Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и секвенирование кДНК , кодирующих тирозил-тРНК синтетазу млекопитающих

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и секвенирование кДНК , кодирующих тирозил-тРНК синтетазу млекопитающих"

РГ 6 од

■ -' НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

ЛЕВАНЕЦЬ Оксана Володимирівна

УДК 577.217.32

КЛОНУВАННЯ ТА СЕКВЕНУВАННЯ кДНК, ЩО КОДУЄ ТИРОЗИЛ-тРПК СИНТЕТАЗУ ССАВЦІВ

03.00.03 - молекулярна біологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук Корнелюк Олександр Іванович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник.

доктор біологічних наук Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник;

кандидат біологічних наук Живолуп Олександр Миколайович,

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

Провідна установа:

Київський університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист дисертації відбудеться 23 /І£Р€>М^І^ 1998 року о 10 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д26.237.01 в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розіслано 2-Ъ ПТ, 998 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Одним з ключових етапів процесу реалізації генетичної інформації є ферментативне аміноацилювання тРНК аміноацил-тРНК синтетазами (АРСази, КФ 6.1.1.) на дорибосомному етапі біосинтезу білка. Останнім часом було досягнуто значних успіхів у дослідженнях структур АРСаз прокаріот та нижчих еукаріот, в той час як АРСази вищих еукаріот вивчені набагато менше.

Слід відзначити, що аміноацил-тРНК синтетази з вищих еукаріот відрізняються більш складною структурою в порівнянні з прокаріотичними ферментами та мають додаткові домени на N- або С-кінцях поліпептидного ланцюга. Для АРСаз вищих еукаріот характерна тенденція до формування високомолекулярних комплексів, виявлена множинність молекулярних форм. Ці ферменти можуть виконувати неканонічні функції, наприклад, брати участь в сплайсингу РНК, асоціації з мРНК, синтезі Ар4А та контролі клітинної проліферації, патогенезах при аутоімунних та онкологічних захворюваннях та в деяких інших процесах. В той же час вивчення структурних основ функціонування аміноацил-тРНК синтетаз потребує знання первинної структури цих білків.

Тирозил-тРНК синтетаза (КФ 6.1.1.1) з печінки бика (Bos taurus) являє собою димер а2-типу з молекулярною масою 2x59 кДа. Крім основної форми фермента виділено та вивчено функціонально активну протеолітично модифіковану форму з масою 2x39 кДа. Не суттєве для каталітичної функції С-кінцеве подовження поліпептидного ланцюга вносить значний вклад в спорідненість тирозші-тРНК синтетази до високомолекулярних РНК (Курочкин и др., 1991). Проведено імунохімічне дослідження тирозил-тРНК синтетази з використанням моноклональних антитіл, вивчено структуру активного центру фермента методом селективних хімічних модифікацій. Але подальший структурно-функціональний аналіз еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази, зокрема детальне вивчення будови активного центру та його гомології з бактеріальними тирозил-тРНК синтетазами, виявлення механізму впізнавання гомологічної тРНК, функції некаталітичного домену та інше, суттєво обмежувався відсутністю даних по первинній структурі цього білка.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було клонування кДНК та визначення первинної структури тирозил-тРНК синтетази печінки бика. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1) клонувати кДНК, що кодує тирозил-тРНК синтетазу печінки бика;

2) визначити нуклеотидну послідовність клонованої кДНК та амінокислотну послідовність білка, який вона кодує;

3) провести аналіз гомологи амінокислотної послідовності тирозил-тРНК синтетази бика з послідовностями інших білків, в тому числі тирозил-тРНК синтетаз з інших організмів;

4) провести експресію тирозил-тРНК синтетази бика в бактеріальній системі та отримати рекомбінантний білок.

Наукова новизна отриманих результатів. В даній роботі вперше визначено нуклеотидну послідовність кДНК, що кодує тирозил-тРНК синтетазу бика, та виведено амінокислотну послідовність названого ферменту.

Показано, що тирозил-тРНК синтетаза з печінки бика має гомологію з тирозил-тРНК синтетазами еубактерій (Bacillus stearothermophilus та Escherichia coli - 16% ідентичності), архебактерій (Methanococcus jatmaschii - 37%), нижчих еукаріот (Pneumocystis carinii - 62%, Saccharomyces cerevisiae - 59%), мітохондрій (Neurospora crassa - 20%). Тирозил-тРНК синтетаза бика на 96% ідентична послідовністі відповідного білка людини.

Показано, що С-кінцевий некаталітичний домен тирозил-тРНК синтетази ссавців, який відсутній у інших тирозил-тРНК синтетаз, має гомологію з новим цитокіном ендотеліальним-моноцитактивуючим поліпептидом II людини (ЕМАР II), а також з некаталітичними доменами метіонил- та фенілаланіл-тРНК синтетаз та білком Агсір (кофактор аміноацил-тРНК синтетаз 1) дріжджів.

Отримано рекомбінантну тирозил-тРНК синтетазу, що відповідає формі 2x39 кДа, у бактеріальній системі експресії.

Практичне значення дослідження. Знання первинної структури тирозил-тРНК синтетази бика має значення з точки зору вивчення фундаментальних механізмів функціонування аміноацил-тРНК синтетаз в процесі біосинтезу білка у вищих еукаріот, а також дослідження можливих неканонічних функцій, зумовлених появою додаткових доменів в структурі еукаріотичних ферментів. Отримання тирозил-тРНК синтетази бика генноінженерним шляхом у бактеріальній системі експресії дає можливість подальшого вивчення цього ферменту методами білкової інженерії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках плану науково-дослідних робіт відділу структури і функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за темою “Структурно-функціональне дослідження еукаріотичних аміноацил-тРНК синтетаз І та II класів”.

з

Особистий внесок автора. Роботу виконано під керівництвом д.б.н.

О.І.Корнелюка у співробітництві з к.б.н. М.І.Вудмаскою, В.Г.Найдьоновим та К.О.Одинцем, з якими автор має спільні публікації. Особистий внесок автора полягає в плануванні та виконанні експериментів, аналізі отриманих результатів. Експериментальні дані, наведені в дисертації, отримано за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідалися на VII Українському біохімічному з'їзді та на наукових семінарах відділу структури і функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті та 1 тези.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що складається з методів та результатів дослідження, обговорення результатів та висновків. Роботу викладено на 139 стор. машинописного тексту, ілюстровано 20 рисунками та 2 таблицями. Список цитованої літератури містить 164 джерел.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Виділення сумарної РНК печінки бика проводили згідно (Chomczynski, Sacchi,

1987), виділення мРНК - за допомогою набору "mRNA Purification Kit” ("Pharmacia Biotech”, Швеція) згідно рекомендацій виробника. Синтез кДНК проводили за допомогою М-MLV зворотньої транскриптази за загальноприйнятою методикою (Sambrook et al., 1989). Отримання компетентних клітин Exoli XLl-Blue та їх трансформацію проводили згідно (Nishimura et аі.,1990), виділення плазмідної ДНК - згідно (Ish-Horowicz, Burke, 1981). ПЛР-ампліфікацію кДНК печінки бика проводили за загальноприйнятою методикою (Erlich, 1988). ДНК секвенували за допомогою набору "Sequenase Version 2.0 Sequencing Kit” ("USB", США) згідно рекомендацій виробника з використанням [32P]dCTP та [35S]dATP ("Amersham", Англія). Електрофорез, обробку та висушування денатуруючого поліакріламідного гелю виконували згідно інструкціям виробника на приладі Macrophor Sequencing System (“LKB”, Швеція). Радіоактивно мічений зонд методом ПЛР синтезували за методикою (Schowalter, Sommer, 1989). Скринінги кДНК-бібліотеки з використанням радіоактивного зонду, дот-гібридизацію, гібридизацію за Саузерном та Нозерн-гібридизацію РНК печінки бика проводили за стандартними методиками (Маниатнс и др., 1984) з використанням [32P]dATP ("Радиопрепарат”, Узбекистан), вищеплення послідовності плазмідної ДНК з фагової in vivo - як описано у (Short et al., 1988).

Для отримання повнорозмірної кДНК було проведено ампліфікацію З'-кінцевої послідовності кДНК за методикою (Ohara et al., 1989) з деякими модифікаціями. Синтез кДНК проводили з 1 мкг ро!у(А)4?НК печінки бика з використанням 10 пмоль праймера Oiigo(dT)-adaptor за допомогою M-MLV зворотньої транскриптази за стандартною методикою. Аліквоти одержаної кДНК використовували для двох послідовних раундів ПЛР з специфічними (+)-праймерами SK6 та SK8 відповідно та неспецифічним (-)-праймером Adaptor. Після обробки Pfu полімеразою згідно (Costa et al., 1994) продукти ампліфікації клонували в вектор pBluescript SK (+) по сайту EcoRV.

Клонування 5-кінцевої послідовності кДНК проводилося за допомогою методу інвертованої полімеразної ланцюгової реакції (Huang et al., 1990) з деякими модифікаціями. Зворотню транскрипцію мРНК печінки бика проводили з використанням специфічного праймера SK9 з 5 мкг poly(A)+PHK печінки бика за допомогою M-MLV зворотньої транскриптази. Синтез другого ланцюга кДНК проводили з використанням РНКази Н та ДНК-полімерази І, кінці дволанцюгової кДНК оброблялися ДНК-полімеразою Т4. Дволанцюгову кДНК було циркуляризовано за допомогою Т4 ДНК-лігази. Аліквоту отриманої кДНК було використано для проведення ПЛР з праймерами SK6 та РМ. Аліквоту реакційної суміші після першого раунду ПЛР ампліфікували з "nested''-праймерами SK8 та М15 Продукт другої ампліфікації було очищено в хода препаративного електрофорезу в агарозному гелі. Після цього фрагмент ДНК обробляли ДНК-полімеразою Pfu та клонували у вектор pBluescript SK (+) по сайту EcoRV. Аналіз нуклеотидних послідовностей отриманих клонів, виведення амінокислотних послідовностей та їх аналіз, вибір та аналіз праймерів для ПЛР проводили за допомогою пакету програм PC/Gene.

Аналіз отриманих нуклеотидних та амінокислотних послідовностей проводили також з використанням мережового сервера програми BLAST. Нуклеотидні послідовності кДНК перевіряли, співставляючи з базами даних нуклеотидних послідовностей: GenBank™, версія 79.0 таЕМВЬ, версія 36.0. Використовуючи програму BLASTP, амінокислотні послідовності порівнювали з базами даних білкових послідовностей: Swiss-Prot, версія 34,0 та PIR-NBRF, версія 38,0. .

Клонування кДНК, що кодує тирозил-тРНК синтетазу бика, у вектор pGEX-2T (“Pharmacia Biotech”, Швеція) проводили за стандартними методиками (Маниатис и др., 1984). Експресію рекомбінантної тирозил-тРНК синтетази (форма 39 кДа) проводили у векторі pGEX-2T в клітинах £ сой JM109 згідно (Smith, Johnson, 1988). Електрофорез білків в денатуруючих умовах проводили за методом Леммлі (Laemmli, 1970).

Імуноблотинг проводили згідно (Заргарова и др., 1985) з використанням “ECL Western Blotting Detection System” (“Amersham”, Англія).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика продукту ПЛР-ампліфікації сумарної кДНК печінки бика. В

ході попередніх структурних досліджень тирозил-тРНК синтетази печінки бика було визначено амінокислотні послідовності фрагментів BrCN-розщеплення як для основної форми ферменту (2 х 59 кДа), так і для протеолітично модифікованої (2 х 39 кДа) (Корнелюк О. І., неопубліковані дані). Порівняння отриманих амінокислотних послідовностей з первинною структурою цитоплазматичної тирозил-тРНК синтетази дріжджів (Chow, RajBhandary, 1993) показало, що три BrCN-пептиди є гомологічними ділянкам 61-86, 109140 та 218-254 дріжджової синтетази.

Для ампліфікації специфічної послідовності кДНК, яка кодує фрагмент тирозил-тРНК синтетази печінки бика, було обрано праймери Z2 (5'-AAGAGAAA CTGCACCTTAT-CACCCG-3') та PM (5'-GCCTGTTAATCCTGGAACCATAGG-3'). Послідовність праймеру РМ виведено на основі аналізу можливої нуклеотидної послідовності, що кодує BrCN-пептид тирозил-тРНК синтетази печінки бика, а праймер Z2 обрано як частину експресованої послідовності людини Z13627 (GenBank), гомологічної дріжджовій цитоплазматичній тирозил-тРНК синтетазі.

В результаті проведення ПЛР з використанням праймерів Z2 та РМ було синтезовано продукт, довжина якого складала приблизно 600 п.н. Продукт клонували у вектор pUC 119 та секвенували.

Аналіз виведеної амінокислотної послідовності показав, що внутрішні фрагменти MSKI...LDN та MLKS...YRL відповідають послідовностям пептидів BrCN-розщеплення В11/88 та В14/91 відповідно. Це дозволяє вважати, що ампліфікований кДНК-фрагмент дійсно кодує частину поліпептидного ланцюга тирозил-тРНК синтетази бика, а саме нуклеотидзв'язуючий домен - згортку Россмана.

Дану послідовність депоновано в GenBank за номером Х96373.

Скринінг кДНК-бібліотеки печінки бика проводили, використовуючи отриману послідовність як зонд. При синтезі радіоактивно міченого зонду в ході ПЛР включення ізотопу складало звичайно 50%. Виходячи з включення та питомої активності використаного препарату [32P]dATP, питома активність отриманого зонду складала приблизно 3,5х109 імп-хв'^мл'1. При первинному скринінгу кДНК-бібліотеки печінки бика з використанням

синтезованого зонду було отримано рад гібридизаційних сигналів. Всього було відібрано 28 зразків, що відповідали позитивним сигналам.

При наступному аналізі використовувалася виділена ДНК відібраних зразків. В дот-гібридизації найбільш сильний сигнал дав зразок 22. Для перевірки результатів дот-гібридизації було проведено гібридизацію за Саузерном з ДНК 11 відібраних зразків, розщепленою по сайту рестрикції ЕсоИ. Результати гібридизації за Саузерном показали, що позитивний сигнал дає рестрикційний фрагмент (=2200 п.н.) клону 22 (рис.1).

В ході другого скринінгу було отримано окремі клони, що давали позитивний сигнал. За загальноприйнятою методикою було проведено ще один скринінг виділених зразків, який показав, що клон 22 є гомогенним та дає сильний позитивний сигнал в гібридизації з зондом, специфічним до тирозил-тРНК синтетази ссавців.

Секвенування та аналіз послідовності плазміди nOL22. Фаговий вектор X ZAPII в своєму складі містить послідовність плазміди pBluescript SK (-), в полілінкер якої клоновано фрагмент кДНК. Ппазмідну ДНК можна вищепити з фагової in vivo за допомогою допоміжного одноланцюгового фага VCS М13. Оскільки маніпуляції з плазмідною ДНК методично значно простіші, з ДНК клону 22 було вищеплено послідовність рекомбінантної плазміди, яка отримала назву pOL22.

Методом секвенування за Сенгером визначено нуклеотидну послідовність кДНК-вставки клона pOL22, точний розмір якої складає 2897 п.н. Але її аналіз виявив, що до кДНК, яка кодує тирозил-тРНК синтетазу, відноситься лише 1032 п.н. Нуклеотидна послідовність на 135 п.н. перекривається з послідовністю просеквенованого раніше фрагмента кДНК Х96373, який кодує N-кінцевий нуклеотидзв'язуючий домен синтетази. Ідентифікація отриманої послідовності як С-кінцевої частини поліпептидного ланцюга тирозил-тРНК синтетази бика незалежно підтверджується відповідністю внутрішнього фрагмента MLL...PAG послідовності пептида BrCN-розщеплення В13/91, просеквенованого раніше (Корнелюк О. І., неопубліковані дані). Цей пептид було виділено з BrCN-розщеплення основної форми тирозил-тРНК синтетази (2x59 кДа), але він був відсутній у

Рис.1. Результат гібридизації за Саузерном ДНК зразків, які було відібрано після першого скринінгу кДНК-бібліотеки печінки бика, з радіоактивно міченим зондом Х96373. Було нанесено такі зразки: 1) контроль - 1 нг ДНК фрагменту Х96373 ; 2) зразок 23; 3) зразок 22; 4) зразок 21; 5) зразок 20; 6) зразок 18; 7) зразок 16; 8) зразок 14; 9) зразок 10; 10) зразок 7; 11) зразок 3; 12) зразок 1

протеолітично модифікованої форми фермента (2x39 кДа), тобто відносився до некаталітичного С-кінцевого домена синтетази.

Послідовність кДНК-вставки клону pOL22, що відносилася до тирозил-тРНК синтетази, не мала стоп-кодону, тобто не містила повну З'-кінцеву послідовність.

Продукт ампліфікації З'-кінцевої послідовності кДНК печінки бика (3'RACEI. Після синтеза кДНК з використанням праймера 01igo(dT)-adaptor (5-CTGGATCCGT CGACATCGAT(T)i5-3') 1/10 отриманого продукта було використано для проведення ПЛР із специфічним (+)-праймером SK6 (5'-CTTTGCTGATGAGGTTGT-3') та неспецифічним (-)-праймером Adaptor (5'-CAGGATCCGTCGACATCGAT-3'). Продукти першого раунду ПЛР не виявилися на агарозному гелі після окрашування бромистим етідієм, тому було проведено їх ампліфікацію з використанням іншого специфічного праймера, SK8 (5-AAGGAGGAACTGCAGGAC-3'), - "nested"-PCR. В ході другої реакції утворився ряд продуктів, з яких для подальшого аналізу було обрано продукт розміром приблизно 1150 п.н., який синтезувався в присутності обох праймерів. Оскільки послідовність синтезованого фрагмента була невідома, він клонувався у вектор pBluescript SK (+) по сайту EcoRV. Перед клонуванням продукт ПЛР було оброблено ДНК-полімеразою Pfu, оскільки використана в ПЛР Taq ДНК-полімераза має дезоксинуклеотидилтрансферазну активність та утворює продукти з одноланцюговими ганцями. Секвенування ДНК отриманих клонів показало, що послідовність продукту 3'RACE на 299 п.н. перекривалася з послідовністю клону pOL22. Отримана нуклеотидна послідовність мала в своєму складі термінаторний кодон TAG, тобто кодувала С-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази бика. Після стоп-кодону продукт 3'RACE містив З'-кінцеву область, що не транслюється.

5'-кінцева послідовність кДНК. Для клонування 5'-кінцевої послідовності кДНК, яка кодує тирозіи-тРНК синтетазу бика, обрано метод інвертованої полімеразної ланцюгової реакції, оскільки цей метод є чутливішим, а також простішим у виконанні, ніж альтернативний - 5rRACE. Оскільки метою даного етапу було клонування 5'-кінцевої послідовності кДНК, методику ШЛР було модифіковано: синтез кДНК проводився із специфічного праймера SK9 (5'-CTTCTACAGAAGCACACA-3'). Таким чином, вже на етапі зворотньої транскрипції було проведено відбір специфічних послідовностей та зменшено розмір синтезованої кДНК, що підвищувало ймовірність синтезу повної з 5'-кінця молекули.

Після синтезу другого ланцюга кДНК та добудови кінців було проведено цирку-ляризацію лінійних молекул. Денатурація кільцевих молекул відбувалася безпосередньо при проведенні ПЛР.

В результаті двох послідовних раундів ПЛР з праймерами РМ-5К6 та МІ5(5'-ТСТСТОАСС АС АОААОАОАСКЗС-З')-5К8 було отримано декілька продуктів. З них було обрано продукт розміром близько 620 п.н., який ампліфікувався лише в присутності обох праймерів. Цей фрагмент ДНК було очищено, оброблено ДНК-полімеразою Рій та клоновано у векторі рВІиезсгірІ БК (+) по сайту ЯсоКУ.

Визначена нуклеотидна послідовність отриманій клонів на 379 п.н. перекривалася з визначеною раніше послідовністю фрагменту Х96373. Аналіз виведеної амінокислотної послідовності показав, що визначений фрагмент кодує М-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази бика та містить стартовий кодон АТ&

Характеристика мРНК. що кодус тнпозил-тРНК сннтетазу бика, за результатами нозерн-гібридизаиії. Аналіз мРНК, що кодує тирозил-тРНК синтетазу печінки бика,

проведений методом нозерн-гібридизації, показав наявність єдиного транскрипту розміром близько 2400 п.н. (рис.2).

Рис.2. Нозерн-гібридизація ро1у(А)* РНК, специфічної до тирозил-тРНК синтетази з печінки бика. Рибосомальні РНК з печінки щура (1874 та 4784 п.н.) використані як маркери.

Повна нуклеотидна та виведена амінокислотна послідовності тирозил-тРНК сннтетази бика. Повна послідовність кДНК, що кодує тирозил-тРНК синтетазу печінки бика, складається з послідовностей чотирьох фрагментів, які частково перекриваються між собою. Нуклеотидна послідовність кДНК та виведена амінокислотна представлені на рис.З. Аналіз рамок трансляції показав, що лише одна з трьох можливих рамок є відкритою та кодує послідовність 528 амінокислотних залишків. Віднесення отриманої амінокислотної послідовності до тирозил-тРНК синтетази бика основано на порівнянні з послідовностями ВгСМ-пептидів. Розрахована за амінокислотним складом молекулярна маса поліпептидного ланцюга тирозил-тРНК синтетази печінки бика складає 59,121 кДа, що знаходиться у відповідності з попередньо опублікованою молекулярною масою субодиниці ферменту 59 кДа, визначеною методом гель-електрофорезу в денатуруючому ПААГ (Корнелюк и др.,

1988).

В розшифрованій амінокислотній послідовності тирозил-тРНК синтетази вищих еукаріот вперше знайдено унікальний варіант консервативного НЩН-подібного мотива, а

28в гШЧА , 4784 пі

18Б гША 1874 Ш

саме: НУАУ, в якому залишок гліцину, який раніше вважався абсолютно консервативним

для всіх АРСаз класу I (Moras, 1992), заміщений залишком аланіну.

GGTGCAACTG ATAAGCTGGA AGCCTGTGTG TCTGATGGGA CAGACTCCGG CCTGGGTGCC GGCTAACCGC TGGAGACTGC 80

AGCGACAGAG CCATGGGGGA CTCTCTGAGC CCTGAAGAGA AGCTAAGCCT TATCACCCGG AACCTGCAGG AGGTTCTCGG 160

MOD S L S PEE К X. S L I T R N L Q E A L G

GGAAGAGAAG CTGAAOQAGA TACTGAAGGA GCGAGAACTT AAAGTTTACT GGGGGACAGC AACTACAGGC AAGCCACATG 240

Е В К L К В I L X E R E L К V Y V G T A T T G К P H

TGGCTTACTT TGTGCCGATG TCTAAGATCG CAGACTTCCT GAAAGCAGGA TGTOAGGTAA COAITCTGTT TGCGGACC7G 320

V А Г Р V P M SKI A D F L К A G С В V T I L F A D L

GACGCATACC TGGATAACAT GAAGGCTCCO TGGGACGTTC TAGAACTTCG AACCA0C7AT TATGAGAATG TGATCAAGGC 400

ВАТ L D N M КАР W D V X. S L R T S Y Y 2 H VIKA

AATGCTGGAG AGCATTGGGG TCCCCTTAGA GAAGCTCAGG TTCATCAAAG GGACTGATTA CCAGCTCAGC AAAGAGTACA 460

Н L В S I 0 V P L В К L R F I К О T D Y О L S KEY

CGCTGGATGT CTACCGCCTC TCTTCTGTGG TCACACAGCA CGATGCCAAA AAAGCTGGAO CTGAGGTGGT AAAGCAGGTG 5*0

Т L D У Y R L S S V V T Q H DAK К A G A E V V К Q V

GAGCACCCTC TGCTGAGTGG CCTGCTGTAC CCCGGGCTGC AGGCCTTGGA TGAAGAATAC TTGAAAGTGG ATGCCCAGTT 640

ВНР L L S 0 L L Y P G L Q A L D E Z Y L К V D A Q F

TGGAGOTGTT GATCAGAGAA AGATTTTCAC CTTTGCAGAG AAGTACCTCC CTGCACTTGG TTACTCAAAA CGAATCCATC 720

a e v D Q R К I P T P A В К Y L PALO Y S X R I H

TGATGAATCC TATGGTTCCA GGATTAACTG GCAGCAAAAT GAGCTCTTCA GAAGAGGAGT CCAAGATTGA TCTGCTTGAT 800

L M N ? H V p G Ь T G S К H S S S EBB SKID L L D

CGGAAAGAGG ATGTAAAGAA AAAACTGAAG AAGGCCTTCT GTGAGCCAGG GAATGTGGAG AACAACGGCG TTCTGGCCTT 880

R К E D V К К К L К К A 7 С E P G N V E К H G V L A F

CATCAGACAT GTCCTCTTTC CTCTCAAGTC TGAGTTTGTG ATCCTTCOAG ATGAAAAATG GGGTGGAAAC AAAACCTACA 960

I ft H V L P P L К S В F V I L R D E К W a a h К T Y

CAGCTTACTT GGACCTGGAA AAGGACTTTG CTGATGAGGT TGTCCACCCT GGAGACCTCA AGAATTCTOT TGAAOTTGCC 1040

T A Y L D L Z К D F A D E V VHP О D L К N S V EVA

CTGAACAAGT TGCTGOATCC CATCCGGGAG AAGTTTAATA CTCCTGCTCT GAAGAAAgTG TCCAGCGCTG CCTACCCAGA 1120

L N К L L D P IRE К F N T P A L К К L S S A A Y P D

TCCCTCAAAG CAGAAGCCAG CTGTCAAAGG CCCTGCCAAG AATTCGGAGC CAGAGGAGGT CATCCCATCC CGGCTGGATA 1200

P s К Q К P a v к a P A К N S В P E В V IPS R L D

TCCGTGTGGG GAAAGTGATT AGTGTGGACA AGCACCCAGA TGCAGACAGC CTGTATGTGQ AOAAGATTGA TG7GGGGGAA 1280

I R V G К V I S V D К H P D ADS L Y V В К I D V G В

GCTGAGCCAC GGACTGTGGT OAGTGGCCTG GTGCAGTTTG TGCCCAAGGA GGAACTGCAG GACAGGCTGG TGGTGGTGCT 1Э60

A E P R T V V S G L V Q F V P К E I L Q D R L V V V L

GTGGAATCTG AAACCCCAGA AGATGAGAGG AGTCAAGTCC CAAGGCATGC TCCTGTGTGC TTCTGTAGAA GGGGTAAACC 1440

С N L К P Q К M R G V К s Q 9 M L L С A S V E G V H

GGAAOGTTOA GCCTCTAGAC CCTCCTGGAG GCTCTGCTCC TGGTGAGCGA GTGTTTGTGA AGGGCTATGA GAAGGGCCAA 1520

R К V В P L D P P A G S A P G E R V F V X G Y E К G Q

CCAGACGAAG AGCTGAAGCC CAAGAAGAAA GTCTTTGAGA AATTGCAGGC TGACTTTAAA ATTTCTGACG AGTACATTGC 1600

POX E L К P К К К VPS К L Q A D P К I S D В Y I A

ACAGTGGAAG CAAACCAACT TCATGACCAA GATGGGGTCC GTCT'CCTGTA AATCGCTGAA AGGGGGGAAC ATCAGCTAGC 1680

Q W К Q T N F M T К H G S V s с К S L К О G N IS*

CAACCTGGC3 GCTTCCTCCC TTCTCTCATC ATCCTCAGTC ATCTGCTCTC TCCTTAATTT GCTCCGTCCA TCACCTGCTT 1760

АТССАГСТСС CAGGACACTG AAGCAGGAC9 TTCAGGACTC TCTTAOACAC AAGACTTGGT GAGGGCAGCT CAGCCTCCTA 1840

GGATCCAGGA GCACCCTGTC TGCAGGGAGA GGCTGACCTG GGGAGTGATG AOGOCAGGGC AGCACAGGGA GTCCAGCCCT 1920

ACCTTCTTCC CTTGGCAGCT GATCTGACAA ATCTGGTTTC AATATAACAT AACTCAGAAA AAGTTTATGC CATAATCCTT 2000

CTAATTGGAA AAATATTGGT TTCCAGTTTT CCTAGCGTTA TCACGGCAGT CATGTCTCTO GCTGGGATCT GGTGCCTGAA 2080

CCGGGCTAAT TACAGCCTCT CCCCAACAGG AAACTGTGGG ATTTGAAAAG TGGAGGGAAG GGAAAACAGA GAACCTAGTO 2160

GTCTACCAAG TGGCTGGCAG CTTTCCCCCA GGATGCCAAC TCTGAGGCTT GGCGCTGGGG CAGGGCCTCC CCGGGGCTCC 2240

TGGAATGTCC TTTGATCATG CTAGGTGGGG ACAATCCCTG AACCAGCTGT GTGTTGTTGO ATGGCACAGA CTGGTTTTTT 2320

CCTCGGGGAG GGTGGAGTCA AT 2342

Рис. 3. Нуклеотидна послідовність кДНК, що кодує цитоплазматичну тирозил-тРНК синтетазу бика (В. іаигиі), та виведена амінокислотна послідовність. Визначені амінокислотні послідовності ВгСМ-пептидів підкреслено

Аналіз гомологи тирозил-тРНК синтетази бика та тнрозил-тРНК сиитетаз з інших організмів. Порівняння амінокислотної послідовності тирозил-тРНК синтетази бика з послідовностями інших відомих тирозил-тРНК синтетаз - баїсгеріальних, мітохондріальних та з нижчих еукаріот (дріжджів) - представлене на рис.4.

Тирозил-тРНК синтетаза бика на 96% ідентична послідовністі відповідного білка людини (Кіеешап й аі., 1997). Без врахування С-кінцевого домена, тирозил-тРНК синтетаза бика демонструє високий рівень гомології з іншими еукаріотичними тирозил-тРНК синтетазами: з Р. сагіпіі (62% ідентичності), 5. сегеуіїіае (59%) та з КісоЧапа іаЬасит (30%).

З послідовністю тирозил-тРНК синтетази з архебактерій М.]сата$сШ цей фермент має гомологію протягом усієї довжини поліпептидного ланцюга (37% ідентичності).

Згортка Россмаиа частиш І 'HIGH'

B.tmixve «bea.DAPSPtEKLHLITRKLgKALOrSKLKlILK. .IRZLKVYW3IATTCK.PHVAXTVPMSKIADIXXlGCXVTmADLHAIIiDNMK 84

H. вхрілпв «U3.CA2SPZ£KLKLZTSHLQZVLOESKLKCZbK. .ЕВЕІЛГХЮТЛТТОК. РНУА?ГУИ^КІАРГЦСАДСГУТІХ.Г&Г!ШХГияЯШС B4

О.т*1ллод*мі»х*1&. .GITPAXKKALXTWIIiQXTI*GDGin«TKILA. . WDLKIWeiXTTeK.PKVAYTVPKSKIAEFLraiOCtVTXIJTC3IJtX3CLDl«K 83

C.тілдлпc*... 9AVEEITEKTKXTRELILMIbQXSb6'/Dia.TKQLDIPGKVTHVYW01XII5K.HrVGYLVPMRKIMirbiyuSLKVTIL?M)blUXbDHMK 95

Р.алхілії ‘»«3FT3EIVNKKYE1ITRGLQIVL6AXRLRKILE. .IRDLXLYWOTSPICnt.PKCGYTVPKIiaADIXKAEVXVTIbrADIHXFbDffLK 85

З.слглтгімім* *MS5AATVDfNSAFGLITK2tWJ*VLNPQIIK)VLEV£KRJ!LKLYWGTAPTeR. PMCGYt’VFbfl'KLADFIJAGCKVTVLLXDLHAFXDHMK 88 М.ЗяпплмсЬІІ ‘MDEFE.4IKRHTSEII SiEELREVLXK. DEK.SAYIQtEPSGK. IKLGHYLQIKXMIDLQNASFDIHLIADLMAXLKQK. 76

N. tabaam J8AMSLXXKFKIVRSIGEXCIQXDELMNLIAK. KPQPVCrDOFEPSeR.MHIAQGVLKALNVNXb2lLaCKVJaWlJkDWFJU3bN»K2_140

ELI. TeFPTHV F AG I>

B.*t»*rotbr*. *MDLLAElQW»Gb2QTTDCDabRKLbjM. .EERVTLYCeFDPTADSLHIGHLATILTMRRTQQAeHRPIAbVGGATGLICDPS 80

K.colL *MASSKLIKQbQERGi|QVTD*EALA*RIiA. .QGPIALlCeFDPTADSLHLGKLVSLLCLKFJQQXeHKPVALVGGATGLIGDPS 83

a. fcjmra#

H. шаріла»

D.m*laaogamt*x

C. лілдапал

Р.СДГІПІІ

f.etnrUiM

U. j*nn*Mchl±

К.ЬлЬлсия

Вста&очннй пегттид

I I

»вигют.кт.ат8УУипгдмл.ит......«VPX«IArcXQTDYQbS|KEYTbDVYBbSSVVTQHn*X»eJkZWKgVEHFLI.|Se 163

AFWELLXLRVST«XilVIX»MLISI.....SVPLXXLKTIKaTOTALS | KnTUJVYK-SSWTQHDSiaCXCftZWKQVSHPLL ] S3 163

APWSLbCLRTKYYZgVIWkMLSSI......0VFLX2SiKXVKe5DYQLS | KXYTLDVYXLSSWTPmAKKAQAXWKSVKYPXX159 162

SSfVSLLKCRVIlOTtfVZmLL'' 116 |

APIDIVKYXAKTYXFIXXAILKSI......GVSTXKLKFVLGSSTQLS | S KTCKDN FRLCTrVTEKDAXXIUUZWKQVBNSLL I SO 164

JLPLEWNYRAKYYXL.TIXAn«RSI.....NVPIXXbKIWOSSYQbT | PDTI^I FOLSNIVSQNI1AKRAQXDVVKQVANPLL | 3<3 167

GELDEIRK1GDYNKKVFEAH..........OL.. .XAKYVYOSEFQE.D|KDYntNVXBLALKTTX.KRARRSKELIAREDXNPKV|AE 148

GDLKKIKWGQ7LIEIWIOLV..........eMMb*JVETLWSSKEINS| 3IYW?LVMDVARRNKLPRILRCCQIMGRS.»2DE3.| JQ 214

Y | R I

GKXSERTLNAKETVEAWSARIKEQLGRrLDFEADGNPAKIKNNTrDWICPLDVITFLRDVGKHFSVNYMMAKESVQSRIXTGISFTE Івв FKAAERKLNTEETVQEWVDKIRKQVAPFLDFDCGENSAlAANNyDWFGNMNVbTFLH0IGKHFSVNQMINKXAVlCQR4DQGISFTE 172

В. Ыигам

Н.ялрілпл

D.malanogamttr

P.СЛГІПІІ

S.c*r»vi*l»»

H.JinnAMChtL V. tabacim

Згортка Россиян* частика П Міждомекда петля

Tmsks' і

LLYPGLQALDSXYLICVtAOfeevr^aDrTrJUEKYLPAJ^YSKRIHLttnWPeLT. О. SKMSSSSUSEZSZXD ЩЕХРУИОДЛС 246 LLYPGLOALDSIYbKVOAQTeO ZDQftJCIfTFAXXXLMLeYSK&VHLMIiPtfVPGLT. O. SKMSSSXXESXXDLLD jSXZDVXXKLK 246

Xj.ypGLQALDEXYbKVCAQreOVDQIlXZrTrSXKXLPCLGYEjatXKFiarnfVPGtA. 0. GKMSSSEZDSEZDLLD] -------- 235

LLYPCSMOALDEEYbDSDAQrQeVDQBXZrmXKXLPKLeLKiailKUCnflPGbA. a. GntSASGNE2ICmiLD | DAETVKKXIN 248 LIYPLMQALDZQFbOVDCQrOTVDQftKIFVLUEENLPSLOTKX&AKXJOmCVTCLAQQ. GXMSASDPNSKZSLLE) EPKQVKXK1N 251

VtYf IMQVNDIHXbGVDVAVOOMEQXXXHML&RELL*_KXWCIHH?VLT6Z,0.GEGSUSSSICGN. FIAVDD|SPXEIRAXIX 227

IFXPCMQCADI FFLKADICQLe^DORKVNVIAREYCDDIRRKNKPI irKJOILPaLQEQQEIliSKSDPSSSIYMED | ЕЕАЕПТїЯЖІК 300

Y Q D L GO DQ OK D|

FSYMMbOXYDFLRLYE5LQieeSDQWGNITAGLELIRKTKGEAHAFGLTIPLVTKADe.TXFGiCrKSGT. .IWbDI .CTKTSPYEF 247 FSYNLLQGYDFACLNKSLQieeSOttWGNITSGIDLTRRLH.QNQVFGLTVPLITKADe.rKFGKTEGGA. .VWLD| . PKKTSPYKF 252

а-спіряльннй домен

В. tauru# ICAXCXPaHVXmroVbAriJIXVIJTLXSirVILSDXEWOatnCrYTAXLDLXTOTADXWHKDLXMSVXVaLHXLLDPIRXXr. KTIAL

к.варіюж KATCSPOKVIHIiGVI.SnKHVLrPLKSITVXLRDKBTOaNKmAT'v’DLUBrAAr'/VHPGDI^NSVIVMJIKLLDPiaXKT.HTPAI»

D .алІяяодалЬлх -----------------------------------------------------

P.CAxinlt KALCVLAAVmKGLLELAK2!V7f9VL6ALTIK’&£lJB*S<3PVSYNSirELX>KLEYVKRKL£PCjDLKXGISD£LVFXiLESlllLEXA£NKEF

«.MNViflj* SATCSPOTV*EWaLLSBrVQYVIAPIQSEl'FXDRPLXF(WPrrrXSFE£MKLATtC£iKLSPpnUCIGVAEAJ»ELLEPrRQEJ,AHNKSF

M.jaimAMchii XAYCPAQWXdfPIMEIAKYFIiEYP. . .LTIKBi'XRFaaCL.TVNSYEcXXSLI,KNKELXPMDLXHAVA£EI.IXILEPHlKRL*306aa

K.Ub*cim XArcpPKWXKWPCbEYIKYIVLPWFNXFKIbaSAENOADKrrKNFEELAADYESGNLKPAnbXPALSKAIXICILQPVUDHrKNDQiCA

F KY

8.<tMrotb«n. YQTW. .IMTDDRD7IRYLKYFTfl.SKEXIEALEQXLR£APEKRAAQKTlAEEVTKLVHGEEAbRGAIRISEALFSGDIANLTAAEIEQ

K.ooll YQFW.. INTADADVYRrLKFFTJMSIEIINAbEbXDKNSGKAPRAQYVLAEQVTRLVHCEEGXQAAKRITECLFSGSLSALSEADFEQ

333

338

МЬцдомснне з’єднання

С-кінцеве подовження В-домен

В. Ьжихчя XKLSSAAXPOPSXQXPAVKSSAXNSXnXVI | PSBLDZBVSKVlSV&iaiCDADSLYVKXIBVGE&URSWSeLVQrvrXXELQDBLV

Я. жлрілпш XKLASAAYPDPSXQKFMAWJUUOISEPXXVI | PSRLDIKVSKHrTEXHPDADSXYVXKrDVCTAIPRTWSaLVgrVPKKLQDRLV

Р.слгіміі QEILHLAJfPNEGKQSSQKK.-.SlTKNIKVNSN* 370»»

Я. сітлгійілл QEASEKGYPVATPQXSKKAKKPXHXGTKYPGATKTNEIATKLEETKL* 394u

V.Uuca KCLMKRVKSFKVTR* 408аж

B.stmarothmzm. GFKDVPSFVHEGGDVPLVELLVSAGISPSKRQAREDIQNGAIYVNGERLQDVGAILTAEHRLEGRFTVIRRGKKKYYLIRYA* 41Su

X.oolL LAQDGVPMVEWEKGADLMQALVDSELQPSRGQARKTIASNAITINGEKQSDPEYFFKEEDRLFGRFTLLRRGiCKNYCLICWK* 423a*

А-субдомен

I 'KPEEK'

B.tMumM VVZAaJCrOBafiUSVXaQASLLCASVEaVHIUCVEPLDPPAeUPeXItVrVKieYXXOQPOSXLRPKXinTSIXaADnCISOCYIAgWKQ 507

H. влрІФал WLCNUVQKlfRB7ESQaiLbCMIEGXiniQLKPLD7FAGSASeX}1VrVKiexXX0QPDKXLKPKRKVrZiagADn3SeECIAQKRQ 507

I

B.tzuros TlKTMZraeSSVSCKSLXOGnS* 52S«*

H.шлрілпм XimVTKLSSISCKSbKSGniS* 528u

Рис.4. Порівняння виведених амінокислотних послідовностей тирозил-тРНК синтетаз з B.taurus, H.sapiens, C.elegcms (ESTs D74722, D75774), P.carinii (gl584013), S.cerevisiae (P36421), M.jannaschii (Q57834), N.tabacum (gl841467), B.stearolhermophylus (P00952), E.coli (P00951). Використані символи: * - кінець послідовності; л - кінець фрагменту; | - межі доменів. Амінокислотні залишки ферменту бика, консервативні для інших організмів, виділено жирним шрифтом.

В той же час тирозил-тРІПС синтегаза бика має невисокий ступінь гомології з послідовностями відповідних бактеріальних ферментів, зокрема з B.stearothermophilus та Е.соїі (16% ідентичності), та з мітохондріальною тирозил-тРНК синтетазою з N. crassa (20%).

Вивчення тирозил-тРНК синтетази B.stearothermophilus з використанням методів рентгеноструктурного аналізу та білкової інженерії дозволило виявити окремі амінокислотні залишки, які відповідають за взаємодію ферменту з субстратами на різних етапах процесу аміноацилювання тРНК1^. Рентгеноструктурний аналіз комплексу бактеріальної тирозил-тРНК синтетази з тирозиладенілатом показав, що у взаємодію вступають такі амінокислотні залишки ферменту: Туг34, Asp38, Asp78, Tyrl69, Glnl73, Aspl76, Glyl92 та Aspl94 (Brick et al., 1988). З них всі, крім Asp38, є консервативними також для тирозил-тРНК синтетази бика. В той же час дослідження бактеріального ферменту за допомогою методів білкової інженерії показало, що такі амінокислотні залишки, як Cys35, Thr40, His45, His48, Thr51, Lys 82, Arg86, Lys230 та Lys233, хоча не взаємодіють безпосередньо з тирозиладенілатом, але є критичними для його формування на етапі стабілізації перехідного стану (Fersht et al., 1988). З них Thr40, His45, Lys 82 та Lys230 є консервативними для тирозил-тРНК синтетази бика (рис.5). Було показано (Fersht, 1987), що Tyr34, Cys35, Asp78, Tyrl69, Glnl73 та Aspl76 формують центр зв’язування тирозину, в той час як Thr40, His45, His48, Thr51, Lys82, Arg86, Lys230 та Lys233 утворюють зв’язок з рибозою ATP.

**+* * * * * * * * * *

Bst . .LY3«CGFDPTADSLHIGHLATI. .GD1ePSGKKSERT. . SY166MMLQAYDF. .

Bta . . VY3SWGTATTGKP-HVAY FVPM. . -Dn-NMKAP-----. . LY16ePGLQALDE. .

* * * *

Bst . .GGujSDQ. .TKjjoFGKT. .

Bta . . GGnsVDQ. . SK222MSSS. .

Рис. 5. Схематичне порівняння амінокислотних послідовностей тирозил-тРНК синтегаз з B.stearothermophilus (Bst) та бика (Bta) в ділянках, які є критичними для формування тирозиладенілату за даними рентгеноструктурного аналізу та білкової інженерії. Зірочками позначено амінокислотні залишки ферменту з B.stearothermophilus, що приймають участь у формуванні тирозиладенілату, жирним шрифтом виділено ті з них, які є консервативними також для тирозил-тРНК синтетази бика.

Таким чином, з 17 амінокислотних залишків, що є критичними для тирозил-тРНК синтетази з B.stearothermophilus на етапі активації тирозину, 11 є консервативними для ферменту бика. Це дозволяє припустити, що бактеріальна та еукаріотична тирозил-тРНК синтетази можуть мати подібні механізми активації амінокислоти.

Для тирозші-тРНК синтетази з B.stearothermophilus показано за допомогою реіптеноструктурного аналізу та білкової інженерії, що критичними для взаємодії ферменту з гомологічною тРНКТ)т є такі амінокислотні залишки: Arg207 та Lys208 відповідають за взаємодію синтетази з акцепторним стеблом тРНК, Arg368, Gln369, Ala370, Arg371, Arg407, Arg408, Lys 410 та Lys411 взаємодіють з антикодоном тРНК, а залишок Lysl51 утворює додатковий контакт з акцепторним стеблом на етапі утворення зв'язку між активованою амінокислотою та тРНК (Bedouelle, Winter, 1986). Аналіз гомології тирозил-тРНК синтетаз B.stearothermophilus та бика виявив, що для еукаріотичного ферменту з цих 11 амінокислотних залишків консервативним є лише Arg371.

Відсутність гомології в ділянках, критичних для взаємодії з тРНК, дозволяє припустити, що механізми впізнавання гомологічної тРНКт>г для еукаріотичного та про-каріотичного ферментів є різними. Це припущення добре узгоджується з фактом, що еукаріотичні тирозил-тРНК синтетази не аміноацилюють прокаріотичну тРНКТуг і навпаки.

Аналіз гомології С-кінцевого домену тирозил-тРНК синтетази бика з послідовностями інших білків. На основі аналізу гомології послідовності С-кінцевого домену тирозил-тРНК синтетази бика з іншими білками у його складі можна виділити В-домен (область 356-470) та А-субдомен (область 471-528). Гомологічні В-домену послідовності знайдено у прокаріотичних білків, в той час як А-субдомен мають лише еукаріотичні білки.

Порівняння амінокислотної послідовності С-кінцевого домену тирозил-тРНК синтетази бика з гомологічними послідовностями інших білків представлене на рис.6.

С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази печінки бика має гомологію з цитокіном людини, ЕМАР II (ідентичність 62,7% та для окремого В-домену - 51,9%). Також С-кінцевий домен демонструє гомологію з С-кінцевою областю метіонил-тРНК синтетази з нематоди С. elegans (62,7% та 52,9% відповідно) та з С-кінцевою частиною Агсір білка S.cerevisiae (55,3% та 44,8% відповідно), яку залучено до неспецифічного зв'язування тРНК та їх спрямування до активних центрів асоційованих з білком аміноацил-тРНК синтетаз.

Цитокін ЕМАР II являє з себе поліпептид, який активує ендотеліальні клітини та моноцити при хімічному канцерогенезі. Нещодавно було виявлено, що поліпептидом-попередником цього цитокіну є білок р43, - компонент високомолекулярного комплексу АРСаз (Quevillon et al., 1997).

Окремо В-домен має гомологію з некаталітичними С-кінцевими доменами бактеріальних метіонил-тРНК синтетаз (Е.соїі, 27,7%, та Th.thermophilus, 26,7 % ідентичності) та з некаталітичним доменом В2 Р-субодиниці бактеріальних фенілаланін-

тРНК синтетаз (E.coli, 26,7% ідентичності). Також В-домен демонструє гомологію з такими бактеріальними білками, як YGJH з E.coli (41,6%) та MG449 з М. pneumoniae (21,9%).

TyrRS

іугад

«МАРІЇ

КаШ

Агеїр

tfetRS

MetRS

YTWH

PbeRSp

Pb*Rsp

МЭ449

TytR5

TyrRS

BOPXX

item

Arelp

MatRJ

MatRS

YOJM

PbeRSp

PbeRip

MS449

B.taoru*

M. Npl«nf Н.йлрілпл

C. тітдялл

S ,е*г*г±віж* Ж.colt M.Jannaachlt t.coli Г. coll

T. tharmopbtl. И.раттопіат

B.tanxve H.MplMf H. aapimns

C. ліфджпя

t ,e»T9ViBt*4

t.coli.

H. )arma»chit

t.QOli

K.eolt

T. tb«xuophil. И. рптшоаі**

МІждоменне

сполучення

353 GPATOSIPtrVIP 35 3 GTAKHSZPUVXP

140 SIAGSADSKPIDV 74S OAAAAPVDDTIDV 194 QEOOHKAPZKPKP 563 DDFIQETITFDDF 539 OOEKMEQIDISYL 1 METVAYADF 28 AJLEVDGVKPVAG

2 9 LGFETDRIERVTP 92 ISELLNYCLTPLA

Я-домен * * t

SRLDZRVQKV7SVDXX9DADSLYVZOtlVSXIkZPRrVVSaLVQlV?mLQDIILWVb(3rLlC?QlM

SRLDZIiV<3KIITVEXKFDASSLY7XKirrveKAKPftTWSeLVQrVPKXSLQ09LVWLaiLKPOn<

SRlDLRIOCIITARKBPnADSLrTXEVDVCTlIArMVVSaLV'JHVPtbQMQKll.'-IVlLbQILKPAJKM GRbDMKTORI XKCEKSIFQADALYVXQIDVeSSAfRCTVSSLVRHVFLDQMQNRLVWXiCMLKPAm SAIDFHVeFIQKAIIOIK5ADSbTVSTIDVODE2PRTVC8aLVKHFPLOAMQERirVVWQILKPVm AKVDLKVALIENAEFVEGSI>KLLRI.TLDL<*3ER.JU»VFS6IRSAY2PqAI,IGllH?IMVA]*LAPRiaf EKIOLSVOEWEAEOIPKSKKX»LKLMVDLODEK.»2rvSeiKGYYKPIDbVGKKVIVIQILKPAJa ARLEMRVOXIVEVKRKENADKLTIVQVDVOQKT. LQTVTSLVPYYSEIIXMGKTWVLCHLQKAKM 5FHGVWe£WECAQHPNADK3^R7TFVNV9GDRLLDrVCQAPN5PVAVTTrGAVLPGDFKIICBAK[» IPRGWFAKVLEA. HPIPGTPXICRIVIDAGRT. .VEWSOAEN7GVALAXPGTELPG2QKVGERVI KKVPFWCSVISA. IPIPNTKLK?.CKVNTeSNKSLDWCeADN'v,RVGL5KVGGVLPDGTIIBDCAJCI

431 RovKsgaiLLCMvxovraKVEPbDPPAOixpenvr 431 ROVESQ®ttiCllSIEeiHRQVEPlDPPAGSAPGSHVr 219 R9VLSQAMVMCAJSPE. . .KItlZAPPNOSVPODRIT 823 RSVESRAKVNCWSPD. . .KVXIMEVPXDSKPeTPW 272 MIKSTAMVLCGSNDD. . .KVXFVEPPKDSKAODKVT 640 RFGI8EGMVMAAGPGOK. . DIFLbSPDXOAKPSHCVK' 616 COVLSEGMILAXEDOSG. .NVSLiTVDKDIKAQSKVR '5 RflETSEC»bCKETODG,SESVU.TPERMMPA«V»VV' 106 RaEPSECKbCSFSELeirDHSGIIEIPADVRIOTDIR 103 C?eVRSFOIALSPRELev2YGGGIX£FPEDAL2aTPLS; 1 б ч AOYDSMOKLCSEKELNL2KNQGII ElKSHIKiCKS il I

Л-субдомт

VKanKOQPDKZXJCPKKK^rKXLQIkDnaSDCyZXaKKQTMr

VKCnrEROQPDBZLKPKiaCVnXLQADrKXSEKCXAaMKQTKr

FDAFP.a£POKlbNPKiaCIKXQIQPDLHT.‘®*CVXTYKGVPr

С P PTT. KP^nrCLMPKMCI KIT VAECLKVS axg fatwkgq p l

FEaFGDEAPMKQUJPKKKXV.XbXQPFrTTNDGLEVIFICE22

б^баа

651ал

ПОзі

EYLKLDCMTIEISVTPKRADCLG 171/795аа EA.WPEEWLDLEVTPNRPDALG 169/7G5aa DVYLNNSEKFSAWVSTKKRVTGN* 234aa

TyxRi B.tauxue 509 MTKMOSVSC.KSLJCaaHIS* *2Sdi

TyrRS Н.яжрілп* 509 VTKLeSISC.KSIJaXMIS* 528аа

XMXPXX H.0врі»п» 243 EVKCKGVCRAQTMSNSGJK* 312аа

tfelftS 099 LIGSESKMTAPTLReVHVK* 917аа

Arolp Я.аттшгівілл 359 NAKCESFKVA.SIANAQVR* З^баа

Рис.6 Порівняння амінокислотних послідовностей білків, гомологічних з С-кінцевим розширенням тирозил-тРНК синтетази печінки бика. Скорочення: TyrRS - тирозил-тРНК синтетази £. taurus та Н. sapiens; ЕМАР II - ендотеліальний-моноцитактивуючий поліпептид П Н. sapiens (gl370034); MetRS - метіонил-тРНК синтетази С. elegans (gl370034), E. coli (Р00959)таМ jannaschii (Q58659); Arclp - кофактор аміноацил-тРНК синтетаз 1 S. cerevisiae (P46672); YGJH - гіпотетичний білок E. coli (P42589); MG449 - гомолог білка Y449 M. pneumoniae (P75128); PheRSb - 3-субодиниці фенілаланіл-тРНК синтетаз Е. coli (Р07395) та 77/. thermophilus (Р27002). Показано розташування В-домену та А-субдомену.

У попередніх структурних дослідженнях тирозил-тРНК синтетази бика було показано, що С-кінцевий некаталітичний поліпептид відповідає за спорідненість білка до високомолекулярних РНК (Курочкин и др., 1991). Існує припущення про можливу нуклеотидну специфічність зв'язування РНК цим доменом: найбільший ефект інгібування активності тирозил-тРНК синтетази в реакції аміноацилювання тРНК мав полірибонуклеотид ро1у(С). В зв'язку з цим слід відзначити існування кластера заряджених залишків лізину КРККК в А-субдомені С-кінцевого домену фермента. Цей кластер може виконувати функцію зв'язування РНК, оскільки для інших РНК-зв'язуючих білків показано, що послідовності заряджених залишків лізину приймають участь у білково-нуклеїнових взаємодіях (РаШак еі аі., 1988). До того ж інший еукаріотичний фермент, валіл-тРНК синтетаза дріжджів, також має в своїй структурі подібний лізин-збагачений мотив

K465KPKKKK, який знаходиться у N-кінцевому некаталітичному домені та має поліаніонзв'язуючі властивості (Mirande, 1991).

Ще одним фактом, який свідчить про можливу участь С-кінцевого домену тирозил-тРНК синтетази бика у неспецифічному зв'язуванні РНК, є наявність досить високої гомології (55,3% ідентичності) з Агсір білком дріжджів, функцією якого є неспецифічна асоціація з тРНК та наступне спрямування тРНК до активного центру аміноацил-тРНК синтетаз (Simos et al., 1996).

Тирозил-тРНК синтетаза в пострибосомальному супернатанті печінки бика приймає участь у формуванні лабільного високомолекулярного комплексу масою 220-240 кДа (Гнатенко и др., 1991). Інші компоненти комплексу не ідентифіковано в зв'язку з високою лабільністю останнього, але встановлено, що асоціація не впливає на каталітичні константи реакції аміноацшповання тРНКТуг. Це може свідчити про можливу участь С-кінцевого некаталітичного домену тирозил-тРНК синтетази у процесі специфічної білок-білкової взаємодії in vivo. Непрямим підтвердженням такого припущення може служити гомологія названого домену з некаталітичним доменом бактеріальної метіоніл-тРНК синтетази, який бере участь в димеризації ферменту (Cassio, Waller, 1971).

Аналіз амінокислотної послідовності тирозил-тРНК синтетази з печінки бика дозволяє визначити потенційний сайт розщеплення ферменту внутрішньоклітинними протеазами з утворенням форми 2x39 кДа. С-домен тирозил-тРНК синтетази з'єднаний з каталітичним ядром ферменту пептидною ділянкою 340-365. В цій ділянці потенційним сайтом протеолітичного розщеплення може бути ПОСЛІДОВНІСТЬ S358EPE. Ця послідовність є PEST-подібною амінокислотною послідовністю (Rogers et al., 1986), які, як відомо, можуть бути первинними сайтами для протеолітичної атаки внутрішньоклітинними протеазами ряду білків, включаючи аміноацил-тРНК синтетази ссавців (Jacobo-Molina et al., 1988). Припущення про те, що послідовність SEPE може бути сайтом протеолітичного розщеплення в тирозил-тРНК синтетазі бика в ході ендогенного обмеженого протеолізу, потребує експериментального підтвердження. При цьому цікаво відзначити, що цей потенційний сайт розщеплення в тирозил-тРНК синтетазі практично збігається з аналогічним сайтом при утворенні цитокіну ЕМАР П з його попередника: N-кінцевий залишок Du в ЕМАР П відповідає Е359 в тирозил-тРНК синтетазі (рис.6).

Субклонування фрагмента ДНК. що кодує модифіковану Форму тнрозил-тРНК синтетази (2x39 кДа). в векторі PGEX-2T. Як вже відзначалося вище, тирозил-тРНК синтетаза з печінки бика виділяється у вигляді як повнорозмірного білка з молекулярною масою 2x59 кДа, так і протеолітично модифікованої форми 2x39 кДа, яка має близькі до

основної форми каталітичні характеристики в реакціях аміноацилювання тРНКТуг та АТР-пірофосфатного обміну. Тому для досліджень функціонування еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази в реакції аміноацилювання гомологічної тРНКІуг достатньо забезпечити високоефективну експресію в клітинах Е.соїі білка, який відповідає протеолітично модифікованій формі 2x39 кДа.

Фрагмент ДНК, який кодує модифіковану форму тирозил-тРНК синтетази бика, збирався з продукту ІПЛР, що кодує N-кінцеву частину тирозил-тРНК синтетази, фрагмента, що кодує нуклеотидзв'язуючий домен ферменту, Х96373, та фрагмента клону pOL22. З продукту ІПЛР було вищеплено фрагмент 268 п.н. по сайтам рестрикції Ncol - Xbal, після розщеплення по сайту Ncol ДНК було оброблено ДНК-полімеразою Т4 для отримання "тупих" кінців. З фрагмента Х96373 було вищеплено послідовність 245 п.н. по сайтам Xbal -Styl. З клону pOL22 вищеплено фрагмент 536 п.н. по сайтам Styl - PvuII. Ці три послідовності було клоновано у вектор pGEX-2T по сайту Smal.

Експресія рекомбінантяого білка. Експресію гібридного білка GST-TyrRS спочатку проводили при температурі 37°С. В бактеріальних клітинах, що містять плазміду pGYRS40, при індукції культури ізопропіл-З-В-тіогалактопіранозидом (IPTG), специфічно синтезується поліпептид, який мігрує приблизно в зоні 67 кДа за маркером, що збігається з потенційною молекулярною масою гібридного білка глютатіон-Б-трансфераза (GST)-TyrRS (26 кДа GST та 39 кДа тирозил-тРНК синтетаза) (рис.7).

Рис.7. Електрофоретичне розділення в денатуруючому ПААГ (А) та імуноблотинг з моноклональними антитілами Т3 проти тирозил-тРНК синтетази бика (Б) сумарних лізатів клітин Е.соІі, в яких проводилася експресія рекомбінантної тирозил-тРНК синтетази при 37°С. 1 - нативна тирозил-тРНК синтетаза печінки бика (форма 39 кДа); 2 - лізат клітин, в яких було експресовано рекомбінантну тирозил-тРНК синтетазу (39 кДа) - нерозчинна фракція;

З - те ж саме - розчинна фракція; 4 -контроль - лізат клітин, в яких було експресовано глютатіон-Б-трансферазу.

Але виявилося, що при температурі інкубації клітин 37°С білок, який в них експресується, знаходиться у складі нерозчинної фракції. При зниженні температури інкубації до 18-20°С тирозил-тРНК синтетаза, яка експресується в бактеріальних клітинах, частково переходить до розчинної фракції.

А в

12 3 4 12 3 4

= g

-

Щоб ідентифікувати білок, який експресується в клітинах, що містять плазміду рСУНЗДО, було проведено імуноблотинг білків сумарного клітинного лізату з моно-клональними антитілами проти тирозил-тРНК синтетази, виділеної з печінки бика (Рибкинска и др., 1991). Результати імуноблотингу (рис.7) показали, що антитіла специфічно зв'язуються лише з одним з білків лізату клітин, які містять плазміду рСУР.840, причому молекулярна маса білка відповідає потенційному білку ОБТ-Туг!^. Це дозволяє вважати, що білок, який специфічно експресується в бактеріальних клітинах, що містять плазміду рОУИ^О, при індукції ІРТО, є гібридним білком СБТ-ТутЯЗ.

ВИСНОВКИ

1. Вперше визначено первинну структуру кДНК, що кодує тирозил-тРНК синтетазу бика, та виведено і проаналізовано амінокислотну послідовність цього ферменту.

2. В амінокислотній послідовності тирозил-тРНК синтетази вищих еукаріот вперше знайдено унікальний варіант консервативного НЮН-подібного мотива, НУАУ, в якому залишок гліцину, який раніше вважався абсолютно консервативним для всіх АРСаз класу І, заміщений залишком аланіну.

3. Проведено аналіз гомології амінокислотної послідовності тирозил-тРНК синтетази бика з тирозил-тРНК синтетазами з інших організмів: еубактерій (В.ьіеагоікегторкіїиз, Ехоїі), архебактерій (М/дашяс/ш), нижчих еукаріот (Я.сеге\>І5Іаг) та еукаріот (Р.сагіпіі, ЫЛаЬасит, С.еіе^ат, Н.ьаріепх), а також з мітохондріальною тирозил-тРНК синтетазою /Лстшісг. Виявлено, що тирозил-тРНК синтетаза бика має низький рівень гомології з бактеріальними ферментами - 16% ідентичності, а найвищий - з ферментом людини - 96%. Всі відомі тирозил-тРНК синтетази мають гомологію переважно в області згортки Россмана та а-спірального домену.

4. Вперше виявлено, що С-кінцевий домен тирозил-тРНК синтетази бика має гомологію з рядом еукаріотичних та прокаріотичних білків: цитокіном людини ЕМАР II, С-кінцевою областю метіонил-тРНК синтетази С.е/е^а/г?, С-кінцевою частиною Агсір білка Я.сегешіае, некаталітичними С-кінцевими доменами бактеріальних метіонил-тРНК синтетаз, р-субодиницею бактеріальних фенілаланіл-тРНК синтетаз, білками УвШ Е.соІі та \1G449 М.рпеитопіае та М.%епіІаІіит.

5. Виявлено, що з 17 амінокислотних залишків, що для тирозил-тРНК синтетази з В.^ІгагоЛіегторкіІиз за даними рентгеноструктурного аналізу та білкової інженерії є критичними для формування тирозиладенілату, 11 є консервативними для тирозил-тРНК синтетази бика, в той час як з 11 амінокислотних залишків, що є критичними для взаємодії

[іктеріального ферменту з гомологічною тРНКт>\ тільки 1 є консервативним для фермента ика.

6. Рекомбінантну тирозил-тРНК синтетазу, що відповідає модифікованій формі 2x39 Ца, експресовано в бактеріальній системі. Продукт експресії ідентифіковано методом <уноблотингу з моноклональними антитілами мкАт Тз, одержаними проти тирозил-тРНК ніггетази з печінки бика.

ПРЕШК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Леванец О.В., Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Одынец К.А., Мацука Г.Х., [орнелюк А.И. ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента кДНК, одирующего нуклеотидсвязьшающий домен тирозил-тРНК сиитетазы млекопитающих // иополимеры и клетка. - 1996. - Т. 12, №5. - С.бб-70.

2. Леванец О.В., Найденов В.Г., Вудмаска М.И., Манука Г.Х., Корнелюк А.И. локирование кДНК, кодирующей С-концевую часть тирозил-тРНК синтетазы лекопитающих, с использованием ПЦР-амплифицированного радиоактивно меченого ібридизационнош зонда // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т.13, №2. - С.121-126.

3. Леванец О.В., Найденов В.Г., Одынец К.А., Вудмаска М.И., Мацука Г.Х., орнелюк А.И. Гомология С-концевого некаталитического домена тирозил-тРНК синтетазы пекопитающих с ЕМАР П цитокином и некаталитическими доменами метионил- и енилаланил-тРНК синтетаз // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, №б. - С.474-478.

4. Леванець О.В., Найдьонов В.Г., Вудмаска М.І., Одинець К.О., Мацука Г.Х., орнелюк О.І., Вінтьес Ф.-Й., Гассен Г.Г. Клонувания та секвенування кДНК, що кодує ірозил-тРНК синтетазу ссавців И Тези доповідей VI Українського біохімічного з’їзду, Київ, 397. - С.28-29.

Леванець О.В. Клонувакня та секвенування кДІІК, що кодує тирозил-тРНК гатетазу ссавців. — Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної ології і генетики НАН України, Київ, 1998.

Визначена первинна структура тирозил-тРНК синтетази бика шляхом хлонування та жвенування відповідної кДНК і проведений аналіз амінокислотної послідовності фермента.

Показано, що тирозил-тРНК синтетаза з печінки бика має низький рівень гомології бактеріальними тирозил-тРНК синтетазами. Тирозил-тРНК синтетаза бика на 96% ідентична зслідовності відповідного білка людини. Показано, що С-кінцевий некаталітичний домен ірозил-тРНК синтетази ссавців має гомологію з новим цитокіном - ендотеліальним-зноцитактивуючим поліпептидом П (ЕМАР П), некаталітичними доменами метиоігал- і енілаланіл-тРНК синтетаз і білком Агсір (кофактор аміноацил-тРНК синтетаз 1) дріжджів, становлено, що з 17 амінокислотних залишків, що є для тирозил-тРНК синтетази з В. еагоЛегторМІш за даними рентгеноструктурного аналіза та білкової інженерії критичними [Я формування тирозиладенілата, 11 є консервативними для тирозил-тРНК синтетази бика, в

той час ж з 11 амінокислотних залишків, що е критичними для взаємодії бактеріальної фермента з гомологічною тРНКТуг, тільки 1 е консервативним для білка бика. Отримав рекомбінантна тирозил-тРНК синтетаза, відповідна формі 2x39 кДа, в бактеріальній систеї експресії.

Ключові слова: тирозил-тРНК синтетаза, кДНК, первинна структура, гомологія.

Леванец О.В. Клонирование и секвенирование кДІІК, кодирующей тирозил-тРН сшггетазу млекопитающих. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидат биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. Инстаг молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

Определена первичная структура тирозил-тРНК синтетазы быка путем клонироваш и секвенирования соответствующей кДНК и проведен анализ аминокислотнс последовательности фермента.

Показано, что тирозил-тРНК синтетаза из печени быка имеет низкий уровеї гомологии с бактериальными тирозил-тРНК синтетазами. Тирозил-тРНК синтстаза быка і 96% идентична последовательности соответствующего белка человека. Показано, что ( концевой некаталитический домен тирозил-тРНК синтетазы млекопитающих имеет гомологи с новым цитокином - эндотелиальным-моноцитактивирующим полипептидом Н (ЕМАР D некатапитическими доменами метионил- и фенилаланил-тРНК синтетаз и белком Arc] (кофактор аминоацил-тРНК синтетаз 1) дрожжей. Установлено, что из 17 аминокислотнь остатков, являющихся для тирозил-тРНК синтетазы из В. stearothermophilus по даны рентгеноструктурного анализа и белковой инженерии критическими для формирован! тирозиладснилата, 11 являются консервативными для тирозил-тРНК синтетазы быка, в і время как из 11 аминокислотных остатков, являющихся критическими для взаимодсйстві бактериального фермента с гомологической тРНКТуг, только 1 является консервативным да белка быка. Получена рекомбинантная тирозил-тРНК синтетаза, соответствующая форме 2х^ кДа, в бактереальной системе экспрссии.

Ключевые слова: тирозил-тРНК синтетаза, кДНК, первичная структура, гомология

Levanets O.V. Cloning and sequencing of cDNA encoding mammalian tyrosil-tRN synthetase. - Manuscript. Thesis for degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Biology, speciali

03.00.03 - Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy i Sciences of Ukraine, Kiev, 1998.

Primary structure of bovine tyrosyl-tRNA synthetase has been determined by cloning ai sequencing of respective cDNA and amino acid sequence has been analysed.

Tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) of bovine liver shares low level of amino ac sequence homology with bacterial tyrosyl-tRNA synthetases. Bovine TyrRS is 96% identical to tl human TyrRS sequence. It has been shown that C-terminal non-catalytic domain of bovine ТугБ reveals amino acid sequence homology with a novel cytokine - endothelial monocyte-activatii polypeptide П (ЕМАР II), with non-catalytic C-terminal domains of methionyl- and phenylalanj

NA synthetases and with yeast Arclp (aminoacyl-tRNA synthetase cofactor 1) protein. Eleven of e seventeen amino acids involved in tyrosyl adenilate formation in the B. stearothermophilus rosyl-tRNA synthetase by x-ray crystallography and site-directed mutagenesis data are conserved the bovine enzyme, whereas only one of the eleven amino acids known to be involved in INA1^ recognition is conserved between the the bovine and B. stearothermophilus enzymes, ecombinant tyrosyl-tRNA synthetase has been expressed in E. coli cells.

Key words: tyrosyl-tRNA synthetase, cDNA, primary structure, homology.