Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА ИННА АНАТОЛЬЕВНА

Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2005 г

Работа выполнена в Институте химической бисло( и и и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН)

Научный руководитель Научный консультант' Ивановна

к.х н Моор Нина Александровна д.х н.. профессор Лаврик Олыа

Официальные оппоненты

д б к. Зенкова Марина Аркадьевна к.х н. Зернов Юрий Петрович

Ведущая организация. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

на заседании диссертационного совета Д 003 045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

гю адресу 630090, г. Новосибирск-90, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «¿У» Я 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета д х н Федорова О С.

Защита, состоится ¿/2005 г в ^

часов

lOOG -fr

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Точность воспроизведения генетически заданной структуры белков зависит от способности аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) узнавать и эффективно аминоацилировать соответствующую тРНК. Многочисленные исследования по проблеме "узнавания" тРНК, выполненные с использованием генетических методов in vivo и кинетических экспериментов in vitro с мутантными тРНК, позволили установить, что правильный отбор и аминоацилирование тРНК достигается благодаря взаимодействиям aaRS с определенным набором нуклеотидных остатков тРНК, называемых "элементами идентичности" или "элементами узнавания". Элементы идентичности известны для всех 20 систем из Е. coli и для нескольких систем из дрожжей, Т. thermophilus и высших эукариот. Многостадийный процесс аминоацилирования тРНК включает связывание субстратов (аминокислоты, АТР и тРНК), конформационную перестройку комплекса, химическую реакцию в активном центре и освобождение продуктов. Данные об уровне распознавания тРНК на различных этапах взаимодействия получены лишь для ограниченного числа систем и показывают их индивидуальность не только в наборе элементов узнавания, но и выполняемых ими функциях. Известная структура ряда комплексов aaRS с тРНК позволяет понять механизм обеспечения специфичности на атомном уровне, но для многих систем не решена проблема продуктивного связывания акцепторного конца тРНК из-за ограничений, накладываемых условиями кристаллизации и возможным синтезом аминоацил-тРНК в кристаллах. С другой стороны, использование устойчивых аналогов аминоациладенилатов не всегда способствует функциональному связыванию акцепторного конца тРНК.

Фенилаланил-тРНК-синтетаза (PheRS) имеет редкую для aaRS сложную субъединичную структуру (аР)2-типа. Решена структура комплексов PheRS Т. thermophilus с отдельными субстратами (фенилаланином, тРНКРЬе) и фенилаланиладенилатом (Phe-AMP). Элементы узнавания тРНКРЬс идентифицированы в эволюционно различных организмах, но их биохимическая функция не исследована.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение функциональной роли элементов узнавания тРНКРЬе на стадии первоначального связывания PheRS Т. thermophilus и последующих перестройках комплекса в каталитически активную форму, в том числе индуцируемых низкомолекулярными субстратами.

В ходе исследования решались следующие задачи:

• изучение эффективности распознавания различных тРНК в процессе комплексообразования и выявление структурных элементов тРНКРЬе, ответственных за специфичность связывания с PheRS;

• исследование функциональной роли фенилаланина и АТР в продуктивном

связывании З'-конца тРНКРЬе; / гос. илциоил """

«ивдиот е?АНЛ"1 с. Пет«,

-»«Г

• исследование роли элементов узнавания тРНКРЬе в функциональной ориентации акцепторного конца, контролируемой низкомолекулярными субстратами.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые исследована эффективность распознавания тРНК в процессе комплексообразования с PheRS и выявлены структурные элементы тРНКРЬе, ответственные за специфичность связывания, путем измерения констант диссоциации комплексов PheRS Т. thermophilics с тРНК различной специфичности и мутантными тРНКРЬс (с помощью эффективного метода задержки комплексов в геле). Впервые изучена конформационная динамика взаимодействия PheRS Т. thermophilus с акцепторным концом тРНКРЬе с помощью аффинной модификации фермента аналогами тРНКРЬе, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды в определенных позициях З'-концевой последовательности: показано влияние фенилаланина и АТР и нуклеотидных замен в различных участках структуры тРНКРЬе на ориентацию З'-конца в комплексе с PheRS. Эффективные фотоаффинные аналоги тРНКРЬе, замещенные в З'-концевой позиции 4-тиоуридином (s4U) или 6-тиогуанозином (s6G), получены впервые с помощью ферментативных методов синтеза. Подобные аналоги могут оказаться полезными для исследований взаимодействия различных тРНК с aaRS и другими компонентами аппарата трансляции.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 9 тезисах докладов. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 18th tRNA Workshop "tRNA 2000" (Кембридж, 2000); International Conference "Trends in Chemistry of Nucleic acids" (Москва, 2000); IVth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic Science in ISTC Activities" (Новосибирск, 2001); International Conference "RNA as Therapeutic and Genomics Target" (Новосибирск, 2001); III Съезд Биохимического Общества, (Санкт-Петербург, 2002), Asilomar Conference on Aminoacyl-tRNA Synthetases in Biology, Medicine & Evolution, (США, 2002), International Conference "Targerting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference" (Новосибирск, 2003), International conference "Chemical and biological problems of proteomics" (Новосибирск, 2004).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 141 странице, содержит 39 рисунков, 18 таблиц, список цитированной литературы содержит 295 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Эффективность распознавания тРНК PheRS Т. thermophilus на стадии связывания

Для оценки эффективности распознавания различных тРНК в процессе комплексообразования' с PheRS и выявления структурных элементов, ответственных за" специфичность связывания, мы определили величины K¿

комплексов фермента с тРНКРЬе различного происхождения, рядом мутантных тРНКРЬе и неспецифичных тРНК с помощью неравновесного метода задержки в геле. Использованные мутантные тРНК содержали замены нуклеотидов 16, 20 (в D-петле), 34, 35 и 36 (в антикодоновой петле), 73 (в акцепторном конце), пар оснований 27-43, 28-42 (в антикодоновом стебле), третичных пар 19-56, 26-44 или тройственного взаимодействия 45-10-25 в тРНКРЬе Е coli (рис. 1, а). Аналогичные мутанты тРНКРЬе Е. coli, являющейся наиболее эффективным гетерологичным субстратом PheRS Т. thermophilus благодаря высокому уровню структурного сходства с тРНКРЬе Т. thermophilus (рис. 1, б), были использованы ранее для идентификации элементов узнавания в исследуемой системе.

* +А

С U С G

5 A + U, С, G

G» С С • G

е - С7о

С " G SG* С

о • с ^ и

а ua,ugagccu " usa^R'^'^cscc

А

с

с

« Е

G • С С • G С • его G-[C]/ А ■U mSG -I

76Л1-А2 В1,ВЗ

VYV-? СА^»ие<3и с U GSCGG И

<5АСЛА С и SS + <«n GÄ С" »=uTiac. га.- U'A'G cc'®gA ^Ш®

А"и * a'g^U cc-S-C ы^.сс-

А, G, С " G-C и G

JOG"C<0

А • U U А U А

А А»„ А, С ^ С и

»G-C »

А • f С А U iruaeA

Рис. 1. а — Структура тРНКРЬе-транскрипта Е coli', стрелками показаны замены в используемых мутантных тРНКРЬе. б - Структура тРНКРЬе Т thermophilus Нуклеотиды, образующие по данным РСА контакты с PheRS, обведены в квадратные рамки; G34, А35, А36 и А76 взаимодействуют с участием оснований. Обозначены тРНКРЬе-связывающие домены а- (AI, А2 и N-концевая биспираль СС) и ß-субъединиц (В1-В8); отмеченные звездочкой фрагменты относятся ко второму aß-гетеродимеру.

Для комплексов PheRS с немодифицированным тРНКРЬе-транскриптом Е coli и природной тРНКРЬе Т thermophilus мы определили одинаковые значения констант диссоциации (рис. 2, а и б; К$=5 нМ). Эти результаты свидетельствуют о том, что посттранскрипционная модификация тРНКРЬе не важна для комплексообразования.

1.1. Сравнение параметров связывания и аминоацилирования мутантных тРНКРЬе

Константы диссоциации комплексов PheRS с различными тРНКРЬе, измеренные нами с помощью метода задержки в геле, приведены в табл. 1, где для сравнения представлены известные кинетические характеристики аминоацилирования. Все мутации оказывают значительно большее влияние на значения Кд, чем на кинетические параметры.

PheRS о 4 15 25

(нМ)

- тРНК в кошпсксс

- несвАъшная тРНК

PheRS

(itM)

6

6 10

♦-тРНК в кичтиих несвячаиндя |РНК

PheRS <иМ)

О 20 50 100 200 0 «F4-

тРНК* в комплексе

—несвя jdHHiix тРНК

Рис. 2. Разделение продуктов комплексообразования PheRS Т thermophilus с субстратными iPHKphe. тРНКр -транскриптом Е coli (а), природной тРНКРЬе Т thermophilus (б) и 034С/А35и-мутантным

транскриптом (в) с помощью электрофореза в нативных условиях. Сверху указаны концентрации PheRS в пробах.

Из сравнения эффектов мутаций следует, что нуклеотиды антикодона и в первую очередь в34, вносят основной вклад в эффективность комплексообразования. Эти результаты полностью согласуются с данными РСА: С34 образует наибольшее число специфических контактов с ферментом. Замены в антикодоне оказывают самое сильное влияние и на каталитические характеристики аминоацилирования. Таким образом, антикодон доминирует как в первоначальном узнавании на этапе связывания, так и в обеспечении эффективного катализа.

Мы исследовали связывание РЬеЯЗ с шестью транскриптами, содержащими замены в консервативной третичной паре оснований С19-С56, стабилизирующей взаимодействие между Б- и Т-петлями. Все мутации заметно ухудшают прочность комплекса: величина Кй увеличивается в 8-70 раз (см. табл. 1); в то же время влияние мутаций на кажущуюся константу скорости реакции аминоацилирования выражено в гораздо меньшей степени. Стабильность третичной структуры этих мутантов была оценена нами с помощью метода УФ-индуцируемых сшивок тРНК№е (с участием сближенных в третичной структуре нуклеотидов С48 и и59); относительные скорости фотопревращения соответствующих тРНКРЬе по сравнению с транскриптом дикого типа приведены в табл. 1. Эффективность связывания мутантов уменьшается в том же ряду, что и стабильность их третичной структуры. Таким образом, основная роль нуклеотидов в19 и С56 состоит в стабилизации правильной структуры тРНК, необходимой для связывания и в меньшей степени для последующих этапов аминоацилирования.

Из двух транскриптов с заменами нуклеотидов, образующих тройственное взаимодействие 010-025-1145, только для мутанта С10А/С25и с измененной третичной структурой наблюдалось уменьшение активности как в связывании, так и в аминоацилировании. Замена и450, не нарушающая третичной укладки тРНКРЬе, не влияет на активность. Сравнимые изменения величин Кл и ксМ, наблюдаемые для первого мутанта, показывают, что эти нуклеотиды вносят

Таблица 1. Константы диссоциации комплексов РЬеКБ с мутантными тРНКРЬе и сравнение их с кинетическими параметрами аминоацилирования

тР[ 1К' Ье- гранскрипт Е colT

дикий тип (1,0)" G34Ar G34C/A35Ur А36С

C56U (0,86)" G19A/C56U (0,72)° G19U/C56A (0,75)° G19U/C56G (0,53)" C56G (0,50)" G19U/C56U (0,37)в G10A/C25U" U45Gr G44CA

A26G/G44Ar

U20A"

U20GÄ

U20C"

A73U

A73C

A73G

G27A/C43U, G28A/C42Ur

Кл, mkM"

0,005 1,2(240) 1,6(320) 0,15(30) 0,040(8) 0,060(12) 0,060(12) 0,16(32) 0,20(40) 0,35(70) 0,020(4) 0,005(1) 0,020(4) 0,040(8) 0,040(8) 0,030(6) 0,025(5) 0,005(1) 0,005(1) 0,005(1) 0,005(1)

Am, MXM*''

0,18 3,4(19) 10(56) 0,41,2.1) 0,46(2,6) 0,44(2,4) 0,59(3,3) 1,9(11) 2,0(11) i,9(iir;:

0,17 0,24(1,3) 0,26(M) 0,43(2,4) 0,36(2,0) 0,34(1,9) Ö,I8

f,19(l,l) 0,20(1,1) 0.2К1Д)

Ы,

pfte7j

< jiiji&f <

Csfi,7)

0,41(2,4) 0,26(3,8) 0,36(2,8)

| J

0,47(2,1) 1,1

1,0 ; 0,86(1,2)

1,0 0,88(1,1)

■"Кинетические характеристики аминоацилирования (показанные на сером фоне) определены ранее. Рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ген тРНКРЬе Е coli (дикого типа или мутантные) под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, сконструированы в лаборатории проф. О Уленбека (Университет Колорадо, США) "Степень увеличения Kd и Кт или уменьшения kcat (по сравнению с транскриптом дикого типа) указана в скобках.

5kcat нормированы на соответствующие значения для транскрипта дикого типа. "В скобках указаны относительные скорости образования продуктов фотопревращения тРНК, нормированные на соответствующее значение для транскрипта дикого типа Третичная структура мутантов не нарушена по сравнению тРНКр|1е-транскриптом дикою типа, как показано с помощью сайт-специфичного расщепления ионами свинца "Мутанты отличаются от транскрипта дикого типа третичной структурой

одинаковый вклад в формирование правильной конформации тРНКРЬе как на стадии связывания, так и каталитического превращения.

Замены в паре оснований А26-в44 приводят к совершенно отличным эффектам в сравнении с другими структурными мутантами. Мутант в44С связывается более прочно, чем двойной мутант А260/044А (структурно подобный транскрипту дикого типа), но менее активен в реакции аминоацилирования. Аналогичная корреляция наблюдается для всех трех мутантов с заменами в 20-ом положении: Мутация Ш0А оказывает самый большой эффект на связывание и меньше всего влияет на катализ. Нуклеотиды

А26 и в44 вовлечены в неспецифические взаимодействия с ферментом, ШО вообще не образует контактов с белком. По данным РСА и биохимических экспериментов они расположены в районах, претерпевающих существенные конформационные изменения в процессе связывания тРНКРЬе с ферментом. Таким образом, нуклеотиды 20, 26 и 44 важны для конформационной подстройки комплекса.

Все три мутанта тРНКРЬе с заменами в положении 73 связываются с ферментом также эффективно, как и транскрипт тРНКРЬе дикого типа, т.е. специфичность этого нуклеотида не проявляется на стадии связывания. Небольшое уменьшение ксМ при замене А73 пиримидиновыми остатками позволяет предположить минорную роль этого нуклеотида в стабилизации переходного состояния каталитической реакции.

Замена двух пар в антикодоновом стебле (А27-ШЗ, А28-1142) также не влияет на эффективность связывания.

Мы сравнили связывание термофильного фермента с различными РЬе-специфичными тРНК. Химерные тРНК (тРНК1Ъг""РЬе и тРНК(Мй"*№е) синтезированы на основе тРНКТЬг и тРНКМй трансплантацией в них элементов узнавания тРНКРЬе. Константы диссоциации их комплексов мало отличаются от соответствующих значений для тРНКРЬе Е. соИ (табл. 2).

Таблица 1. Связывание и аминоацилирование различных тРНК"" и

неспецифичных тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т thermophilus

тРНК Kä, мкМа /{¿мкМ... f 1t *>ь

тРНК^-транскрипт Е coli" TpHKPhe Т thermophilus* TpHKThr-.Phe. Tp[_[[^fMct -.Phe* тРНКр|1е-транскрипт человека* тРНКА|а-транскрипт Е coli дрожжевая тРНКАзр tPHKGIu Е coli 0,005 0,005 0,0075(1,5) 0,015(3) 0,080(16) 0,57(114) 15(3000) 12(2400) 0,18 "-г 0,12 ^ 0,18 -0,32(1,8) Ä 0,82(4,6) " 3,6(20) 1,0 0,73 * 0,62(1,6) 6,060(1^) 0,91(1,1) 0,60(1,7) н.а.в н а.в

'Кинетические характеристики аминоацилирования (показаны на сером фоне) измерены ранее

аСтспень увеличения Kd и Кт или уменьшения (в сравнении с тРНКРЬе-транскриптом Е coli) указана в скобках.

skczl нормированы на соответствующие значения для тРНКРЬе-транскрипта Е coli вн а. - Нет аминоацилирования

Структурные различия химерных и тРНКРНе находятся преимущественно в акцепторном и антикодоновом стеблях (рис. 3). Таким образом, множественные неспецифические контакты этих районов в закристаллизованном комплексе, не важны для распознавании тРНКРЬе в процессе связывания. Значительное уменьшение сродства наблюдается для тРНКРЬе человека, которая отличается от бактериальных тРНКр,1е нуклеотидами в положениях 20, 26 и 44, важными для узнавания (см. табл. 2).

тРНК^-транскрипт Е coli тРНК"" Т thermophilus тРНК"*-тра11скрипт человека тРНК7*'^"* тРНКа*"и"

тРНК^-транскрипт Е coli тРНК01" Е toh tPIHC41 дрожжей

GCGCGGAÜAGCUCAGUCGGÜ AGAGCAGGGGAUUGAAAAUCCCC GCCGAGGÜAGCUCAGÜÜGGD AGAGCAUGCGACÜGAAAATCGCA GCCGAAAÜAGCUCAGÜUGGG AGAGCGOUAGACDGAAGAOCUAA ' GCUGAÜ AUAGCUCAGUUGGU AGAGCACACCCUUGAAAAGGGUG GGCGGGGÜGGCGCAGCCGGU AGCGCAUCGGGCUGAAAACCCGA ' GGGGCOAUAGCUCAGCUGGG AGAGCGCÜÜGCAOGGCAÜGCAAG GUCCCCUUCGUCTAGA GGCCCAGGACACCGCCCOTTJCACGGCGG UCCGUGAUAGUOTAAU GGDC AGAAUGGGCGOTUGÜCGCGUGCC I-1 I-1 I-1

акцепторный стебель

D-вствъ

антакодуновад ветвь

тРНК"*-транскрипт Е coli tPHK"" Т thermophilus тРНКи"-транскрипт человека •tPHKT1"~F*c тРНК™""""

тРНКЛ|"-транскрипт Е coli тРНК™° Е coli iPHK" дрожжей

GÜGUCCUÜGGÜUCGAUÜCCGAGÜCCGCGCACCA1 GUGUCGGCGGTVCGAUUCCGCUCCUCGGCACCA AGGUCCCUGGUUCGAÜCCCGGGUHUCGGCACCA' GÜGOCGGCAGUüCGAOOCOGCeOAOCAGCACCA3' GUGOCGÜCGGUUC&AUUCCGGCCCCCGCCACCA ' AGGUCAGCGGOOCGAOCCCGCOUAGC2CCACCA'' CAA CAGGGGT^CGAAÜCCCCUAGGGGACGCCA AGA UCGGGGTTCAAOUCCCCGUCGCGGCGCCA"

I-1-1-1

нариаоельная нем л я

T-ветвь

акцепторный стебель

Рис. 3. Сравнение последовательностей тРНК, используемых в экспериментах по связыванию и аминоацилированию PheRS Т. thermophilus Нуклеотиды, отличающиеся от нуклеотидов тРНКРЬе Е coli и Т thermophilus, подчеркнуты; модификации оснований не учитываются при сравнении Плазмиды для in vitro транскрипции генов тРГГКРЬе Е coli и человека, химерных TPHKThr->Phe и тРНК'Мм~,рЬе предоставлены проф. О Уленбеком (Университет Колорадо, США), тРНКА|а Е coli предоставлена проф П. Шиммелем (Институт химической биологии, Скагс, США)

1.2. Взаимодействие PheRS с неспецифичными тРНК

Для исследования эффективности распознавания тРНК на стадии связывания изучено взаимодействие PheRS с тремя неспецифичными тРНК. Основной элемент узнавания тРНКРЫ, G34, сохраняется в антикодоне тРНК а и tPHKAsp (см. рис. 3). тРНК01" и тРНКА5р отличаются от тРНКА1а и тРНК№е положением консервативных третичных нуклеотидов Gl 8 и Gl 9, ответственных за взаимное расположение D- и Т-петель, и более короткой вариабельной петлей.

тРНКА1а наиболее

активна в связывании и может аминоацилироваться фенилаланином (см. табл. 2). Две другие неспецифичные тРНК образуют значительно менее прочные комплексы с PheRS и неактивны в аминоацилировании. Таким образом, снижение прочности связывания неспецифичных тРНК на 2-3 порядка по сравнению со специфичной обеспечивает их преимущественную отбраковку на уровне связывания.

2. Роль низкомолекулярных субстратов и элементов узнавания в продуктивном взаимодействии PheRS Т. thermophilus с акцепторным концом

TpHKPhe

2.1. Получение реакционноспособных аналогов тРНКРЬе, исследование их субстратных свойств и аффинная модификация РЬеИв

Структура используемых реакционноспособных производных тРНКры и схема их синтеза представлена на рис. 4. В тРНКРЬе-Аох76 2',3'-цис-диольная группа рибозы З'-концевого нуклеотида окислена специфически периодатом натрия. Фотоактивируемые аналоги тРНКРЬе, содержащие на З'-конце остаток 4-тиоуридина или 6-тиогуанозина, были получены впервые с использованием концевой тРНК-нуклеотидилтрансферазы или Т4 РНК-лигазы.

LI и *

S'C С • G ©• С?о C'G sG • С С

тРМК^-А 76

iPHK -А76

1 pslJp РНК 1игада ,

, А' U

С у С S © А G С ,

в А <3 С С

: J>0 и s в

2 ш фосфатаза

2 анилин 3. щ фосфатаза

rPHK^s4^

гтРПК""^И76

ps*lJp РНК лигаза 2 щ фосфатаза

G » С и

©»с

© *С

wo« С40

и

♦ и

TPHK|,,r-s4J(s6G)76

iPHK -С75

1 NalO,

2 анилин

щ фосфатаза

тРНКи*-С74

1 ps'Up РНК лигаза

2 iu фосфатаза

tPI1K*VIJ75

Рис. 4. Структура тРНКРЬе -транскрипта Е coli В рамках обозначены замены в З'-концевой последовательности, соответствующие структуре реагентов TPHKphe-s6G76, тРНКРЬе- s4U75, TPHKphe-s4U76, TPHKphe-s4U77 и тРНКРЬе-Аох76. Справа указана краткая схема получения реагентов.

Структура всех реагентов предусматривает образование близких контактов реакционноспособного нуклеотида с белком. Остатки s4U- и s6G обладают удачными структурными и фотохимическими характеристиками и широкой специфичностью присоединения к аминокислотным остаткам. Структура диальдегидного производного предусматривает сохранение специфических контактов основания З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе с ферментом, но эффективность мечения в этом случае ограничивается узкой специфичностью реагента. Мы провели сравнительное исследование аффинного мечения PheRS различными аналогами тРНКРЬс, учитывая их преимущества и недостатки.

Для фотоактивируемых аналогов тРНКРЬс были изучены субстратные свойства в реакции аминоацилирования, катализируемой PheRS (табл. 3). TPHKPhe-s6G76 аминоацилируется, но замена А76 на s6G приводит к существенному уменьшению эффективности аминоацилирования. TPHKphe-s4U76 связывается специфически с PheRS и имеет почти такое же сродство, как тРШСРЬс-s6G76, но не аминоацилируется. Таким образом, специфическим контактам экзоциклической аминогруппы и имидазольного цикла А76 принадлежит ведущая роль в продуктивном взаимодействии акцепторного конца с PheRS: отсутствие одного из этих структурных элементов (при замене на s6G) существенно снижает

каталитическую эффективность аминоацилирования, а утрата обоих приводит к потере субстратной активности тРНКРЬе.

Таблица 3. Субстратные свойства модифицированных тРПК™е в реакции аминоацилирования, катализируемой фенилаланил-тРНК-синтетазой

Аналог тРИК^ Кт, мкМ V а ' тах К„ мкМ

тРНКР1и-транскрипт 0,19 (1.0) (1,0)

тРНКРНе-8б076 1,0 0,014 0,0027

тРНКРЬе-54и76б 0,92

"Значения Ктх и Утвх/Кт нормированы на соответствующие величины для тРНКр|1е-транскрипта.

Разделение продуктов фотоаффинного мечения РИеКБ показано на рис. 5. Для идентификации субъединиц в продуктах мечения различными аналогами тРНК мы использовали нуклеазный гидролиз.

а б

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 ii 12 13 14

уп и V IV и II I та VI V IV ш и I продукт

------- + ++ + + + + бензоназа

¡¡4/76

мин 15 30 2 15 30

vii

ФШЩШ vi ^Шч&ь

112- v

iv -тш

iii

р 70- ш11ши ii

57- 1

а _

39-

36- итй*»

•ш

л 4

т

Рис. 5. Электрофоретическое разделение в Ой-Иа-ПААТ продуктов фотоаффинного мечения РЬеЯЗ и их анализ, а - Радиоавтографы гелей после разделения продуктов ковалентного присоединения 32Р-меченых (статистическим включением [а-32Р]АМР) аналогов и тР11КРЬе-86076 к ферменту. Концентрации фермента и реагентов

1 мкМ Время облучения проб указано сверху Положения субъединиц (а и р) и минорной полосы (М) синтетазы, а также молекулярные массы маркеров отмечены слева; [-VI! -продукты ковалентного присоединения б - Идентификация субъединиц в продуктах аффинного мечения РЬеЯ8 аналогом

с помощью нуклеазного гидролиза Разделенные с помощью электрофореза продукты обрабатывали бензоназой. Количество исходного материала в пробах с бензоназой (дорожки 8-14) в 3 раза больше по сравнению с контрольными (дорожки 1-7). Справа отмечены положения а- и. р-субъединиц и минорной полосы (М) в препарате РИеЯЗ.

Анализ распределения радиоактивности в продуктах модификации, обработанных и необработанных бензоназой, показал, что продукты с кажущимися молекулярными массами в диапазоне 56-70 кДа образованы присоединением тРНК к а-субъединице, а остальные - к ß-субъединице. Аналог TPHKphe-s4U76 образует тот же набор из 6 продуктов, что и аналог xPHKphe-s4U75, использованный ранее для модификации PheRS Т. themophilus (рис. 6). Пять продуктов мечения 5бО-содержашим аналогом совпадают по подвижности с продуктами мечения TPHKPhe-s4U76. Для диальдегидного производного

Рис. 6. Относительные выходы продуктов мечения PheRS (% от общего уровня мечения белка) различными аналогами тРНКРЬе Е coli. Сверху указаны кажущиеся мол. массы (кДа) продуктов мечения а-(штриховка на белом фоне) и ß-субъединиц (штриховка на сером фоне), соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы. Реакционноспособные нуклеотиды, их позиции в тРНК и отношения уровней а- и ß-субъединиц указаны мечения снизу.

Доказательства аффинного характера мечения PheRS аналогами тРНКРЬе представлены на рис 7. Природный субстрат тРНКРЬе Т. thermophilus (или тРНКРЬе-транскрипт Е. coli) добавленный в 10-кратном избытке по отношению к PheRS, эффективно защищает фермент от модификации фотоактивируемым и диальдегидным аналогами, при этом в равной степени защищаются все модифицируемые остатки обеих субъединиц.

Рис. 7. Влияние тРНКр|,е на аффинное мечение PheRS Разделение продуктов мечения фермента (1 мкМ). а - TPHKphe-s4U76 Е coli (0,1 мкМ) в отсутствие (дорожка 1) или в присутствии 10 мкМ суммарной тРНК (дорожка 2) или 10 мкМ тРНКРЬе Т thermophilus (дорожка 3); б -тРНКРЬе-А0Х76 (4 мкМ) в отсутствие (дорожка 1) или в присутствии 10 мкМ природной тРНК№е (дорожка 2) или 10 мкМ тРНКРЬе-транскрипта Е coli (дорожка 3) Время реакции 15 мин для TPHKphe-s4U76 (облучение с помощью азотного лазера) и 120 мин для тРНКР1,е-Аох76 (инкубация в присутствии цианборгидрида натрия). Указаны кажущиеся молекулярные массы продуктов мечения и положения субъединиц и минорной полосы фермента.

наблюдаются только три продукта мечения.

а 56-66 о 70 в 100 в 110 в 1J2 в 155-165

-s4U75 -s4U76 -s6G76 - Аох76 ct/ß 0,049 1,9 2,2 2,1

s'U76

i г з

тРНК""- _ +

тРНК - + -

б

1 2 3

тРНК"1"-транскрипт lPHK1*1* -

ß-

м-

-250 200 -160

-100

■56

Защитное влияние тРНКРЬе обусловлено образованием специфичного комплекса, поскольку суммарная тРНК (содержащая не больше 1,5% тРНКРЬс) в такой же концентрации не оказывает влияния на модификацию фермента.

Результаты мечения PheRS аналогами TPHKPhe, содержащими реакционноспособный нуклеотид в различных позициях, хорошо согласуются с данными РСА о взаимодействии двух соседних нуклеотидов акцепторного конца с разными субъединицами. Отсутствие строгой селективности мечения а- и ß-субъединиц различными аналогами и образование нескольких продуктов свидетельствуют о конформационной подвижности З'-конца в комплексе с PheRS. TPHKphe-s4U76 не является субстратом, но по соотношению уровней мечения субъединиц мало уступает другим реагентам, структура которых предусматривает сохранение специфических контактов З'-концевого нуклеотида. Широкая специфичность действия такого аналога и возможность "замораживать" его комплекс с PheRS и аминоациладенилатом, делают его эффективной пробой для анализа конформационной динамики взаимодействия PheRS с 3'-концом тРНКРЬе.

2.2. Взаимодействие PheRS с акцепторным концом TPHKPhe в присутствии низкомолекулярных субстратов

2.2.1. Влияние Phe и АТР на модификацию PheRS различными аналогами

TpHKPh«

Влияние низкомолекулярных субстратов на модификацию PheRS было изучено для всех аналогов тРНКРЬе Е. coli (рис. 8).

Рис. 8. а - Разделение продуктов мечения PheRS (1 мкМ) аналогом тРНКр|,е-Аох-76 (4 мкМ) в отсутствие или в присутствии 70 мкМ Phe, 5 мМ АТР. б - Разделение продуктов мечения PheRS (2 мкМ) аналогом TPHKphe-s4U76 (0,2 мкМ) в отсутствие или в присутствии 5 мМ АТР, 50 мкМ Phe. Положения субъединиц (и минорной полосы фермента) указаны слева, кажущиеся молекулярные массы продуктов мечения обозначены справа

На рис. 9 представлены отношения выходов продуктов мечения фермента различными аналогами тРНКРЬе в присутствии Phe и АТР субстратов к соответствующим значениям в их отсутствие. Оба субстрата влияют на мечение а- и (З-субъединиц. Изменение эффективности мечения Р-субъединицы свидетельствует о влиянии субстратов на ориентацию реакционноспособного нуклеотида в тРНК, так как известно, что их связывание в активном центре, локализованном на а-субъединице, не индуцируют структурных перестроек Р-субъединицы.

И 66-58 □ 70 и 100 а 110 а 132 В 155-165

Рис. 9. Изменения выходов продуктов мечения PheRS в присутствии Phe и АТР Сверху указаны мол массы (кДа) продуктов мечения а- (штриховка на белом фоне) и р-субъединиц (на сером фоне), соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы. Представлены средние значения трех измерений и их средние отклонения (6-8% для минорных и 2-4% для остальных продуктов).

Влияние Phe и АТР на выходы всех продуктов мечения ß-субъединицы s U-замещенным аналогом выражено более отчетливо, чем диальдегидным. В последующих экспериментах для анализа конформационной динамики взаимодействия PheRS с З'-концом тРНКРЬе использовались з4и-замещенные аналоги.

2.2.2. Роль низкомолекул$шных субстратов в функциональном связывании акцепторного конца тРНК е фенилаланил-тРНК-синтетазой

Для исследования функциональной роли фенилаланина и АТР в продуктивном связывании З'-конца тРНК мы провели сравнительный анализ аффинного мечения PheRS 54и-замещенными аналогами тРНКРЬе Е. coli (Ее) и человека (Hs). тРНКРЬе (Hs) менее активна в связывании и аминоацилировании по сравнению с бактериальной тРНКРЬе, что обусловлено их различиями в трех функционально важных позициях (см. раздел 1.1.). При модификации PheRS тРНКРЬе (Hs), содержащими s U в различных позициях З'-конца, образуется большой набор продуктов, из которых только два совпадают по электрофоретической подвижности с продуктами присоединения аналогов тРНКРЬе (Ее) (рис. 10, а). Нуклеазный гидролиз продуктов модификации (без предварительного разделения их электрофорезом) приводит к образованию двух полос, соответствующих по подвижности а- и ß-субъединицам (рис. 10, б).

Для аналогов тРНКРЬе разного происхождения сохраняется общая закономерность увеличения относительной эффективности мечения а-субъединицы при перемещении реакционноспособного нуклеотида из 75-го положения на одно-два звена к З'-концу (рис. 11). Однако относительные уровни мечения а- и ß-субъединиц отличаются для аналогов тРНКРЬе разного происхождения с одинаковым положением s4U-ocTaTKa. Снижение селективности

мечения двумя аналогами тРНК e-s U75 и тРНК e-s U77 эукариотической тРНК свидетельствует о большей конформационной подвижности ее акцепторного конца в комплексе с ферментом.

12 3 4 5 Ее Гс Hs Hs Hs 76 77 77 76 75

12 3 4 s'U 77 75 77 75

Рис. 10. а - Разделение в Вэ-Ма-ПЛАГ продуктов аффинного мечения РЬеКв (2 мкМ) 32Р-мечеными аналогами тРНК№е (Ее) (0,2 мкМ) и (№) (0,4 мкМ) Происхождение тРНКРЬе и положения 841,1 в аналогах указаны сверху, положения в геле а- и (5-субъединиц фермента и маркеров молекулярных масс указаны слева.

б - Идентификация субъединиц в продуктах мечения РИеЯЗ аналогами тРНКРЬе (Не) Необработанные (дор. 1, 2) и обработанные бензоназой (дор. 3, 4) пробы белка, облученного в присутствии тРНК№е-54и77 (дор 1, 3) или тРНК''Ье-84Ш5 (дор. 2, 4) Положения а- и р-субъединиц отмечены справа.

Рис. 11. Относительные выходы продуктов фотоаффинного мечения PheRS Т. themophilus 84и-замещенными аналогами

TpHICPhe (Ес) и (Hs) от общего

уровня мечения фермента Сверху указаны кажущиеся молекулярные массы (56-58 кДа, 67*, 70 кДа; 100 кДа; 108*, 110 кДа, 120*, 132 кДа, 140-155*, 155-165 кДа; звездочкой отмечены продукты мечения аналогами TPHKphe(Hs), отличающиеся по подвижности от продуктов мечения аналогами тРНKPhe (Ее)) продуктов мечения а- (штриховка на белом фоне) и Р- (штриховка на сером фоне) субъединиц, соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы. В один ряд сгруппированы продукты с близкой электрофоретической подвижностью; диапазон молекулярных масс указан для набора продуктов, не разрешенных полностью (дающих уширенную или сдвоенную полосу)

Влияние Phe на выходы продуктов модификации Р-субъединицы практически не различается для аналогов разного происхождения, замещенных в одинаковом положении, но существенно зависят от положения реакционноспособного нуклеотида в З'-концевой последовательности тРНКРЬе (Ее) (рис. 12, 13). Эффекты, наблюдаемые в присутствии АТР, наоборот, значительно различаются для аналогов тРНКРЬ (Ее) и (Hs). Наблюдаемая чувствительность эффектов к структурным различиям двух тРНК не может быть объяснена влиянием нуклеотидного субстрата на связывание только З'-концевого нуклеотида; очевидно, что АТР индуцирует более глубокие изменения в структуре комплекса PheRS с тРНКРЬе.

О56-58 067/70 0100 D108/110 D120/132 В 140-155/155-165

^ ВО

5 70 х

2 60

'1 50 х

i 40

£ 30 jj 20 О 10 0

оУЭ

— Pi It" Pi

■

¡J- \—jr jclna ilil

-s4U75 Ее 0,05

-s U76 Ее 1.9

-s"U77 Ее 6,8

-s U75 Hs 0,21

-s"U76 -s4U77 Hs Hs

2,2 3,8

Рис. 12. Сравнительный анализ продуктов аффинного мечения PheRS (2 мкМ) аналогами тРНКРЬе (Ее) (а) и (Hs) (б) в отсутствие и в присутствии малых субстратов. Происхождение тРНКРЬе и положения s4U в аналогах указаны снизу Концентрации аналогов тРНКРЬе (Ее) и (Hs) -0,2 мкМ и 0,4 мкМ, соответственно, АТР 5 мМ, Phe 50 мкМ.

056-58 □ 67/70 В10О 0108/110 В120/132 В140-155/155-165 Пи Bß BTotal Зт-----—

-s4U76(Ec) -s4U77(Ec) -s4U76(Hs) -s4U76(Ec) -s"U77(Ec) -s4U76(Hs) Phe + + +

ATP + + +

Рис. 13. Влияние низкомолекулярных субстратов на мечение PheRS 84и-замещенными аналогами тРНКр|,е (Ее) и (Hs). Сверху указаны кажущиеся молекулярные массы (кДа) продуктов мечения а- (штриховка на белом фоне) и ß-субъединиц (штриховка на сером фоне), соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы. Степень мечения определяли как отношение выходов отдельных продуктов или всех продуктов мечения субъединиц (а или ß) или общей (Total) эффективности мечения белка (последние столбцы) в присутствии Phe или АТР к соответствующим значениям в их отсутствие.

3. Влияние нуклеотидных замен в тРНКр|к на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фенилаланил-тРНК-синтетазой

3.1. 54и-индуцируемая модификация PheRS аналогами тРНКр|,е, содержащими замены элементов узнавания

Для того чтобы определить роль различных элементов узнавания тРНКРЬе в обеспечении продуктивного связывания акцепторного конца, было проведено сравнительное исследование фотоаффинного мечения PheRS Т. thermophilus s4U-замещенными аналогами мутантных тРНКРЬе в отсутствие и в присутствии низкомолекулярных субстратов. Для исследования были выбраны шесть мутантов тРНКРЬе Е coli (G34C/A35U, G34A, А36С, G44C, U20A и G19U/C56G, см. рис. 1, а), которые отличаются по эффективности первоначального связывания и каталитического превращения (см. табл. 1). Разделение продуктов мечения PheRS 54и76-содержащими аналогами мутантных тРНКРЬе с помощью Ds-Na-ПААГ-

Phe АТР

2 3 4 5 6 7

12 3 4 Phe - + - + АТР - - + +

s4U76(Ec) s4J77(Ec)

s4U76(HS)

электрофореза представлено на рис. 14. Идентификацию субъединиц в продуктах проводили с помощью гидролиза бензоназой (данные не представлены).

а б

^ Рис. 14. Разделение с помощью электрофореза продуктов аффинного мечения РЬеЯЭ (2 мкМ)

193-

112-

<>v С? & в

V

39

Шт»штт

86_ Р"

ш т—-

193- А

112- Ж

86_ Р" М

70- Ж

57- «

а _

I Ii м» ,

s и76-замещенными аналогами ( Р-мечеными) TPHKphe Е coli (0,2 мкМ)- а - дикого типа и мутантов U20A, G34A, G19U/C56G, G44C и А36С; б - дикого типа и мутанта G34C/A35U Время облучения образцов 30 мин Положения субъединиц фермента (а и ß) и молекулярные массы маркеров указаны слева

Одинаковые наборы продуктов наблюдаются для аналогов тРНКРЬе дикого типа (в контрольном эксперименте) и мутантов С34А, А36С и Ст44С. Небольшие отличия в электрофоретической подвижности трех продуктов присоединения аналогов структурных мутантов ШОА и 911/С5бО от соответствующих продуктов в контрольном образце обусловлены, скорее всего, структурными различиями присоединенных тРНК. Мутации оказывают неодинаковое влияние на селективность мечения субъединиц и общую эффективность мечения РЬеКБ (рис. 15).

□ 56 58 067/69/70 В100 в104 0110 В120/128/132 0 150/150-160/155-165 60 -----

дикий тип G34C/A35U G34A А36С ШОА G44C G19U/C56G а/р 1,9 0,89 1,7 1,9 1,9 1,2 2,1

9,% 64 4 18 64 40 43 55

Рис. 15. Относительные выходы продуктов фотоаффинного мечения PheRS s4U76-замещенными аналогами тРНКРЬе Е coli и ее мутантов Сверху указаны мол массы (кДа) продуктов мечения а- (штриховка на белом фоне) и ß-субъединиц (штриховка на сером фоне), необычного продукта мечения ß-субъединицы аналогом G34C/A35U-m\TaHra (штриховка на черном фоне), соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы Снизу указаны типы мутаций и соотношения уровней мечения субъединиц Эффективность мечения (0) определена как количество присоединенного к белку реагента, нормированное на количество комплекса (рассчитанное с использованием величин Кл для исходных мутантов без учета влияния замены 3'-концевого А на s4U)

Значительные эффекты на ориентацию З'-конца в отсутствие малых субстратов наблюдаются для двойной замены в антикодоне G34C/A35U и С44С-мутации. Влияние остальных замен выражено в меньшей степени, и мечение фермента соответствующими аналогами было исследовано в присутствии Phe и АТР. Результаты этих экспериментов с аналогами двух мутантов тРНКг представлены на рис. 16.

Phe

и дикого типа

дикий тип

С36

1 2 3 4 1 2 3 4 Phe - + - + + - +

АТР - - + + - - + +

U19G56 12 3 4

■кщ i

Рис. 16. Сравнительный анализ продуктов фотоаффинного мечения PheRS аналогами тРНКРЬе Е coli дикого типа и мутантов G19U/C56G и А36С в отсутствие и в присутствии низкомолекулярных субстратов

Концентрации фермента 2 мкМ, аналогов тРНК 0,2 мкМ, АТР 5 мМ, Phe 50 мкМ. Пробы облучали в течение 30 мин. Слева указаны положения субъединиц.

Наибольшие различия в эффектах, производимых Phe-субстратом, по сравнению с контрольным экспериментом наблюдаются для аналога с заменой в 34 положении (рис 17, а), что свидетельствует о ведущей роли этого нуклеотида в формировании комплекса с функциональной ориентацией 3'-концевого нуклеотида в активном центре. В присутствии АТР все мутации существенно уменьшают общую эффективность модификации, подавляя в основном мечение Р-субъединицы, которое увеличивается в контрольном эксперименте (рис. 17, б). Эти данные еще раз свидетельствуют о лидирующей роли АТР в продуктивном связывании акцепторного конца.

Относительные выходы отдельных продуктов модификации в присутствии обоих малых субстратов являются наиболее показательными для оценки влияния различных мутаций на функциональную ориентацию акцепторного конца, контролируемую взаимодействием с Phe и АТР (рис. 18). По этому критерию замена G34 на А оказывает максимальное дезориентирующее влияние: распределение продуктов в этом случае существенно отличается от контрольного эксперимента. Минимальные изменения в относительной эффективности образования различных продуктов мечения наблюдаются для ШОА-мутации. Негативное влияние четырех мутаций на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе в комплексе PheRS со всеми функциональными лигандами увеличивается в ряду (U20A<G19U/C56G<A36C<G34A). В таком же ряду уменьшаются каталитические скорости аминоацилирования соответствующих тРНК с нативным акцепторным концом (U20A>G19U/C56G>A36C>G34A) (см. табл. 1 и рис. 18). Наблюдаемая корреляция свидетельствует о том, что влияние мутаций на

О 56-58 □ 67/69/70 В 100 В110 в 120/128/132 в 150/150-160/155-165 □,< в р BTotal

Phe

дикий тип G34A А36С U20A G19U/C56G + + + + +

АТР

дикий тип +

Рис. 17. Влияние Phe (а) и АТР (б) на мечение PheRS 84Ш6-замещенными аналогами TPIIKphe и ее мутантов Сверху указаны молекулярные массы (кДа) продуктов мечения а-(штриховка на белом фоне) и р-субъединиц (штриховка на сером фоне), соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы Степень мечения определяли как отношение выходов отдельных продуктов (56-58 кДа; 67/69/70 кДа; 100 кДа; 110 кДа, 120/128/132 кДа; 150/150-160/155-165 кДа) или всех продуктов мечения а- или р-субъединиц или общей (Total) эффективности мечения белка (последние столбцы) в присутствии субстратов к соответствующим значениям в их отсутствие.

Ш 56-58 0 67/69/70 В100 Н110 В120/128/132 В150/150 160/155-165 50

дикий тип G34A Phe+ATP + +

U20A G19U/C56G + +

Рис. 18. Относительные выходы продуктов мечения PheRS (% от общего уровня мечения белка) в присутствии Phe и AIP Сверху указаны мол. массы (кДа) продуктов мечения а- (штриховка на белом фоне) и р-субъединиц (на сером фоне), соответствующих по типу штриховки столбцам диаграммы

ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе в присутствии Phe и АТР отражает нарушения взаимодействий в комплексе фермента с тРНК, ответственных за продуктивное связывание акцепторного конца.

Влияние нуклеотидной замены в 36-ом положении на взаимодействие PheRS с З'-концевым нуклеотидом отчетливо проявляется только в присутствии малых субстратов, что свидетельствует о важной роли А36 в конформационной адаптации фермента и тРНКРЬе при формировании продуктивного комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Для выявления структурных элементов, ответственных за специфичность связывания и эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т thermophilus, измерены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКРЬе, содержащими замены различных нуклеотидов, и неспецифичными тРНК. Показано, что

- специфичность комплексообразования определяется, в первую очередь, идентичностью антикодона;

- нуклеотиды, образующие третичные взаимодействия G19-C56 и G10-C25-U45, вносят основной вклад в стабилизацию правильной трехмерной структуры тРНК, необходимой для оптимального связывания;

- U20 и нуклеотиды, образующие третичное взаимодействие A26-G44, важны для конформационной подстройки комплекса;

неспецифические взаимодействия фермента с антикодоновым и акцепторным стеблями и с А73 не важны для распознавания тРНКРЬе в процессе комплексообразования;

- уменьшение эффективности комплексообразования с неспецифичными тРНК в 100-3000 раз по сравнению с тРНКРНе обеспечивает их преимущественную отбраковку на уровне связывания.

2. Впервые с помощью аффинной модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus аналогами тРНКРЬе, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды в определенных позициях З'-концевой последовательности (окисленные периодатом натрия по концевой рибозе или фотоактивируемые), изучена конформационная динамика взаимодействия фермента с акцепторным концом тРНКРЬе.

- Показано, что взаимодействия фермента с фенилаланином и АТР влияют на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬс; индуцируемые нуклеотидным субстратом эффекты выражены значительно сильнее и зависят от структурных различий бактериальной и эукариотической тРНКРЬе в районах, не контактирующих с активным центром.

На основе анализа полученных результатов и известных рентгеноструктурных данных высказано предположение, что взаимодействия с аминокислотным субстратом контролируют связывание З'-концевого аденозина

тРНКРЬе в активном центре, а индуцируемые АТР более глубокие перестройки в структуре комплекса модулируют конформацию акцепторной ветви в целом

3. Исследована роль различных элементов узнавания тРНК№с в обеспечении продуктивного связывания акцепторного конца с помощью фотоаффинного мечения фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus з4и-содержащими аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие и в присутствии фенилаланина и АТР. Показано, что

- взаимодействие фермента с тРНКРЬе на этапе, предшествующем каталитической стадии, требует тонкой конформационной подстройки комплекса: любые мутации оказывают более существенное влияние на ориентацию 3'-концевого нуклеотида тРНКРЬс в присутствии фенилаланина и АТР, чем в их отсутствие;

- нарушение специфических взаимодействий с антикодоном наиболее критично для функциональной ориентации акцепторного конца, контролируемой малыми субстратами.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Васильева И. А., Анкилова В. Н., Лаврик О. И., Моор Н. А. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы Thermus thermophilus с 3'-концевым нуклеотидом тРНКРЬе// Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1368-1379.

2. Vasil'eva I. A., Ankilova V. N., Lavrik О. I., Moor N. A. tRNA discrimination by Т. thermophilus phenylalanyl-tRNA synthetase at the binding step // J. Mol. Recognit. 2002. V. 15. P. 188-196.

3. Васильева И. А., Богачев В. С , Фавр А., Лаврик О. И, Моор Н. А. Роль низкомолекулярных субстратов в функциональном связывании акцепторного конца тРНКРЬе фенилаланил-тРНК-синтетазой // Биохимия. 2004. Т. 69. С 179191.

4. Васильева И. А., Фавр А., Лаврик О. И., Моор Н. А. Влияние нуклеотидных замен в тРНКРЬе на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фенилаланил-тРНК-синтетазой // Биохимия. 2004. Т. 69 С 192-203.

Подписано к печати с 2! » мая 2005 г Тираж 100 экз Заказ № 1455 Ошечашно "Документ-Гервис'', 630090 Новосибирск Институтская 4/1, гел 356-600

til £3 3 Г

РНБ Русский фонд

2006-4 6803

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Васильева, Инна Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Реакция аминоацилирования тРНК.

1.2. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз.

1.3. Структура тРНК.

1.4. Общие закономерности и особенности высокоспецифичного взаимодействия аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК: методы выявления элементов идентичности в тРНК и исследования их функциональной роли.

1.4.1. In vivo и in vitro методы определения элементов специфичности.

1.4.2. Распределение элементов узнавания в тРНК.

1.4.3. Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования.

1.4.4. Аминоацилирование мини-тРНК субстратов (mini- и microhelices).

1.4.5. Функциональная роль элементов узнавания в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия.

1.4.6. Природа контактов, обеспечивающих специфичность взаимодействия.

1.4.7. Динамика взаимодействия с тРНК.

1.4.8. Механизмы контроля продуктивного связывания З'-конца тРНК.

1.5. Фенилаланил-тРНК-синтетаза: структурно-функциональные особенности фермента и его взаимодействия с субстратами.

1.5.1. Общая характеристика структуры фермента.

1.5.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНКРЬе.

1.5.3. Структурные основы каталитической функции фермента.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение плазмидных ДНК.

2.2.2. Гидролиз плазмидных ДНК эндонуклеазой рестрикции.

2.2.3. Синтез и выделение тРНК-транскриптов.

2.2.4.32Р-Мечение тРНК по 5'-концу.

2.2.5. Ступенчатая деградация тРНК с З'-конца.

2.2.6. УФ-индуцируемая модификация мутантных тРНКРЬе.

2.2.7. Частичный нуклеазный и щелочной гидролиз тРНК.

2.2.8. Получение транскриптов тРНК , содержащих остаток s4U(s6G) на З'-конце, с использованием концевой СТР(АТР):тРНК-нуклеотидилтрансферазы.

2.2.9. Получение диальдегидных производных тРНКРЬе.

2.2.10. Получение з4и-замещенных аналогов тРНКр|1е с использованием Т4 РНК-лигазы.

2.2.11. Аминоацилирование тРНКРЬе, тРНКРЬе-транскрипта и его фотоактивных аналогов и неспецифичных тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой.

2.2.12. Мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы фотореакционноспособными аналогами тРНКРЬе и разделение продуктов модификации.

2.2.13. Аффинное мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы диальдегидными производными тРНКРЬе.

2.2.14. Нуклеазный гидролиз продуктов модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы.

2.2.15. Определение констант диссоциации комплексов фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНК.

2.2.16. Гель-электофорез нуклеиновых кислот и белков.

Глава 3. (РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ) Функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия с фенилаланил-тРНК-синтетазой.

3.1. Эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus на стадии связывания.

3.1.1. тРНКРЬе Е. coli - эффективный субстрат фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus в связывании.

3.1.2. Исследование стабильности третичной структуры мутантных тРНКРЬе с нуклеотидными заменами в 19-ом и 56-ом положениях.

3.1.3. Сравнение параметров связывания и аминоацилирования мутантных тРНКРЬе.

3.1.4. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с неспецифичными тРНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия"

Точность воспроизведения генетически заданной структуры белков зависит от способности аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) узнавать и эффективно аминоацилировать соответствующую тРНК. Правильный отбор и аминоацилирование тРНК достигается благодаря взаимодействиям aaRS с определенным набором нуклеотидных остатков тРНК, называемых "элементами идентичности" ("identity elements") или "элементами узнавания" ("recognition elements"). В настоящее время известны элементы идентичности для всех 20 систем тРНК-aaRS из Е. coli и для нескольких систем из дрожжей, Thermus thermophilus и высших эукариот, включая человека [1]. Аминоацилирование тРНК - это многостадийный процесс, который включает первоначальное связывание субстратов, конформационную перестройку фермент-субстратного комплекса, химическую реакцию в активном центре и освобождение продуктов. Несмотря на многочисленные исследования по проблеме "узнавания" тРНК, выполненные преимущественно с использованием генетических методов in vivo и кинетических экспериментов in vitro с мутантными тРНК [1,2], данные об уровне распознавания тРНК на стадии связывания и последующих этапах каталитического превращения получены для ограниченного числа систем. Взаимодействия аспартил-тРНК-синтетазы (AspRS) дрожжей и гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS) Е. coli с антикодоном специфичных тРНК вносят основной вклад в прочность соответствующих комплексов и обеспечивают специфичность отбора на стадии связывания [3, 4]. Многочисленные биохимические и структурные исследования дрожжевой AspRS и ее взаимодействия с субстратами позволили установить, что связывание tPHKAsp инициируется узнаванием антикодоновой петли, и что все элементы ее узнавания участвуют в формировании каталитически активного комплекса [5]. Селективность отбора tPHKHis на стадии связывания усиливается взаимодействием HisRS с устойчивым аналогом гистидиладенилата [4]. В то же время идентичность тРНКТгр определяет преимущественно скорость переноса на нее активированной аминокислоты [6]. Нарушения взаимодействий глутаминил-тРНК-синтетазы Е. coli с элементами идентичности тРНК01" влияют на эффективность узнавания глутамина [7]. Способность тРНК оптимизировать взаимодействие фермента со специфичной аминокислотой обнаружена и для тРНК-независимых триптофанил- и серил-тРНК-синтетаз (катализирующих реакцию активации в отсутствие тРНК) [6, 8]. Уменьшение каталитической эффективности аминоацилирования тРНКРЬе дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазой в результате мутаций нуклеотидов, стабилизирующих третичную структуру, обусловлено в значительной мере ингибированием диссоциации пирофосфата

9]. Таким образом, индивидуальность систем проявляется не только в наборе элементов узнавания, но и выполняемых ими функциях.

Основной целью данной работы было изучение функциональной роли элементов узнавания тРНК на разных этапах взаимодействия: на стадии первоначального связывания тРНК синтетазой и последующих перестройках комплекса в каталитически активную форму, в том числе индуцируемых низкомолекулярными субстратами. В качестве объекта исследования была выбрана фенилаланин-специфичная система из Thermus thermophilus.

Фенилаланил-тРНК-синтетаза (PheRS) - один из наиболее сложноорганизованных ферментов семейства аминоацил-тРНК-синтетаз: субъединичная структура цитоплазматического фермента (аР)2-типа эволюционно консервативна [10]. Согласно своим структурным характеристикам PheRS принадлежит к так называемому классу II синтетаз, но использует 2'-гидроксил концевой рибозы тРНК для переноса аминокислоты, подобно ферментам класса I [11-13]. Трехмерная структура PheRS Т. thermophilus и ее комплексов с отдельными субстратами (фенилаланином, тРНКРЬе) и фенилаланиладенилатом (Phe-AMP) установлена с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [10, 14-16]. Взаимодействие PheRS Т. thermophilus с тРНКРЬе изучено с помощью биохимических методов [17, 18]. Идентифицированы элементы узнавания тРНК№е в эволюционно различных организмах [19-26]. Структурные исследования ряда комплексов aaRS с тРНК на атомном уровне позволили понять молекулярную основу специфичности их взаимодействия, но для большинства систем не решена проблема продуктивного связывания акцепторного конца тРНК. Данные РСА комплексов с правильной ориентацией ССА-конца получены пока для глутаминил-, глутамил- и аргинил-тРНК-синтетаз (GlnRS, GluRS и ArgRS) класса I, аспартил-, треонил- и серил-тРНК-синтетаз (AspRS, ThrRS и SerRS) класса II [5,27-33]. Присутствие малых субстратов в активном центре является необходимым условием функционального связывания 3'-конца тРНК не только для тРНК-зависимых aaRS (GlnRS, GluRS и ArgRS, не синтезирующих аминоациладенилат в отсутствие тРНК). Для Asp- и Ser-специфичных ферментов класса II показано, что правильная ориентация акцепторного конца тРНК, необходимая для катализа, достигается только в присутствии АТР и аминокислоты [30, 31, 33]. Необходимость существования аналогичного механизма контроля для PheRS следует из анализа структуры комплексов фермента с отдельными субстратами (низкомолекулярными или TPHKPhe): перекрывание участков связывания концевого аденозина и фенилаланина создает серьезные препятствия для продуктивного взаимодействия [16]. Получение комплексов aaRS со всеми субстратами является большой удачей из-за ограничений, накладываемых условиями кристаллизации и возможного протекания второй стадии реакции аминоацилирования в кристаллах [29]. С другой стороны, использование негидролизуемых аналогов аденилатов не всегда способствует связыванию и функциональной ориентации акцепторного конца тРНК. Так, в комплексах лизил- и пролил-тРНК-синтетаз, сокристаллизованных со специфичными тРНК в присутствии устойчивых аналогов аминоациладенилата, ССА-конец остается неупорядоченным [34, 35]. Альтернативным подходом к изучению структурной динамики взаимодействия с тРНК представляется метод аффинной модификации, применявшийся в основном в ранних исследованиях aaRS [36, 37].

Первой задачей данной работы было изучение эффективности распознавания специфичной и отбраковки неспецифичных тРНК PheRS Т. thermophilus на стадии связывания. Для её решения были определены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКР11е различного происхождения, рядом мутантных тРНКР1к Е. coli и неспецифичными тРНК и сопоставлены с известными кинетическими параметрами аминоацилирования.

Второй задачей было изучение функциональной роли фенилаланина и АТР в продуктивном связывании акцепторного конца тРНКРЬе с помощью аффинного мечения PheRS аналогами тРНКРЬе, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды на З'-конце.

Третьей задачей являлась оценка роли структурных элементов тРНКРЬе, определяющих специфичность системы, в функциональном связывании акцепторного конца, контролируемом низкомолекулярными субстратами. Для ее решения был проведен сравнительный анализ продуктов мечения субъединиц PheRS Т. thermophilus s4U76-замещенными аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие либо в присутствии малых субстратов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Васильева, Инна Анатольевна

выводы

1. Для выявления структурных элементов, ответственных за специфичность связывания и эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Т. thermophilus, измерены константы диссоциации комплексов фермента с тРНКРЬе, содержащими замены различных нуклеотидов, и неспецифичными тРНК. Показано, что

- специфичность комплексообразования определяется в первую очередь идентичностью антикодона;

- нуклеотиды, образующие третичные взаимодействия G19-C56 и U45-G10-C25, вносят основной вклад в стабилизацию правильной трехмерной структуры тРНК, необходимой для оптимального связывания;

- U20 и нуклеотиды, образующие третичное взаимодействие A26-G44, важны для конформационной подстройки комплекса;

- неспецифические взаимодействия фермента с антикодоновым и акцепторным стеблями и с А73 не важны для распознавания тРНКРЬе в процессе комплексообразования;

- уменьшение эффективности комплексообразования с неспецифичными тРНК в 100-3000 раз по сравнению с тРНКРЬе обеспечивает их преимущественную отбраковку на уровне связывания.

2. Впервые с помощью аффинной модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus аналогами тРНК№е, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды в определенных позициях З'-концевой последовательности (окисленные периодатом натрия по концевой рибозе или фотоактивируемые), изучена конформационная динамика взаимодействия фермента с акцепторным концом тРНКРЬе.

- Показано, что взаимодействия фермента с фенилаланином и АТР влияют на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе; индуцируемые нуклеотидным субстратом эффекты выражены значительно сильнее и зависят от структурных различий бактериальной и эукариотической тРНКРЬе в районах, не контактирующих с активным центром.

- На основе анализа полученных результатов и известных рентгеноструктурных данных высказано предположение, что взаимодействия с аминокислотным субстратом контролируют связывание З'-концевого аденозина тРНКРЬе в активном центре, а индуцируемые АТР более глубокие перестройки в структуре комплекса модулируют конформацию акцепторной ветви в целом.

3. Исследована роль различных элементов узнавания тРНКРЬе в обеспечении продуктивного связывания акцепторного конца с помощью фотоаффинного мечения фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus з4и-содержащими аналогами тРНКРЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие и в присутствии фенилаланина и АТР. Показано, что

- взаимодействие фермента с тРНКРЬе на этапе, предшествующем каталитической стадии, требует тонкой конформационной подстройки комплекса: любые мутации оказывают более существенное влияние на ориентацию З'-концевого нуклеотида тРНКРЬе в присутствии фенилаланина и АТР, чем в их отсутствие;

- нарушение специфических взаимодействий с антикодоном наиболее критично для функциональной ориентации акцепторного конца, контролируемой малыми субстратами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Васильева, Инна Анатольевна, Новосибирск

1. Giege R., Sissler M., Florentz C. Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 5017-5035.

2. Beuning P. J., Musier-Forsyth K. Transfer RNA recognition by aminoacyl-tRNA synthetases // Biopolymers. 1999. V. 52. P. 1-28.

3. Bovee M. L., Yan W., Sproat B. S., Francklyn C. S. tRNA discrimination at the binding step by a class II aminoacyl-tRNA synthetase // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 13725-13735.

4. Ibba M., Sever S., Praetorius-Ibba M., Söll D. Transfer RNA identity contributes to transition state stabilization during aminoacyl-tRNA synthesis // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 3631-3637.

5. Gruic-Sovulj I., Landeka I., Söll D., Weygand-Durasevic I. tRNA-dependent amino acid discrimination by yeast seryl-tRNA synthetase // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 52715279.

6. Khvorova A., Motorin Y., Wolfson A. Pyrophosphate mediates the effect of certain tRNA mutations on aminoacylation of yeast tRNA // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 4451-4456.

7. Mosyak L., Safro M. Phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus has four antiparallel folds of which only two are catalytically functional // Biochimie. 1993. V. 75. P. 1091-1098.

8. Fräser T. H., Rich A. Amino acids are not all initially attached to the same position on transfer RNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1975. V. 72. P. 3044-3048.

9. Sprinzl M., Cramer F. Site of aminoacylation of tRNAs from E. coli with respect to the 2'- or 3'-hydroxyl group of the terminal adenosine // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1975. V. 72. P. 3049-3053.