Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное исследование эукариотической тирозил-тРНК синтетазы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование эукариотической тирозил-тРНК синтетазы"

НАЦШНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ М0ЛЕКУЛЯРН01 Б10Л0Г11* I ГЕНЕТИКИ

; од

. фг .п 13с;5 На правах рукопису

УДК 577.1Б2.611

КОРНЕЛОК Олександр 1ванович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦ ЮНАЛЬНЕ ДОСЛ1ДЖЕННЯ ЕУКАРЮТИЧНОК ТИРОЗИЛ-ТРНК ОШТЕТАЗИ

03.00.03 - Молекулярна ОЮлоПя

Автореферат дисертацП на здобуття наукового ступеня доктора б!одог1чиих наук

Ки1в - 1995

Дисертшцею в рукопис.

Робота виконана у в!дд1л1 структури i функц1й нукле'1 новях кислот 1нетитутУ молекулярно! öioaorii i генетики HAH Укра1ни.

0ф1ц1йн1 опоненти:

доктор 61олог1чних наук, професор Р.П.Виноградова доктор бюлогхчних наук, професор Е.А.Бурштейн доктор 61олог1чних наук, член Нью-ЙоркськоЗ академН наук Е.А.Козлов

Пров1дна установа: 1нститут öioxiMii HAH УкраЗни

Захист в!дбудеться " 2.7 " иютого iggs року о 10 годин! на зае!данн1 слец1ал1аовано1 вченоК ради Д 016.11.01 з захисту докюрських дисертац1й в 1нститут1 молекулярной б!одогП 1 генетики HAH Укра'1ни ва адресою:

252627, М.КИ1В-143, вул. акад.3аболотного,150.

3 дисертац1ею ыохна ознайомитися у 01бл1отец1 ¡нституту молекулярно! б!олог11 1 генетики НАН УкраТни

. Автореферат роз!слано " 9J* " с^ьнм 1995 року

Вчений секретар спец1ал1аовано1 вчено! ради,

Л.Л.Лукаш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актулыисть проблеии.

Одним з ключових етап!в процесу реал1зац11 генетично"! 1нформацП б ферментативке ам1ноацилгавання тРНК ам1ноа-цил-тРНК сиктетазами (АРСази, К® 6-1.1.) на дориОосомному етаги бЮскнтезу б1лка. При вп1знаванн1 ам1ноацил-т,РНК сик-тетазами гомолог1чних тРНК реал1зуеться один з най01лып ви-сокоспециф1чккх проп,5с1з С1лково-пукле! нового вп!вназання. Для вияснення молекулярных механ1ам1в спецкф1чного ам1ноаци-лювання тРКК иеобх1дие детальне вивчекня структурно-функц!о-калько'1 орган1зацН АРСаз. Сстанн1м часом були дослгнут1 ус-п!хи в доил!дженн1 структура АРСаз , в основному ,для синте-таз з прокзр1от1в та нижчих еукар1от!в.

Ам1ноацил-тРНК синтетази з вищих эукар!от1в вивчен! на-багато ыэкшэ . Сл1д в!дзначити, що АРСази з вищих еукар1от з!др1зкяються б1льш складной структурою в пор1вняш;1 з лро-кар1отичниш АРСаз а},'.и. Це зумовлено ускладненням геному та виникненшм дифереиц!ацП у багатокл 1тинних орган!змов, що потребуе б1льшого удосконалення апарату 01осинтезу балка та його регуляцП. Для АРСаз вищих еукзр1от1в характерна тен-денц1я до формування високоыолекулярних комплексов, .а такох виявлена множиннЮть молекулярних форм, структуры 1 основи яко! вивчен1 щэ недостатньо. Важлнво в!дзначити, що АРСази еукар!от1в можуть виконувати також некакон1чн! функцП, нап-риклад, лрюшати участь в сплайсингу РКК, асоц1ац11 э мРНК , регуляцП б1осинтезу ам1нокислот, синтез! Ар<А та контрол1 кл1тинно1 прол1ферацП, патогенезах при ауто!мунних захворю-ваннях та в 1неих процесах.

Важливу роль в механ1эм1 функц!онування АРСаэ в!д1грзють взаемн! конформащ шп зм1ни синтетази 1 тРНК в процесх Зх вп!знавання . Зг1дно з'сучасними уявленнями функц1онаяьн1 властивост1 ферментов можуть Сути адекватно описан! з точки зору 1х динашки в розчин1. Отже, для побудови молекулярного механ!зму функц!онування АРСаэ необх!дне вивчення Их дина-м!чних влаотивостей у розчин! в нативних уыовах.

Мета та аавдання досл1джень. Метою роботи було проведения детального структурно-функц!онального досл1дження тиро-эил-тРНК синтетази (КФ 6.1.1.1) вищих еукар1от!в. В1дпов1дно до поставлено! мети Сули сформульован! так1 задач!:

1.Розробити методики вид!лення та провести досл1дження ф!зико-х1м1чних властизостей тирозил-тРНК синтетази з печ!н-ки бика.

2.Вивчити ыожлив1сть асоц1ацИ тирозил-тРНК синтетази з печ!нки бика в високомолекулярний комплекс.

3.Провести 1мунох1м1чяе дослАдження тирозил-тРНК синтетази з використанняы моно- та пол1клональних антит1л,

4.Досл1дити роль електростатичних вэавмод1й в комплексо-утворенн! м!ж еукар1отичною тирозил-тРНК синтетазою та гомолог 1чною тРНКТуг.

5.Вивчити будову активного центру тирозил-тРНК синтетази та вотановити функц!ональну роль окремих ам1нокиолотних за-

лкшк1в.

6. Провести досл!дження характеристик власно'1 флуорео-ценцП тирозил-тРНК синтетази в розчин! та вивчити внут-р1тньомолекулярну динэм1ку синтетази .

7. Вивчити конфарыац1йн! зм!ни структури тироэил-тРНК синтетази при взаемодИ э низькомолекулярними субстратами :

ATP та L-тирозиком, пром!иним продуктом реакцП тирозил-аден!латом та гомологичною тРНКТуг-

CciioBiii положения, що винесен! до зазшсту:

1. Ткрозкл-тРНК синтетаэа в печ1нки бика характеризу-' еться мнсж;;кн1ста молэкулярних форы ферменту. В структур!

оснозко! форми синтетази б домен, несуттБвий для кзтал!тнч-jioI фуккци в раакщл зшноацилмвакня тРНК.

2. Еукар1от>икз тирозил-тРНК синтетаза мае еволювдйно набуту спорхд'кекЮть до високомолекулярних РКК, зцо може бути нео6х1дксю для компартментал!заци на полгрибосомах,

3- Вплзлено 1снувалкя высокомолекулярного лаб1лыюго комплексу тирозил-тРНК синтетази вищих еукар1от, в склад1 якого синтетаза б!льш стшка до термоактивзцП.

4. Актизний центр еукар1отично! тирозил-тРНК синтетази включав залишки г!стидину та цистерну, як! фушщ1оназгьно важлив1 на етап! активацН амгкокиолоти, та залижи л!зину, необх!дн1 на етап! комплексоутворення ферменту а гомологi4-ною тРНКТуг та Fi ашюацилювання.

5. Вэавмодгя тирозил-тРНК синтетази з пргаЛжнш продук-. том реакц!1 тироэилзден1латом тз гомолог1чною тРНКТуг сулро-

воджувться ганформавдйнши зм!нзми ферменту.

6. Запропоноваиа динам1чна модель функц1онувашш тпро-зил-тРНК синтетази в oohobI rkoI лежить вкутрИпньомолекуляр-па динатка ферменту, яка' обуыовлюе коифорыац1йн1 эм1ни при вэаемодП з суботратами, в тому числ1 при вп1энаванн1 гомолог 1чко1 тРНКТуг, а також вэаемну структурну адаптац!» цент-р1э зв'язування АТР та тРНК.

Наукова ношгаиа та прштгша ц1ш|1сть робота. Еперпе проведено структурно-фунгаЦональне досл!дження еукар1отично5

тирозил-тРНК синтетази , выявлена множиннЮть молекулярних форм ферменту та визначен1 ix молекулярн! та катад1тичн1 характеристики, Встановлена наявн1сть в структур! тирозил-тРНК синтетази фрагменту (¡20 кДа), який б несуттевим для катал!-тично1 активност! i характеризуемся високиы bmíctgm залиш-kíb л!зину та високою Пдрофобнгстю.

Влерше виявлено високомолекулярний лаб!льний комплекс тирозил-тРНК синтетази вищих еукархот, в склад! якого оинте-таза б1льш стайка до термо1нактивацП. Синтетаза мзв еволю-ц!йно найуту неспециф!чну спор!днен!сть до високомолекуляр-них РНК, ир може бути нео6х!днсю для П компартментал1зац1'1 на пол1рибосомах.

• Проведено 1мукох1ы1чке досл!дження тирозил-тРНК синтетази з використзнням моно- та пол1клональнж аитит!л.Показана наявнЮть антигенно'1 детерм1нанти , яка еволюц!йно набута т!льки тирозил-тРНК синтетазами вищих eyKapiOTiB.

Вотановлена роль електростатичних взаБыод1й у вп1энаван-Hi еукар!отичною тироэил-тРНК синтетазою гомолоПчно! тРНХТуг. Вивчена Судова активного центру тирозил-тРНК синтетази i встановлена функц1оналъна роль задишк!в Пстидину, л!зину та цистерну в реакцП ам1ноацшаовання тРНКТуг. Запро-понована модель структура активногр центру ферменту.

Бивчено характеристик власно! флуоресценцП тиро-зил-тРНК синтетази та показана наявн1оть двох компонент в спектр! триптофаново* флуоресценцП синтетази, одна з яких наделить внутрйнньоглобулярним, а друга - експонованим за-лишкам триптофану. Показано наявн1оть швидко! конформад1йно1 рухливост! тирозил-тРНК оинтетази, для якоК характерн! низьк! екергП активац!i xa регуляц!я дифуз!йними характе-

ристиками розчинника.

Виявлеч! кокформац1йн! зм!ни тирозил-тРНК синтетази при формуваяа1 пром1жного -продукту т::рознладеи1лату та при вэае-модП з гомолоМчною тРНКТуг. Показано, щр швидка диполъ-релаксац!йна дкнзмхка синтетази змХнюеться при специф!чкому вп!знаванн1 r0M0.2Gri4H0i тРНКТуг.

Встановлено 1снування взаемного впливу центр1в зв'язування АТР та тРНКТуг в тироэил-ггРНК синтетаз!. Кояформац1йна зм!на синтетази при взаемодП э тРНКТуг 1ндукуе формувзння оптимально! кокформацП для зв'язування АТР в активному центр1 ферменту. Аналог1чна взаемод1я центр!в зв'язування АТР i тРНК астановлена такш для 1нш1 АРСази 1-го структурного кдасу - лейцил-тРНК синтетази ссавц!в.

Пропонуеться дикам!чна' модель функцЮнування тиро-аид-тРНК синтетази, в основ! яко! лежить внутр1шьомолеку-лярна динам1ка ферменту, яка обумовлш конформац1йн! зм!ни синтетази при взавмодП з субстратами, в тому чксл! при вп!знаванн1 гомолог!чно} тРНКТуг, а також взаемну отруктурну адаптац!ю центр1в зв'язування АТР та тРНК.

Результата роботи маять теоретично .значения в аспект1 э'ясузання отруктурно-функц1онально! орган1зац11 та механ1з-му функцЮнування АРСаз в процес! бЮсинтезу 01лка у вищих еукар1от!в.

OchobhI висновки дано! роботи використовуються в лекц!й-ному курс! "Генетична ензимолог1я" для отудент1в б1олог!чно-го факультету Нац1онального унхвероитету 1мен1 Тараса Шев-ченка.

АпроСац1я роботи.

Матер1ааи дисертац1йно'1 роботи допов!далися на 16-, 18-,

- 6,21- та 22-му конгресах ОЕБО (Москва,1984; Любляна,1987 ; Дуб-л!н, 1ЭЭ2; Стокгольм,1993), рздянсько-француэьких симпоэ1умах (Цхалтубо,1982; Москва,1986; Кшв,1990; Конкзрко,1991), 1та-л1йсько-радянських симпоз1умзх "Макромолекулы в функционирующей клетке" (С1ена,1982; KinB,1984); 5-й Всесоюзной науко-Biñ коиференцзЛ "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва, 1987) ; Ш-му Всесоюзному симпозиум! "Равновесная динзыикз структуры ОИОПОЛИЫерОВ" (пущино, 198?): m-í-i та 8-й конференщях ыолодих вчених сощалгстичних Kpaïн по б1ооргак!чн1й xlMiï (Пущино,1988; Рига,1991); VI-й та VI 1-й конференциях по спектроскоп П öionojiiuepiE (Хар-к1в,1988,1931); V-му Украшському GioxiulunoMy а''1эд1 (1ва-но-Фратйвськ, 1S87) ; 2б-й миккароднгн кокференцП по спектроскоп i ï (Соф1я, 1989); VI-му Всесоюзному симпоз1г/м1 по спектроскоп i'i пол!ыер!в (М1кськ,1989); Всесоюзном-/ симпозиума "Химия белков" (TöiJiici, 1Q90) ; 14-му та 15-му мхжнародких робочих парадах по тРНК (Ридэина,1991, Кап-Дат, 1993); Mi>oia-родн1й конференцП "Биосинтез белка" (Пущино,1991); Всесоюз-hííí нарад! "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992); КМдешпй нау-kobíh конфер&нци 1нституту ыолекулярно! бхологП i генетики HAH Укра! ни (Khïb, 1993) ; Кйжяародгйй школ1 по вивченнкз динз-ы1ки б!лк!в (Стокгольм,1994).

ПублхкацП. Основнх результата роботи викладен! в 45 публ!кац!ях, у тому чиол1 1 ыоксгрзф1ï та 22 статтях у в!т-чизняних та заруб1жних журналах.

Структура та обсяг дисертацп. Дисертащя складаеться з 6 глав та ы!стить вступ, огляд л!тератури, матер!аяи та ые-

тоди досл!дження, чотири розд!лк результат!в та ix обгово-рення,заключения, висковки та список цитовано! л1тератури. Роботу викладено на сторз.кках машинописного тексту,

зонз мЮтить таблиць та рисунк!в. Список цитовано! д!тератури включав 405 б1бл1ограф1чних посилань.

Bei доелдаенкя виконано з Шц1ативи автора та зз його безпосередкьою участи в експеримектах та аизлхэ! результатов.

1.Характеристика шш/кншвга ыолекулярних форм тироаил-тР1Ж

синтетази а печенки бита. 1.1. Вид1ленкя та ф1зико-х1м1чнГ влаотивоот! ochobhoi форми тирозил-тРНК синтетази. Для очистки тирозил-тРНК синтетази з печ1нки бика нами запропокована схема , приведена з таблиц! 1. Вид1лення фер-

Таблиця 1. Очистка ochoehoi форми тироэил-тРНК синтетази з П6Ч1НКИ Сикз.

Стадхя очистки

х)1л0к(

иг

Лктома аКТИВ-HiCXb "

Загальна Краттсть

активнЮть очистки 1мп ХВ~£ 1МП хз 1 10"°

мг-1 I0~d

ВИХ1Д, 7.

вих1дшш

екстракт

Висолювання

сульфатом

амонгю

(45-65 %)

ДЕАЕ-целю-

лоза.рН 7.6

Сефадеко

G-150

Фосфоцелзо-

лоза.рН 6.8

Оксиапатит,

pH 6.8

30000 1,2 36 1 100

6450 3,4 21,9 2,8 60,8

420 17,3 7,3 14,4 .20,3

59,5 55/5 3,3 46,3 9,2

5,4 353,0 1.9 294 5,3

0,31 2310 1,2 3176 3,3

* Активн1сть в реакцП ам1коацшшвання тРНКТуг.

- 8 - ,

менту проводили в присутност! 1кг1б3.тор1в протеаз: фенилме-тилсульфонилфториду(ШОЕ) та дИзопропклфторфосфату (ДСФ), в результат!•було досягнута очистка в'3175 pasiB в пор!внянн1 з виххднш екстрактом.

Еикоркстовувади також модиф1ковану схему очистки сияте-тази, в як!й проводили фракц1онуБання ПЕГ-6000 (5-9Х) та хроматограф!ю на геларин-оефароз!.

Чистоту фермента , яка становила 957., визначали по даяим електрофорезу в пол!акрилаждному гел1. П1сля елхлш з гелю т1льки ця б1лкова смуга проявляла фермектативну активгЛсть в реакцП АТР-[Э2РЗ п1рофосфатного сбмгну.

Молек/дярку масу тирозил-тРНК сиктетази в нативних умо-вах визначали гель-хроматограф1ею на сефадекс! G-200, П величина скдадаз 124 ± 4. кДа. По даним електрофорезу в декату-рувчих умовах в присутност! О,IX DS-Na молекулярна маса син-тетааи складала 59 ± 1,5 кДа, отхе тирозил-тРНК синтетаза врщих еукар!от!в в структурним димером i was четвертинну-структуру

Осковна форма тирозил-тРНК сиктетази в1д8начаеться висо-кою лаб!льк1стю. При виксристанн! в процес! очистки тхльки 1 iHriOiTopy протеаз СМСФ поряд з ооновною формою синтетази виявлялк також форму сиктетази з молекулярной мзссю полШеп-тидного ланцига.39 ±1,5 кДа, яка зберхгала ферментативну активн!сть як в реакцП а>аноадилювання тРНКТуг, так 1 в ре-акци ATP- [3ZP] п!рофосфатного обмхну. Ми припустили , цо ця форма е продуктом обмежекого ендогенного протеол1зу ochobho'i фсрми тирозил-тРНК синтетази. Дхйсно, при розщеплекн! основ-Ho'i форми сиктетази трипсином (1:100) аба еластазаю (1:20)

спостер!гали появу бЬтково! подоси э Мг 39 кДа, при цьому ам1ноац:шоюча акидапсть синтетази не втрачалась.

1.2. Вщцлення та характеристика ендогенко протеол!тично ш-дифхкозако! фуннщовально активно! форми тирозил-тРНК синтетази.

Ми розробили окрему схему зид1лэння про?еол!тично моди-фхковано} форми тирозил-тРНК синтетази. II особливосткми були аикористання т!лъки одного !кг!батора протеза СМОФ ,фрак-ц1окунания 01лк1в осзджекям при рН 5.0 та викоркстанкя висо-коефектизно! рхдинно! хроматографП на оксиалатит! при рН 8.8 . В результат! була досягнута очистка ц!е1 форми ферменту в 5374 рази в пор1вкянн1 з вих!дним екстрактом.-

Молекулярну масу ферменту в натизних удавах визначали високоефэктизноо р!диннои хроматографхб» на колонц! "ВЮ-БИ ТоК-250", И величина склада 84 кДа. Отже, модиф1кована фуккщояально активна форма тирозил-тРНК синтетази з печ1нки бика, як 1 основка форма , тех в структурним димером 1 мае четвертинну структуру типу а-х .

Катал!тичн! характеристики дзох форм тирозил-тРКК синтетази в реакщях ашноацилзозання тРНКТуг та АТР- 1'32Р: пхро-фосфатного обм!ну приведен! в таблиц! 2.

Величини Км та кСаЬ для протеолхтично модифхковано"! фор-ми тирозил-тРНК синтетази виявились близькими до катал!тзгч-них констант основной форми синтетази як в реакцП амгноаци-лювання гомолог!чно'1 тРНКТуг, так 1 в реакцП АТР-[3:гРЗ п!-рофосфатного обм!ну (таблица 2).

Було проведено 1зоелектрофокусування синтетази (форма 2

Таблица 2. Катал1тичн1 характеристики двох форм тирозил-тРНК синтетази а печ1нки бикз.

Сорма ! Kj.i ^ | kcat

L-Туг, мкМ ATP, Ш тРНКТуг, мкМ хв~г

АТР-СзгР] пхрофосфатний oSMiK 2 X 59 кДа 28,5 0,29 - 2S0

2 X 39 кДа 29,0 0,60 - . 300

Ам1Ноацилввання тРНК 2 х 59 кДа 1,0 0,125 0,75 2,97

2 X 39 кДа 1,5 ' 0,160 1,19 2,99

Розрахукки проводили по nporpam "Enzfitter".

х 39 кДа) в пол!акрилам1дному гел! з паралельним 1зоелектро-фокусузакням маркерних б!лк!в. Встакозлеко, що 1зоелектрична точка основко! смуги ферменту в!дпов1дае pi 5,5, однак спос-тэрагаеться також к1лька мхнорких полос, цо мають pi в 1н-тервал! 5,2 - 6,0. ПодiОка картина гетерогенное^ по pi електрофоретично гомогенного С1лку в1дома для еукар1отичних ам1ноацил-тРНК синтетаа i, очевидно, пов'язана з 'ix кова-лентниш посттрансляхцйкими ыодиф!кац1ями.

1.3. Ам1нокислотний апал1з двох форм тирозил-тРНК синтетази

з печ1нки бикз.

АмХнокиашткии склад двох форм тирозил-тРНК синтетази визначали на аминокислотному анализатор! "PicoTag"' ■("Waters").Основка форма ферменту м!стить 529 ам!иокислотких ззлишк!в. Пор1вняння ам1нокислотного складу двох форм показало, щр чаотииа пол1пептвдкого ланцога, яка в1дд&плюеться при обмежекому протеол!з! основно! форми i ке s суттввою для -ам1ноацилвваиня тРКК, насичена позитивно заряджаними .залив-

ками л1зику (46 залкшк1в, тобго 80Т. в!д 1х загалько'1 к!ль-кост1 ), а також мае виявлекий г1дрофобний характер (42 за. люки лейцину, '25 залиплив вал1ну, 10 залишк1в 1золейцину). Можна допусткти, що цей додатковий домен тирозил-тРНК синте-тази може грати певну роль в и компартментал1зацП в б!лок-синтезуючому апарат1 вгецих еукар!от шляхом електростатичних 1 г1дрофоСних азагмод!й з 1кз;тми кл!тинними структурами.

1.4. Р1-форма ткрсзил-тРКК синтетази.

При хроматограф!'1 тирозил-тРКК синтетази на фосфоцелшо-з1 в процес1 елвцп б!лк!в нами виязлеш 2 тки активност1 тирозил-тРНК синтетази в реакцН АТР-[32Р]п1рофосфатного об-м!ку як1 елетвались ,в!дпов1дко, при 0,16 1 0,26 М ка-л1й-фосфзгного буферу (Р1- 1 Р2-форми). Ильки Р2-форма мала активн1сть в реакцп ам1ноацшювакня тРНКТуг 1 в,очевидно, основною формою тирозил-тРНК синтетази. Експерименти по ре-хроматогрзфП Р1.1 Р2-форм на фосфоцелюлоз1 виключили можли-В1сть бдлину фосфоцелшози на формування Р1-форми.

Р1-форма синтетази була очищена в гомогенному стан1. Мо-лекулярнз мзсз ц±Б1 форми ферменту в натпвних умовах склала 01 ля 126 кДа, а в денатуруючих умовах - 59 кДа. Отже, ця форма синтетази не е продуктом протеолхзу основно'1 Форш ферменту.Найб1льш в1рог1дно, що формування Р1-форми обумо-влене ковалентнои модиф1кац1са основной форми ферменту.

1.5. Еисокомолекулярна лаб1льна форма тирозил-тРНК синтетази. При гель-ф1льтрац11 на сефакрил1 5-200 безрибосомного

екотракту з печ1нки бика , отриманого в присутност! ДФЭ та

Ci.iGO, тирозил-тРНК синтетазна активность виходить у в!льному об'ем! колонки (Мг>106Да) .Ягацо безрибоссмкий екстрзкт отри-мували в присутност! т1льки 1мМ ШС®, ткрозил-тРНК синтетазна активн1сть елшвадась у фракщЗ, що водповодае молекуляр-н1й мае! 220 кДа. Пром1жний комплекс s лзбольним, його хро-матограф1я на ДЕАЕ-целюлоз1 приводить до утворекш? Bi;n>Höi форми тирозил-тРНК синтетази. Таким чином, дисоц1ащ» тиро-зил-тРНК синтетази з комплекса можна описати схемою: високо-молекулярний комплекс (Мг > 10бДа) - проможний лабальний комплекс (240 кДа) - вхлька форма ферменту (120 кДа).

Км для тРНКТуг в реакцП амоноацилювзння для лабального промажного комплексу становить 1,66 мкМ. Пор1вняння к!нетики теплоБо! 1нактивац11 (42 °С) промхжного комплексу та в1льно! форми тирозил-тРНК синтетази .проведено! зг1дно (Негруцкий, Ельская,1984) показало, щр синтетаза в склад1 пром!жного комплексу (К1Ыакт.= 0,020 ) значно б1льш отаб!льна в пор1в-нянн1 з в1льним ферментом (KiHai«.B 0,086) .

1.6. Спор1днен1сть р1эних форм еукар1отично! тирозил-тРНК

синтетази з печ1нки бика до високомолекулярних РНК.

Осиовна форма тирозил-тРНК синтетази (2 х 53 кДа) практично повн1сгл адсорбуеться на колонц1 э рРНК-сефарозою та елюювться 100 мМ KCl. Протеол1тично модиф1кована форма ферменту (2 х 38 кДа) Т1ль.ки чзстково söepiras спор1днен1сть до рРНК,що св!дчить про вклад в1дщеплюваного при протеол1з! фрагменту в цю взаемод!ю. На В1дм1нн1стъ в1д еукар!отичного ферменту, бактер1альна тирозил-тРНК синтетаза не мае спор!д-неност! до високомолекулярних РНК. PI-форма тирозил-тРНК синтетази в описаних умовах не зв'яэувалась а рРНК-сефаро-

зскз. 16S pPHK E.coli iHrißye ам1ноацилюючу активн1сть основ-Hoi форм;; ткрозил-тРНК синтетази . Це !нг!бування носить частково конкурент};;« по в1дношеиню до тРНКТуг характер. В!дпоз!дно, цектрн эа'язувалня рРНХ та тРНК можуть частково п&рекривзтись, aßo рРНК-зв'язуючий центр, що в!др!эняеться в!д тРНК-зв'язувчого центру, д!е на активность тирозил-тРНК сиктетази алостернчно.В той же час рРНК не вплизала на awi-ноациливчу властив!сть тлрозил-тРНК синтетази з E.coli та T.thermophilus. Таким чином, спор!днен!стю до рРНК золод!е тальк:-! еукар Этична тирозил-тРНК синтетаза, що, мабуть, ке-абх1дно для П кшпартментал1зац!1 на пол!рибосомах.

2.1кунох1м1чне дскиидження тирозил-тРНК синтетази.

2.1. Характеристика молекулярних форм тирозил-тРНК синтетази за допомогою моноклонадьних антит!л.

Нами вперше одержан! моно;<локальи1 антит1ла проти тирс-зил-тРНК синтетази з викоркстаккям нового методу селекцН гибридом, сэкретуючих мококлональн1 антиПла, розробленого сильно з С.Ф.Берестенем Институт молекулярной 01ологП РАН). Вивчення мококлокальних анткт1л л1н11 Тз (мкАт Тз) показало, що 1х взаемод1я э тирозил-тРНК синтетазою не- впливае на активн1сть фермента. Одержан! дан! дозволяють вважати, що актигенна детерм!нанта для мкАт Тз знаходиться поза активним цеатром фермента. При акал!з! методом !муноблот!нгу взаемо-д!5 мкАт Тз з ферментом нами виявлено, що антигенна детерм!-нанта эбэр!гаеться при денатурац!! 0!лка. Т!лъки один з роэ-чинних б!лк!в, одержаних п!оля хроматограф!! гомогенату пе-ч!нки бика на ОЕАЕ-Тоуореаг! вэаемод!б э одержаними мкАт Та,

при цьому його рухливгсть сп!впадаз а тирозил-тРНК синтета-зою.

Виникае питания, чи мохе антигенна детерм1накта мкАт Тз, яка локал1зована поза активним центром тирозил-тРНК сиктета-зи , бути зв'язана з фрагментом пол1пэптидного лакцога, який .в1ди;еплю5ться при обмеженому протеол!зу. При вивченнД амуно-резктивност! мкАт Тз э двома формами тирозил-тРНК синтетази було встановлено, ¡да антигенна детерм!нанта для мкАт Тэ збе-Р1гаеться також i у форми тирозил-тРНК синтетази з меншов молекулярной масою 2 х 39 кДа.

2.2. Вивчення еволюцишо! консераатнвност! антигекно! детер-хпнанти мкАт Тз.

Суттввий iHTepeo становить- вивчення еволюцпшо! консервативности антигеко! детермхкакти у тирозил-тРНК синтетаз pisHoro походхення. Нами проведено вивчення взаемодП мкАт Тз з тирозил-тРНК синтетаззми з npoKapiOTiB ( E.coli , Th. thermophilus), з нижчих еукзрЮтав (др1ждж1) та з тканин ссавщв (печенка кроля, печшка бика, плацента людини). За данимн 1».г/нойлот1кгу мкАт Тз взаемодДе э тирозил-тРНК синте-тазоа з печанки бика та з печДнки кроля, тобто mijk цими дво-мз ферментами 1скуе ДмуколоПчзшй перехрест. За даиими дот-анзл!зу не виявлено взаемодП мкАт Тз проти тирозил-тРНК синтетази з печгкки бика i в1дпов1дними ферментами з E.coli (1), Th. thermophilus (2) i др1ждж1в (3), тобто антигенна детерм!нанта приоутня т1кьки у тирозил-тРНК синтетаз вищих eyKapiOTis. Таким чином, на основ! одержаних даних можна зробити ' висновок, цо ця антигенна детерм!нанта 6 сШльиоп для тирозил-тРНК синтетаз ссавцДз , тобто еволюц!йно набута

* I

* ' 4С

- Ю -

т!льки тирозил-тРНК синтетазами вищих еукар1от.

3. Вивчення структури активного центру тирозил-тРНК сшггета-зи з печ1нки бика.

3-1« Визначення к!лькост! електростатичних контакт!в, м!ж ти-розил-тРНК синтетазою та тРНКТуг. Була вивчена залежнЮть початково? швидкост1 реакцП агЛноацилювання тРНК в1д концентрацП тРНКТуг в подвига;« обернених координатах Лайну1вера-Берка при р1зн!й 1онк!й си-л1 розчину. Сбробка ц1е"1 залехност1 в координатах Дебая-Хюк-келя виявила взаемод!ю 3,6 (в першому наближэнк! 4) позитивна та тако! ж к!лькост1 негативних заряд1в. В рамках 1кпгаго п!дходу зПдно модел! Дауна одержан! дан! вказували на Юну-вання двох фосфатних груп тРНК, ¡до взагмод!ють з такою ж к!льк1стю позитивних заряджених труп в тирозил-тРНК синтета-з!. Б1льш обгрунтованою е модель Дауна, в як!й цшиндричний пол1електрол!т краще моделюе структуру тРНК, н!ж сферичний макро!он в наближенн! Дебая-Хюккеля.Можна допустити, цо електростатична взаемод1я тРНК з позитивними зарядами на по-верхн1 синтетази реал!зуБться на першому етап! б!лковокукле-1нового вп!знавання .

3.2. Специф!чна х!м1чна модиф!кац!я залишк!в л!зину тиро-зил-тРНК синтетази о-фталевим альдег!дом. Важливо вивчити природу позитивно заряджених груп в еу-карютичн!й тироэил-тРНК синтетаэ1, що ыожуть взасмод!яти з гомолог!чною тРНКТуг. Для вивчення функц!онально'1 рол! за-лишк!в л!зину в тирозил-тРНК синтетаз! з печ!нки бика нами

булн oSpaHi метода седективних xïmî4kkx модиф!кащй о-фта-левш альдегидом (ОФА) та п1ридоксаль-Б*-фосфатом (ПО).

. Основною перевагою вйкористання ООА для модифхкацп за-лшгав л1зину у 01лках б те, що продукт реакцН модиф1кацП мае власну флуоресценцш з максимумом при 475 нм. Це дае можливЮть прямого визначення К1лькост1 утвореного .продукту реакц!Л по хитенсиьност1 його флуоресценц1ï. Виявилось.що в 1 субодиншд тиразил-тРНК синтетази (форма ферменту 2 х 39 кДа) в денатуруючих умовах (1%-ний додецилсудьфат Na) моди-ф!куютьсй прислизко 9 t 1 валиаок л!зину (2 залиики л!зпну не модиЗцкуються ,мабуть, з-за ковалентних модиф1кац!й).

Утворення комплексу ферменту з гомологичною тРНКТу'г частково захищаз залшпки лхзину в1д модиф!кац1Д ООА .

СШвставляючи залежн1сть ступени ыодиф1кац!1 залишк!в Лузину в1д значения Р та залежн1сть активност1 тирозил-тРНК синтетази в реакцП ашноацилювання тРНК було встановлено, що 4 ± 2 залиашв л!зину (на димер тирозил-тРНК синтетази) е ^отними на друПй стадП реакцП ашноацилювання - взаемо-дП з тРНК та перенос! активованого эалишку тирозину на

ТРНКТУГ

3.3. Модиф1кац1я &алишк!в л!эину пхридоксадь-б'-фосфатом.

В1домо,що п!ридоксаль-5*-фосфат (Ш), в реагентом ,який здатнии специф1чно вэагмод!яти з нуклеотидзв'пзуючши центрами фермент!в . Була вивчена залежн1сть глибинн модиф!кацН тирозил-тРНК-синтетази в!д часу при р1зн1й концентрацП ПФ. Виявлено,що х1м1чна модиф1кац1н 2 залишк!в л1эину на молекулу ферменту в!дбуваеться досить швидко.тод! як 2 1нших доо-ТУПНЙХ ЗЗЛ1ШК1В ыодиф1куються зкачно пов1льнхшэ. Як в!домо,

• • 1 •

-i n ~ XI -

одним з основних критерПв аф!кко'1 модиф1кацП б те ,ар эа-лежисть ночатково! швидкост! модифхкацН ферменту зм1нюеть-ся э початковою-концентратею реагенту по г!пербол1чному, эа--коку, досягзючи граничних значень при достаткьо виооких концентрациях реагенту. Sriдно одержаним нами експериментальним дан™ характер залежкост! св1дчить про насичання реакцП i може св!дч;;?и на користь припущення про псевдоаф1нний характер вэаемодИ ПФ з ферментом.

Модиф1кзц1я залишив л!зину практично не впливала на ак-тиан1сть ферменту в реакцП АТР-[32Р]п1рофосфатнаго обмхну. Збереження ферментом активное?! в реакцП ATP- С32Р]п!рофос-фаткого обману при модифхкацП 4 залишав л!зину може, напевно, св!дчити npD те, ¡до iU эалшки ке приймають участ! у взаемодП з низькомолекуляркими субстратами. 3 1кшсго боку, це, напевно, може вказувати на в1дсутн1с~ь глобальних кон-формзцхйких зшн у структур! ферменту при модиф!кацП залиш-к!в лхзику, насл!дками яких могла б Сути 1на)стивац!п в реак-цП ам1ноацидювання tFHK.

1нкубац1я э субстратами захищае фермент в!д 1иактивацП в реакцП аы1ноацилювашт тРКК . На початков!й д1лянц! к1не-тичних кривих максимальний захисний ефект дае гомолог!чна тРНКТуг . Протягом 15 хв реакцП модиф!кацН глибина 1накти-вацП ферменту у в!дсутност! субстрат!в складas 75%, а в приоутност! тРНК - 15%, Глибина !нактивацП в присутност! АТР та <АТР + L-тирозин} склад as 50Z. Захисний ефект, що вякликаетьоя низькомолекулярними субстратами може поясиова-тися конформац1йними зм!нами б!лку,.що виникають при зв'язу-ванн! цих субстрат1в.

Залежн1оть активност! тирозил-тРНК синтетази в реакцП

аШноацшювэння тРНК в1д глибини модиф1кац!1 ферменту вияви-ла,, цо модиф!кац1я т1льки 1 эалишку л1эину на димер синте-тази приводить до 1нактивац1! ферменту на 807.. Дал! при мо-диф!кац!! !гаиих 3 залишк!в, !нэктивац!я поотупово досягав S07.. Лог!чно припустити, то Lys, який е найб!льш реакц!йно здатним, лопай эований у центр! зв'язування тРНК або, в ката-лНичному центр! (рис.1).

Вивчення швидкост! модиф!кацП ферменту ПФ в приоутност! АТР ! тРНК показало, що максимальней захисний ефект в!д ко-вадентного приеднання ПО на лШинш Д1лянц1 к!нетично! криво! мае тРНКТуг. Як можна бачити, тРНКТуг захищае в1д моди-ф!кацн 1 залишск л1зину ка димер ферменту.Цей залишок Lys, мабуть, включавться беспосередньо у вэаемод!» s тРНКТуг та його ыодиф1кац!я ПО приводить до îctothoï !нактивац!! ферменту в реакцП амхноацилювання тРНК. Можна припустити, що в даиому видадку ми спостер!гаемо прояв антикооперативних вза-бмод1й М1ж тРНК-эв'язунчими центрами,як! локал!зован! на 2 субодшшцях тирозил-тРНК синтетази.

Таким чином, дан! по х1м1чн!й модиф!кац1! эалишк1в л!зи-ну ПО узгоджуються з результатами модкф!кац!! цих залшюв OSA. 3 одержаних даних можна зробити висновок, що залишки л!зику тирозил-тРНК синтетази 6 функЩонально важливиыи на друг1й стад!! реакц!! ам!ноацилювання тРНК !,мабуть, не бе-руть участ! в реакц!! активац!! амНюкислоти.

Експершентальн! дан!, одержан! у лаборатор!! Фершта при вивчекн! взавмодП тирозил-тРНК синтетаэи з • В. stearothermophilus г тРНКТуГ .показали, що у процес! 61-лок-нукле!нового вп!знавання в ц!й Оактер!альн!й пар! оинте-тааа - тРНК приймае участь кластер заряджених труп, але

л

Е-» о

я а я ь< ■л

100

80

60

40

20

12 3 4 К1льк1сть модиф!кованих залшшив

Рис.1. Залежн1сть активност! тироаил-тРНК синтетази в реакцП ам1ноадшаоваиня тРНКТуг в!д гдибини модиф!кац1'1 ферменту п1ридоксаль-5'-фосфатом.

Рио.2. ЗалежнЮть активност! тирозин-тРНК синтетази в реагацях амхноацилповання тРНКТуг(1) та АТР-[32Р]п1ро-фосфатного,обм1ну (2) в!д часу 1нкубацП а ДЕПК.Р-15.

особливу роль у вп!знаванн1 грае додатковий контакт, щр ут-ворюеться м1ж залишком Ьуз-151 та адек1ном-73 у тРНКТуг.

У тирозид-тРНК синтетаз! з печгнки бика аналог!чку роль мохе грати найб1льш реакцДйно адатний залишок д!эину в тРНК-зв'яэуючому сайт!, модиф!кац!я якого впливае на катал!-тичну активность друго! субчаотини сиктетази. Козину припус-тити, ¡до в дакому випадку мае мЮце проява ангикооператизно! взаемодП м1ж тРНК-зв'язувчимн сайтами субчастик ферменту, яка може бути, викликана за рахунок кокформац1йно'1 зм!ки в димер! сиктетази. Антикооперативна взазмодхя тРНК-зв'язую-чих центр!в раню була показана як для бактер!ально1 ткро-зил-тРНК синтетази ,так 1 для анших фермект!в ц1е1 групи.

3.4. Х1м1чна ыодиф!кащя залшпк!в г!стидину тирозил-тРНК синтетази бика

Для вивчення функционально! рол1 залилшв Пстидину у тирозид-тРНК-синтетаз1 з печДнки Сика використовували метод специф1чно"1 х1м1чко1 модиф!кацП цих залишк!в д!етзшпрокар-бонатом (ДЕПК).Модиф!кац1я синтетази в нативних умовах показала, що при кокцентрацзЛ ДЕПК 0,31 мМ константа твидкост! реакцП ыодиф!кацШ складала к=0,19 хв"1 та зб!льшення пог-линання при довжинД хвилх 240 км .заканчуеться через 15-20 хвилин пюля початку реакцП. При цьому модифДкузались близь-ко 5 залишк1в Пстидину на димер сиктетази. Е1дсутн1сть зм1н поглинання в облаетД 260-280 нм в диференц1адьному спектр! модифДкованого ферменту свадчить про в!дсутн!сть ыодиф1кацП задишкДв тирозину при даному надлишку реагенту.

Вхдковленкя зал!шк1в г!отидину !нкубац!вю а Ндроксила-м!ном (0.5 М, рН 7.0, 24 години, 4 °С ) приводить до прак-

• «

«

ткчно повкого зкиккення поглинанкя при довжет! явил! 240 нм

1 дозволяь зиклнчити утвореккя д1кар6етокскпох1дних г1стиди-ну.

1ккубац1я ферменту з д!етилп1рокар6онатом приводить до анактизаци тирозкл-тРНК-сиктетази на cGox етапах реакцП ам1ноацихювалня.(рис.2).

Молнз бачкти, до при модкфгкзцП 2 задиштв г1откдзгау 1кактизац1я у реакцП Атр-[32р]п1рофосфатниго обм1ну складав 72X, а у реакцП аманоацилювання тРНКТуг - 91™.. ЗалехШсть залих<ово1 активное?i ферменту з1д кхлькоот! модифякованззх His дозволяв гробити биоковок про суттеву функц!ональну роль

2 залкнтз Пстидину на молекулу ферменту.

В1дновленкя залзштв гЮтидику г1дроксклзм1ном приводить до вхдкезлекня активное?! тирозкл-тРНК сиктетази в реакцП ам1ноацилювання ка 75%, а в реакцП АТР-[32РЗп1рофосфатного обм!ку - на Q0I . Це очевидно ов!дчить, що 1нактивац1я ферменту при оккубзцП з ДЕПК эумовлека утворезшпм монокарбе-токсгаюх1днкх г!стидину.

Були проведет експерзашкти по вивчекнзо впливу р1зких субстратов реакцП на шзидк!сть 1нзктзгвацП тироэил tFHK сиктетази ка початков!й долянцо кпзетпчноз криво'!. Естановле-но, ' що зсо субстрати в пев;;in Mipi захкцають фермент з!д !нактизацП на кожному э еталоз реакцП. Але найб1лыаий за-хисний ефект як в реакцП АТР-СЭ2Р]п1рофосфатного о£5м1ну, так i в рэахцП ам1ноацилювання тРНК , мав АТР в прпсутност! тирозину.

Можиа припустити, що залишки г1отидину, як! модиф1кують-ся, .Серуть участь у ]<атал1э! утворензш ам1ноациладен1лату, ймов1рно. взаемод1ши а АТР.

- 2? -

При вивчен1 активного центру тирозил-тРНК синтетази а В.

stearothenriophilus було показано, що залшпки гЮТиднну

1

His-45 и His-48, що входить до складу консервативно! НШН-посл!довност1 для ам!ноацил-тРНК синтетаз лершого кла-су,, приймають участь у стаб!л1зацП пере/лдкого стачу комплексу Е*Туг- 'iilP-*PPi шляхом вэаемодП з ATP (Fersht,1988). Можна припустити, що эалнпки г!стидину еукар1отично1 тиро-аил-тРНК синтетази Ъиконують аналог!чку роль у катал!з1.

3.5. Х1м1чна модиф!кащя галидк!в цистезку тирозил-тРНК синтетази з печенки Сика. Ми вивчали вплиз р-хлормеркур1бензоату (13ХМБ) на актив-HicTb тирозил-тРНК синтетази в реакцН ам5.коацшшвання тРНКТуг. Естановлено, що модиф!кац1я 1 SH-групи ферменту приводить до 50-902-Ho'i 1нактивацП тирозил-тРНК синтетази. Як ниаькомолекулярнi оубстрати,так i гомолог!чна тРНКТуг з печ!нки бика не захищають синтетазу в1д 1нактивац1Л ПХМБ (слабккй ефект захисту споотер!гався т!дьки для комплексу синтетази э тирозиладен!латом). Одержал! дан! дозволишь припустити,що модиф!кован! SH-групи ыокуть приймзти участь в катад1тичному механ1зм! а5о в Шдтриманн! структури активного центру еукрЮтично! тироэил-тРНК синтетази.

4. Досл1джешш еукар1отично'1 тирозил-тРНК синтетази методами флуорски\еитио1 спектроскоп!

4,1. Параметри власно'1 флуоресценцИ еукзр!отнчно'! тиро-зил-тРНК синтетази.

В робот!, вш!рян! спектри флуоресценцИ макромолекули

тирозил-тРНК синтетази при довжинах хзиль збудження 280 1 256 им. При збудженн! на довжин! хеши 235 им в спектр! флуоресценц! 1 ферменту прксутня т!льки триптофзкова компонента. Р1ЭНИЦЯ в положенн! мзксимум!в спектр!в при эбудженн1 на 230 ! 296 км обумоглена вкладом тирозиново! флуоресценц! !, яка становись б!ля 5Х . .

Розрахован! нами на основ! експериментальиих даиих пара-метри власко! флуоресценц!1 молекули ферменту представлен! в таблиц! 3.

Таблиц« 3. Пзраметри гласно! флуоресценц!! тирозил-тРНК син-тегази з печ1нки бика .

Параметр

Довяика хвил! збудження Аах=280 км :\ох=256 км

Положения максимуму спектра ,нм Ширина спектру ,ДЛ,км Квантоьий вих!д,ч Ефектизн!сть перекосу енергН тирозин-триптофан, т

335 ± 1 56 ± 1 0,24 ± 0,01

0,85 ± 0,10

338 ± 1 55 + 1 0,25 ± 0,01

4.2. Визначекня к1лькост! триптофанових залгепк!в 1 1х лока-л1эац1! в тирозил-тРНК синтетаз1.

К1льк1сть залишк!з Тгр, визначенз зПдно методу (Ра^о1, 1976) становить 6,0 ± 0,9 залишк!з на 1 субодиницю для основно! форми синтетази та 3 ± 0,9 для форми синтетази 2 х 39 кДа.

Для вивчення локал1зац!1 флуорофор!в (залипк!а Тгр) в тирозил-тРНК синтетаз! було проведено розклэдакня спектр!в трштофаково! флуоресценц!I по 1о£-нормзльниы кривим методом розробленим в робот! (Аборнев .Бурштейн , 1992). Виявилося, 4 що спектри випром1нювшшя ферменту, розкдаден! за даним ал-

« •

горитмом на дв! компонента;, належать класам зкутр!шньоглобу-лярним i експоновакм трипгофакових залишкам (у випадку га-oiHKK KI i- акрилам!дом). Положения' мзксимум!в спskipis вкп-ромиссваккя цих класДв хромофор!в в!дпов!дають довжикам хвкаь 320 ±11 344 ± 1 км.

Таким чином, зализки триптофану, е природкими флуорес-центними зондами в структур! тирозил-тРНК сиктетази, локал1-зованими як всередик! б!лкз , так 1 на його пов&рхн!.

4.3. Внутршньомолекулярна дикамДка макромолекула тиро-зил-тРКК сиктетази по данким температурного гас1нню триптофаново! флуоресценцП.

¡кдуковане температурою гасгння флуоресцекцП тиро-зил-тРНК сиктетазсю було винчено шляхом вимДру параметр1в флуоресцейцП ферменту в д!апазок! +18 -г +75 °С . Температурка залежнЮть положения максимуму спектру флуоресцекцП показуg, що в межах температур до +40 °С збер!гаЕться натив-на кокформац1я б1лка. В д!апазон1 температур +40 4- +50 °С спостерхгаеться эмхч&иня максимуму спектру на 3 нм в довгох-вильову область. Була визначена екерг!я активацП процесу raciHHH флуоресценцП, цо становить 21 ± 4 кДж/моль. Предс-тазляючи температурку залежнЮть квантового виходу в координатах i/q - а + b-T/ti (Бурштейк та cniESBT., 1Q78), ми припускали, до динэлка б1лкових груп, враховуючи i BHyTpiarai, залежить в!д коефф!ц1ента дифуз!'! розчинккка, i тому кванто-зий вих!д б!лка пропорщйний Т/n (и - в'язкЮть розчинника). OrpiiuaHi залежлост1 л1н!йк! в межах температур до +40°С (тут збер!газться кативна кокформац!я б!лка, нема спектральних

• (

зрушень спектру флуоресценцИ). Вхдхилення в!д лШйнос?! при температурах, вищих за + 40 °С, пов'язаке, очевздно, з збхлъшенням температурка-1ндуковано! рухливост! окремих частим 01лково'1 молекули.

Еикористовуючи дан! про температурну залежн!сть максимуму спектру вгаром!нивання тирозил-тРНК синтетези при збуд-женн1 на хвилях 280 ! 296 нм ! вважаючи, цо спектральн! зм!-ни в !нтерзал! +20 -г +50 °С визначааться днпольною реор!ек- • тащйною релаксзц!е» оточення триптофанових залишк!в у Фермент!, булл визначен! часи диполько! ор1ентащйно1 релакса-цп (хг) в дакому температурному 1нтервал1.При цьому корис-тувались в!дпов!дким р!внянкям (Демченко , 1986). Розрахова-1П часи релаксацП зм!коються в межах 7 - 12 не в д1алазон1 температур + 20 -г- + 50 °С. Л!н!йн!сть залежност! в координатах Арренхуса свадчить про активащйний характер диполь-но-ор!ектац!йко1 рухливоог! м!крооточення триптофанових за-липк!в в синтвтаз1.Величина енергп активацП становить 14 ± 3 кДж/моль.

Отже, результати наших досл!джень показали , що для внутр!пшьомолекулярно! рухлизост! тирозил-тРНК синтетази при температур! до + 40 °С характера! ниэьк! енергП активацП ! опосередкована регуляЩя дифуз!йшши характеристиками роз-чикника . Це справедливо як для екопонованих на поверхт, так ! для вкутр!птх д1лякок макромолекули.

4.4. Конформацайна рухлха!сть глроэил-тРНК синтетази по да-ним гасхнкя флуоресцент1 низькомолекулярними гаскиками.

Нами показано незначне зменшення 1нтенсивност! флуорес-ценцП при додаванн! до розчину синтетази йодиду . Це дозво-

те припустити, що- йодид контактуе т!лъки а невеликою части-ною зашшив триптофану, локал!зованих на поверхн! тиро-зил-тРНК синтетази, а основна 'ix частина для йодиду недоо-тупна.

Екопериментальн! залежност! !нтенсизност! флуоресценцП синтетази в1д концентрацП акриламаду мають характерн! особ-лпвост! з!тккювального механизму raoiHHH флуоресценцП . Л!-н!йн!сть граф1ку в координатах Лерера св1дчить про те, що в тирозил-тРНК синтетаз! можутьбути вид1лек1 два класи флуо-рофорхв - доотупн! i ловшстю недоступн! для акрилам!ду. Ре-эультати розрахушйв параметр!в гаспшя флуоресценцП моле-кули ферменту зкрилапдом га р1внянням Лерера (Lehrer , 1971) наведен! в таблиц! 4.

Для з'ясування механ!зму гас1ння досл!джена залежн!сть ефективност! гасхння флуоресценцП акриламадом в1д в*яэкост1 розчинника ,що досягалось додаванням в розчин глЩерину з ыасовим вмЮтом - 0; 10; 25 i 50 Z. Як видно в таблиц! 4, при эб!льшенн! в'язкост1 розчинника константа гас1ння эмен-шувться, а доля*доотупност! залишаеться незм!нною.

Якщо взяти до уваги, що гашння можливе при з!ткненн1 хромофора i гасника ,то залежнЮть ефективност! гас!ння в!д в'язкост1 розчинника, може означати, що доступна для гасника частика тршзтофалил!в знаходиться в контакт! з гасником впродовж часу життя збудженого стану хромофора - близько 10"® о. Це дозволяз припустити ,що доотупн! акрилам!ду триптофан или, що обуыозлвють б!ля 74 Z сумарно'1 !НТ6НСИВН0СТ! флуоресценцП (таблица 4), очевидно, розташован! усередин! б1лково'1 матриц!. При цьому контакт акрилам!ду э триптофани-лами може бути зд!йонений эавдяки маштабним флуктуац!ям

б1лково! структура, що вводять П в стан з в!дкритсю 1 аак-ритоо порожнинои для розчинника .

Таблица 4. Залежн1сть константи Штерна-Фольмера (Кзу) I в1д-носко! доступност! триптофанових залилшв тиро-зил-тШК сингетази (1") для гасШня флуоресценцП акрилам!дом з!д в'язкост! розчинника.

Вм1ст В'язк1сть„розчинника е

гл1церинуД ■п ,10-* Па-с и1-

0 0,895 13,2 0,74

10 1,249 10,0 0,74

25 1,805 7,5 0,74

50 5,024 4,5 0,74

Отде,результата досл!джень гасхння трилтофаяово! флуоресценцП низькомолекулярними гасниками св!дчать про наяв-н!сть швидко'1 (канссекундко!) конформац1йно! рухливост! мо-лекули тирозил-тРНК синтетази в розчин!, яка приводить 61л-кову матрицо в стан э в!дкритою 1 закритою порожникою"для розчинника.

4.5. Локальн1 конформац1йн! флуктуацИ молек/ли тирозил-тРНК синтетази (форма 2 х 39 кДа).

Вивчали тешературну залежн1сть характеристик безвипро-м1нювального переносу енергП збудженкя м!ж заливками триптофана 1 флуоресцентким зондом п!ридоксаль-5'-фосфатом , введении по залишках л1зину, як! локал!зован1 в тРНК-эв'язу-ючому центр1 ферменту (розд!л 3.3).

Ампл1туду локальних конформац1йних флуктуац1й тиро-зил-тРНК синтетази у розчин1 оц1нювали за параметром Г [Зотову! е1 а1.,19843, що б в!дношенням ефективност! перено-

су енергН збудження м!ж донором i акцептором до квантового виходу донорно! флуоресценц!! i пов'язаний з в!дношенням r/R (г - амшитуда флуктуац!й акцептора навколо положения р1вно-ваги, R - в!дстань донор-акцептор). Одержан! дан! дозволяють припустити, що амшитуда конформац!йних флуктуац!й вар1юе в межах 0,5 -г 2,8 Я.

4.6. Конформащйн1 2м1ни тирозил-тРНК синтетази при форму-ванн! тирозиладен1лату та вааемодН з гомолог!чною тРНКТг/г.

Для досл!дження зм!н конформацП тирозил-тРНК синтетази застосували метод резонансного переносу енергП збудження за MexaiiisMOM Ферстера м!ж залишками Тгр та ковалентно приедна-ним флуоресцентним зондом М-Щйодацетил)ам1но]етилЗ-5-наф-тилам!но-1-сульфокислота (AEDANS).Цей зонд локал!зований поза активним центром синтетази (форма 2 х 59 кДа).

При взаемодп синтетази з АТР ! L-тирозином cnocTepira-еться гас!ння флуоресценц!'! AEDANS, в!дпов!дно, на 27 i 22% Одна!«, при формуваши пром!жного продукту реакцП тирозиладе-н!лату спостер1галосъ зб!льшення !нтенсивн!ст! флуоресценц!! зонду на 34 х. При цьому ефоктиБк!сть переносу енергН збудження на AEDANS зростала в!д 81 до 30 %, а в!дстань донор- аюдептор зменшувалась в!д до 24,4 % (таблица 5, риаЗ).Можиа зробити висновок, що тирозил-тРНК синтетаза зазнае конформа-цхйно! эм!ни при формуванн! тирозиладен!лату.

*

Рис,3.3алежн1сть 1нтеисшзност1 флуоресценцП тирозил-тРНК синтетази, м1чено1" AEDANS, в!д концентрацП тирозиладен!лату (1) та при додавали! фен1лаланшу до комплексу синтетази з АТР (2).

Ко!щентрац1я тРНК, 10"6 M

Рио.4.3алежн!сть íktghchbkoctí флуоресценцП AEDAHS-mî^shoï тирозил-тРНК синтетази в!д концентрацП тРНК. 1 - тРНКТуг з печ!нки бика, 2 - тРНКТуг E.coli.

Таблица Б. ©луоресцентн! властивост! AEDANS-miчено! тиро-. зил-тРНК синтетази з печ!нки бика in комплекс1в з субстратами.

«

" 1 " ' ' ' 1 "

км" Е (7.) Ro$) RCA)

25,0 27,4

35,0 25,3

25,0 24,1

35,0 27,0

25,0 22,3

35,0 24,1

35,0 27,4

Взавмод!я ферменту э гомолог!члою тРНКТуг приводить до вб1лыаення флуоресценцП эв'язаного зонда AEDANS на 25 7., тод! як при взаЕмодП г тРНКТуг E.coli, яка не ам!ноаци-люеться еукар!отичною сиктетазою, спостер!гаеться лише га-oiHHH флуоресценцп AEDANS на 8 Z. В1дстань Mix триптофани-лами i зондом зменшувалась до 25.3 % при взаемодП з гомологичною тРНКТуг (табдиця Б , рис.4.).

При додаванн1 АТР до комплексу ферменту з гоыолог1чкоа тРНКТуг спостерхгаяось каступнэ зб1льшення флуоресценцп AEDANS на 32 7., при'цьому в1дотань донор-акцептор становила 24.1 %, а ефективн1сть переносу енергП при цьому зростала до 90 7. (таблиця 5) .

Таким чином, одержан! дан! покаэумть, що вп!знавання ти-розил-тРНК синтетази гомолог!чною тРНКТуг супроводжуеться конформац!йною зм1нсю ферменту, яка, очевидно, пот!м !ндукуе формувакня оптимально! конформацП для наступного зв'язуван-кя АТР в активному центр! синтетази. Псд1бний ефект недавно описаний для комплексу глютам!н!л-тРКК синтетази з тРНК61"

AEDANS-TyrPO т 477 81

AEDANS-ТугРС+тРНКг а печ!нки 477 87 бика

AEDAKS-Tyrrc+TPHKTyr з печ!нки 477 ВО бика + АТР _ •

AEDANS-ТугРС + тРНКТуг E.coli 477 82

AEDANS-ТугРС + Т'уг + АТР 476 93

AEDANS-ТугРС + АТР + Туг 476 90

AEDANS-ТугРС + АТР + Phe 476 81

AEDANS в розчин1 493

E.coli в крнстзл1чному стан1 по даним рентгеноструктурного anaaisy (Rould et al., 1S91). Припускааться, що вз'аемод1я антикодону тРКК з рухливими фрагментами б!лка "запускае" конформац!йн1 змДни, необх1дн1 для наступного ефективного зв'язування АТР.

Нами також проведено вивчення конформад1йно! рухливост! тирозил-тРНК синтетази з використанклм спектроскоп!I крайо-вого збудження флуоресценцП (Демченко,1886,1988). ЕзаемодХя тирозил-тРНК синтетази з гомолоПчною тРНК приводила до сут-Tsao'i зм1ки вэличикн крайового зсуву триптофаново) флуорес-ценцп.Цей ефект може бути гатерпретовакий як эменпэшш кон-формац1йно1 рухливост1 С1штетаэи в окремих дДлянках ,як1, в1рог1дно,залучен1 в тРНК-зв'язуючому центр1.

Взаемний вплив цектр1в зв'язування АТР та тРНК нами був також виявлений при досл1дженнх 1ншо1 еукар1отично1 сштетази -лейщш-тРНК синтетази ссазцДв, що те» наложить до 1-го структурного класу АРСаз. При взаемодП АТР з комплексом лейцил-тРНК синтетази з гомолог1чною тРНКЬеи спостер1галось не гасДння триптофаново! флуоресценцП, як у в1дсутноот! тРНК, а зростання Днтенсивност! на 13,5%. Цей ефект був строго специф!чний для АТР. Константа acoitfaui'i АТР з ферментом зростала в1д 8.4-104 до 2.71-Ю6 КГ1 в присутност1 тРНКЬеи. Отже, в лейцил-тРНК синтетаз! ссавц1в також виявле-на взаемод1я центр1в зв'язування АТР та тРНК, яка супровод-жубться конформац!йниш зм1нами синтетази та п!двищенням специф1чност! асод1ацП з субстратами.

- 32 -

4.7. Динам1чна модель функпдокуваккя тирозил-тРНК синтетази.

Одержан! нами експериментальн! дан1 дозволкють сформуло-вати динащчну модель фуккц!онування тирозил-тРНК 'синтетази в проц£с! ам!ноацклювання гомолог i4;;o'i тРНК. В основ! ц!б! модел! лежить внутр!шньомоле1сулярна диначхка ферменту . яка виквлека при флуоресценткмх дослхдженкях цього ферменту. Внутр!шньомолекулярка динаьйка мохе обумовлювати конформац1й-н! зм!ни синтетази при взаемодП з субстратами в тому числ1 при вп!зкаванн! гомолоПчно'! тРНК.Завдяки конформац!йн!й рухливосИ синтетази може реал!зовуватись синергична взаемо-д!я м1ж центрами зв'язування тРНК i ATP, яка приводить до вэаеыко! структурно: адаптацП цих центр!в ! п!двищення спе-цифачност! реакцП ам!ноацилювання. Такий механ1зм може реа-л!зовуватись також i для пших АРСаа 1-го структурного кла-су.

ВШЮВКИ: •

1. Вид1лена в гомогенному стан! тирозил-тРНК синтетаза з печ!нки бика та вивчон! Ti ф1зико-х!м!чн! та катал!тичн! властивость Синтетаза е структурним димером «¿-типу з Мг 2 х 59 кДа. Виявлека мкожиш^сть молекулярних форм еукар1отич-Ho'i тирозил-тРНК синтетази. В безрибосомному екстракт! э пе-ч1нки бика тирозил-тРНК синтетаза знаходиться в склад1 висо-комолекулярного комплексу з молекулярной масою б1льш як 1000 КЦа , з якого фермент дисоцПое через пром!жний лаб!льний KOMiuieicc до BixiiV.o'i форми синтетази. Порпд з основною формою iCHye поЕнхстю активна ендогенно протеол1тично модиф1кована

форма Мг 2 х 39 кДа 1 Р'1-форма, яка е активною тьтьки в ре-акцП утворення тирозиладеихлату . Р1-форма складаеться з дбох не 1дентичних по хроматограф1чному поводженню субоди-ниць .одна э яких ковалектно модифхкована.

2. Тирозил-тРНК синтетаза мае езолюЩйно набуту нёспе-' циф1чну спор1днен!сть до високомолекулярних РНК, яка, напевно, необх1дна для компартмектал!защ1 на пол!рибосомах.

3. Проведено 1мунох1м1чке досл1дженкя тирозил-тРНК син-тетази з викориотанням моноклональних та пол1Клональних ан-тит!л. Показано, що одна з антигенних детермгнант локад1зо-вана поза активним центром ферменту 1 е сп!льною для обох форм тирозил-тРНК синтетази. Ця детермшанта 6 еволющйно набутою т1льки тирозил-тРНК синтетазами вищих еукар1от та в1дсутня у нижчих еукар1от (др1жд«1в) та бактерий.

4. Вивчено будову активного центру тирозил-тРНК синтетази методами селективних х1м1чних модиф!кац1й. Встановлена фунгацональна роль залиишв пстидину в катал1тичн1й стадП реакц:П ам1ноацилювання тРНКГуг та залишк1в лхзину на стадП комплексоутворення ферменту з тРНК, Встановлена також функ-щональна роль ЗН-груп в реакцИ амшоацилюваннй тРНКТуг,

5. Вивчена роль електростатичних взаемод1й в комплексо-утворенн! синтетази з гомолог1чною тРНКТуг в рамках моделей Дебая-Хюккеля та Дауна 1 визначена к1лькЮть електростатичних контакт1в м!ж ферментом та тРНК.

6. Досл1дженням власно! триптофановой флуоресценцп ти-

розил-тРНК синтетази показана каявн!сть двох компонент , одна з яких 31дпоа1даБ внутр!шньоглобулярнкм залишкам триптофану, а друга - експонованим до розчзшника трззптофазплам.

7. Методами флуоресцентно! спектроскопi'i показано наяв-н!сть шзидко! конформац!кно1 рухливост! тирозил-тРНК синтетази .для яко! характерн1 низьк1 eHepri'i актзтацп та опосе-редкована регуляц!я диффуз1йними характеристиками розчинни-ка.

8. Еиявлен! конформац1йн! зм!ни тирозил-тРНК синтетаззз при утворенн! пром1жного продукту тирозиладеи!лату та при взаемод!! а гомолог1чною тРНКТуг. Встановлеио !снування кон-формац1йно'1 вэаемодП м!ж центрами зв'яэування АТР та тРНКТуг.

9. Методом флуоресцентно'! спектроскоп!! досл1джена лей-цил-тРНК синтетаза ссавщв. Показано взавмний вплив центр1в зв'яэування АТР та тРНКЬеи,який приводить до тдвизцення спе-циф!чност1 зв'язуЕанкя cyöcTpaTiB.

10. Эапропоновака динам!чна модель функцЮнування тиро-зил-тРНК сштетаэи , в основ! яко! лежить вкутр!шньомолеку-лярна динам1ка ферменту, яка обумовлзое конформац!йн1 зм!ни при взаемод!! з субстратами, в тому числ! при вп!знаванн! гомолог1чно! тРНКТуг, а також взаемну структурну адаптац!ю центр1в эв'язуваиня АТР та тРНК.

OcHOBiii роботи, надрукован! аа темою диеертацП:

1. МацукаГ.Х., Ельская A.B., Коваленко М.И., Корнелюк А.И.

Транспортные рибонуклеиновые кислоты. - К. :Наук.думка, 1976. -219 с.

2. Корнелвк А.Я.ЯМР-опектроскопия транспортной.РНК//Сб."Мо-

- 35 -

лекулярная биология".-К.:Наук.думка.- 1975.- т.12.- С.99-115.

3. Корнелюк А.И. Метод расчета параметров связывания амикоа-цил-тРКК сиктетаэ с субстратами по данным флуоресцентного титрования//Методы молекулярной биологии.-К. ¡Наук.дум-ка.-1979.-С.140-142.

4. Корнелюк А.И.,Мзцука Г.Х., Жилин В.В. Изучение взаимодействии лейцил-тРНК сиктетазы с субстратами методом флуоресцентной спектроскопии//Укр.биохим.журнал.-1980.-т.52, N1.-С.79-83.

5. Корнелюк А.И.,Мацука Г.Х., Шилин В.В. Флуоресцентны;! анализ доступности триптофанвых остатков лейцил-тРНК синте-тазы в фэрмект-субстраткых комплексах//Биофизика.-1980. -Т.25, N3.-С.402-404.

6. Корнелюк А.И.,Емец Б.Г..Дмитренко А.А..Жилякова Т.А., Шейкин 2.Я. Гидратация транспортной РНК по данным ядерного спик-эхо эксперимента//Тезксы докл.1-го Всесоюзного биофизического съезда, Москва,1S82.-t.1.-C.60.

7. Matsuka G.Kh.,Kornelyuk A.I.,Tukalo M.A.,Shilin V.V.The study on the interaction between leucyl-tRNA synthetase from mammary gland and its substrates/ZQuaderni de "La Ricerca Scientifica",1984.-v.113.-P.117 -124.

8. Корнелюк A.J1. ,Шилин В.В.,Гудзера О.И. ,Рожко 0.Т.,Мацука Г.Х.Химическая модификация триптофановых остатков лей-цил-тРНК сицтетазы N-бромсукцинимидом и 2-окси-5-нитро-бекзилбромидом//Биоорганическая химия.- 1985.- т.11, N5.-С.605-512.

9. Осадчук Т.В.,Корнелюк А.И.Пр;шенекие флуоресцентной спектроскопии для идентификации А- и Б- цепей тромбина

- 36 -

при их хроматографическом разделении// Укр.биохим.журнал. -1986.-Т.53,N3.-С.54-58.

10. Корнелюк А. И. .Курочкин И.В.,Мацука Г.X.Выделение и физико-химические свойства тирозин-тРНК синтетазы из печени быка//Тезисы докладов Республ.конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван,1986.-С.24.

11. Курочкин И.В..Крупская И.В..Корнелюк А.К.,Мацука Г.Х.Си-.зико-химические свойства тирозил-тРНК синтетазы из печени быка//Докл.АН УССР.Сер.Б.-1986.- N12.-C.65-68.

12. Когл.Яуик A. I. .Kurochkin I.V. .Matsuka G.Kh.Conformational mobility of tyrosyl-tRNA synthetase in solution//Abstracts of 2nd International Meeting "Molecular and cellular regulation of enzyme activity",Halle,1986.- P.lll.

13. Курочкин И.В..Корнелюк А.И.,Рибкинская Т.А..Гнатенко Д.В..Мацука Г.X.Гетерогенность тирозил-тРНК синтетазы из печени быка//Тезисы докладов 5-го Укр.Оиохим.съезда,Киев,1987.-С.41.

14. Kornelyuk A.I.,Kurochkin I.V..Ribkinska Т.А.,Matsuka G.Kh.Isolation and some properties of tyrosyl-tRNA synthetase of beef liver//Abstracts of 18th European FEBS Meeting,L3ublj ana,1987.-P.120.

15. Корнелюк А.И..Курочкин И.В.,Мацука Г.X.Тирозил-тРНК син-тетаза из печени быка. Выделение и физико-химические свойства//Молекулярная биология.-1988.- t.22,N1.- С.176-186.

16. Корнелюк А.И.Структурное окружение триптофаиовых остатков и конформационная подвижность в тирозил-тРНК оинте-тазе из печени быка//Тезисы 4-й Конференции по спектроо-

копии биополимеров,Харьков,1988.- С.165.

17. Курочклн Я.В..Гкатекко Д.В..Рибккнска Т.А..Коркелюк А.И. Тирозил-тРНК' сиктетаза из печени быка: выделение и характеристика множественных форм фермента //Тезисы докладов 5-й Конференции молодых ученых соцстран по биоорган, химии,Пущнко, 1988. -С. 54-55.

18. Komelyuk A.I. , Kurochkin I.V. , Rifckinska Т.A., Gnatenko D.V., Matsuka G. Kh. Tyrosyl-tRHA synthetase from beef liver: generation of multiple enzyme forms by endogenous proteolysis//Abstracts of the International Seminar on Interferon and Biotechnology,Havana,1989.-S06.066.

19. Гуща Т.О.,. Клименко И.В., Корнелюк А.И. Конформационная подвижность полипептидной цепи тирозил-тРНК синтетазы по данным флуоресцентной спектроскопии //Тезисы докладов VI Всесоюзного координационного совещания по спектроскопии полимеров,Минск,25-28 октября,1989.-С.37.

20. Гнатенко Д.В.,Коркелюк А.И. .Мацука Г.Х.Изучение функциональной роли остатков лизина тирозил-тРНК синтетазы из печени быка методом химической модификации о-фталевым альдегидом//Доклады АН УССР.Сер.Б.-1991.-N5.-С. 140-143.

21. Гнатенко Д.В..Корнелюк А.И., Мацука Г.Х. Роль электростатических взаимодействий в реакции аминоацилирования TPHK, катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой//Доклады АН УССР.-1991.- N 6.- С.145-148.

22. Гнатенко Д.В..Курочкин И.В..Рибкинска Т.А..Коркелюк А.И..Мацука Г.Х. Выделение и характеристика функционально активной протеолитически модифицированной формы тиро-зил-тРНК-синтетазы из печени быка//Укр. биохимический

- 38-

журнал.- 1Q91.- t.63,N 4.- С.61-67.

23. Kornelyuk A.I..Gnatenko D.V. .Rybkinska T.A..Matsuka G.Kh. Characterization of two forms of tyrosyl-tEMA synthetase from bovine liver //Abstracts of International Conference "Protein Biosynthesis", Pushchino, 1991, P.75.

24. Клименко И.В., Корнелюк А.И. Равновесная динамика тиро-з!1Л- тРНК синтетазы по данным температурного тушения трпптофановой флуоресценции // Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров, Харьков, 1991,- С.41.

25. Гнатенко Д.В..Коркелюк А.И..Мацука Г.Х. Тиро-зил-тРНК-синтетаза из печени быка. Изучение функциональной роли остатков гистидина//Биоорганическая химия. -1991.- т.17, N 8.-С.1033-1037.

26. Gnatenko D.V.,Kornelyuk A.I.Matsuka G.Kh. Tyrosyl-tRMA synthetase from bovine liver: functional role of histidine and lysine residues // Abstracts of 8th International Conference of Young Scientists on Organic and Bioorganic Chemistry, Riga,1991. -P.142.

£7. Рибкикска Т.A., Вартанян 0.A., Оилоненко В.В., Сидорик Л.Л., Корнелюк А.И..Берестень С.О.Метод селекции гибридом, секретируыдих моноклинальные антитела, основанный на энэшатической активности ферментаУ/Биополимеры и клетка. -1990. -т. 6, N4. -С. 97-101.

28. Гнатенко Д.В..Корнелюк А.И..Лаврик 0.И.Изучение функциональной роли остатков лизина в эукариотической тиро-зил-тРНК синтетазе методами хшических модификации/Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Химия белков".

Тбшшси, 1990.-С .120.

29. Гуща Т".О,, Клименко И.В., Корнелюк А.И. Наносекундная конфирмационная подвижность тирозил-тРНК синтетазы в растворе по данным тушения триптофановой флуоресценции // Докл.АН УССР.Сер.Б.-1990.- N 7.-С.77-80.

30. Klimsnko I.V., Guscha Т.О., Kornelyuk A.I. Conformational mobility of polypeptide chain of tyrosyl-tRNA synthetase studied by fluorescence spectroscopy //Abstracts of VI Symposium on Optical Spectroscopy, Neubrandenburg, BDR, 1990.-P.87.

31. Гнатенко Д.В. .Корнелкзк А.И. .Курочкин И.В. .Мацукз Г.Х. Высокомолекулярный лабильный комплекс тирозил-тРНК-син-тетазы из печени быка//Биополимеры и ¡слетка.-1991.- т.7, Н 1.-С.63-59.

32. Курочкин И.В..Корнелюк А.И..Мацука Г.Х. Взаимодействие эукарнотической т:фозил-тРНК-синтетазы о высокомолекулярными РНК/'/Молекулярная биология.-1991,- т.25, ЯЗ.-С.779-785.

33. Kornelyuk A.I..Gnatenko D.V..Matsuka G.H.,Lavrik 0.1. Evidence for essential histidine and lysine residues in tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver//14th International tRHA Workshop, Rydzyna, 1991.-P.173.

34. Рибкикскз Т.А..Береотень С.Ф..Корнелюк А.И.,Мацука Г.Х. йммунохимический подход к изучению структуры .тирозил-тРНК синтетазы из печени быка//Биополимеры и клетка. -1091,- т.7, N 5.-С.33-36.

35. Клименко И.В., Гуща Т.О., Корнелюк А.И. Свойства трипто-фановой флуоресценции двух форм тирозил-тРНК синтетазы из печени быка//Еиополимеры и клетка.-1991.-т.7,М 6.-С.

83-88.

36. Гнатенко Д.В..Корнелюк А.И.,Лаврик О.И. Химическая модификация остатков лизина тирозил-тРНК синтетазы из печени быка о помощью пирцдонсаль-Б'-фосфата/УБиохимия.-1991.-Т.Б8, N 11- С.56-60.

37. Клименко И.В., Корнелюк А.И. Поляризация флуореоценции и вращательная подвижность остатков триптофана эукариоти-ческой тироэиЛ'-тРНК синтетазы // Тезисы докладов VI-го Всесоюзного совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение".Москва, 1992.-С.19-20.

38. Gnatenko D.V..Kornelyuk A.I..Matsuka G.Ch. One lysine residue of tyrosyl- tRNA synthetase from bovin liver is critical for amino- acylation of tRNATvr//Absraots of 21th FEBS Meeting, Dublin,1992, Supplementary Abstracts.- Tu-180.

39. Kornelyuk A,I..Klimenko I.V..Kalachnyuk L.G.,Odynets K.A. Conformational changes of mairanallan tyrosyl-tRWA synthetase in the oourse of tyrosyl adenylate formation and cognate tRNA binding: revealed from fluorescence energy transfer measurements// Abstracts of 15th International tRNA Workshop« Cap d'Agde, France, May 30 - June 4,1993. -P.344,

40. Kalachnyuk L.G..Gnatenko D.V..Odynets K.A..Kornelyuk A. I..Matsuka G.Kh. The contaots of bovine tRNATvr with tyrosyl-tRNA synthetase studied by footprinting experiments //Abstracts of lBth International tRNA Workshop, Cap d'Adge, France, May 30 - June 4, 1933.-P.341. .

41. Gnatenko D.V..Klimenko I.V..Kornelyuk A.I., Odynets K.A. Conformation fluctuations of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase in solution studied by fluorescence spectro-scopy//Abstracts of 22nd Meeting of the FEBS,Stockholm, Sweden,July 4-9,1993.-P.190.

42. Клименко И.В., Корнелюк А.И., Мацука Г.Х. Конформацион-ное изменение тирозил-тРНК синтетазы из печени быка при взаимодействии о гомологичной тРНК по данным флуоресцентной спектроскопии//Биополимеры и клетка.-1993.-т.9,N 6.-С.29-33.

43. Kornelyuk А.I.,Klimenko I.V. Fluorescence spectroscopic study of intramolecular dynamics of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase in solution//Abstracts of International School "Understandins Protein Motion", Stockholm,1994.-P.34.

44. Kornelyuk A.I..Klimenko I.V..Odynetz K.A. Conformational changes of mammalian tyrosyl-tRNA. synthetase in the course of specific interaction of cognate tRNATyr//Abstraots of International School "Understanding Protein Motion", Stockholm,1994.-P.35.

45. Kornelyuk A.I..Klimenko I.V..Odynets K.A.Conformational change of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase induced by tyrosyl adenylate formation/ZBiochemistry and Molecular Biology International.-1994.- v.35.-P.

- 42 -

Komeluyk A.I. Structural and functional investigation of eukaryotic tyrosyl-tRNA synthetase.

Doctor of Sciences Dissertation, specialization 03.00.03 - Molecular Biology, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine,Kiev,1994.

The materials of 45 scientific publications of the studies of structural and functional organization of tyrosyl-tRNA synthetase from higher eukaryots are defended. It has been established that tyrosyl-tRNA synthetase reveals the multiple molecular forms and has a rRNA affinity.Enzyme active site contains His, Lys and Cys residues. The dynamical model of tyrosyl-tRNA synthetase action is proposed according which the intramolecular dynamics" determines the conformational changes in the course of substrate binding.

Корнелюк А.К. Структурно-функциональное исследование эу-кариотической тироэил-тРНК синтетазы.

Диссертация на соискание ученой степени доктора Биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев,1995.

Защищается 45 научных работ, которые содержат материалы экспериментальных исследований структурно-функциональной организации тироэил-тРНК синтетазы высших эу-кариот. Обнаружена множественность молекулярных форм фермента и изучены их особенности. Тирозил-тРНК синте-

- 43 -

таза обладает зволюционно приобретенным сродством к рРНК. АкТивний центр синтетазы содержит остатки His,Lys и Cys. Предложена динамическая модель функционирования тироэил-тРНК синтетазы в реакции " аминоацилирования тРНК, согласно которой внутримолекулярная динамика белка определяет конформационные изменения синтетазы при взаимодействии о субстратами.

Кличов1 оловаг еукар!оти, тирозил-тРНК синтетаза, множинн!сть форм, активний центр, конформац!йн1 зы!ни.