экспериментов приведены на рис.1. Видно, спектр КД тРНКТгр в присутствии WRS заметно меняется 1рис .1, кривая 2) -амплитуда отрицательного пика при 295 нм уменьшается на 20£. Эти наблюдения привели нас к заключению о возможности изменения пространственной структуры тРНК в комплексе с синтетазой.

Структурное картирование тРНК^гР в комплексе с VfRS РНКазоя VI. тРНКТгр в отсутствие WRS расщепляется РНКазаой VI преимущественно по 5'-стороне антикодонового стебля (положения 26-28); по 5'-стороне и З'-стороне акцепторного стебля (положения 5-7, 65 и 71). тРНК гидролизуется также в положениях 13-15 (рис.2, дорожка d).

тРНК^гР в комплексе с гомологичной синтетазой прекращает расщепляться РНКазоя VI по положениям 27 и 28, но начинают образовываться фрагменты 1-40, 1-41; увеличивается также скорость гидролиза 5'- и З'-стороны акцепторного стебля (положения б, 7, 65 и. 71, дорожка f). тРНК в комплексе с протеолиэированной формой WRS

а Ь с d • f | 1

Г^ГГ »

Рис. 1. Спектры КЛ бычьей тРНКТгр в отсутствие (1 ) и в присутствии (2) гомологичной WRS при 20°С. Спектр КД WHS (3). WRS - 0,7 мкМ, тРНКТгР - 0,6 МКМ

Рис. 2. Структурное картирование бычьей тРНК^гР (дорожка d) и

тРНКТгр в комплексе с гомологичной 3-WKSg0 и WHS (дорожки е, Т,

соответственно) РНКазоя VI при 0°. Авторадиограмма продуктов

расцепления 5'-меченой тРНК, разделенных в 10й-ном ПААГ с в М

мочевиной. Дорожки a, b и с - контроли: тРНКТгр (а), тРНКТгр,

инкубированная в присутствии э-WRS-,, СЪJ и в присутствии WRS (с).

Trn

Дорожки g и h - продукты тРНК полученные после гидролиза шелочы и РНКаэой А, соответственно. WRS - 10 мкМ, тРНКТгр - 8,5

Is-WRSgQ, фермент лишен М^-концевого домена; подробнее эта форма WBS будет описана в третьем разделе) расщепляется РНКазой VI практически.так же как и в присутствии нативноя синтетазы. При полном анализе всех окрашиваемых фрагментов тРНК^Р, образованных в результате гидролиза РНКазой Vî как в присутствии WS, так и в ее отсутствие, оказалось, что разрывы в положениях 27, 28 (свободная тРНК) и 40, -41 ( тРИС в комплексе с синтетазои ) независимы.

Исходя из независимости этих разрывов друг от друга, увеличения скорости гидролиза области акцепторного стебля в присутствии синтетазы, а также из изменения спектра КД тРНК^гР при образовании комплекса с WRS, мы пришли к заключению, что тРНК^гР изменяет пространственную структуру при образовании комплекса. За последнее десятилетие этот вывод был подтвежден на различных тРНК-синтетазных парах как при изучении комплексов в растворе химическими и знэиматическими методами", так и с использованием рентгеноструктурного анализа. В последнем случае с высоким уровнем разрешения были получены трехмерные структуры комплексов тРНКС*п -глютаминил-тРНК-синтетаза (QRS) E.coll (Rould et al., 1989) и TPHKAsp- аспартил-тРНК-синтетаза дрожжей (Moras et al., 1991). Сравнение трехмерных структур тРНК в комплексе и свободной тРНК показало их существенное различие. В настоящее время считается, что тРНК. подвергается конформационному напряжение в комплексе.

Транспортные РНК содержат около 50 различным образом модифицированных нуклеозидов, так называемых миноров (Bjork et al., 1987). Значительная часть этих миноров найдена в различных положениях вдоль первичной структуры молекул тРНК, другая часть локализуется в строго определенных положениях тРНК различной специфичности. Роль этих модификаций в структуре и функции тРНК только к настоящему времени начинает проясняться, поскольку недавно разработана технология (Sampson & Uhlenbeck et al., 1988), основанная на транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы фага Т7 и позволяющая получать тРНК., лишенную посттранскрипционньус модификация. Сравнение физико-химических характеристик немодифицированной и модифицированной тРНК в растворе показало (Hall et al., 1989), что посттранскрипционные модификации стабилизируют третичную структуру молекулы тРНК. Поскольку tFHK подвергается конформационному напряжению при комплексоосразовании с

синтетазой, мы предположили, что стабилизирующая функция миноров

должна проявляться в молекуле тРНК при взаимодействии с синтетазой.

Б качестве модели для сравнения транскрипта и зрелой молекулы тРНК в

этом аспекте была выбрана тРНкЯ1п и QRS E.coli, для которой, как

указывалось выше, известна трехмерная структура комплекса, а также

было показано, что транскрипт тРНК^п (далее - немодифицированная

или in vitro тРНК^") аминоацилируется глутамином QRS с близкими

кинетическими параметрами, как и зрелая тРНК^п (далее -

модифицированная или In vivo тРНКЕ1г') Uahn et al., 1991). тРНКи1п

4 2

E.coli содержит девять модифицированных нуклеозидов s US, m G17, D20, m2U32, œ2A37, ¥38, W9, rT54 и ¥55.

Роль модифицированных нуклеотидов тРНКС*п при комплексообразовании

с QRS.

QRS индуцирует гидролиз тРНКС1п^ Модифицированная и немодифицированная тРНК*^п были инкубированы в присутствии 10 мМ Me" и OPS. На рис.3 (дорожки 1-5) видно, что немодифицированная тРНК^п в комплексе с гомологичной синтетазой расшеплятся более эффективно в положениях 30-37 области антикодоновой петли; во всех положенеиях Г-петли и D-стебля, включая положения 6-9 (рис. 3 А), а - также в положениях 71-73 акцепторного стебля (рис. 3 В), тогда как модифицированная тРНКС1п остается сравнительно стабильнои. На рис. 3 С и D показаны принципиальные области расщепления в тРНК^1п In vitro сравнительно с тРНКС1п In vivo при комплексообразовании с QRS.

Наблюдаемый феномен может также обьясняться контаминацией РНКазами препарата QES. Для решения этого вопроса в препарат QRS было добавлено небольшое количество неспецифической РНКазы Т2 и проведено структурное картирование модифицированной и немодифицированной тРНКС1п РНКазой Т2 и смесысг РНКазой Т2 с QRS.

Структурное картирование модифицированной и немодиаицированнои ГРЖ— и тРНКС1п в комплексе с GlnRS РНКазой Т2. На рис. 4 представлены результаты опыта, где тРНКС1п одновременно инкубировали со смесью QHS и РНКазы Т2. Видно, что In vitro и In vivo тРНКС1п в одинаковой степени защищены от действия РНКазы Т2 в некоторых положениях антикодоновой петли (сравнение дорожек 2 и 4 для модифицированной и немодифицированной TPHKGlnl. С другой

tPUKgu in vitro 1 in vivo

Д 4ClaRS

9 я 1 1 < t « i ?

■ t

jj + ClnRS J *CloRs|

оГз 3 4 si» ян a > < gl« 7,

WffîfXSfr

Рис. 3. Структурное картирование In vitro тРНКС1п и In vivo тРНКС1п E.coll в комплексе с гомологичной QRS. А. Авторадиограмма продуктов расщепления 5'--меченой тРНКС1п, разделенных в 14Х-ном ПААГ с 6 M мочевиной: Дорожки 1-5 - тРНКС1п, инкубированная в присутствии QRS 2, 5, 9, 14 и 20 мин., соответственно, при Дорожка 0 - тРНКС1п в отсутствие QRS, инкубированная 20 мин. Дорожки 5 и 7, продукты In vitro тРНКС1п, полученные после гидролиза РНКазоя Г1 и щелочью, соответственно. Дорожки 8 и 9 то же, что 6 и 7 для In /Ivo тРНКТгР. (продолжение подписи см. на следующей стр.)

tPUKGUi In vitro I in vivo

,Gln

Рис. 4. Структурное картирование in vitro и in vivo тРНКС1п E.coll в свободном состоянии и в комплексе с гомологичной QRS РНКазой Т2. Авторадиограмма продуктов расщепления 5'-меченой тРНК" разделенных в 14£-ном ПААГ с 6 Ы мочевиной. тРНКС1п (дорожка 1), тРНКС1п, инкубированная в присутствии РНКазы Г2 (дорожка 2), в присутствии QRS (дорожка 3) и в присутствии смеси QRS с РНКазой Т2 (дорожка 4). Дорожки 5 и 6, продукты гидролиза

тРИС

Gin

РНКазой Г1 и щелочью.

соответственно. Эксперимент выполнен

r\Qn Í1DQ _ В, WT/1к/

при (ГС. QRS - 5 мкМ, тРНК""1 - 2 мкМ. РНКаза Т2 - 0,1 мкМ, Mg++ - 10 мМ

(продолжение подписи к рис. 3)

В. Авто.ради о грамма верхней части аналогичного геля (см. А) при более длительном времени электрофореза. С и В. Локализация участков молекулы тРНК^п, подвергаемых более эффективному расщеплени» в транскрипте по отношению к in vivo тРНКС1п в присутствии QRS. С -

D - прост-(Rould, et

вторичная структура тРНК^п в форме клеверного листа, ранственная структура ln vivo тРНКС1п в комплексе с QRS al., 1989). Участки различной стабильности выделены интенсивными линиями. Модифицированные нуклеозиды на трехмерной структуре TPHiCGln обозначены черными кружками. QRS - 5 мкМ, тРНКС1п- 2 мкМ, №g++- 10 м

стороны уровень, расщепления антикодоновой петли РНКазой Т2 модифицированной и немодифицированной тРНкЯ1п в комплексе с QRS совершенно идентичен, что отличается от результатов, представленных на рис. 3, где расщеплению в присутствии QRS подвергается область антикодоновой петли главным образом tPHK2*11 in vitro. Эти данные являются первым аргументом в пользу того, что наблюдаемое расщепление тРНКС1п в присутствии QRS не есть.результат действия РНКаз.

Из рис. 4 также видно (сравнение дорожек 2 для TPHKGlrl In vitro и In vivo), что модифицированная тРНК^п более устойчива по отношению к деградации РНКазой Т2 в области D-ветви (положения 1024), чем немодифииированный транскрипт. Этот результат подтверждает ранее сделанный вывод о различии в стабильности пространственной структуры модифицированной и немодифицированноя тРНК.

Второй аргумент, указывающий на не РНКазную природу наблюдаемого феномена - корреляция между уровнем деградации тРНКС1п в присутствии QHS и уровнем тРНК, находящейся в комплексе. Результаты этого эксперимента, приведены на рис. 5. Видно, что чем больше тРНК23'11-транскрипта находится в связанном состоянии при различных концентрациях синтетаэы (кривая 1), тем выше уровень наблюдаемого расщепления молекулы тРНКС1п In vitro (кривая 2 1. Более того, термоинактивированная синтетаза (2мин. 65°С) не способна образовывать комплекс с тРНКСЗп (кривая 3) и индуцировать расщепление в немодифицированноя тРНК (кривая 4).

Третий аргумент заключается в том, что оптимальная температура наблюдаемого растепления в комплексе с QRS как тРНК^п In vltrp, так и In vivo- 30°С (рис. б), а не 37° (оптимум для активности большинства РНКаз).

Исходя из совокупности этих результатов, мы пришли к заключению, что наблюдаемый феномен -- расщепление тРНКС1п при комплексообразованин-- есть результат взаимодействия с QRS, а не действия примесных РНКаз.

Как было показано (Reld & Cowan, 1990), максимальное насыщение молекулы тРНК ионами Mg** достигается при 30°С, Максимальную ■ деградацию тРНКС1п при образовании комплекса мы наблюдали при этой же температере - 30°С, которая однако ниже оптимальной температуры аминоацилирования тРНКс*п. Поэтому следующий эксперимент был связан

QRS/тРНК. (МОЛЬ/ЛЛОЛЬ)

Рис. 5. Зависимость степени расщепления in vitro тРНКС1п E.coll от

эффективности комплексообразования с гомологичной QRS. Кривые 1 и 3

„.Gin

- процент транскрипта тРНК , находящемся в комплексе с (ЗЯБ, по результатам торможения тРНК в геле. Кривые 2 И 4 - процент степени

1 и 2 -

расщепления транскрипта тРНКС1п за 20 мин. при 30°С.

нативная QHS - 2 мкМ

3 и 4 - терыоинактивированная QRS (2 мин. 65 С). тРНК.

Mg++ - 10 ыМ

О 10 20 30 40 50

Температура (*с)

Рис. 6. Зависимость степени расщепления in vitro и In vivo тРНКС1п от температуры при коыплексообразовании с QRS. Кривая 1 - In vitro тРНКС1п, кривая 2 - in vivo тРНКС1п. Инкубация 20 мин. QRS'- 5 мкМ, тРНК - 2 мкМ, Mg** - 10 ММ.

с выяснением возможной роли ионов Mg4"1' в расщеплении тРНКС1"п, индуцированном гомологичной синтетазой при комплексообразовании.

Рашепление тРНКС1п. индуцированное GlnES, - Мг^-зависимое. И модифицированная, и немодифицированная тРНКС1п стабильны при возрастающей концентрации ионов Mg++ (рис. 7 А и Б, дорожки 1-5). Однако добавленная QRS стимулирует Mg++- зависимый гидролиз тРНК особенно в немодифицированной молекуле (рис. 7 А и В, дорожки 1-5 + GlnRS) в следующих положениях: во всей антикодоновой петле; в D-петле и D-стебле, включая положения 6-9; в положениях 44 и 45 дополнительной петли, а также в области акцепторного стебля (положения 71-73). Эти результаты показывают зависимость расщепление тРНКС1п, индуцируемого гомологичной синтетазои от ионов

Следует отметить, что характер расщепления в положениях 44 и 45 дополнительной петли модифицированной тРНКЕ1п и тРНКС1п-транскрипта практически идентичен.

С целью анализа специфичности расщепления, индуцируемого QRS, мы исследовали комплексообразование In vitro тРНКТгР E.coll с QR5 E.coll при различных концентрациях ионов Mg++. Выбор тРНКТгр в качестве некорректного субстрата для QRS был обусловлен следующими причинами. Во-первых, эта тРНК может акцептировать остаток глутамина под действием QRS (Cells et al., 1976; Yarus et al.. 1977) , во-вторых, образовывать прочный комплекс с QRS с эффективностью, в три раза меньшей по сравнению с комплексом тРН1СС1п - QRS (данные не приводятся).

Как видно из рис. 7 (С и D), расщепление модифицированной тРНК^гР, индуцированное QRS, происходит значительно эффективнее, чем расщепление модифицированной тРНК1^111 и в отличающихся от тРНК2'1'0 положениях (области антикодоновой петли, акцепторного стебля, а также в положениях 7-141. Эти результаты указывают на различие в стабильности "своей" и "несЕоея" тРНК~^гР при комплексообразовании с QRS.

Размер иона металла влияет на эффективность индуцируемого

гидролиза. Ионы Са и Ва так же как и ионы \t¡¿~*, не стимулируют

расщепление свободной тРНК (данные не приводятся). После

добавления ORS мы наблюдали следующее различие в расщеплении тРНК

TpUK&in

in vítr о

A 4 Gin RS

1 2 34 S 1 2 ?4 5 Л 7<

tn VIVO

l«»»ij .....inri

... ::urs !

................и

-.•* 17

• ■>•< IS

TPHK.Trp in vLvo

_.ClnKS

. i K^S \

•г к

:::!

■4Ш §

* *

В -»cinits , »fitnKs D _♦Owws

I 2 3 * SI 2 3 * 5 7 tJJ2111211L! * « H4S t 2 3 4 5? 6

' ■ :ú¿fS ir.ir: \ ■■••

Рис. 7. Структурное картирование In vitro и in vivo TPHKGln E.coll (А и В) и тРНКТгр f.coll (С и DI в комплексе с- QRS E.coll при различных концентрациях ионов Mg""^. А и С. Авторадиограмма продуктов гидролиза 5'-меченой тРНКС1п и тРН1СТгр, разделенных в 14%-ном ПААГ с 6 М мочевиной. Дорожки 1-5 - 0; 3,5; 7,5; 15 и 30 мМ Mg++, соответственно. Инкубация 20 мин. при 30°С. Дорожки 6 и 7 - продукты тРНК, полученные после гидролиза щелочьс и РНКазои Т1, соответственно. В и D. Авторадиограмма верхней части аналогичного геля (см, А и С) при более длительном времени электрофореза. 0HS - 5 мкМ, тРНК - 2 ыкМ

Mg"

С a*

м : з t í ( 7 i î i

Ba" ■

5 6 7 I 2 3 « Ï ft 7

Mg*

СгГ Ea+J

liu<!ljm.!imi<!ll

0; 1,0; 3,5; 7,5; Инкубация 20 мин.

Рис. 9. Структурное картирование in viîro TPHKGln в комплексе с гомологичной QRS при различных концентрациях ионов Mg++, Ва++ и Са .А. Авторадиограмма продуктов гидролиза 5'-меченой тРНК , разделенных в 14%-ном ПААГ C5M мочевиной. Дорожки 0-5 Са , соответственно.

Ва

15 и 30 мМ Mg

при 30°С. Дорожки 6 и 7 - продукты тРНКС1п полученные после гидролиза шелочьо и РНКаэой Т1, соответственно В и С. Авторадиограмма верхней (В) и средней части (С) аналогичного геля (см. А) при более длительном времени электрофореза. D и Е Пространственная структура m vivo тРНКС1п в комплексе с QRS (Rbuld тРНК^" 1989ИНТеНСИВНЬШИ линиями Указаны области молекулы

где увеличение радиуса иона металла приводит к уменьшению (D) или усилению (Е) степени расщепления in vitro присутствии QRS. .QRS - 5 ЖМ, ТРНК - 2 мкМ

TPHKGln в'

In vitro: увеличение радиуса металла (Mg++<Ca++<Ba++), как видно из

рис. S , приводит как к уменьшению эффективности расщепления в

области антикодоновой петли (положения 30-37), в области D-ветви

(положения 22-24) и акцепторного стебля (положения 71-73) (рис. 6,

А, В и D), так и к усилению расщепления в положениях 6, 13, 20, 21,

44 и 45 (рис. 6, А, С и Е). Важно отметить, что области молекулы

тРНК, в которых эффективность расщепления, индуцируемого QRS,

ослабевает с увеличением радиуса иона металла, соответствуют

Php ++

областям молекулы тРНК , координирующим ионы Mg (Qulgley et al.,

1978).

Усиление гидролиза тРНКС1п транскрипта в области акцепторного стебля (положения 71-73), видимо, не связано с посттрансляционными модификациями, а есть результат мутации U1 -> G1. Влияние мутаций в транскрипте молекулы тРНКСЗп на характер индуцируемого гидролиза при комплексообразовании с гомологичной синтетазой рассматривается в следующих экспериментах.

Мутации в транскрипте тРНКС*п усиливают индуцированное расщепление. Мутации в антикодоне 1G36 -> АЗб )и в области акцепторного стебля (G2-C71 -> A2-U71) приводят к потере способности - тРНК^п In vitro аМиноацилироватья глутамином в присутствии QRS (Jahn et al., 1991 ), однако эти ыутантные тРНК сохраняют способность к взаимодействию с QRS, что было показано методом торможения тРНК. в геле (данные не приводятся). Поэтому мы использовали два этих мутантных транскрипта tPHIC^11 в экспериментах по структурному картированию тРНК. в комплексе с QRS. Оказалось, что при мутации в антикодоне происходит явное усиление расщепления, индуцированное QRS, в области антикодоновой петли (положения 32-36), а также в области акцепторного стебля (положения 71-73) 1Рис.' 9, А и В, дорожка 5). В случае двойной мутации в акцепторном стебле усиливается расщепление в положениях 63-70 акцепторного стебля, а также в положениях 21-24 области D-ветви (Рис, 9, А и В, доромка 5). Области, подвергаемые более эффективному гидролизу в мутантных тРНКС1п-транскриптах по отношению к In vitro тРНКС1п указаны на Рис. 9, С и D.

Ионы Mg++, как известно, стабилизируют структуру транскрипта (Hall et al., 1959) с другой стороны, повышение ионов' Me'1"''

gi g1.a36 ci, д2-цп

■ -

=1=1 2

. a *

i-т i --Л

g1, a2-u71

Рис. 9. Структурное картирование мутантов lu vitro TPHKGln E.coll комплексе с гомологичной QRS. А. Авторадиограмма продуктов расщепления 5'- меченой тРНК.С1п, разделенных в 14%-ном ПААГ с 8 M мочевиной. Дорожки 1-4 - тРНКС1п, инкубированная в присутствии QRS 2, 5, 9, и 14 мин., соответственно, при 30°С. Дорожка 0 - тРН1СС1п в отсутствие ORS, инкубированная 14 мин. Дорожки 5 и 6, продукты не мутантной in vitro тРНКС1п, полученные после гидролиза РНКазой Т1 и щелочью, соответственно. В. Авторадиограмма верхней части аналогичного геля (си. А) при более длительном времени электрофореза. С и D. Пространственная структура in vivo тРНКС*п в комплексе с QRS ( Rould et al., 19S9). Интенсивными линиями указаны области молекулы тРНКС1п, где расщепление происходит более эффективно в мутантных транскриптах, по отношению к in vitro TPHKGlnGl в присутствии QRS. Черными кружками показаны мутантные нуклеотиды. С. in vitro мутант TPHKGlnGl,A35. D. In vitro мутант TPHKGln GU2-U71 . QRS - 5 мкМ, тРНК - 2 мкМ, - 10 мМ

• 1» • ii

усиливает растепление тРНК^*11 при комплексообразовании с гомологичной синтетазой. Это скорее всего должно означать, что влияние на расщепление осуществляется не непосредственно через ионы Mg а'через структуру тРНК, или, что менее вероятно, через структуру фермента. В пользу первого г-оворят наши наблюдения о том, что спермин (данные не приводятся) при полном отсутствии ионов Mg++ заменяет эти ионы в их влиянии на расщепление тРНКС1п транскрипта при образовании комплекса с QRS. Следует отметить, что спермин стабилизирует структуру тРНК аналогично ионам Mg++.

Наблюдаемый феномен индукции растепления транскрипта тРНК^1п при комплексообразовании с гомологичной синтетазой можно обьяснить, по-видимому, с двух точек зрения. Во-первых, можно допустить, что в присутствии высоких концентраций Mg , ионов других дивалентных металлов или спермина синтетаза приобретает способность гидролизовать фосфодиэфирные связи в определенных положениях молекулы тРНК подобно широко известной группе ферментов, которые назьшаотся РНКазаыи. При этом допускается, что транскрипт является гораздо лучшим субстратом для этой предполагаемой "РНКазы". Роль модификаций в этом случае заключается в том, чтобы защитить молекулу тРНК от этой потенциальной "РНКазноя" активности.синтетазы. Против этого предположения можно высказать, по крайней мере, несколько аргументов. Во-первых, гидролизу подвергаются фосфодиэфирные связи тНКС1п, которые не находятся в непосредственном контакте с QRS по данным рентгеноструктурного анализа комплекса тРНКС1п - QRS. Во-вторых, это предположение крайне слозно совместить с различной эффективностью влияния ионов дивалентных металлов, а также спермина, на глубину расщепления транскрипта тРНКС1п , индуцированого QRS (Рис. В). В-третьих, столь жг трудно обьяснить, почему мутация в одном положении тРНКС*п изменяет характер растепления не только прилегающей области молекулы тРНХ, но и в достаточно удаленных участках (Рис. 9!. Следует также отметить, что при анализе первичной структуры РНКаэ и аминоацил-тРНК-синтетаз не удалось выявить сходных элементов первичной структуры.

Согласно второй точке зрения при определенных условиях допускается возмозшость саморасшвпления транскрипта тРНКС1п„ вызываемая комплексообразованием со "своей" синтетазой. Иными словами, предполагается, что в присутствии определенного белка

транскрипт тРНК приобретает свойства рибозима, а роль модификаций заключается в том, чтобы препятствовать проявлению этого потенциального свойства. Хотя механизм этого явления не изучен и не ясен, мы предполагаем, что синтетаэа индуцирует такое конформационное напряжение в молекуле тРНК, которое резко облегчает возможность гидролитического растепления определенных фосфодизфирных связей.

Не исключена возможность, что роль посттранскрипционных модификация в других РНК, например, рибосомальннх, также заключается в заште от'потенциальной рибозим-подобноЯ активности.

Из анализа комплексов глутаминиловой пары E.coll и аспартиловоя пары дрожжей видно, что тРНК различной специфичности при образовании комплексов с гомологичными синтетазами подвергаются различным конформ'ационным изменениям, поэтому можно предположить, что напряжение в молекуле тРНК при специфическом комплвксообразовании уникально для определенной тРНК-синтетазной пары. Следовательно, уникальной должна быть и защита от рибозимоподобной активности тРНК в комплексе. Для создания этой зашиты, видимо, и существует высокое разнообразие модификаций в тРНК и расположены они в разных положениях тРН1С различной специфичности. В некорректном комплексе (например, In vivo тРНКГгр - QRS E.coll) тРНК, по-видимому, испытывает несвойственное корректному комплексу напряжение, поэтому система защиты с помощью модификация не работает, что приводит к расщеплению "несвоей" тРНК. Последнее может указывать на дополнительный механизм коррекции от использования ошибочно аминоацилированноя тРНК при трансляции, поскольку происходит расщепление функционально существенных участков (антикодона, акцепторного стебля) молекулы тРНК.

Иммунохимическое изучение WHS.

Определение числа сильных антигенных детерминант на молекуле WR5. Одной из основных иммунохимических характеристик антигена является число антигенных детерминант на молекуле. Классический метод определения числа антигенных детерминант (Kabat & Mayer, 1961), основанный на измерении количества белка в преципитате в зоне эквивалентности, требует относительно больших количеств белка и продолжителен во'времени. Мы разработали способ определения числа

антигенных детерминант, исходя из следующих соображений. Если инкубировать Feb-фрагмент полиАТ с увеличивавшимися количествами антигена, то концентрация несвязавшихся Fab- фрагментов будет,

естественно, постепенно падать. Это уменьшение можно определить по

125

сорбции оставшихся свободными I-меченных РаЬ-фрагментов на

антигене (синтетазе), фиксированном на матриксе. Экстраполяция

линейного участка кривой.полученной в таком опыте, к уровню

неспецифической сорбции t IЖаЪ-фрагментов (при заведомо большом избытке синтетазы в растворе) дает соотношение Fat/WRS , при котором все антигенные детерминанты фермента связаны с Fat-фрагментами.

Предварительные опыты показали, что доля антител к WRS в используемой нами фракции полиАТ составляет 2,5При гидролизе до Fab- и Fc-фрагментов количество взаимодействующего с ферментом материала должно уменьшиться примерно на 1/3 (на два Fsb-фрагмента

3: 3

-I

к)

• I-

0.02 0.04 3 5

Сим/летазаг ¿мкг)

Рис.10

Рис Рис 1 -

13 3 7

йнтигпела/синтетаза (пот/мо/^

Рис.11

.10. Определение числа антигенных детерминант на молекуле

.11. Ингибирование ферментативной активности КШЭ РаЬ-фрагментами.

АТР-РР1 обмен, 2

аминоацилирование тРНК

Тгр

приходится один Fc-фрагмент ). Таким образом, содержание специфических к WRS Fat-фрагментов можно принять примерно за 1,1%. На рис.10 показаны результаты опыта по определению числа антигенных детерминант WBS описанным способом. Из епыта следует, что 0.,54 пмоль фермента полностью связывают 4,75 пмэль. специфических к WRS ГаЬ-Фрагментов, т.е. в молекуле синтетазы содержится 9 антигенных

детерминант. Величина 9-1 получена в трех независимых опытах, в

125

которых варьировали как количество 1-меченных Fab-фрагментов, так и соотношение ГаЬ-фрагменты/таэ.

Описанный метод весьма прост в исполнении, требует минимальных количеств антигена. Для определения числа антигенных детерминант предлагаемым методом предпочтительно применять моновалентные Fat-фрагменты, поскольку использование двухвалентных антител, способных образовывать преципитат, может исказить результаты.

Влияние Fab-фрагментов на активность VfRS. На рис. 11 представлены результаты влияния полиАТ на активность WRS. Видно, что они ингибируют как суммарную реакцию ашноацилирования тРНК, так и промежуточную реакцию активации триптофана. Поэтому можно предположить, что антитела препятствуют образование триптофаниладенилата, а также возможно и предотвращают образование комплекса с тРНК. Для проверки второго предположения определяли влияние Fab-фрагментов на способность WRS' образовывать комплекс с 13Н 1триптофанил-тРНКТгР и пришли к заключению, что присоединение Fab-фрагментов к WBS не влияет существенным образом на комплексообразование фермента с тРНК (данные не приводятся). Можно думать, что среди полиАТ к WRS, по-видимому, отсутствуют антитела к участку фермента, ответственному за связывание с тРНК. Это довольно интересный вывод, поскольку известно, что зона контакта фермента с тРНК достаточно обширна, что находит подтверждение в данных рентгеноструктурного анализа комплексов tPHKAs^ - аспартил-тРНК-синтетаза (Moras et al, 1991 ) и тРНКС1п- QHS (Fould et al.. 1989). Отсутствие сильных детерминант в этом участке WRS можно, вероятно, объяснить следующим способом: либо этот участок не иммуногенен, либо участок контакта синтетазы с тРНК не экспонирован в свободном ферменте, а тРНК индуцирует конформационные изменения, приводящие его в контакт с субстратом. Феномен конформационных изменений в WRS при комплексообразовании с гомологичной тРНКТг13 был показан ранее. (Берестень и др., 1981).

Антигенность фрагментов WRS. Ранее показано (Prassolov et al., 1975; Lenaire et al., 1975), что при выделении WRS из поджелудочной железы быка б отсутствие ингибиторов протеаз поисходит ограниченный

протеолиз до ферментативно активной формы с Мг 80 кДа (э-УШ380), состоящей из двух полипептидных цепей по 40 кДа. Ограниченным трипсинолиэом также можно получить протеолизованную форму (т-таЭдд) ТОБ с Мг, близкой к мол.массе э-та380> которая, однако, не обладает ферментативной активностью (Ргагео)^ е! а1., 1975). Таким образом, модифицированные молекулы \ffiS, содержащие полипептидные цепи с близким значением Мг (около 40 кДа), в зависимости от природы протеолитического фермента или сохраняет ферментативную активность, или утрачивает ее. В связи с этими данными могло стать информативным иммунохимическое сравнение нативной ИБ с активной и неактивной протеолизованными формами фермента.

20 ДО

йититепа (мк.п)

^ ю Синтетаза Шкг)

Рис 12. Торможение радиоиммуноадсорбции [1251ШЗ с помощью

таз (1) и з-таэ 'на полиАТ

12 )

Рис.13. Ингибирование ферментативной активности \tfRS в реакции аминоацилирования тРНК^г^ различными фракциями антител. А-антитела, "сорбировавшиеся" на ВЭА-матриксе (1), антитела к т-Утэ80 (2), антитела к ТГОБ (3). Б - антитела истощенные на ВБА-матриксе (1), на тУЖБ^-матриксе (2), на чгаэ-матриксе (3)

Для сравнения способности э-1Ж580 и нативнои синтетазы

связываться с полиАТ использовали реакцию торможения

125

радиоиммуноадсорбции I I ¡ШЭ на антителах, фиксированных на

матриксе. Из рис.12 видно, что кривые торможения сорбции

1 11синтетазы в присутствии таз и з-ЧШБдд выходят на разные плато,

причем уровень торможения фрагментом в 3 раза ниже, чем для

препарата нативной У/йБ. При другой постановке опыта, когда в

125

качестве меченого белка использовали 1 11з-№КЗбд, нативный и протеолизованныя ферменты давали идентичные уровни торможения (данные не приводятся). Из этих результатов следует, что все антитела к э-удаЭдр входят в популяцио антител к нативному ферменту, составляя, однако лишь третью ее часть.

Таблица 1

Взаимодействие ТОБ и ее триптических фрагментов 125

с I 111(2(2 фракцией антисыворотки

Образец Белок, фиксиро Количество свя- Общее количество антител ванный на завшихся с вычетом неспецифичес-

матриксе (имп/мин! - . кой сорбции

(имп/мин) %

1. альбумин

4. .

1. синтетаза 26023

2. 3694 28932 100

3. 1804

4. триптический 686 - -

5. фрагмент 586

1. триптический 9491

2. Фрагмент • 1756 9645 33.3

3. 980

4. синтетаза 12920

5. 1605

1105

824

613

524

512

Взаимодействие t-WRSnf, с полиАТ исследовали двумя способами.

80 f>5

В реакции торможения радиоиммуноалсорбции [ 11WHS t-WRSr0 не

отличалась от 3-YfRSg0, связывая только 1/3 антител к нативной WRS.

Полностью совпадающие результаты были получены с помощью 1

исчерпывающей сорбции I-меченных полиАТ на матриксе с фиксированной t-WRSB0 и WES (табл.1). Следовательно, при расщеплении как эндогенными протеазами, так и трипсином молекула WRS вместе с 1/3 полипептидного материала (переход 120кДа —> 80кДа) теряет 2/3 антигенных детерминант. Следует отметить, что последний вывод справедлив только при условии одинакового содержания в сыворотке антител к различным детерминантам.

Таким образом, два продукта ограниченного протеолиза синтетаэы иммунохимически неразличимы, хотя первый ферментативно активен, а второй лишен активности. Они близки по молекулярным массам, но T-WRSeo, вероятно, несколько короче, причем участок полипептидной цепи, на который они различаются, не вовлекается в формирование эпитопа, но критичен для активности фермента. Аминокислотные остатки, локализованные в этом фрагменте, могут или входить в состав активного центра, или участвовать в поддержании нативной конформации.

Разделение антител к WR5 по их влиянию на Ферментативную активность. Основываясь на данных предыдущего раздела, антитела к WRS можно разделить на две субпопуляции - к протеолизованной форме WRSg0 и к отщепляемой при протеолизе Ш^-концевой, по данным Gros et al., (1972), части молекулы. Для фракционирования антител использовали матрикс с фиксированой т-WKSgQ. Последовательная инкубация полиАТ с несколькими порциями матрикса приводит к полному удалению из супернатанта антител к T-WBSgg.a в растворе остаются антитела к ЛН2-концевому участку синтетазы. На рис.13 показаны результаты опытов по влияние полученных фракции антител на активность синтетазы в реакции аминоацилирования тРНК. Видно, что 2/3 полиАТ, не взаимодействующих с t-WHSqq, не влияют на активность фермента, в то время как антитела, связывающиеся с T-WR3e0, будучи элюированы с матрикса, полностью ингибируют активность WHS.

Таким образом, как и следовало ожидать, антитела, специфичные к несущественному для активности Ш2-концевому фрагменту синтетазы с Mr 20 кДа, не влияют на активность WRS, тогда как антитела, специфичные к остальной части полипептидной цепи, ингибируют ее активность.

Иммунохимический перекрест между таз из разных организмов. Цель последующих опытов, связанных с полиАТ, сводилась к выявлению консервативных эпитспов в из различных источников. Поскольку выделение из каждого объекта индивидуальной таг достаточно затруднительно, мы ограничились оценкой влияния поликлональных антител к бычьей синтетазе на ферментативную активность таг из других организмов. Бее препараты .исследуемых синтетаз аминоацилировали один и тот же субстрат - дрожжевую тРНКТгр и давали один и тот же уровень максимального аминоацилирования. Опыты по определению активности УГОЗ проводили при насыщающих концентрациях всех субстратов в условиях линейной зависимости уровня аминоацилированной тРНКТгр от концентрации фермента и времени

Рис. 14. Эффект полиАТ против бычьей на активность в реакции аминоацилирования тРНКТгР таз из различных источников: поджелудочной железы быка III, печени быка (2), печени свиньи (3), печени цыпленка (4), печени крысы (5) и дрожжей (б)

инкубации. Как видно из рис. 14, препараты ТОБ можно условно разделить на три группы по влиянию на них полиАТ: а) ферменты из поджелудочной железы и печени быка, активность которых равно эффективно ингибируется антителами против таг из поджелудочной железы, б) ферменты из печени свиньи и печени курицы, активность которых ингибируется этими антителами в 4-5 раз слабее, в) ферменты из дрожжей и печени крысы, активность которых не изменяется в присутствии антител к бычьей таг.

Отсутствие способности ингибировать ферментативную активность синтетаз из дрожжей и печени крысы полиАТ можно объяснить двумя причинами: либо антитела вообще не взаимодействуют с этими синтетазами, либо ишунохимический перекрест существует, но в

Зу 6 (м*г)

области структуры синтетаз, не существенной для активности

ферментов. Для решения этой альтернативы был получен частично

очищенный препарат ШБ из печени крысы и иммобилизован на ыатриксе.

Е таблице 2 представлен результат опытов по связыванию

моноспецифических антител к бычьей синтетазе с ШВЭ из печени крысы.

125

Видно, что только около 1/10 1-меченных моноспецифических антител к бычьему ферменту взаимодействует с крысиным. Подобные эксперименты были проведены и с У/Лб из печени свиньи и цыпленка.

Таким образом, иммунохимический. перекрест между бычьей и крысиной синтетазами существует, но консервативный эпитоп (эпитопы) лежит за пределами участка таг, существенного для ферментативной активности. Поскольку антигенные детерминанты для популяции полиАТ к

Таблица 2

125

Адсорбция моноспецифических t I ]антител против бычьей WRS на матриксах с VJRS из различных источников

Источник таг 125 Количество адсорбировавшихся [ I ¡антител

(имп/мин) (%)

Печень крысы 1.920 7.2

Печень свиньи 1.665 7.0

Печень цыпленка 3.267 12.3

Поджелудочная же- 25.503 100

леза быка

бычьей синтетазе, не влияющие на ферментативную активность, расположены на Ш^-концевом фрагменте, то можно думать, что консервативные элементы структуры в случае бычьей и крысиной синтетаз расположены также в области NHj-KOHua полипептидных цепей. Что касается синтетаз из печени свиньи и курицы, то они имеют также сходные с бычьей WRS элементы структуры в области, определяющей ферментативную активность.

Дальнейшее углубление иммунохимического подхода к изучению WRS могло быть достигнуто с использованием моноклональных антител (моноАТ), специфически настроенных на различные антигенные детерминанты.

В результате слияния иммунных спленоцитов с миеломными клетками мышей линии P3/Ag6 653, проверки первичных популяции гибридных

клеток и последующего клонирования были получены три линии гибридом, секретируюкие моноАТ к TOS, обозначенные как Ami, Ап2 и АтЗ. Все полученные антитела относились к классу IgGl с легкими цепями х-типа.

Специфичность полученных моноклональных антител и их влияние на активность бычьей WRS. Доказательства специфичности моноАТ к WBS, как и к любому другому ферменту, должны включать связывание с антигеном и влияние моноАТ на ферментативную активность. На рис. 15 представлены данные опыта, в котором моноАТ, иммобилизованные на матриксе, удаляют активность WKS из раствора. Преинкубация с IgG-фракцией.неиммунных мышея или бычьим сывороточным альбумином, иммобилизованном на матриксе, практически не сказывается на активности фермента, открываемой в надосадочной жидкости. Следовательно, полученные клоны действительно секретировали моноАТ к

На рис. 16 приведены данные по влиянию моноАТ на активирующую (А) и ацилирующую активности (Б) синтетазы. Видно, что Аш2 ингибирует активность WRS уже на первой стадии реакции (рис. 16 А, кривая 2), тогда как связывание Ami и АшЗ (рис. 16, кривые 1 и 3, сответственно) не приводят к инактивации фермента.

Картирование эпитопов для моноАТ. Следующий этап работы заключался в локализации эпитопов для полученных моноАТ, различным образом влияющих'на ферментативную активность. Для реиэния этого

WRS.

Рис.15. Влияние преинкубации WRS с Ап1 (1), Аш2 ( 2 ), АтЗ (3), IgG неиымунных мышей (41 и BSA (5 ), фиксированных на матриксе, на способность надосадочной жидкости катализировать АТР-РР1-обмен

*20 АО латрикссиют;

вопроса мы использовалм способность моноАТ связываться с различными формами димерной WRS, образующимися в результате ограниченного трипсинолиза. Трипсинолиз субъединиц WRS происходит, как указывалось выше,, последовательно с NHj-KOHija по следующей схеме: 60 кДа —> 51 —> 40 —> (24 + 14 кДа) (Lemalre et- al., 1975, Prassolov et al., 19751. В присутствии триптофаниладенилата трипсинолиз WRS останавливается на расщеплении каждой субъединицы в основном до Mr 51кДа. Вначале определили способность такой димерноя формы WRS к связыванию с моноАТ (рис. 17). Видно, что только Аш2 взаимодействует с этой димерноя формой фермента.

Аналогичные результаты с моноАТ получили для димерноя WRS с Mr субъединицы 40 кДа, образующейся после ограниченного протеолиза эластазой (Epely et al., 1976). Мы пришли к заключению, что антигенная детерминанта для Аш2 локализована на ферментативно активной форме 2x40 кДа. Эти результаты хорошо согласуются с влиянием Аш2, но не Ami и АтЗ, на ферментативную активность.

100 75 SQ 23

too

0,5

t,o

0,5

Нонохлональные снгттиггглсз/*//

Рис.16. Елияние Ami (1), Аш2 (2) и АтЗ (3 ) на активность WRS в реакциях аыиноацилирования тРНКТгр (А) и. ATP-PPl-обмена (Б)

Рис.17. Иммунореактивность Ami (1), Am2 (2) и АтЗ (3) с формой WRS, состоящей из двух 51-кДа субъединиц. Адсорбция при 280 нм (4)

Агво

Г S* о4 QZ- А

1 $40 | ' к

| / / \ ®ч •I z4V.

1 -is I 20 1

8M2222S22222AM

2D 25 фракции

Если эпитопы для Ami и АтЗ не принадлежат к типу прерывных конформационных детерминант, то результаты опыта, приведенного на рис. 17, однозначно указывали бы на локализацию этих эпитопов на Фрагменте 9 кДа с NHj-KOHua молекулы WBS. Сохранение детерминанты в денатурирующих условиях свидетельствует о ее непрерывности. Из данных рис.18 (А и Б, дорожка 1) видно, что антигенная детерминанта для Ami сохраняется при иммуноблоттинге белков, разделенных при денатурирующих условиях. Основываясь на этих результатах, мы делаем вывод, что детерминанта для Ami относится к непрерывному типу и расположена на расстоянии 9 кДа или менее от ЫН„-конца цепи WRS.

Рис.18. Иммуноблоттинг. Иммунореактивность Ami с WRS в грубом экстракте бычьей печени.Фермент-связанная иммунологическая окраска (А), окраска AmidoMacl? (Б)

Возможно, что на NHj-KOHue расположена и детерминанта для АтЗ, т.к. эпитопы для Ami и АиЗ сблиякны, поскольку АтЗ ингибирует

радиоиммуноадсорбцию С1 IlAml, и аналогичным образом Ami ингибирует

i 25

радиоиммуноадсорбцию [ 11АшЗ на WRS (данные не приводятся). Эти результаты, равно как отсутствие влияния АтЗ на активность WRS, свидетельствуют о том, что зпитоп для АтЗ, принадлежа к конформационному типу, локализован, как и эпитоп для Ami, в NH,-концевой области'длиной 9 кДа или менее.

Ат2 не влияет на сорбцию ни 1 IlAml, ни I 11Апй на WRS (данные не приводятся!. Эти результаты полностью согласуются со сделанным ранее выводом о локализации детерминанты для Ат2 на ферментативно активном "ядре" (2x40 кДа) и свидетельствуют об отсутствии какого-либо перекрывания детерминант для Ami и АшЗ с Ат2. Более того, -анализ связывания Аш2 с WRS на разных стадиях

ограниченного протеолиза показал, что потеря Ат2 реактивной способности связываться с Ат2 вызывается расщеплением полипептида 24 кДа, который, по-видимому, ответствен за поддержание должной конформации антигенной детерминанты для Ат2.

Данные по картированию зпитопов для моноАТ в сочетании с анализом ферментативной активности протеолизованных форм УШ и с исследованием влияния полиАТ свидетельствует о том, что димерная молекула теэ состоит из ферментативно активного "ядра", построенного из СООН-концевых двух третей полипептидных цепей, и из несущественной для активности ЫН,-концевой области, расположенной, по-видимому, на периферии белковой глобулы.

Эволюционный консерватизм антигенной детерминанты для Ami. Как уже отмечалось выше, антигенная детерминанта для одного из моноАТ - Ami сохраняется в условиях проведения иммуноблоттинга (рис.161. При иммуноблоттингегомогената печени быка из множества растворимых белков только один, электрофоретическая подвижность которого совпадает с подвижностью субъединицы VffiS, взаимодействует с Ami (рис. 16, дорожки 2 и 3). Аналогичный результат наблюдался

\о

- Ь7 -

- 45

Рис.19. Иммунореактивность Ат1 с ОТЕ из различных организмов. Иммуноблоттинг супернатантов после центрифугирования при 30.000 ^ плаценты человека (1), печени быка (2), кошки (3), собаки (4), кролика (6). и крысы (7); клеточные гомогенаты И.На1оЬ1иш 16! и Е.соИ (9!, очищенная бычья ТОБ (5, 10)

- 12.4 -

при иммуноблоттинге надосадочноя жидкости гомогената бычьего мозжечка, полученной после центрифугирования при 30.ООО g. Эти данные указывает на отсутствие структурных элементов, сходных с антигенной детерминантов для Аш1 на других растворимых белках бычьих клеток, т.е. свидетельствует об уникальности антигенной детерминанты для Ami на WRS. Эти свойства Ami открывает возможность использования этих моноАТ для оценки степени консервативности тех участков структуры WRS, которые формирует данный зпитоп. Существование консервативных элементов структуры WRS из различных организмов нам удалось ранее наблюдать в опытах с полиАТ, о которых говорилось выше.

В гомогенатах тканей различных отрядов млекопитающих выявляется единственный белок, реагирующий с Ami (рис.19, дорожки 1, 3, 4, 6, 7). Совпадение электрофоретических подвияностея этих белков с подвижностью бычьего фермента (дорожки 2 и 51 свидетельствуют о большой близости или идентичности размеров полипептидных цепей WRS млекопитающих. Для WRS человека это хорошо соответствует имеющимся данным (Penneys & Muench, 1974 ).

Белок, реагирующий с Ami, обнаруживается также у E.colí (рис.19, дорожка 9). Размеры его полипептидной цепи, полученные в наших опытах (36 кДа), совпадают с установленными ранее для TOS из этого источника (Joseph & Muench, 1971). Подвижность полипептидной цепи, выявляемой Ami у архебактерии Halohacterlun haloblum, совпадала с подвижностью эукариотических WRS (рис .19, дорожка 8). Таким образом, WRS эукариот, эубактерил и архебактерий имеют общую антигенную детерминанту. Этот вывод подтверждается также опытами с гомогенатами личинок дрозофилы, клеток дрожжей и неироспоры, хотя в этих случаях возникли существенные затруднения, связанные с высоким уровнем эндогенного протеолиза в клеточных гомогенатах.

Для окончательного подтверждения существования общей антигенной детерминанты в эу- и- прокариотической WRS для Аш1 мы решили получить очищенный препарат прокариотинескоя WRS. Разработан быстрый двустадииный метод выделения WRS из E.coll с помощью системы FPLÍ. На последней стадии очистки на колонке с Nono S WRS E.coll элюирует-ся симметричным пиком (рис. 20, Б). Электрофорез этого пика в DS-Na ПААГ выявляет единственный полипептид с tir 38 кДа (рис. 20, В).

Способность .всех трех моноАТ к взаимодействию с выделенной

бактериальной WRS была исследоЕана с помощью реакции непрямой радиоиммуноадсорбции. На обеих стадиях очистки (рис.20, А и Б) профиль радиоиммуноадсорбции с использованием Ami совпадает с

профилем аминоацилирующея активности тРНК

Тгр

г г

Следовательно, белок,

k Da

-96

-49 •-36

30 tpffOMiUU

Рис.20. Очистка WRS E.coli и ее иммуиореактиЕНОсть с моноАТ. Фракционирование свободного от рибосом экстракта на колонке Mono Q (А) с последующей хроматографией на колонке Mono S IБ)..Адсорбция

Тгр

при 260 нм (-) активность в реакции аминоацилирования тРНК непрямая радиоиммуноадсорбция Ami - 2, Am2 - 3 и АвЗ - 4.' (Б) Электрофорез в ПААГ б присутствии DS-Na очищенного препарата WTÎS E.coli. Справа указаны положения и размер белков-свидетелей

с которым взаимодействует Аи1-при иммуноблоттинге лизатов Е.сoil, действительно WRS. Взаимодействие этого моноАТ с WRS высокоспецифично, поскольку ни один из других белков Е.со11 не узнается Ami ни в нативных, ни в денатурирующих условиях. Ат2 и АпЗ не взаимодействуют с WRS Е.со11 (рис. 20 А и Б).

Аффинность Ami к WRS E.coll и быка сравнивали в реакции

ингибирования радиоиммуноадсорбции Ami на бычьей синтетазе..

Оказалось, что сродство WRS E.coll к Ami примерно на два порядка

низке по сравнению с бычьим ферментом, что указывает на сходство, но

не идентичность эпитопов для Ami на двух WRS. Ami для бычьей

WR5, определенная по методу Beatty et al. 11997), составляла около

Ю-9 М, тогда как К,.^ Ami для WRS E.coll, ло-видимоыу, близка к

-7 -5

10 М. При концентрации Ami 10 M моноАТ, как и в случае бычьей

таз, не влияли на ферментативную активность WRS E.coll в реакции

аминоацилирования тРНКТгр.

Таким образом, с помощью Aral выявлены общие антигенные детерминанты в WRS из всех трех царств живой природы, что укаэывет на древность ферментов этой группы. Это можно было ожидать a priori, учитывая важную роль аминоацил-тРНК-синтетаз в трансляции и известную консервативность других компонентов белок-синтезирующей машины.

Естественно ожидать, что под селективным давлением эволюции структурной консервативностью должен обладать активный центр фермента. Например, общий зпитоп выявлен в каталитическом домене аланил-тРНК-синтетаз из E.coll и Bombyx йог! (Regan et al., 1986). Однако, выявленный нами эволюционно консервативный участок молекул WRS, связывающийся с Ami, лежит за пределами активного центра как у про-, так и у эукариот. Область, где локализуется антигенная детерминанта для Ami, в случае бычьей WRS находится, по описанным выше данным, на фрагменте- длиной 9 кДа с Г^-конца молекулы синтетазы. Как отмечалось выше.,- с помоыыз полиАТ также локализованы консервативные элементы структуры в ¥RS млекопитающих.

Таким образом, участок VfRS, не существенный для активности", обладает эволюционной консервативностью. Этот интересный феномен может быть объяснен при допущении, что консервативная область вовлечена в какую-то. важную функцию фермента, не связанную непосредственно о функцией аминоацилирования тРНКТгр и активации

триптофана .Метод локализации антигенных детерминант линейного типа на полипептидных цепях белков с неизвестной первичной структурой. Следующий этап исследований был связан с Солее детальной локализацией зпитопа для Ami. Существует множество методов определения местоположения антигенных детерминант вдоль полипептидной цепи с известной аминокислотной последовательностью (Tzartos et al., 1988; Himberg et al., 1984; Jameson & Wolf, 1988 i. Первичная структуры бычьей WRS в то время была неизвестна. Б этом случае задача по локализации антигенной детерминанты ыожет быть решена только, если искусственно ввести точку отсчета в исследуемый полипептид. В работах IJua & Doolittle, 1985; Jay, 1984) предложены способы введения Н^-концевых флуоресцентной и радиоактивной меток в полипептиды, что позволяет определить положение некоторых аминокислотных остатков (Arg-, Asp, Cys, Met, Trp, Asp-Pro, Asn-Gly) Эти способы основаны на модификации тиоацетилтиогликолевой кислотой (TATGA) или фенилизотиоционатом IPITC) как а-, так и е-Ш2-групп с последующим отщеплением модифицированной [^-концевой аминокислоты и введением во вновь образовавшуюся а-ЫН2~группу флуоресцентного или радиоактивного реагента, специфичного только к Ш2-грулпаы. Однако, необратимая модификация е-Ш2-группы лизиновых остатков с помощью TATGA и Р1ТС может повредить антигенную детерминанту. Кроме того, у ряда белков, и, в частности, у кативкоя VÍRS быка ИН2~концевая группа блокирована (Gros et al., 1972).

Был предложен и разработан способ локализации антигенных детерминант линейного типа на полипептидных цепях белков с неизвестной первичной структурой с использованием обратимо модифицирующего реагента - малеинового ангидрида. Общий принцип метода показан на рис.21. Модифицированную полипептидную цепь расщепляют так, чтобы на молекулу в среднем приходилось менее одного разрыва (принцип статистического расщепления на белках был применен цитируемыми выше авторами для выявления положения определенных аминокислот вдоль полилептидноя цепи, а также Грачевым и др. (1986) для поиска антигенной детерминанты' при известной первичной . структуре). При этом должен образоваться набор пептидных фрагментов

б 6

2! ♦ * f ' I

» f .

t t t ♦ 1

г ■ f J

0 * t ,

, t т г oJ—1

coon

- 205 -

- 116 -94 -67 -

43 -ЗО -

РИС. 22

Рис. 21. Схема введения НН2-концевой метки для локализации антигенных детерминант: а - исходная полипептидная цепь; б - полипептидная цепь с модифицированными Ш2~ концевыми и £-МН2 группами остатков лизина; в - расщепленная модифицированная полипептидная цепь; г - мечение свободных КН^-концевых групп 125-меченным реагентом Болтона и Хантера; д - меченные фрагменты после демодификации М^-концевых и £-N[42 групп лизинов

Рис. 22. Электрофорез в полиакриламидном геле продуктов ограниченного

трипсинолиза малеилированнои синтетазы после коныэгирования с 125

1-меченным реагентом Болтона и Хантера. 1 - исходная синтетаза; 2 - после трипсинолиза. Окраска геля кумасси (А) «радиоавтограф геля (Б!

различной длины. Все фрагменты в этой смеси, кроме М^-концевых,

будут содержать немодифицированную, вновь образовавшуюся

a-NH2~rpynny. Так как Q-NHj-rpynna N-концевой аминокислоты, а также

E-NHj-rpynnbi остатков лизинов в исходной полипептидной цепи

предварительно блокированы, то в данной смеси пептидов можно

маркировать все фрагменты, используя какой-либо реагент, специфичный

105 '

к NHj-группам, например, I-меченныл реагент Болтона и Хантера

(Bolton 4 Hunter, 1973), а затем демодифицировать малеилированные

Ш2~группы кислотной обработкой. Нахождение после демодификации двух

самых длинных фрагментов, более длинный из которых еше связывается с

моноклональным антителом, а второй, более короткий - уже не

связывается, позволит определить положение антигенной детерминанты вдоль полипептидной цепи антигена.

Применительно к бычьей WRS блокирование e-NHj-rpynn лизинов, как показали опыты по исследование связывания малеилированноя формы фермента с Ami б реакциях радиоиымуноадсорбции и торможения радиоиымуноадсорбции, приводит к утрате антигенной детерминанты. После удаления блокирующей группы антигенная детерминанта полностью восстанавливается. Эти данные демонстрируют преимущества метода с обратимой модификацией £-Ш2-групп в сравнении с методом I Jue & Doolittle, 1985; Jay, 1984), использующими необратимую модификацию, по крайней мере для конкретного фермента - бычьей WRS. На основании этих данных, по-видимому, правомерно считать, что эпитоп для Ami содержит остаток лизина!ов).

Для расщепления белка использовали трипсин, гидролизуюдая

полипептидную цепь у остатков лизина и аргинина, а после модификации

e-NHj-rpynn лиэиновых остатков - только после остатков аргинина

(Smyth, 1967). На рис. 22 показано гель-электрофоретическое

разделение продуктов частичного растепления малеилированноя WRS 125

после конъюгирования с I-меченным реагентом Болтона и Хантера.

Видно, что малеилированныи нерасщепленный белок (рис. 22, А и Б,

125

- дорожка 1) практически не включает I, что свидетельствует о полной блокировке £-NH„-rpynn лизиновых остатков. При соотношении WRS/трипсин, равном 10^/1 (по весу) радиоавтография выявляет два меченых фрагмента (рис. 22, Б, дорожка 2), которые, возможно, содержат СООН-конец исходной полипептидной цепи, поскольку, как видно из рис. 22. А (дорожки 1 и 2), подавляющая часть белка в этих условиях остается нерасщепленной.

Как видно из рис. 22, подвижность модифицированной малеинс-вым ангидридом WRS меняется. Если Mr субъединицы исходного фермента 60 кДа, то после модификации ее кажущаяся молекулярная масса соответствует 90 кДа (рис. 22, А, дорожка 1). Следует отметить, что хотя причина кажущегося "утяжеления" полипептидных цепей (в 1,33 раза) не совсем ясна, близкое изменение наблюдали также для модифицированных, малеиновым ангидридом молекул человеческого трансферрина, бычьего сывороточного альбумина, а также легких и тяжелых иепеи IgG кролика. Это позволило нам ориентировочно оценить истинные значения Mr 1^"|1-меченных фрагментов WBS как 43 и 3S кДа,

исходя из сравнения с немсдифицированными белками-свидетелями, при

кажущейся молекулярной массе 65 и 56 кДа. Результаты по связыванию

смеси меченых фрагментов после демалеилмрования с антителами,

адсорбированными в лунках планшета, показали полное отсутствие

сорбции (данные не приводятся). В качестве положительного контроля

использовали сорбцию нативной синтетазы, конъюгированной с 19е!

I-меченным реагентом Болтона и Хантера.

Таким образом, меченые фрагменты с Mr 43 и 36 кДа, полученные отщеплением 17 и 22 кДа с Ш2-конца исходной полипептидной цепи, не взаимодействует с Ami. Тем самым мы подтвердили независимым путем положение эпитопа для Ami на Ш2-концевом фрагменте WRS с массой 17 кДа, постулированное ранее, исходя из данных (Lemalre et al., 1975> об отщеплении М^-конца на первой стадии ограниченного протеолиза. г* сожалению, нам не удалось получить относительно равномерного расщепления полипептидной цепи трипсином и тем самым сузить область расположения антигенной детерминанты. Эту цель нам удалось достичь, используя для статистического расщепления метод частичной химической деградации. В качестве реагента использовали BrCN, который, как известно, расщепляет полипептидные цепи у остатков метионина. Фрагменты, образующиеся после исчерпывающего расщепления под действием BrCN, сохраняли антигенную детерминанту для Ami (данные не приводятся).

При ограниченном химическом расщеплении по метиониновым остаткам в присутствии различных концентраций BrCN (рис.23) образуется набор фрагментов различной длины. По данным

1 пъ

иммуноблоттинга с использованием [ I IAml (рис.24) антитела связываются как с нерасшепленной цепью (60 кДа), так и с фрагментами Mr 48, 35 и 28 кДа и не взаимодействуют с самым крупным из образующихся фрагментов с Mr 55 кДа (рис.23, дорожка 5). Выше было показано двумя независимыми путями, что антигенная детерминанта для Ami находится на М^-конце полипептидной цепи WES. Из сопоставления этих двух наблюдений вытекает, что фрагмент с Mr 55 кДа возникает е результате отшепления М^-конца, а фрагменты с Mr 48, 35 и 28 отщепления СООН-конца. Антигенная детерминанта для исследуемого моноАТ должна быть расположена на Ш2~концевом фрагменте размером около 5 кДа, отщепляемом при образовании полипептида с Mr 55 кДа. Исходя из сохранения антигенной детерминанты для Ami после

исчерпывающего расщепления BrCN, локализация эпитопа для Ami определяется следующим образом: он находится между двумя остатками метионина на расстоянии 55 кДа от СООН-конца молекулы WRS, либо непосредственно между NH2~kohuom и ближайшим остатком метионина.

1 1 Z 3 Ч S 1 2 3

— £7

у -—. «es® с^?

•TV ¿"7 «г? ... ¡f¡

'. "Т*"" f*"*; .• 31

" - » Ч5ГУ<

Рис. 24

Рис. 23. Электрофоретическое разделение продуктов ограниченного расщепления триптофанид-тРНК-синтетазы под действием BrCN. 1 -исходная синтетаза; 2-5 - продукты расщепления, с использованием уменьшавшихся концентраций BrCN

Рис. 24. Радиоиммуноблоттинг продуктов ограниченного расщепления синтетазы под действием BrCN. Дорожка 1 - исходная синтетаза, 2 -после расщепления BrCN, 3 - меченные белки-свидетели

Иммунноэлектронномикроскопическое определение локализации WRS в клетках высших эукариог % бактерий. Описанные выше свойства эпитопа для моноАТ Ami - с одной стороны, его уникальность для WRS, а с другой - универсальное присутствие в WRS организмов всех царств живой природы - позволило использовать Ami для изучения распределения WRS в клетках эу- и прокариот. Локализацию WRS в клетках изучали на ультратонких срезах фибробластов крыс линии RATI,

заключенных в смолу "Lowicrll К4М", обрабатывая их комплексом Ami с частицами коллоидного золота размером 15 нм. Одновременно срезы обрабатывали комплексами ыоноспецифических полиАТ к бычьей WRS с коллоидным золотом размером 8 нм. Распределение частиц золота нал различными органеллами клетки показано на рис. 25. Видно сходное распределение на срезе частиц золота, конъюгированных как с моноспецифическими, так и с моноклональными антителами. Наиболее активно, метится цитоплазма, однако метка над цитоплазмой распределяется крайне неравномерно, что обьясняется, по-видимому, неодинаковой структурной организацией разных участков цитоплазмы.

Наибольшее количество частиц золота обнаруживается над участками цитоплазмы, где присутствует большое количество рибосом (рис. 25). Б среднем в этих участках наблюдали 25 частиц золота на 1

мкм , хотя видны зоны, где уровень метки значительно выие. Следует отметить, что метка необязательно располагается вдоль мембран грубого эндоплазматического ретикулума, а может локализоваться в участках скопления свободных рибосом. Синтетаза не обнаружена в цистернах эндоплазматического ретикулума и в участках цитоплазмы, где располагаются микрофиламенты. Однозначного вывода об отсутствии или наличии WRS в комплексе Гольджи пока сделать нельзя, т.к. в выбранных для максимальной сохранности антигенных детерминант условиях фиксации (без осмирования клеток) на ультратонких срезах плохо выявились мембранные структуры.

Значительное количество WRS обнаруживается в митохондриях (рис. 25). Исходя из количества частиц золота на 1 мкм' площади среза, содержание фермента в митохондриях составляет около 70% от содержания его в цитоплазме (рис.25 и 26). Эти данные согласуются с результатами биохимических исследований, в которых показано , что WRS присутствует в изолированных митохондриях (Gabues & Cramer, 1934 I.

Удалось также наблюдать WRS в ядрах фибробластов. В ядре метка сосредоточена в основном над зонами, где находится диффузный хроматин (рис.25). В участках локализации компактного хроматина метка почти отсутствует. Небольшое количество моноАТ связывается с ядрышками (данные не приводятся).

Для проверки специфичности маркирования были поставлены следующие контрольные опыты: 1 ) срезы инкубировали в каплях раствора

Рис.25. Ультратонкий срез фибробласта, фиксированного глутаральдегидом, заключенного в смолу "1.ои11<гу1 К4М" и обработанного комплексами Аш1 Аи35 и поли'Ат Аи8. Здесь и далее обозначения на срезах: Я - ядро; Мх -митохондрия, ДХ -диффузный хроматин: КХ - компактных хроматин; Ц - цитоплазма. Увеличение х41 500

Рис.26. Гистограмма распределения метки над различными клеточными структурами фибробластов; 1 - полиАТ*Аи 8, 2 - Аш1*Аи 15, 3 -полиАТ*Аи 8 + Ап1»Аи 15, 4 - полиАТ*Аи 3 + Ат1 «Аи 15 + 1 мг/мл

тай

■о §

и« «S

о £

АО

-20

■ 2'

11 а

иитоплаьма ичклеоий

Рис.27. Гистограмма распределения частиц золота на ультратонком срезе клеток E.coll, фиксированных глутаральдегидом, заключенных в смолу "Lowikril К4М" и обработанных комплексами : 1 - Aml«Aul5, 2 -Aml*Au 15+1 мг/мл таз

коллоидного золота, не коньсгированного с антителами. Специфическоп связывания обнаружено не было; 2) в капли с комплексами моно- и полкЛТ с коллоидным золотом Aml*Aul5 добавляли WES до конечной концентрации 3 мг/мл, При этом количество метки над структурами снижалось практически до фонового уровня.

На рис. 27 приведена гистограмма распределения частиц золота, конъсгированного с Aul, в клетках E.coli. Основная часть метки (8090%) распределена по цитоплазме обычно более или менее равномерно. Нуклеоид метится гораздо слабее, метка в нем часто сравнима с уровнем фона. Таким образом, важным отличием в распределении TOS в бактериальных и зукариотических клетках является присутствие значительного количества иммунореактивного материала в ядрах клеток эукариот.

Количество частиц золота в зонах, где расположен диффузный хроматин, составляет 50-602 от количества метки в цитоплазме. Напротив, в бактериальных клетках количество частиц золота над нуклеоидоы обычно не превышает 10-20% интенсивности метки в цитоплазме. Возможно, что присутствие WRS в ядрах эукариот связано с дополнительными функциями, которые она выполняет в эукариотических клетках, кроме участия в синтезе Тгр-тРНКТгР. Аргументом в пользу . этого предположения может служить неравномерное распределение WRS внутри ядра.-

Присутствие WRS в ядрах фибробластов согласуется с иммуннофлуоресцентными данными о присутствии некоторых других аминоацил-гРНК-синтетаз в ядрах высших эукариот (Dang et al., 1963, Mlrande et al., 1985, Rosa et al., 1963). Mlrande et al.(1985), выявившие фенилаланил-тРНК-синтетаэу в ядрах клеток некоторых эукариот, высказали предположение, что содержание этого фермента в ядре может меняться на разных стадиях клеточного цикла. Наши данные показывает, что количество метки в ядрах разных клеток фибробластов такж$ может быть различным, что может быть косвенным доводом в пользу высказанного выше предположения.

Весьма интересно наблюдение о том, что VHS просто обнаруживается в ядре животных клеток, но и избирательно сосредоточена в диффузном хроматине. Подобная локализация фермента может указывать на участие WRS во внутриядерных процессах, таких, например, как транскрипция, працессинг, перенос макромолекул из ядра

в цитоплазму и др. Очевидно, что эти наблюдения позволяют планировать ноеый цикл исследования, связанный с изучением возможных внутриядерных функций таз.

Второй момент, на который следует обратить внимание, заключается в том, что наибольшее скопление ОТ(3 коррелирует с большим числом рибосом. Большинство эукариотических аминоацил-тРНК-синтетаз связываются с рибосомной РНК (А1гапоуа еХ а1., 1960, 1992, 5р1г1п & ОусМпп!!^, 1984, Иейогоу е! а1., 1985). Однако, нативная тез не обладает этой способностью (Федоров и Фаворова, 1988). Мы предположили, что существует некая молекула-адаптор, которая осуществляет комплексообразование с рибосомами через рибосомную РНК.

Глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназа образует-комплекс с УИЗ. На первом этапе этой части работы задача сводилась к выявлению среди полипептидов животной клетки гипотетической молекулы-адаптора, способной взаимодействовать с полипептидами УШб клеточного лизата. Здесь мы применили принцип, лежашй в основе метода иммуноблоттинга и позволяющий выявить взаимодействия, сохранявшиеся при денатурации белковых молекул. Клеточный лизат был подвергнут электрофорети-ческому разделению в ЮБ-^-ПААГ. Полипептиды после разделения были перенесены на нитроцеллюлозный фильтр. Гель после пассивного

переноса окрашен кумасси (рис. 26, А), а фильтр обработан

1 2е)

1-ыеченной высокоочищэнной таз (рис. 28, Б). Из рис. 28, Б видно, что тез взаимодействует с полосой с кажущимся Мг 37 кДа (дорожка 3). В этом опыте взаимодействие антиген-антитело, т.е. между №ЙЗ и Аи1 использовали как положительный контроль (дорожка 1). Для того, чтобы подтвердить белковую природу взаимодействующего материала, клеточные лизаты перед нанесением на гель обрабатывали ДНКазоя, РНКазой и проназоя. Полоса 37 кДа исчезала только после обработки проназой. Полипептид 37 кДа выявлялся меченой таг также в лизате человеческих клеток К562.

Этот полипептид относится к числу основных (мажорных) растворимых клеточных белков. Среди идентифицированных белков клетки, также представленных в значительных количествах, известны два фермента гликолиза, имеющие близкие к 37 кДа размеры субъединиц - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД, КФ 1.2.1.12) и

лактатдегидрогеназа (ЛД, КФ 1.1.1.26). Таблица 3 показывает, что ГАФД действительно связывается с WRS, тогда как ЛД связывается очень слабо. Еажно отметить, что результаты, представленные в табл.3, получены в неденатурируюших условиях, в отличие от результатов, приведенных на рис.-28. Показано, что ГАМ не влияет на ферментативную активность WRS в реакции РР^-АТР обмена, что видно из табл.4. 10 мМ АТР практически не влиял на комплексообразование ГАФД с WRS. Поскольку Ami, Ат2 и АтЗ взаимодействуют с различными участками молекулы WRS, мы их использовали для идентификации участка синтетазы, ответственного за взаимодействие с ГАФД. Как видно из рис. 29, Ami сильно конкурирует с ГАФД за связывание с WRS, а Аш2 вообще не конкурирует за связывание . АтЗ слабее конкурирует за связывание с синтетазой по сравнению с Ami..

Как указывалось выше, антигенные детерминанты для

Рис.26. Радиоблоттинг лизата клеток Р/3 AgS 653 с использованием

105

! I1VRS . Гель, окрашенный кумасси после диффузного переноса полипептидов на нитроцеллюлозный фильтр (А). Дорожка 1 - маноАТ AMl, 2 - WRS, 3 - лизат 5х105 клеток Р/3 Ag8 653

4С

Таблица 3

1 —з

Радиоадсорбция t I ]WRS (имп/мин х 10 ) на белках

Белок (1 мкг./лунку) адсорбированный на планшете

МоноАТ Глицеральде- Лактат- Бычий сыво-

гид-3-фосфат-дегидро- роточный WRS Ami Авй АтЗ дегидрогена геназа бумин _за__

1. 16.1 10.5 15.3 13.2 0.5 1.2 0.3

2. 13.9 12.1 13.7 13.4 0.1 0.7 0.2

Таблица 4

Влияние глицеральдегид'-3-<$юсфатдегидрогеназы на ферментативную

активность WRS

з? —°

Условия эксперимента [ РЗАТР-РР1 обмен Iимп/мин х 10 J)

Контрольная WR5 (50 нМоль) • 14.4

15.4

VffiS с 0,1 мкМ Ам2 3.6

4.1

WRS с 0,1 МКМ ГАФД 14.9

14.2

Ami и АтЗ пространственно сближены и эта область WRS не существенна для каталитической активности фермента. Ранее (Ryazanov, 1985) было показано, что ГАФД связывается с рибосомной РНК. Действительно, табл. 5 показывает, что такой тройной комплекс можно обнаружить.

Основываясь на полученных результатах, можно предположить, что ГАФД выполняет в клетках зукариот роль молекулы-адаптора, участвуя в образовании тройного комплекса рРНК - ГАФД - WRS и обеспечивая -связывание с рибосомами одной из аминоацил-тРНК-синтетаэ, не связывающейся непосредственно с рРНК.

Таким образом, показано, что, возможно, существует третий путь компартментализации аминоацил-тРНК-синтетаэ в зукариотических <летках - через молекулу-адап-гор, например, ГАФД. Первый путь

Рис.29. Ингибирование радиоадсорбции I-VRS на ГАФЛ моноАТ Ам1 (1 ), Ам2 (2 ), АмЗ (3 )

Радиоадсорбция I^^IJWKS на рРНК-сефарозе 1 оп

Количество нано- Адсорбция 1 11VJRS на

симой [125I)WRS рРНК-сефарозе (имп/мин х ю~3)

_(мкг)_

глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа • без ■ с

1.5 1.0 5.5

3.0 1.1 8.5

20.0 2.0 50.0

компартментализации - образование стабильных мультиферментных комплексов (см.обзоры Dang & Dang, 1966, Киселев и др., 1984), однако "WRS в эти комплексы не входит (Klsselev, et al., 1979; Klsselev и Kovaleva, 1987). Второй путь - непосредственное связывание ряда аминоацил-тРНК-синтетаз tHO не WRS) с рРНК (Alzhanova et al., 1982; Splrln & Ovciilnnlkov, 1934; Feüorov et al., 1935), что обсуждалось выше.

Эти результаты находятся в полном соответствии с обшей концепцией А.Спирина о компартментализации эукариотического аппарата белкового синтеза через связывание с полирибосомами компонентов,

Антитела (тлокь)

Таблица 5

осуществляющих внерибосомный этап трансляции (Splrin, 1S7Ö; Spirln & Ovchlnnikov, i960). Важно подчеркнуть, что коыпартыентализация WRS через молекулу-адаптор - ГАФД осуществляется за счет несущественной для ферментативной активности Ш^-концевой части WRS. ГАФД видимо, не единственная молекула, способная служить адаптером для компартментализации, возможно, и другие клеточные белки в состоянии осуществлять подобные функции.

С целью имыунохимического изучения других аминоацил-тРНК-синтетаз были разработаны быстрые методы выделения фенилаланил-тРНК-синтетазы, тирозил-тРНК-синтетаэы и получено ряд линий гибридом, секретируюших моноАТ к этим ферментам. Получены также линии гибридных клеток, продуцирюших моноАТ к мультиферментноыу комплексу аминоацил-тРНК-синтетаз, в состав которого входят синтетазы, специфичные для Glu, Gin, Ile, Leu, Met, Arg, Lys,.а также полипептиды с Mr 37 и 43- кДа с неизвестной функцией. МоноАТ идентифицированы как узнаюше аргинил-, глутаминил-тРНК.~синтетаэы и полипептиды 37 и 43 кДа. Антитела полностью охарактеризованы и используются в настоящее время для локализации ферментов в клетке и изучения сборки мультиферментного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз 1 п vivo.

В заключении этого раздела хотелось бы отметить, что все перечисленные иммунохимические возможности, апробированные главным образом на бычьей триптофанил-тРНК-синтетазе, могут по аналогии быть использованы не только при изучении других синтетаз, но и вообще других ферментов. —

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при образовании комплекса тРНКТгР -триптофанил-тРНК-синтетаза происходят изменения пространственной структуры тРНК^гр, что следует из а) изменения спектра кругового дихроизма, б) ускорения гидролиза антикодонового и акцепторного стеблей РНКазой VI.

2. Обнаружено, что при образовании комплекса немодифицированной ; тРНКС1п с глутамйнил-тРНК-синтетазой (0И5) происходит или

спермин— зависимое расщепление фосфодизфирных связей тРНКС*п 1п vitro во всей области антикодоновоя петли, а также в положениях 2224 D-стебля, D-петли и в положениях 71-73 акцепторного стебля. Полностью модифицированная тРНК1^11 практически нечувствительна к Mg++- или спермин-зависимому растеплению в этих областях тРНК при комплексообразовании с гомологичной синтетаэой. Области различной стабильности модифицированной и немодифицированной "своей" тРНК в комплексе с глутаминил-тРНК-синтетазоя содержат ряд модифицированию нуклеотидов, что указывает на их существенную роль в компенсации индуцированного QRS конформационного напряжения в молекуле тРНК.

3. Замена ионов Mg++ при комплексообразовании тРНКС1п 'с гомологичной синтетазсй на ионы Са++ и Ба++ приводит к изменению характера расщепления транскрипта тРНКС1п. При увеличении радиуса иона металла эффективность расщепления в области антикодоновои петли, D-петли и D-стебля (положения 22-24), а также акцепторного стебля падает, тогда как в области дополнительной петли (положения 43 и 44), а также D-петли (положения 20 и 21) усиливается.

4. Мутации в in vitro тРНКС1п приводят к усилению расщепления фосфодизфирных связей не только прилежащих, но и отдаленных участков молекулы тРНКС1п. Б случае "несвоей" модифицированной тРНКТгр напряжение при комплексообразовании с QRS также приводит к разрыву фосфодизфирных связей определенных участков структуры тРНК.. Предполагается, что одним из дополнительных механизмов защиты от использования ошибочно аминоашлированной тРНК при трансляции может быть расщепление функционально существенных участков (антикодона, акцепторного стебля) тРНК, индуцируемое в некорректном комплексе.

5. Выдвинута гипотеза, что обнаруженный феномен индукции расщепления определенных фосфодизфирных связей является проявлением потенциальной рибозим-подобной активности в молекуле тРНК, обнаруживаемой при достижении определенного конформационного напряжения при комплексообразовании с синтетазой, и подавляемой посттранскрипционной модификацией нуклеозидов.

6. Исследовано взаимодействия бычьей WRS и ее фрагментов с кроличьими полиАТ IgG-фракции и их Fab-фрагментами. Показано, что 1/3 антител взаимодействует с СООН-концевым фрагментом WRS .размером 40 кДа и ингибирует активность фермента в обеих реакциях, тогда как остальные полиАТ к ЛН2-концевому домену (20 кДа) не влияют на

активность синтетазы.

С помошъю моноспецифических полиАТ установлено наличие общих антигенных детерминант для WRS быка, свиньи, курицы и крысы. Показано, что консервативные детерминанты расположены также в несущественной для активности фермента области молекулы синтетазы.

7. Получены три линии гибридом, секретируюшие ыоноклоиальные антитела, обозначенные Ami, Аи2 и АпЗ, к бычьей WRS- МоноАТ Аш2 ингибируют активность WPS в обеих реакциях. Эпитоп для этого антитела расположен на СООН-концевом 40 кДа домене молекулы WRS. МоноАТ Ami и АтЗ не влияют на активность фермента. Антигенные детерминанты для этих антител сближены и локализованы на фрагменте 9 кДа с NHj-Konua полипептидной цепи синтетазы. Иммунохимическая реактивность Ami сохраняется после денатурации WRS.

Показан эволюционный консерватизм антигенной детерминанты для Ami. Участок структуры фермента, не существенный для каталитической функции, присутствует в WRS всех трех надцарств живой природы: зубактерия, архебактерий и эукариот.

8. Разработан быстрый метод выделения WRS из E.coll. Этот фермент взаимодействовал только с моноАТ Ami, но не Ат2 и АтЗ. Так же как и в случае с бычьей TOS, Aal не влияло на активность фермента E.coll.

9. Разработан общий подход к локализации антигенных детерминант на полипептидах с неизвестной первичной структурой. С помощью этого метода уточнено положение атнигенноя детерминанты для моноАТ Ami : она расположена на концевом фрагменте длиной около 5 кДа с №2-конца молекулы бычьей WRS.

10. Обнаружено, что бычья WRS способна образовывать комплекс с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназь (ГАФД) In vitro. Установлено с помошью моноАТ Ami, Ап2 и АшЗ, что комплексообразоваиие синтетазы происходит за счет несущественного для ферментативной активности [^-концевого домена-фермента. Показано, что WES способна взаимодействовать с рРНК через образование тройного комплекса синтетаза - ГАФД - рРНК.

11. Проведено иммуноэлектронноыикроскопическое изучение локализации WRS е клетках фибробластов крыс с помошью полиАТ и моноАТ, конъюгированных с частицами коллоидного золота. Установлено, что WRS локализована в основном в цитозоле в местах скопления

рибосом, как ассоциированных с эндоплазматическим ретикулумом, так ¡ свободных, а также в митохондриях. Значительное количество VÍRS выявлено в ядре в ассоциации с нуклеопротеидныыи частицами диффузного хроматина. Можно предположить,что синтетаза участвует в регуляции транскрипции и (или) в переносе тРНК из ядра в цитоплазму в форме тРНК-синтетазного комплекса.

Проведено иммуноэлектронномикроскопическое изучение локализацш WRS в клетках E.coli. Синтетаза обнаружена главным образом в цитоплазме. Основным отличием в распределении WRS в эу- и прокариотической клетке является отсутствие синтетазы в области нуклеоиха.

12. Разработаны быстрые методы выделения тирозил- и фенилаланмл-тРНК-синтетаз млекопитающих. Получен ряд линий гибридом, секретирующих моноАТ к этим ферментам, а также к компонентам мультиферментного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз (аргикил-, глутаминил-тРНК-синтетазам и полипептидам с Mr 37 и 43 кДа).

13. Обобщая все изложенные в работе данные, можно прийти к заключению, что, несмотря на достаточно полную изученность аминоацил-тРНК-синтетаз, тРНК и их комплексов, дальнейшее развитие методических приемов вполне оправдано и позволяет расширять и углублять представления, сложившеся в этой области молекулярной биологии.

СПИСОК

основных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Берестень С.Ф., Иейнкер В.Ш., Рохлин О.В. Иммунохимические свойства триптофанил-тРНК-смнтетазы и ее фрагментов.

Мол. биология., 1976, т.12., с.1403-1419. -

2. Schelnker V.Sh., Beresten S.F., Mazo A.M., Ambartsumyan N.S., Rokhlln О.У., Favorova 0.0. and Klsselev I.L. Immunochemical studies of teef pancreas tryptophanyl-tRNA synthetase and Its fragments. Eur. J. Blochen., 1979, v.97, p.529-540.

3. Klsselev L.L., Kovaleva G.K., Favorova 0.0., Schelnker V.S., and Beresten S.F. Molecular etymology of tryptophanyl-tRNA synthetase from beef pancreas. Епгуте regulation and mechanism of action. (Mlldner P. and Ries B. eds)', Pergamon

press, Oxford, N.Y., 1980, vol.60, p.199-210.

!. Beresten S.F., Scheinker Y.Sh..Favorova 0.0. and Kisselev L.L. Mutual conformational changes of tryptophany1-tRNA synthetase and tRNATrp in the course or their specific interactions. Eur. J. Blochem., 19S3, v.136, p.559-570.

> Берестень С.Ф., Заргарова Т.А., Костров С.В., Фаворова 0.0. Моноклональные антитела к триптофанил-тРНК-синтетазе. Мол. биология, 1984, т.18, с.1407-1411.

>. Заргарова Т.А., Берестень С.Ф., Фаворова 0.0., Киселев Л.Л. Триптофанил-тРНК-синтетазы эукариот, прокариот и архебактерий имеют общую антигенную детерминанту. Докл. АН СССР., 1985, Т.285, N.6, С.1464-1466.

Г. Берестень С.Ф., Рубикаяте Б.И., Киселев Л.Л. Локализация антигенных детерминант с использованием моноклональных антител и введения -а-М^-концевоя метки в полипептидные цепи. Биоорганическая химия, 1986, т.12, с.316-325.

5. Берестень С.Ф., Рубикаяте Б.И., Киселев Л.Л. Метод выявления 5елок-оелкоЕых взаимодействий. Обнаружение белка с М - 37 кЛа, связывающегося с триптофанил-тРНК-синтетазой. Биоорганическая химия, 1987. т.136, N 10, с.1325-1330.

3. Bsresten S.F. . RuMkalte B.I. and Kisselev L.L. A general approach to the localization of antigenic determinants of a linear type in protein of unknown primary structure. J. Immunol. Meth., 1968, v.113, p.247-254.

¡0. Beresten S.F., Zargarova T.A.. Favorova 0.0., RuMkaite B.I., Ryazanov A.G. and Kisselev L.L. Molecular and cellular studies of tryptophanyl-tRNA synthetases using monoclonal antibodies. Evaluation of common antlgenetic determinant in eukaryotic prokaryotic and archebacterial enzyme which maps outside the catalytic domain. Eur. J. Biochem., 1989, v.184, p.575-561.

11. Favorova 0.0.. Zargarova T.A., Rukosuyev V.S., Beresten S.F. and Kisselev L.L. Molecular and cellular studies tryptophanyl-tRHA synthetases using monoclonal antibodies. Remarkable variation in the content of tryptophany1-tRNA synthetase In pancreas of different mammals. Eur. J. Blochem., 1989, v.134, p.583-588.

12. Fllonenko V.V., Beresten S.F., RuMkaite B.I. and Kisselev

I.L. bovine tryptophanyl-tRNA synthetase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase form a conplex. Blochlo. Biophys. Res. Comxun.,1989,v.161, 461-488.

13. Попенко В.И., Черни Н.Е., Берестень СЛ., Заргарова Т.А., ФаЕорова О.О. Иммуно-электронно-микроскопическое определение локализации триптофанил-тРНК-синтетаэы в клетках бактерия и еусш'.х эукариот. Мол. биология, 1989, т.23, с.1669-1681.

14. Wolfson A.D., Motorin Yu.A., Rlbklnska Т.А. and Beresten 3.F. Purification of namaallan tyrcsyl-tRNA synthetase by high-perforiaance liquid chromatography. J. Chron., 1990 , v.503 , p.277-260.

15. Ьартанян O.A., Маианов-Голиков A.B., Вольфсон А.Л., Захарова О.Д. , Лаврик О.И., Филоненко В.В., Берестень С.Ф. Быстрый метод выделения фенилаланил-тРНК-сиктетазы из млекопитающих и получение антител к этому ферменту. Мол. биология, 1990,

т.24, с.788-794.

16.- Fllonenko V.V., V/olfson A.D., Wartanyan O.A., beresten S.F. Monoclonal antibodies to the components of the high-molecular-nass aninoacyl-tRNA synthetase conplex. Blomed. Sc 1., ¡991, v.2, p.289-292.

17. Берестень С.Ф., Филоненко B.B., ФавороЕа 0.0. Кмнунохимическое изучение триптофанил-тРНК-синтетаз. (Обзор! Биохимия, 1991, т.56, N 7, с.1155-1169.

18. Beresten S.F., Jahn М. and Soll D. The role оГ modiried bases of E.coll tRNAGln In the stabilization of tRNA during the complexatlon with glutamlnyl-tRNA synthetase. The annual research report. Department of Molecular Biophysics anc Blochenlstry. Yale University. 1991, v.22, p.84.

19. Beresten S., Jahn M. and Soll D. Aainoacyl-tRNA synthetase-induced cleavage of tRNA. Nucl. Aside Bes.,1992, accepted.

Автор приносит благодарность В.Ш.Шейнкеру, О.О.Фаворовоя, В.В.Филоненко, Б.И.Рубикаяте, В.И.Попенко, в соавторстве с которы была получена основная часть результатов. Выражас глубокую признательность проф. Л.Л.Киселеву за постоянный интерес, поддерж и за полезные советы при написании данной диссертации.

Зак.ZiSqs tnP-JQO "ультуры

Информация о работе

Берестень, Сергей Федорович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы