Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тирозил-тРНК-синтетаза из печени быка. Изучение функциональной роли отдельных аминокислотных остатков методами химических модификаций

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Тирозил-тРНК-синтетаза из печени быка. Изучение функциональной роли отдельных аминокислотных остатков методами химических модификаций"

ГС>ттоиА поит ^ А т Л ОРР^НЛ ТЮ*''«^!!

ч^г 4404 »л »У и ш иг уЦ^Пп (ЦГ.г ди_»и 1 иЛГ иДии

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи УДК 577.152.6

ГНАТЕНГО Дмитрий Витальевич

ТИРОЗИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА ИЗ ПЕЧЕНИ БЫКА. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСГОГНЫХ ОСТАТКОВ МЕТОДАМИ ХИМИЧЕСКИХ ЗДИСИКАЦИЙ.

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа выполнена в отделе структуры и функции нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Научные руководители:

академик АН УССР, доктор биологических наук,

профессор Г.Х. МАЦУКА,

кандидат биологических наук А.И.КОРНЕЛКК

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.П.ВИНОГРАДОВА доктор биологических наук, профессор В.К.КИБИРЕВ Ведущее учреждение Институт биохиши АН УССР Защита состоится "¿4 " 199 4 года в JO_ часов

на заседании специализированного совета Д 061.11.01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, Киев-143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР

Автореферат разослан "Л" tv^oboj 199/ п.

Учёный секретарь специализированного совета ' кандидат биологических наук ;/.7,-.;'<лЧ Л.Л.ЛУКАШ

J <

и

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Аминоацил-тРЧК-синтетазы КФ 6.1.1.) играют ключевую роль на дорибссомном ят&пе биосинтеза белка, ¡катализируя строго специфическое образование аминоашл-тРНК. Механизм функционирования ашноашл-тРНК-синтетаз. обеспечигаюших высокоточную реализацию генетической информации в процессе биосинтеза белка, остаётся одной из главных проблем современной молекулярной биологи. 1.

Особый интерес в последнее время представляет изучение амино-аиил-тРНК-синтетаз из высших эугариот, которые характеризуются более сложной структурой по сравнению с синтетазами прокариот. Для аминоаиил-тРНК-синтетаз высших кукариот обнаруживается, как правило. множественность молекулярных форы, однако свойства отдельных форм изучены крайне недостаточно.

Информация о структуре активного центра и каталитическом механизме для аминоадил-тРНК-синтетаз из вкспих эукариот также остаётся весьма ограниченной. В то же время представляет существенный интерес при отсутствии данных о точной пространственной структуре исследование роли отдельных аминокислотных остатков этих ферментов с помощью химических методов, что позволяет моделировать строение активного центра фермента. С другой стороны изучение Функциональной роли отдельных аминокислотных остатков методами селективных химических модификаций может быть вадаым этапом для последующего структурно-функционального анализа фермента методами белковой инженерии.

Цель работы. Целью настоящей работы было изучение функциональной роли отдельных аминокислотных' остатков в тирозил-тРЧК-син-тетазе (КФ 6.1.1.1, Ь-Тирозин: тРНКТуг лигаза) из печени быка методами селективных химических модификаций. Эти исследования выполнены на функционально активной протеолитически модифицированное форме тирозил-тРНК-синтс-тазы с молекулярной массой 2 х 39 кДа, для которой проведено изучение физико-химических и каталитических свойств и разработана схема очистки до гомогенного состояния.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана методика получения в гомогенном состоянии функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил-тРЖ-скнтегаэы из печени быка. Показано, что, как и основная форма фермента (2 х 59 кДа), эта форма является димером оС? -типа с молекулярной кассой субъединицы 39 кЛа, изучены её физико-химические свойства. Олрадег

лекы ¡саталитические параметры этой формы тирозил-тРНК-синтетазы п^ реакции аминоацилирсвания тРНН?.'" (К^ = 1.19 мкМ; k cat = 2,33 мин" которые являются близкими к соответствующим величинам для основной формы фермента (К^=0.75 мкМ. к =£,97 мич~ ).

Определено количество электростатических контактов между ти-розил-тРЖ-синтетазой и тРНКТугв реакции аминоацилирования в рамках двух приближений - Дебая - Хюккеля и Дауна.

Изучена роль положительно заряженных остатков лизина в функционировании тирозип-тРНК-синтетазы с использованием химических модификаций л-фталевым альдегидом и пиридоксапь-5' -фосфатом. Показано, что остатки лизина являются существенными на второй стадии реакции аминоацилир'ования тРНК - комплексообразовании фермента с тРНК1уги переносе аминокислотного остатка на тРИК^У1".

Показано, что избирательная модификация остатков гистидина тирозил-тРНК-синтетазы диэтилпирокарбонатом приводит к инактивации

феомента как в оеакаии аминоацилирования тР1й^уг. так и в реакции

-52

ATP-l Р]пирофоефатного обмена. Два наиболее реакционноспособных остатка гистидина локализованы в каталитическом центре фермента, причём все субстраты защищают фермент от инактивации.

Результаты работы имеют теоретическое значение б плане выяснения строения активных центров зукариотических аминоацил-тРНК-синтетаз.

Основные выводы данной работы используются в лекционном курсе "Генетическая знзимология" для студентов биологического факультета Киевского государственного университета имени Т.Г. Шевченко.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы (158 названий). Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержат 32 рисунка и 4 таблицы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на V Украинском биохимическом съезде (Ивано-Сранковск,1987), 5-ой конференции молодых учёных социалистических стран по биоорганической химии СПушино, 1988), 8-ом всесоюзном симпозиуме "Химия белков" (Тбилиси, 1990), 14-ом Международном рабочем совещании по тРНК (Ридзина, 1991), Международном симпозиуме "Биосинтез белка" (Пушено, 1991), 8-ой Международной конференции молодых учёных по биоорганической химии (Рига, 1991).

МАТЕРИАЛЫ И ШТОДЫ.

Функционально активную лротеслитически модифицированную форму тирозил-тРНК-синтетазы и& печени быка выделяли, используя фракционирование белков осаждением при рН 5.0 и ряд хроматографических стаций очистки на различных носителях: ЛЕАЕ-целлюлозе в трис-НС1 буфере (рН 7,9); фосфоцеллюлозе в калий-фосфатном буфере СрН 6,8); ВЭКХ на гидроксиапатйте. Все процедуры по выделению фермента провопили при температуре +4°С в присутствии одного ингибитора Сериковых протеаз- фенилметилсульфонилфторида (1 - 0,1 мМ).

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм и по методу Брэдфорда (Bradford, 1376). а таклк оценивали по интенсивности собственной триптофано-вой флуоресценции белков. Определение ферментативной активности тирозил-тРНК-синтетазы на обеих стадиях катализируемой реакции проводили,как описано ранее (Коркелмк и др, 1988).

Молекулярную массу тирозил-тРНК-синтетазы в нативньк условиях определяли методом гель-фильтрации (Andrews. 1964), в денатуритую-ш условиях - методом гель-электрофореза (Laemnli, 1970). Двумерное разделение и изоэлектрофокусировакие белков проводили на автоматизированной системе "F^ast.-System".

Кинетические параметры тирозил-тРНК-синтетазы определяли по методу двойных обратных координат. Расчёты производили на ПЭВМ IBM PC/XT.

Модификацию остатков лизина л-фталевым альдегидом (ОФА) проводили согласно (Gcodno et.al.,1981), регистрируя увеличение флуоресценции при длине волны 455 нм при возбуждении на 350 нм.

Модификацию остатков лизина пиридоксаль-5'-фосфатом СПФ) проводили в калий-Фосфатном буфере, рН 8,0, при 37°С. Продукт взаимодействия £-аыиногруппн лизина с ПФ восстанавливали обработкой 0,01 М ЛаВД,.. Концентрацию модифицированных остатков лизина определяли по увеличению поглощения на длине волны 325 нм. используя

■Л —1 —1

молярный коэффициент экстиккции ¿=1,05 х 10 М х см ">.

Модификацию остатков гистидпна дизтилпирокарбонатом (ДЭПЮ проводили в 0.1 М калий-фосфатном буфере, рН 6.0, при комнатной температуре. Кинети модификации гистидиновых остатков регистси-ровали по увеличению поглощения при ¿лине волны "40 нм. Для расчй-та количества модифицированных остатков гистидина использовали ве-

личину ко&ффициента молярной зкстинции ¿"=3200 М х см 1 (при концентрации ДЭПК в пробе 1,15 мМ ) согласно (Р!оо£е;гап1,1978). Модифицированные остатки гистидина восстанавливали инкубацией с 0,5 М гидроксиламином. рН 7.0, при 4°С, в течение 24 часов.

Препарат суммарной тРПК из печени быка получали депротеиниза-цией ткани фенолом с последующей хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе (ВгипггаЬег, 1967) и обогашдпи хроматографией на ВО-целлюлозе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение и физию-химические свойства функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил-тРНК-син-тетазы из печени быка.

Длй выделения этой формы тирозил-тРН^-спнтетазы предложена схема, включающая следующее этапы: гомогенизация ткани, фракционирование белков осажд<=ни«м при рН 5,0, хроматография на ДКАЕ-целлюлозе, хроматография на фосфоцеллюлозе и ВЗЖХ на окси&латите. Достигнута очистка тирозил-тРНК-синтетазы но активности в 5374 раза по сравнению с исходным экстрактом (таблица 1).

При выселении основной формы тирсзил-тРНК-синтетазы в присутствии двух ингиоиторой сериновых протеаз - фенилметилсульфо-

Таблица 1. Счистка Функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил тРНК-синтеТазы из печени быка.

Стадия очистки Белок, иг

Удельная Общая Краткость Выход,

активность активность очистки %

-1 -1 -1 имп х мин х мг имп х мин

х 10

-3

х 10

-3

Исходный экстракт Фракционирование при рН 5.0 ДЕАЕ-цзллюлояа Фосфоцаллюлоза Гидрсксиалатит "В1о-С£1 НТРТ"

168 000

10 400 585 12,5

0,37

4.20 69.17 564,49

62 160

43 630 40 465 7 056

0,363 1988,19

1 100

И 187 1526

5374

70.3 65,1

11.4

-1x1

килфторида (®»СФ) и циизопропилфторфосфата в получаемом препарате не обнаруживается примесей функционально активных ферм фермента с меньшими молекулярными массами. Однако ранее было показано, что в ходе ограниченного протеолиза основной Форш тирозил-тРНК-синтета-зы (2 х 53 кДа) трипсином и зластазой вначале происходит образование формы фермента с молекулярной массой 2 х 33 кЛа, которая сохраняет Ферментативную активность (Курочкин, 1989). По-видимому, выделение тирозил-тРНК-синтетазы в присутствии только одного ингибитора - Ф«ЕФ - и введение з схему очистки стации фракционирования белков осаждением при рН 5.0 позволяет получать только функционально активную протэолитически модифицированную форму тиро-зил-тРКК-синтетазы без примеси основной формы фермента в результате неполного ингибирозакия протеолиза.

При гель-электрофорезе этой формы тирозил-тРНК-синтетазы в полиакрилашдном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата Ма на электрофореграмме выявлялась одна белковая полоса (рис. 1, дорожка 1). Сравнение злектрофоретической подвижности синтетазы с подвиж-ностями маркерных белков (рис. 1, дорожка 2) позволило оценить молекулярную массу полипептидной цепи этой формы фермента, которая составляет 39±1,5 кДа.

I .2

— 94 кДа

— 67 кДа 43 кДа

30 кДа

рис | Номер фракции

Рис.2

Рис.1. Электрофор-грамма функционально аотивной протполитически модифицированной формы тирозил-тРНК-синтетазы (1) Б присутствии маркерных белков (2) в денатурирующих условиях.

Рис.2. Гель-фильтрация функционально активной протеоллти-чески модифицированной формы тирозил-тРНК-синтетазы на колот«? ВЮ-ЗП ТБК-2Ё0. Стрелками отмечены пики алюции маркерных белкой.

Лазеоное денситометрированиг электроФореграммы показало, что чистота полученного препарата фермента составляет 93%.

По данным колоночной гель-хроматографии, молекулярная масса этой йормы тирозил-тРИК-синтетазы в нативнах условиях составляет 84£4кДа (рис. 2). Данная форма тирозил-тРНК-синтетазы. как и основная Форма фермента, имеет четвертичную структуру типа 2 .

Каталитические параметры полученной наш протеолитически модифицированной и основной форы тироуил-тРНК-синтетазы представлены в таблице 2. liât: можно видеть, каталитические характеристики протеолитически модифицированной формы. Км и kcat, близки к соответствующим величинам для основной Формы Фермента.

Поскольку протеолитически модифицированная форма фермента имеет меньшую длину полипептидной цепи и полностью сохраняет каталитическую активность на обеих стадиях реакции аминоацилирования тРНКь. она является удобным объектом для изучения каталитического механизма эукариотической тирозил-тРНК-синтетазы.

Исследование аминокислотного состава функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил-тРНК-синтетазы (таблица 3) показало, что отшепляемый фрагмент полипептидной цепи длиной 20 кДа характеризуется высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков лизина (46 остатков из общего числа 57 на одну субъединицу фермента), а татсе имеет выраженный гидрофобный характер.

Установлено, что изоэлектрическая точка основной белковой полосы тироаил-тРНК-синтетазы соответствует pi 5,5 (рис. 3), однако наблюдается также несколько минорных полос, которые имеют изо-злектрические точки в диапазоне pi 5.2 - 6,0. Подобная гетерогенность по pi злектрофоретически гомогенного белка не является необычной для эукариотических аминоацил-тРНК-синтетаз (Lorber et.al., 1987) и может, по-видимому, объясняться различиями в посттрансляционных модификациях фермента.

Двумерное разделение препарата тирозил-тРНК-синтетазы (рис. 4) показало, что на электрофореграмые выявляется одна белковая полоса. Молекулярная масса этой полосы составляет 82 ± 4 кДа, что соответствует молекулярной массе функционально активной протеолитически модифицированной формы тирозил-тРНК-синтетазы в нативных условиях. Значения pi этой полосы (pi 5,1 - 6,0) соответствуют значениям pi исследуемой формы тироэил-тРНК-синтетазьГ.

Таблица 2. Каталитические характеристики протоолитичоски модифицированной и основной форм тирозил-тРНК-синтетазы.

Форма ксаЬ ти~1

Ь-тирозин, АТР, мкМ ' мМ тРНКТуГ мгсМ

АТР-пирофссфаткый обмен

о X 39 ООО 29 0,60 - 300

2 х 59 ООО 23,5 0.29 - 230

Ашноацилирование тРНК

о х 39 ООО 1,5 0.160 ' 1,19 2,99

о А, х 59 ООО 1.0 0.125 . 0.75 2.97

Расчёты проводили по программе "ЕгсП^ег". Таблица 3. Аминокислотный состав основной и протеолитически модифицированной форм тирозил-тРНК-синтетазы из печени быка

Аминокислота Основная Протеолитически

форма модифицированная форма

2 х 59 000 1 Мр 2 х

А1а 31 25

АГ£ 18 18

Ай-р + Азп оо «-"А. 23

61и + Б1п 44 за

49 30

Суз 32 п

НАэ 10 8

Не 21 11

Ьеи 70 28

Ьуэ 57 11

МеЪ 3 8

РПе 25 10

Рго 19 18

Зег 39 19

ТЬг 17 14

Тгр 6 3

Туг 14 7

Уа1 47 22

р!

_ 9,30

— М5

— 0,15

----7,ЗЪ

_ 6,55

5,65 5,20 ■ 4,55 . 3,50

р1 У,И0 8,45 6,85 5,20 4,55 3,50

42

Анод

Рис.3

670 440

232 140

Рис.4

Рис.3. Изоэлектрофокусирование тирозил-тРНК-синтетазы.

Рис.4. Злектрофореграмма двумерного разделения тиро-зил-тРНК-синтетазы. Стрелками отмечены положения маркерных белков.

2. (количественная оценка электростатических взаимодействий между тиразил-тРНК-синтетазой и тРНК^3?

Известно, что электростатические контакты играют существенную роль во взаимодействии белков с нуклеиновыми кислотами. Нами проведено количественное изучение ионных взаимодействий функционально активной протеолитически модифицированной формы пуклриотичоской тирозил-тРНК-синтетазы с тРНК в рамках двух приближений - Дебая -

Хюккеля и Дауна - по влиянию ионной силы на 1С, и V для тРНК?уг

11 шах

в реакции ашноацилирования.

В рамках приближения Дебая - Хюккеля взаимодействующие частицы рассматриваются как сферические макроионы равных радиусов, много больших, чем радиусы их противоионов. Согласно этому подхода между тирозил-тРНК-синтетааой и тРНКТуг в первом приближении образуется 4 электростатических контакта .

Приближение Дауна рассматривает взаимодействие аминоацил-тР№ синтетаза - тРНК в рамках теории полиэлектролитов, где участс; тРНК, контактирующей с молекулой фермента, рассматривается как цилиндрический полиэлектролит. В рамках модели Дауна число электростатических контактов между тирозил-тРНК-синтетааой и тРНК?у: равно 2 .

Подобное расхождение результатов количественной "оценки ионньг

взаимодействий между tFKK и ашноацил-тРШ-синтетазами при использовании двух подходов отмечали и раньше (Гаврик, 1981). Представляется более обоснованным подход, предложенный Дауном, так как цилиндрический полизлектролит является более адекватной моделью пространственной структуры tFHK, чем сферический макроион, предложенный в качестве модели тРНК в приближении Дебая - Хюккеля. Однако как из одной, так и из другой модели можно сделать обший вывод

- электростатические контакты играют существенную роль во взаимодействии двух в целом отрицательно заряженных биополимеров - тиро-зил-тРНК-синтетазы и tPHKlj".

3. Специфическая химическая модификация остатков лизина тиро-зил-тРНК-синтетазы.

Ашкоацил-тРНК-синтетазы взаимодействуют с двумя отрицательно заряженными субстратами нуклеотидной природы - АТР и тРНК.Положительные заряды на поверхности молекулы белка при физиологических зьачениих рН могут нести аминокислотные остатки лизина, аргинина и. при определённых условиях, гистидина. Для изучения функциональной роли остатков лизина функционально активной прстеолитически модифицированной формы тирозил-тРЖ-синтетазы проведена химическая модификация зтих остатков двумя реагентами - л-фталевым альдегидом (ОФА) и пиридоксапь-5'-фосфатом (ПФ).

■ Продукт реакции модификации остатков лизина ОФА обладает собственной флуоресценцией с максимумом при Х= 455 нм при возбуждении на л= 345 нм, тогда как непрореагировавший ОФА в данной области не флуоресцирует. Это позволяет проводить прямое определение количества остатков лизина в молекуле белка, доступных для модификации этим реагентом, по интенсивности флуоресценции продукта исчерпывающей модификации белка ОФА. Показано, что 9±1 остаток лизина на субъедкницу ткрозил-тР1К~синтетазы доступны для модификации ОФА.

Мэдификация остатков лизина приводит к быстрой инактивации фермента в реакции аминоацилирования тРНК (Рис.5, кривая А). При соотношении 3 моля ОФА на 1 моль остатков лизина (Р=3) наблюдается 50%-ная инактивация фермента, а при Р-10 глубина инактивации достигает 90%. В то же время влияние модификации на активность фермента в реакции АТР-С^2РЗпирофосфатного обмена менее значительно

- при том же значении Р=10 глубина инактивации достигает только 10%.

Рис. 5. Зависимость остаточной активности тирозил-тРНК-синтетазы в реакциях

аминоашлирования тРНК~уг (А) Ъ"?

и АТР-[ Р]пирофосфатного обмена (Б)-от количества ОФА в растворе (Р, моль/моль лизина)

Другой из использованных нами реагентов, пири-доксаль-5'-фосфат, в силу особенностей своей структуры способен специфически ковапентно взаимодействовать с нуклеотидсвыэыааюшими центрами различных ¿еомектов (Basu et.al.,1989), модифицируя аминогруппы, локализованные внутри или в непосредственной близости от этих центров.

Наши исследования показали, что только 4 из 22 остатков лизина на димер тирозил-тРНК-синтетазы способны модифицироваться ПО (рис.6).

Гиперболическая зависимость серости инактивации фермента от концентрации ПО в начальный момент времени (рис.7) указывает на насыщающий характер взаимодействия реагента с ферментом и может, по-видимому, свидетельствовать в пользу псевдоаффинного характера взаимодействия ПО с тирозил-тРНК-синтетазой, то есть стадии модификации предшествует стадия образования комплекса ПФ с синтетазой (Диксон и др., 1982).

Кинетические кривые инактивации тирозил-тРЧК-синтетазы пири-доксаль-5'-фосфатом на обеих стадиях катализируемой реакции в присутстьии различных субстратов представлены на рис.8. Можно видеть, что исчерпывающая модификация остатков лизина фермента (4 остатка на димер) приводит к аначителоной ( > 00%) инактивации синтетазы в реакции аминоацилирования тРНК и не оказывает существенного влияния на активность в реакции АТР-пирофосфатного обмена. тРНКТуг обладает наибольшим защитным эффектом от инактивации в начальный период времени.

Изучение скорости модификации тирозил-тРНК-синтетазы ПФ в присутствии АТР и тРНК С рис.9) показало, что наибольшим защитным

60 90 120 Вреда, шн

Рис. 6

й

и

¡5

в к td 5

t< о о р. о к о

I 5

Концентрация Ш, мМ

Рис.7

Ргс.б. Модификация остатков лизина тирозил-тРНК-синтетазы ПФ во времени при разной концентрации реагента (А - 5 мМ ПФ, Б - 1 мМ ПФ).

Рис.7. Зависимость скорости инактивации тирозил-тРНК-синтета-зы в начальный момоит времени п реакции аминоацилирования тРНК^У37 от концентрации ПФ.

Рн & -

Й aj « >Q< К К К Pf СО

о к 2 Ч

о « (ч о

Е* М

о ен

CD CJ

д* н ts о ч о

мин

15 30

Время, мин Ряо.9

Рис.8. Кинетические кривые инактивации тирозил-тРНК-синтетазы

хЬ

ПФ в реакциях аминоацилирования (кривые А-Г ) и АТР-С РЗпиро-фоофатного обмена (Д,Е) в присутствии различных субстратов: А,Д -без субстратов; Б - 1 мМ АТР; В,Е - 1 ыМ АТР, 10 мкМ тирозин; Г -2,3 шМ тРШ^.

Рис.9. Модификации остатков лизина тирозил-тРНК-синтетазы ПФ в отсутствие субстратов (А), в присутствии АТР /1 мМ/ (Б) ив

присутствии т

РИС71

/2,3 мкМ/ (В).

эффектом от ковалентного присоединения ПФ в начальный период времени обладает тРНКГуг. При инкубации в течение 30 мин тРН#Уг защищает от модификации 1 остаток лизина на димер фермента.

Учитывая1 что модификация остатков лизина не влияет на активность тирозил-тРНК-синтетазы в реакции АТР-пирофосфатного обмена, можно сделать вывод, что модифицируемые ПФ остатки лизича несущественны для этой реакции. По-видимому, ПФ связывается по нуклео-тидсвязызашему центру тирозил-тРНК-синтетазы, отличному от АТР-связываюшего центра. Защитные эффекты при модификации и инактизации фермента в реакции аминоашлировашя тРНК, вызываемые АТР и тирозином могут, по-видимому, объясняться конформационныш изменениями, возникающими при связывании этих субстратов и при катализе первой стадии реакции аминоацилирования тРНК. Наличие конформационных изменений при связывании тирозина и АТР и при катализе первой стадии реакции аминоацилирования показано для тирозил-тРНК-синтетазы из

Bacillus steaiotherraoDhilus (Monteilhet et.al.1978).

Туг'

То, что тРНК наиболее эффективно защищает тирозил-тРНК-син-тетазу как от инактивации, так и от модификации ПФ, а модификация остатков лизина ПФ приводит к глубокой инактивации фермента в реакции ашкоацилирования позволяет говорить о том, что ПФ модифицирует остатки лизина, существенные на второй стадии реакции аминоацилирования тРНК

Анализируя зависимость активности тирозил-тРНК-синтетазы в реакции аминоацилирования тРНК от количества модифицированных остатков лизина (рис.10) можно видеть, что модификация одного остатка лизина на димер фермента приводит к инактивации синтетазы на Ü0Z. Можно предположить, что в данном случае имеет место проявление антикооперативных взаимодействий между тРНК-связываю-щими центрами двух субъединиц тирозил-тРНК-синтетазы, как зто имеет место для тирозил-тРНК-синтетазы из Bacillus stearothermophilus (Jones et.al.,1085). Связывание ПФ и модификация наиболее реакци-онноспссобного остатка лизина в тРНК-саязывающем центре одной субъединицы приводит к снижению активности аналогичного центра другой субъединииы фермента. В пользу этого предположения говорит также анализ кривых на рис.6.

Сравнение данных по химической модификации остатков лизина тирозил-тРНК-синтотази двумя реагентами - ОФД и ПФ - пасазивает их сходный характер и позволяет говорить о том, что остатки лизина

Рис.10. Зависимость остаточной активности тироэил-тРНК-сннтета-зы в реакции аминоацилирования тРНК от количества модифицированных IT2 остат!сов лизина.

существенны на второй стадии реакции ашноацилирования - комп-лексообразовапии фермента с тРНК и/или переносе аминокислотного остатка на tPHKTj3; Сходные результаты получены при исследовании функциональной роли остатков лизина фешлалашл-тРШ-синтетазь? иэ E.coli (Горшкова и др, 1381).

4. Специфическая химическая модификация oct&ticob гистидина тирозил- тРНК-синтетазы.

Для изучения функциональной роли остатков гистидина проведена модификация фермента с помощью диэтилпирокарбоната (ДЭПК). Это соединение реагирует при нейтральных и Щелочных pH с боковыми цепями нескольких аминокислотных остатков с образованием этоксикар-бонильных производных, однако при pH 6,0 взаимодействует только с азотом ишдагола гистидиновых остатков (Mühlrad et.al.,1967). Модификация фермента в нативных условиях показала, что при концентрации ДЭПК 0,31 мМ (Р=15) реакция модификации заканчивается через 15 минут, при этом модифицируются 5 остатков гистидииа на ди-мер (рис.11, кривая В).

Спектр поглощения тирозил-тРНК-синтс-тазн, модифицированной ДЭПК не обнаруживает отклонений от спектра поглощения немодифици-рованниго фермента в области 260-280 нм. что может свидетельствовать об отсутствии побочной реакции модификации остатков тирозина ( Bavert et.al.,1989). Модификация тирозил-тРНК-синтетаэы в денатурирующих условиях показала наличие 16±1 остатков гистидина на димер. доступных для модификации этим реагентом.

Инкубация тирозил-тРНК-синте^азы с ДЭПК при Р=15 приводит

V. 100

S 60

н

S 40

Количество модифицированных остатков лизина.

S 10 Время, мин

Рис.11. Инактивации тирозил-тРНК-синтетазы ДЭПК в реакциях Tvp

аминоаь'илирования тРНК J (А), АТР-[ F1 пирофосфатного обмена (Б) и модификация остатков гистидина ДЭПК (В) во времени.

инактивации фермента на обеих стадиях катализируемой реакции (рис.11). Гель-злектрофорез модифицированного ДЭПК фермента в на-тивных условиях показал отсутствие диссоциации фермента на субъединицы, чем мозкно было бы объяснить инактивацию синтетазы. Модификация двух наиболее реакционноспособных остаткоз гистидина приводит к значительному снижению каталитической активности - в реакции аминсяцили^ования тРНК глубина инактивации составляет 90%, а в реакции АТР-С^Р] пирофосфатного обмена - 72%.

Инкубация модифицированного ДЭПК фермента с гидроксиламином приводила к полному исчезновению разностного поглощения при 240 ни, что указывает на восстановление остатков гистидина (Аваева и до., 1975). При атом наблюдается восстановление ферментативной активности в реакции аминоацилирования га 30% , в реакции АТР-пиро-фосфатного обмена - на 90% от исходной активности. Инактивация ти-розил-тРНК-синтетазы ДЭПК обусловлена образованием монокарбз-токсипроизводных наиболее реакционноспособных остатков гистидина, а не дикарбэтоксипроизводных этих остатков, так как последние не могут восстанавливаться инкубацией с гидроксиламином (Аваева и др., 1975).

Изучение влияния различных субстратов на скорость инактивации тирозил-тРЖ-синтетазы ДЗПК в начальный период времени показало, что все субстраты в определённой степени защищают фермент от инакг тивации (таблица 4). Так как АТР в присутствии тирозина обладает значительным защитным эффектом, большим, чем эти же субстраты в отдельности, можно предположить, что остатки гистидина существенны на стадии образования тирооиладенилата. Более глубокая инактивации фермента в реакции аминоацилирования может, по-видимому, объясняться тем, что остатки гистидина существенны и на второй стадии реакции аминоацилирования тРШТуг.Анализ сходных данных, полученных при модификации ДЭПК триптофанил-тРНК-синтетазы из поджелудочной железы быка, позволил авторам (Favorova et.al., 1378) предположить существенную роль остатков гистидина на каталитических стадиях реакции ашноашлирования •гРНК^Р.

Таким образом, по совокупности полученных результатов можно

предположить, что остатки гистидина эушриотической тирозил-тРНК-

синтетазы существенны на каталитических стадиях реакции ашноаци-Туг

лирования тРИК .

Таблица 4. Влияние различных субстратов на инактивацию тирозил-тРНК-синтетазы диэтилпирокарбонатом.

Субстрат Концентрация, тМ Остаточная активность, %

АТР- С пирофос-фатный обмен Аминоацили-рование тРНК

j93 субст ратов 28 9

Тирозин- 1 71 73

Тирозин + 1

< АТР 5,4 98 82

АТР 5,4 95 72

тРНКТУг 0,0021 57 52

выводы.

1. Разработана методика выделения в гомогенном виде функционально активной протеолптически модифицированной формы тирозил-тРНК-синтетазы из печени бкка б условиях неполного ингибирования протеольза. Очистка по актиз.чости составляет 5374 раза, выход -1,2%.

2. Молекулярная масса этой формы тироаил-тРНК-синтетазы в денатурирующих условиях составляет 39 - 1,5 кДа, в нативных условиях -84 ±4 кДа. Зта форма, как и основная форма тирозил-тРНК-синтетазы (2 х 59 кДа), является димгром оС2 -типа. Каталитические характеристики модифицированной формы в реакции амикоацилировзния тРНК (К и » »,13 juM, kcnt =• 2,99 мин ) близки к соответствующим величинам, полученным для основной формы фермента ( 0,?5juM и 2,97 мин""1 соответственно). Отщепляемый в ходе- протеолиза фрагмент не существенен для каталитической активности, и содержат значительное количество остатков лизина, лейцина и галина.

3. Определено количество электростатических контактов между тирозил-тРНК-синтетазой и тРНКТуг в рамках моделей Дауна и Дебая • Хюккеля по влиянию ионной силы на каталитические константы в реакции аминоацилирования. оно составляет соответственно 2 и 4 электростатических контакта.

4. Методом химической модификации двумя реагентами - пири-

доксапь-5'-фосфатом и о-фталевш альдегидом показано, что остатки

лизина тирозил-тРИК-синтетагы существенны на второй стадии реакции

аминоацилирования тРНК- комплексообразовании фермента с тРНК и/или

Tvr

переносе аминокислотного остатка на тРНК. тРНК защищает фермент от модификации лиаинспеци^ическими реагентами. Модификация остатков лиаина не приводит к существенным изменениям активности фермой та в реакции АТР-[52Р]пирофосфатного обмена,

5. Мсгификация остатка гистидина с помощью диэтилпирокарбс-ната приводит к инактивации тирояил-тРНК-'синтетазы на обеих стадиях катализируемой реакции. Все субстраты в определенной мере защищают фермент от инактивации, АТР в присутствии тирозина защищает фермент наиболее аффективно. Сделано предположение об участии остатков гчртидииа в каталитических стадиях реакции аминоацилирования тРНК ,УГ

- 17 -

список

работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Гнатенко Д. В., Корнелюк А.И., Манука Г.Х. Изучение функциональной роли остатков лизина тирозил-тРНК-синтетаэы из печени ака методом химичекой модификации о-фталевым альдегидом. - Декады АН УССР. 1991. N 5, с.140-143.

2. Гнатенко Д.В.-, Корнелюк А.И., Мацука Г.Х. Роль электрос-зтических взаимодействий в реакции аминоацилирования тРНК атализируемой тирозил-тРНК-синтетазой. - Доклады АН УССР, 1991, 6. с. 145-148.

3. Гнатенко Д.В.. Курочкин И.В., Рибкинска Т.А.. Корнелюк .И., Мацука Г.X. Выделение и характеритика функционально активной ротеолитичеки модифицированной формы тирозил-тРНК-синтетаэы из эчени быка. - Украинский биохимический журнал,1991, т.63, N 4, .61-67.

4. Гнатенко Д.В.. Корнелюк А.И. . Мацука Г.Х. Тиро-ил-тРНК-сиитетаза из печени быка изучение функциональной роли катков гистидина. - Биоорганическая химия, 1991, т.17, N 8, .1033-1037.

5. Гнатенко Д.В.. Корнелюк А.И., Лаврик О.И. Химическая мо-ификация остатков л'.гаина тирозил-тРНК-сиктетазы из печени быка эмощью пиридоксаль-5'-фосфата. - Биохимия, 1991,.т.56, N 11, а.

6. Куроч!Син И. В., Рибкинска Т. А., Гнатенко Д. В., Корнелюк .И.. Мацука Г.Х. Гетерогенность тирозил-тРНК-синтетаэы из печени ^¡ка. - Тезисы докладов V-ro Украинского биохимического съезда, лев, 1987, с. 41.

7. Курочкин И.В., Гнатенко Д.В., Рибкинска Т.А., Корнелюк А.И. лрозил-тРНК-синтетаза из печени быка: выделение и характерис-лт. множественных форм фермента. - Тезисы докладов 5-ой конфе-гнции молодых учёных социалистических стран по биоорганической ,1мии. Пущино-на-Оке, 1988, с.54-55.

8. Kornelyuk A.I., Gnatenko D.V., Matsuka G.H., Lavrik 0.1. /idence for essential histidine and lysine residues in vTosyl-tRNA syntht ;ise from bovine liver. - 14th Irterr-at.ional •;,\'A Workshop, Rydnvna. 1991. P. 173.

9. Kurochkin I. V., Ribkinska T. A., Gnatenko D. V.. Kornelyu' A. I., Matsuka G.Kh. Tyrosyl-tRNA synthetase from beef liver: generation of multiple enzyme forms by endogenous proteolysis Abstracts of the International Seminar on Interferon an Biotechnology, Havana. 1989,808.606.

10. Гнатенко Д.8., Корнелюк А.И., Лаврик О.И. Изучение фун ционапьной роли остатков лизина в эукариотической тиро зил-тРНК-синтетазе методами химичеких модификаций. - Тезисы цок ладов 8-го всесоюзного симпозиума "Химия Белков",Тбилиси, 1990, 130.

11. Kornelyuk А.I., Gnatenko D.V., Ribkinska Т.А., Matsuka G Н. Characterization of two forms of tyrosyl-tRNA synthetase fro bovine liver. - Abstracts of International Conference "Protei Biosynthesis", Pushchino, 1991, P.75.

12. Gnatenko D.V., Kornelyuk A. I., Matsuka G.Kh Tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver: functional role о histidine and lysine residues. - Abstracts of 8th Internationa Conference of Young Scientists on Organic and Bioorgani Chemistry, Riga, 1991, P. 142.

Зак. 274 Формат 60x84/16. Уч.-изд.л. 1.0

Подписано к печати 18.11.91 г._Ткро*. 1С'0._____

Полиграфический участок Института теоретической физики АН Укра1