Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфическое взаимодействие тРНК - амминоацил-тРНК - синтетаза: роль ковалентной структуры тРНК и олигомерной организации фермента

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Специфическое взаимодействие тРНК - амминоацил-тРНК - синтетаза: роль ковалентной структуры тРНК и олигомерной организации фермента"

Р Г Б ОД

1 6 ЯНВ 1935

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ - ИМЕНИ В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.217.377.3

АФАСИЖЕВ -Руслан Джималевич

СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ тРНК - АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА: РОЛЬ КОВАЛЕНТНОЙ СТРУКТУРЫ тРНК И ОЛИГОМЕРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ФЕРМЕНТА

03.00.03. - Молекулярная(биология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МоскЕа 1995

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ онкогенеза

Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардтг РАН (зав. лаб.

член-корреспондент РАН, проф. Л.Л.Киселев) и в Институте

молекулярной и клеточной биологии (зав. лаб. Ог. Р.Ра$1о1о), Страсбург, Франция. ...

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Л.Л.Киселев доктор биологических наук С.Ф.Берестень

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор О.О.Фаворова доктор химических наук, профессор С.Н.КочеткоЕ

Ведущая организация - Институт биохимии им. а.К.Еаха РАН

С диссертацией можно ознакомится-"в библиотеке ИМБ РАН'

Зашита состоится <3., в <//.> часов на заседании

специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной

биологии имени Е.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан <...> . р^. 199^ г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы.

Изучение специфического взаимодействия транспортных РНК (тРНК) с аминоацил-тРНК - синтетазами (АРСазы) берет свое начало в 1950-е годы когда Ф. Крик постулировал суиествование адапторной РНК-молекулы, способной трансформировать информацию, содержащуюся в последовательности нуклеиновых кислот и переводить ее в аминокислотную последовательность белков. АРСазы (К.Ф. 6.1.1) обеспечивают специфическое присоединение аминокислоты к соответствующей тРНК и составляют самую многочисленную группу ферментов, участвующих в реализации генетической информации. При всем разнообразии первичных и пространственных структур АРСаз многочисленные эксперементальные данные подтверждают

предположение о том, что сложный процесс узнавания можно представить как совокупность более простых взамодействий дискретных модулей тРНК и фермента, обеспечивающих специфичность и катализ (Buechter, D. k Schimmel, P., 1993).- Эти модули ковалеятно связаны в одной молекуле (тРНК, мономерные АРСазы) или входят в состав олигомера (АРСазы, обладающие олигомерной структурой). Несмотря на ' очевидную связь между центрами специфичности и катализа способ передачи информации о корректном связывании элементов узнавания в активный центр фермента остается малойзученным.

Рентгеноструктурный анализ комплексов тРНК-АРС показывет существенное изменение конформации фермента и субстрата при взаимодействии, что говорит о возможном сопряжении структурных перестроек компонентов комплекса и передачи сигнала между элементами специфичности и катализа (Moras, D., 1993). Для тРНК этот вопрос может быть сформулирован как роль фосфодиэфирного "остова", а так же способность молекулы подвергаться соответствующим конформационным изменениям. В АРС -взаиморасположение активного и узнающего центров и их связь с доменной или олигомерной структурой фермента. Некоторым аспектам данной проблемы посвящена наша работа.

Фенилаланиновые тРНК и АРСазы (PheRS) относятся к наиболее изученным с точки зрения структуры и элементов узнавания tFHK. По наличию характеристических последовательностей PheRS принадлежат к второму классу AFCa3, но присоединяет аминокислоту к 2'-гидроксильной группе концевого аденозина, что характерно для АРСаз I класса. Цитоплазматические PheRS из всех описанных источников являются гетеротетрамергми с молекулярной массой около

250 kD и тем неожиданнее было открытие аминоацилирующей активности мономерной а-субъеденицы PheRS из митохондрий дрожжей (Sanni, A. et al, 1992). Изучение данного фермента представляет большой интерес с точки зрения эволюции олигомерной структуры и элементов узнавания тРНК.

При исследовании молекулярных основ узнавания тРНК основное внимание традиционно уделяют локализации функционально важных нуклеотидов, но практически неизученным остается вопрос о роли сахарофосфатного остова и, в частности, фосфодиэфирных связей в молекуле тРНК при взаимодействии с АРСазами. Вопрос о вкладе различных фосфодиэфирных связей в поддержание корректной трехмерной структуры частично исследован на примере кольцевой тРНКР|,е из дрожжей (Pan, Т. к Uhlenbeck, 0., 1991), но аналогичные данные для реакций аминоацилирования отсутствуют. В столь высокоорганизованной структуре как тРНК, очевидно, необходимо рассматривать не только функционально-важные фосфодиэфирные связи, но и роль отдельных элементов вторичной структуры и третичных взаимодействий. Цели и задачи работы.

Данная работа посвяшена. исследованию дрожжевой митохондриальной PheRS - одного из примеров изменения олигомерной структуры АРСаз в процессе эволюции, а также выяснению функциональной роли отдельных доменов и третичных взаимодействий в тРНК (дрожжевая ~тРНКи°1) и ' ковалентной непрерывности '"тРНК (дрожжевая тРШС"'1, тРИКТгр быка).

При этом ставили следующие задачи:

Получение методами белковой инженерии а-субъеденицы дрожжевой митохондриальной PheRS для анализа узнаваемых нуклеотидов в tPHK"" и определения положения первичного присоединения аминокислоты.

Разработка общего подхода для изучения роли различных фосфодиэфирных связей тРНК в реакции аминоацилирования.

Идентификация функционально-важных фосфодиэфирных связей в различив« тРНК (тРНК1гр быка и тРНКй°' из дрожжей).

Изучение роли третичных взаимодействий в акцепторной функции дрожжевой тРНКИе1 методом направленного мутагенеза.

Исследование субстратных свойств молекул РНК, моделирующих отдельные домены дрожжевой тРНК"*' и различные способы их организации.

/

Нз"чная новизна работы.

Впервые выделен из природного источника продукт гена MSF1. Показано, что: для эффективного аминоацилирования тРНКР>" необходимо наличие как 2", так и .3'-гидроксилов концевого рибозного остатка; единственным элементом узнавания в тРНКР1>е является антикодон.

Разработан сбший подход для идентификации

функционально-важных фосфодиэфирных связей в, молекуле тРНК. Показано, что "набор" связей, ковалентная непрерывность которых необходима для - сохранения амноацилирующей активности исследованных тРНК (тРНКТгр быка и - дрожжевая • тРНКМе'), индивидуален. Исследованы субстратные свойства

тРНК -транскриптов с мутациями по положениям третичных взаимодействий. Установлено, что отсутствие отдельных третичных взаимодействий не влияет на аминоацилирующую активность тРНК,ч однако, замены, приводящие к компактизации трехмерной структуры, полностью блокируют реакцию.

С использованием,ряда модельных РНК-субстратов, полученных на основе дрожжевой тРНКМе1, показано, что антикодон (основной элемент узнавания в тРНК1"' для Met RS), отделенный от акцепторного домена, не способен стимулировать реакцию аминоацилирования. Установлено, что необходимым условием протекания реакции являются контакты MetSS с D-шпилькой в молекуле тРНК"". • '

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

1. 14-th International tRNA Workshop (1993) Cap d'Agde, France

2. Young Scientist's View of Molecular Biotechnology (1994) Ascona, Switzerland.

3. Molecular Biology on the Border of XXi Century. Moscow, 1994.

4. A World of RNA: Structure and Function (1994) Spetsai, Greece.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. В списке литературы 107 наименований. Работа содержит 102 страницы, включая 23 рисунка и 5 таблиц.

Список сокращений.

APC - аминоацил-тРНК-синтетаза

ATP - аденозинтр^гфосфорная кислота

GST - глутатион

GTP - гуанозинтрифосфат

DEAE - диэтиламиноэтил

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

DTT - дитиотреитол

XxxRS - амиаоацил-тРНК-синтетаза, соответствующая трехбуквенному обозначению аминокислоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Молекулярное клонирование

Для молекулярного клонирования, секвенирования ДНК, ПЦР и олигонуклеотиднаправленного мутагенеза использовали стандартные методы (Sambrook, J. et all, 1989). Выделение ферментов

TrpRS быка. Выделение свободного от РНКаз фермента проводили по модифицированной методике (Kisselev, L. et al, 1979). Стадию гель-фильтрации на носителе Сефадекс' G5G заменяли гидрофобной хроматографией на смоле Toyopearl HW65 (Kovaleva eî al.) с последующей гель-фильтрацией на колонке Superóse 12 (Pharmacia).

TrpRS из Е. col i. Проводили по методике Beresten, S. et all (1989). Для выделения использовали предварительно полученный на основе вектора pET3d штамм-суперпродуцент pETWRSS.

MetRS из дрожжей. Выделение проводили . из предварительно полученного дрожжевого штамма-продуцента pGGRAMl. Фермент, соединенный с глутатион S-трансферазой, выделяли афинной хроматографией на GST-агарозе как описано Smith, D.B. к Jonson, К., (1988). После тромбинового протеолиза глутатион S-трансферазу удалали повторной хроматографией на GST-агарозе.

Белок MSF1. Экспрессию и выделение проводили аналогично MetRS.

Гель-электрофорез по системе Лэмли. Проводили по стандартной методике с использованием постоянной (1095) или переменной (8 -1596) концентрации разделяющего геля.

Реакция аминоацилирования. Для тРНК-транскрипта или индивидуальной тРНКТгр использовали реакционную смесь следующего состава: 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 2 мМ АТР, 0,4 мМ luC] l-Trp (50-120 cpm/pmol ) 0,1 - 5 мМ тРНК, 1 - 20 нМ

фермента в общем объеме 50 мкл.

Транскрипция 1д vi t го и методы работы с РНК

Транскрипцию проводили в объеме 0.5 - 1 мл А часа при 42 °С. Состав реакционной смеси: 40 мМ Трис-HCl рН 8,1. 22 MgCl2, 20 мМ ДТТ, 1 мМ спермидин, 0,01% Тритон Х-100, 4 мМ всех рибочуклеотидтрифосфатов; 20 мМ GMP или АМР в зависимости от первого нуклеотида в транскрипте, 500 ед ингибитора РНКаз из плаценты 0,05 - 0,1 мг рестрицированной плазыидной ДНК и 0,05 -0,1 мг очищенной РНК-полимеразы бактерофага Т7. Очистку транскриптов проводили хроматографией на колонке МоаоО 5/5 или электрофорезом в полиакриламидном геле с 8М мочевиной.

РНКазное картирование и секвенирование тРНК-транскриптов проводили по стандартным методикам (Ehresmann, С. et al., 1988).

Разделение тРНК и аминоаиил-тРНК афинной хроматографией на иммобилизованном факторе элонгации Tu. Фактор элонгации Tu из Thermus Therrnothilus иммобилизовывали на BCN-ажтивированной Sepharose 4В. Хроматографию вели как описано Derwenscus, К.-H. et ail. ( 1984),. Фракции свободной и аминоацилированной тРНК анализировал!' электрофорезом в 158 секвенируккцем геле.

Электрофорез в кислом геле. Для обнаружения слабого уровня аминоацилирования аликвоты из реакционной смеси экстрагировали фенолом, осаждали этанолом и растворяли в 50% формамизе. Образцы наносили на 10% ПААГ с 7М мочевиной. Б качестве буфера исполь-зовал» 50 ыМ ацетат натрия (рН '5,5). Электрофорез проводили' в течении 2 часов. Гель фиксировали в 10% уксусной кислоте, высушивали и экспонировали с экраном FUGI Phospholmager. Данные обрабатывались с помощью программы Biolraage фирмы Millipore.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспрессия и "выделение фенилаланил-тРНК - синтетазы из митохондрий дрожжей.

При изучении практически всех митохондриальных белков основную трудность представляет их ,выделение в гомогенном состоянии. Дрожжевые митохондриальные АРСазы не являются исключением - лишь некоторые из них-выделены и охарактеризованы (Tzagolov et al., 1990). Единственный путь' решения данной проблемы состоит в экспрессии требуемого фермента с использованием генноинженерных методов. Именно таким образом, в работе Sanni et al.(1991). установлено, что о-субъеденица

митохоидриальной РЬеЯ5 (продукт гена МЕР1) активна в реакции аминоацилирования в виде мономера, в то время как все отальные РЬе115 не могут быть разделены на мономеры без потери активности.

Нами получен эффективный дрожжевой штамп-продуцент, позволяющий выделять 3-5 мг высокоочищенного фермента из 1 литра культуры. Генетическая конструкция для экспресси обеспечивает синтез слитного белка глутатион Б-трансферазы с М5П, который выделяется с использованием афинной хроматографии на глутатион -агарозе. В последующим глутатион $-трансфераза удаляется тромбиновым протеолизом (Рис. 1).

А. Б.

12345678 12345678

205- ■ =5

116- —lagtea

97466- i

45-

Рисунок 1. Выделение белка MSF 1. А. SDS-гельэлектрофорез. Б. Иммуноблотинг. 1 - белки-свидетели (молеклярная масса в кДа), 2 - клеточный экстракт, 3 - осадок после ультрацентрифугирования, 4 - безрибосоыный-экстракт, 5 - безрибосомный экстракт после нанесения на колонку с глутатион-агарозой, 6 - фракция, элюированная буфером, содержащим 10 мМ глутатиона, 7 - фракция 6 после осаждения сульфатом аммония и диализа, 8 - фракция 7 после тромбинового протеолиза и повторного пропускания через афинную колонку.

Характеристика белка MSF1.

Существование белка MSF1 в мономерной форме было показано для фемента, выделенного из Н. coli. Для определения молекулярной массы белка, полученного из дрожжей, использовали аналитическую гель-фильтрацию на HPLC-колонке TSK 3000 SW (Beckman). Полученная молекулярная масса составила • 58 kD (профиль элюции не

приводится), что приблизительно равно молекулярной массе мономера, рассчитанной из аминокислотной последовательности.

В реакции аминоацилирования с использованием дрожжевой тРНК1>Ье при 37 сС кинетические параметры полноразмерной (М5П ) и усеченной с Л-конца (М5РД1-12) форм белка, а также в форме М5Р-ЭЗТ, оказались практически одинаковыми (Табл. 1).

Таблица 1. Кинетические параметры белка М8Р1 в реакции аминоацилирования с дрожжевой тРНК

Белок Км,мкМ Kcat, сек"1 Kcat/KM, сек"'/мкМ"'

MSF1 10 3,5 0,35

MSF1-GST 11 2,9 0,26

MSFA1-12 8 3,1 0,38

MSFA1-12- -GST 9 3,5 0,39

MSF из Е. col i 15 1,25 0,083

Обращает на себя внимание то, что показатель каталитической эффективности iCcat/'Км для белка MSF, выделенного из дрожжей, существенно выше по сравнению с белком, экспргссированным в Е. coli (Sanni et al., 1992). Для PheRS дрожжей и Е. coli показано,, что большинство контактов с тРНК образуют а и ß субьеденицы, соответственно, но в каждом случае для активности необходимо присутствие обеих субъедениц (Khodyreva et al., 1995). Предпологается, что активный центр формируется на поверхности контакта субъедениц. Открытие ферментативной активности мокомерного белка MSF поднимает ряд вопросов об эволюции олигомерной структуры PheRS. Высокая гомология MSF1 и малой субъединицы PheRS Е. coli (Рис. 2) позволяет предположить прокариотическое происхождение MSF путем встраивания 60 аминокислот между мотивами II и III, а также и С- концевого удлинения на 109 аминокислот.

>М 1« )•■

Е.соп ажйнгчмЬ-—шн

im >•< и» >« )«•

S.cervisiae (с) • • "«ШИК

S.cerevisiae (а) TT"'

мотивы 11-го класс* Ё:ЗйН11ШЕ1!1

U I—! I_!

Рисунок 2. Схематическое сопоставление MSF-белкз и а-субъедеккцы PheRS Е. coli. Вертикальными линиями отмечены идентичные последовательности, с-цитоплазма. га-митохондрии.

Способ взаимодействия белка МБР с тРНК должен существенно отличаться от цитоплазматических аналогов, поскольку все необходимые функциональные элементы содержатся в одном полипептиде. С другой стороны, РЬеКБ принадлежат к второму классу АРСаз по наличию характеристических последовательностей (Емап] е1 а1, 1990), но присоединяют аминокислоту к 2'-гидроксилу концевого аденозина. Это единственное исключение и причины его остаются неизвестными. Принимая во внимание вышесказанное, мы считали . логичным продолжить дальнейшие исследования по двум направлениям: локализация нуклеотидов в тРНКР|>,!, существенных для ее узнавания белком М5Р и определение положения первичного присоединения аминокислотного остатка к концевому рибозному остатку тРНК.

Определение положения присоединения аминокислотного

остатка к концевой рибозе тРНКр"° Дрожжевые тРНКР|1° с концевыми 2' и З'-дезоксиаденозинами были любезно предоставлены 0г. М. 5рг1пг1. Соответствующие тРНКРЬс-тран скрипты получены путем транскрипции

амплифицированного фрагмента ДНК с последующим достраиванием 3'-конца тРНК терминальной трансферазой в присутствии 2' или З'ёАТР. Кинетика аминоацилирования тРНК-транскриптов представлена на Рис. 3.

Рисунок 3. Кинетика аминоацилирования тРНК№°- транскриптов после замещения концевого аденозина на его

дезокси-произюдные. А - тРНКр|,е-транскрипт, ¿-замещение на рибоаденозин, замещение на З'дезоксиаденозин, о - замещение на 2'дезоксиаденозин.

Показатели kest,/!Cm (каталитическая эффективность ) для цитоплазматической PheRS дрожжей и MSFl-белка при аминоацилировании с тРНК, содержащей только 2'-гидроксил, существенно различаются: PheRS способна использовать данный субстрат с эффективностью, близкой к нормальной, в то время как для MSFl-белка наблюдается падение каталитической эффективности на два порядка (данные, полученные с использованием тРНК и тРНК-транскриптов практически идентичны). Это свидетельствует о необходимости как 2'-, так и З'-гидроксилов концевой рибозы для эффективного аминоацилирования тРНК14™ белком MSF1.

Положение присоединения аминокислотного остатка к гидроксильной группе определяется жесткой ориентацией 'субстратов в активном центре фермента и асс.чметричность реакции лишь отражение принципиально отличающейся организации активных центров двух классов АРСаз. Безусловно, для понимания структурных основ нгблюдаемых различий между белком MSF1 и PheRS необходимо определение структуры белка, но некоторые предположения могут быть высказаны.

Мы считаем, что белок MSF можно рассматривать как "коровый" (core) фермент, наиболее близко отражающий общую предкозую форму PheRS и единственный сохранивший структуру ее активного центра. Последующую эволюцию возможно представить как появление и усложнение олигомеркой структуры, направленное, вероятно, на -увеличение каталитической- эффективности фермента. Сохранение в митохондриях эвол:ош:энио более древнего белка, возможно, связано с особенностями биосинтеза белка в митохондриях. Этот процесс менее интенсивен по сравнению с цитоплазматическим биосинтезом белка и, вероятно, не требует столь активного дорибосомного этапа. Действительно, отношение к /Км для белка MSF сопоставимо

' cat'

с величинами, характерными для мономерных белков (например 0,3 сек^мкМ"1 у MetRS дрожжей), но существенно ниже чем, например, у PheRS Е. coli - 14,4 сек^нкМ"1. К последствиям олигомеризации, вероятно, относятся перемещение активного центра из пределов одного полипептида на поверхность контакта субьедениц и уменьшение вклада 3'-концевого гидроксила в эффективность катализа.

Элементы узнавания в тРНКр>1° дрожжей.

Для определения элементов, узнаваемых в тРНКРЬе белком MSF, определены кинетические параметры ряда тРНК-транскриптов, содержащих нуклеотидные замены в положениях, существенных для

взаимодействия с PheRS из других источников. Результаты представлены в Табл. 2»

Таблица 2. Кинетичесхие параметры мутантных

. тРНК?>т-транскриптов и тРНК"" в реакции аминоацилирования с белком MSF. Все замены произведены в последовательности дрожжевой тРНКрь. (Y-дрожжи, Е- Е. coli, Т- транскрипт, аминоацилирование не определяется при концентрациях 0,2 мкМ фермента и 10 мкМ тРНК)

замена Км.мкМ Кса1,сек Kcat/KM (отн)

TPHK""Y 8 0,85 . 0,125

TPHKp1"E 20 0,75 0,045

tPHKpi.«Y cytQ T 1 0,81 (1)

тРНКРЬ°ЕГ 10 0,80 0,1

тРНКР1"7 mi to T 1,8 1,4 0,98

G34A - - <0,0001

A35U - - <0,0001

A36C - - <0,0001

G20U 1,1 0,79 0,89

A73U 2,3 0,076 0,04

A73C. ... .13,0 0,070 , 0,006.

G10C, C25U 20,1 0,075 0,004

G15C, C48G 30,0 0,38 0,015

A44G 30,0 0.61 0,025

G45U 15,0 0,16 0,01

G30C

C40G

A31C U39G 2,5 0,55 0,27

Met (GAA) 7,7 2,6 - 0,42

Туг (GAA) 15,0 0,075 ' 0,01

Arg (GAA) 33,0 0,45 0,02

Asp (GAA) 21,1 3,6 0,21

Все тРНК с мутациями в антикодоне не активны в аминоацилировании и, в отличии от дрожжевой PheRS (Sampson et

al., 1989), реакция не обнаруживается даже при высоких концентрациях фермента. Замена в "дискриминаторном" положении приводит к уменьшению Kcat в 10 раз при незначительном повышении Км, как и в случае PheRS Е. coli (Pel er son and Uhlenbeck, 1992). Важность нуклеотида в 20 положении установлена для PheRS Е. coli, дрожжей к человека (Nazarenl-.o et al, 1992), но при взаимодействии с белком MSF, как и с PheRS из T. thermophilus (Moor et al, 1992), эта позиция не существенна. Замены нуклеотидов G10 и С25, а такяе G15 и С48, критичны для взаимодействия с PheRS Е. coli, но практически нг влияют на узнавание тРНКРЬе белком MSF1. При замене нуклеотидов в двух парах оснований, примыкающих к гнтккодоногой петле, тРНКр,>е перестает узнаваться PheRS человека, но при реакции с белком MSF соотношение Kcat/Km уменьшается всего в 4 раза.

Введение фзнилаланинового антикодона GAA в тРНК Met, Туг, Arg и Asp делает их эффективными субстратами для MSFl-белка: уменьшение каталитической эффективности не превышает двух порядков для тРНКТуг, а для тРНКНе1 и тРНКЬср- менее одного порядка.

На основании приведенных данных можно заключить, что злеметы узнавания в тРНКРЬе для белка MSF отличаются от других PheRS. Ндииствгнними элементами узнавания являются три основания антикодона, а вклад остальных элементов, характерных для тРНКР1"\ не существенен. Критическое значение замен в антикодоие может свидетельствовать о передаче сигнала между антикодон-связывакхаим и активным центрами фермента, что оказывается, по-видимому, более существенным для мономеркого MSF-белка, чем для олигомерных PheRS. Влияние замен я антикодоне и более простой, по сравнению с другими PheRS, "набор" • элементов узнавания также могут свидетельствовать в пользу гипотезы о MSFl-беке как о наиболее примитивном и эеслюционно древнем представителе семейства PheRS.

При изучении различных аспектов взаимодействия тРНК с aaRS основное внимание уделяют локализации нуклеотидов, существенных для активности тРНК. Но практически малоизученным остается вопрос о функциональной роли ковалентной структуры тРНК (различных способов ее организации и ковалентной непрерывности) во взаимодействии с ферментом. Задачи дальнейшего исследования состояли: г разработке метода определения функциональной важности различных фосфодиэфирных связей в тРНК; определении субстратных свойств молекул РНК, моделирующих различные домены тРНК;

исследовании роли третичных взаимодействий для структуры и функции тРНЬ.

Локализация функционально-важных фосфодиэфирных связей в молекуле

тРНК.

S.B связи с отсутствием адекватных методических подходов для решения поставленной задачи нами был разработан метод "статистически расщепленных транскриптов". Принципиальная схема метода состоит в следующем:

-синтез тРНК-транскрипта in vitro

-статистический гидролиз в денатурирующих условиях (менее одного разрыва на молекулу)

-ренатурация тРНК-транскрипта

-аминоацилирование полученной популяции частично расщепленных транскриптов ,

-разделение аминоацилированных и неацилированных тРНК-транскриптов

-анализ полученных фракций в секвенируюшем геле с последующим определением радиоактивности в каждой зоне.

Идея метода проста - молекула, содержащая разрыв по определенной связи, является худшим, равноценным или лучшим субстратом для своей АРСазы, и данный эффект отражается в аминоацилированной фракции по интенсивности зоны в геле, соответствующей данному разрыву.

Триптофанил- тРНК быка Частично расщепленный тРНКТгр-транскрипт быка

аминоацилировали триптофаном с помощью высокоочищенной TrpRS и, после разделения тРКК и триптофанил-тРНК хроматографией на бензоилированной ДЕАЕ-целлюлозе, анализировали каждую из полученных фракций в 14% секвенируююем геле (Рис. 4, А).

Как видно из сравнения треков 5 и 6 (Рис. 4, А), интенсивность зон, соответствующих разрывам фосфодиэфирных связей 21, 22, 36 - 38, 57 - 59, 62 и 64, значительно ниже средней (это подтверждается данными денситометрического сканирования геля). Очевидно; что в отличии от исходного гидролизата (Рис. 4, А, трек 2), в аминоацилированной фракции (Рис.4, А, трек 5) молекулы с различными разрывами представлены не равномерно. Другими словами, идет отбор молекул с одиночными разрывами по их субстратной эффективности, что отражается в интенсивности соответствующих зон в геле и позволяет судить о влиянии каждого разрыва на активность тРНК в аминоацилировании.

* 'Л 3 Ч"

■ г-ЛШ

г. "я

г «»—л ж .

•г- -

«в ка^дьдга^

Рис.4. тРНКТгр-транскрипт быка. А. Радиоавтограф 14% ПААГ с 8М мочевиной. 1 - тРНК - контроль, 2 - щелочной гидролизат, 3 -гидролизат РНКазой"Т1, 4 -щелочной гидролизат, инкубированный с ТгрЯБ, 5 - неацилированная тРНК, б - триптофанил-тРНК. Б. "Торможение в геле" комплекса Тгрй5 - расщепленный тРНК1гр

-транскрипт. а. тРНК-транскрипт (контроль), б. тРНК-транскрипт в комплексе с ТгрИЗ; 1 - "связанная" тРНК,2 -"свободная" тРНК. В. Радиоавтограф 14% ПААГ с 8М-мочевиной после анализа связавшейся и не связавшейся тРНК. 1 - тРНК- контроль, 2 ■ - щелочной гидролизат, 3 - гидролиз РНКазой Т1, 4 - "свободная" тРНК (гидролизат), 5 - "связанная" тРНК (гидролизат).

Из полученных данных нельзя заключить, влияют ли разрывы фосфодиэфирных связей на связывание т№К с синтетазой, или только на реакцию аминоацилирования. Расщепленный тРНКТгр-тран скрипт инкубировали с ТгрИБ, после чего отделяли комплекс тРНКТгр -ТгрКБ от несвязавшейся тРНК в нативном полиакриламидном геле (Рис. 4, Б). Анализ в секвенируюшем геле тРНК, элюированной из зон, соответствующих комплексу тРНКТп>-Тгр!15 (Рис.4, Б, 1 ) и

несвязанной тРНК (Рис.4 Б, 2), показал равную интенсивность полос по всем положениям (Рис.4, В). Это свидетельствует о том, что разрыв каждой отдельной фосфодиэфирной связи не препятствует связыванию тРНК1гр c'JrpRS. Вероятно, ковалентная непрерывность установленных связей (Рис. 5) важна для реакции, а не для связывания фермента и субстрата.

Рис.5. Третичная структура тРНК1гр быкг. Стрелками показаны фосфодиэфирные связи, существенные для реакции амивоацилирования; пунктирными стрелками обозначены связи в тРНК, защищаемые триптофанил-тРНК синтетазой от модификации этилнитрозомочевиной (Rombi et ai, 1989).

Следует отметить, что фосфодиэфирные связи, важные для активности, локализованы как в местах контакта тРНК с ферментом (Rombi et а 1, 1989), так и вне этих участког. Данный подход но позволяет однозначно ответить на вопрос, каким образок; разрыв связи влияет на акцепторнуг-' функцию тРПХ. Изменение конформации молекулы представляется маловероятным, поскольку для тРНКР1,е дро;.:к'ей показано, что разрывы только 14 связей из анализированных 68 (Рал, Т. к Uhlenbeck.O., 1991) критичны для структуры. Принимая во внимание общность третичной структуры разных " тРНК и нессгпадение позиций, важных для структуры и функции, мы считаем, что идентифицированные связи . -важны для способности тРНК претерпевать хонформационные изменения при образовании продуктивного комплекса с ферментом.

Дрожжевая тРНК*"

тРНККг1 S. cerevisiae была выбран?. для дальнейших исследований по ряду причин: метионинозая тРНК хорошо изучена с точки зрения структуры и элементов узнавания (Scliulman and Pelica, 1990, Senger et al 1992); предварительно нами получен штамм -продуцент MelRS, позволяаший выделять 3-10 мг фермента из 1 литра культуры дрогжей; использование [3SS]-меченного метионика позволяет обнаруживать низкий уровень аминоацилированик при тестировании модельных субстратов.

Применение метода "статистических разрывов" показало, что проявление эффекта разрыва фосфодиэфирной связи в тРНК зависит от концентрации фермента или времени инкубации реакционной смеси. В реакции аминоацмлирования с концентрацией Ме1118 5 нМ активны только не содержащие разрывов тРНК, а при 100 нМ аминоацилируются тРНК с любыми разрывами (данные не приводятся). Влияние времени инкубации показано на Рис. 6. Реакцию проводили в условиях, позволяющих отбирать аликвоты на линейном участке (1 мин) и при выходе реакции на плато (15 мин).

Из Рис.б видно (сравнение дорожек 5 и 7), что различия в интенсивности полос, наблюдаемые после 1 мин. инкубации, при тотальном аминоацилировании (15 мин.) менее выражены. Мы считаем, что данное явление можно объяснить тем, что тРНК с любым одиночным разрывом сохраняет некоторую афинность для образования продуктивного комплекса с ферментом за счет установления равновесия "активный - неактивный изомер". При этом концентрация "активного" изомера по отношению к "неактивному" определяется долей энергии связывания, при взаимодействии с ферментом, необходимой для компенсации данного разрыва. Возможно, что именно величина этого энергетического барьера определяет эффективность каждого изомера как субстрата для ааРСазы. тРНК с любым разрывом является худшим субстратом по сравнению с< интактной тРНК, что проявляется при низкой концентрации фермента. При высоких концентрациях фермента или длительной инкубации, влияние -любого разрыва может компенсироваться.

Из изложенных данных следует, что предложенный нами подход применим для идентификации наиболее важных фосфодиэфирных связей в тРНК. Для дрожжевой тРНК"" это антикодоновый, акцепторный и ТФС стебли. Важно подчеркнуть, что наиболее существенно влияние разрывов фосфодиэфирных связей в антикодоновом стебле, тогда как основные элементы узнавания тРНК*е1 расположены в антикодоновой петле.

В результате применения разработанного нами подхода ч установлено, что:

-различные фосфодиэфирные связи в тРНК вносят неодинаковый вклад в поддержание акцепторной активности молекулы;

-"набор" функционально-важных связей в тРНК может служить характеристикой специфического взаимодействия тРНК-синтетазных пар;

-влияние разрывов фосфодиэфирных связей на акцепторную активность .

тРНК зависит от концентрации фермента и времени инкубации; -локализация критических фосфодиэфирных связей может отличаться от положения элементов узнавания.

1 2 3 4 5 6 У

31---

30 =■

29 —-

26 .-*»—•

22 Hi^-

Рисуиок 6. Анализ функционально -важных фосфодиэфирных связей в дрожжевой тРНК*е1. I. тРНК - контроль; 2-. щелочной гидролизат; 3. частичный . гидролизат РНКазой Т1; 4-5 - ггацнлированная тРНК и метионил-тРНК, соответственна, после 1 мин. реакции. 6-7 - кеацилированная тРНК и метионил-тРНК, соответственно, после 15 ми.ч реакции.

15 —

Для подтверждения роли идентифицированных связей нами были синтезированы молекулы тРНКи°1, содержащие одиночные разрывы и определена их активность в реакции аминоацилирования. В качестве матрицы для транскрипции in vitro использовали ПЦР-акплифицированные фрагменты ДНК, содержащие промотор РНК-пслимеразы фага Т7. Разрыв по положению 29-30 характеризуется наименьшей Чинтенсивностью в аминоацилирозанной форме тРНК (Рис.6), разрыг 34-35 расположен в области узнаванг.я MetRS (но его интенсивность несколько выше). Разрыв 53-54 в этих опытах служил в качестве внутреннего контроля. Падение каталитической эффективности по отношению к тРНК"е1-транскрипту показано на Рис. 7.

Рисунок 7. Активность тРНК*е1 - транскриптов с одиночными разрывами в реакции амнноацилирования. Уменьшение каталитической эффективности (в X раз) указано в рамке.

Полученные результаты количественно подтверждают возможность применения нашего метода для идентификации фосфодиэфирных связей в тРНК, ковалентная непрерывность которых необходима для v поддержания акцепторной активности молекулы. Важно отметить, что данные, получаемые с использованием разработанного нами подхода, информативны только в сочетании с другими методами. Так, в частности, мы показали, что тРНК с любым точечным разрывом может аминоацилироваться при высоких концентрациях фермента (данные не приводятся). С другой стороны, в литературе описаны примеры специфического аминоацилирования отдельно взятого акцепторного домеН'а тРНК, что подразумевает двойной разрыв сахарофОсфатного "остова" молекулы.

Мы полагаем, что рассмотрение ковалентной структуры тРНК как "каркаса", необходимого для правильной ориентации в пространстве элементов узнавания (Giege et al, 1993), является сильно упрощенным. При помощи ряда модельных субстратов и замен нуклеотидов, образующих третичные взаимодействия, нами предпринята попытка исследовать роль трехмерной структуры и отдельных доменов дрожжевой тРНК**1 для ее акцепторной функции.

Роль отдельных доменов и третичных взаимодействий дрожжевой тРНКНе1 в реакции аминоацилирования 1. Аминоацилирующая активность модельных РНК-субстратов Для тРНК"'1 Е. coli показано (Martinis and Schimmel, 1992), что структурасодержащая только акцепторный стебель, способна с крайне низкой эффективностью, но специфически аминоацилироваться гомологичным ферментом. При постановке экспериментальной задачи

мы учитывали, что основные элементы узнавания дрожжевой тРНК*"'"" расположены в антикодоновой петле и акцепторном стебле. Задача состояла з определении активности следующих модельных субстратов в реакции аминоацилирования: акцепторный домен тРНК (акцепторный стебель и ТФС шпилька), акцепторный домен в присутствии антикодоновой шпильки, акцепторный стебель и антикодоновая шпилька, соединенные последовательностью TPHKSer из митохондрий быка. В этой тРНК отсутствует D-шпилька, но возможно образование компактной структуры, в которой сохраняется расстояние между концами молекулы и их взаимная ориентация (DeBruign and Klug, 1983). В другом модельном субстрате акцепторный стебель и антикодоновая шпилька соедекены последовательностью

митохондриальной тРШС**1 из нематоды Caenorhabdi t i s elegants, в которой отсутствует ТФС-шпилька (Рис. 8). Другими словами, мы стремились соединить элементы узнавания на основе структуры, обеспечивающей их положение в пространстве как нативная тРНК, но лишенной отдельных фрагментов "коровой" части молекулы.

А

с с

А

GU gc cg gc cg cg gc

gagcc cucgg

gc cg au g с gc gc,

В i

с

А

g V g с с g g с С C-

CG G

ug cgguau

AuGC —„

cg aua AD

g с g с g с С А U А с , и

A lj

А с с

g а g с с с g с с g

с v

tagg* gtcu г

LIÄÜCU иV L 1

V gag А и й с

ь.

G tt

/

А

А

с

и

и

А

с

и

Рисунок 8. Дизайн моаельны* субстратов для дрожжевой Ме1К5.

A. Акцепторный домен тРНКВс1. Б. Антикодоновая шпилька тРНК"*1.

B. тРНК5" из митохондрий быка с акцепторным и антикодоновым доменами дрожжевой тРИК^51 (ЛЭ). Г. Митохондриальная тРНККс1 из CaeDOгhabdi 115 е^апБ с акцепторным и антикодоновым доменами дрожжевой тРНКВе1 (йТ).

Эффективность аминоацялирования определяли по измерению радиоактивности после отделения аминоацил-тРНК от невключившейся аминокислоты в денатурируюпем кислом ПААГ (Рис. 9). В качестве стандарта использовали [ ]-Ме1-тРНКк*1 с известной удельной активностью. , 1

А. 1 2 3 4 5

8 16 30 в 16 30 8 16 30 в 16 30 2 4 8

«ОС

Б.

35 [SJmeMRNA (epm.)

# # ср 40 И"1*0*11) ^Met (GAU) _ г 4 8 16 2 4 8

'tot СИ

. *» ^ ©.in ■ .

Рисунок 9. Аминоацилирование модельных РНК-субстратов дрожжевой

MetRS. А. Аминоацилирование акцепторной миниспирали

(ААмС ). 1. ААмс; 2.. ААмс + антикодоновая шпилька (CAU); 3. ААмс + антикодоновая шпилька с мутацией в антикодоне (GAU); 4. ААмс + антикодоновый домен

(антикодоновая шпилька (CAU) и ТФС-шпилька); 5. тРНКи" (400, 860, 1150 ерш). Б. Аминоацилирование AD тРНК е . Время в минутах. Концентрация РНК 60 дМ, MetRS - 0,1цМ.

Использованный метод анализа позволяет производить количественное определение уровня каталитической эффективности субстрата (k^t/Km). По сравнению с тРНК*°1-транскриптом, -для акцепторной миниспирали этот показатель уменьшается в 6000 раз, а для &D тРНКн°1 - в 300 раз (Табл. 4). Очевидно, что акцепторный домен обладает крайне низкой активностью в аминоацияировании, а присутствие антикодонового домена не стимулирует реакцию. Уровень аминоацилирования "химерной" AD тРНК*е1 существенно выше, но, по сравнению с тРНК*''', остается низким.

Для оценки связывания модельных субстратов с ферментом измерены их константы ингибирования в реакции MetRS с тРНК"*1. Для антикодонового домена и AD тРНК"'1 они равны 20 мкМ, акцепторный домен в концентрациях до 200 мкМ реакцию аминоацилирования не ингибирует. Одинаковые значения констант

ингибирования для антикодонового домена и AD тРНК'е позволяют считать, что связывание с MetRS обеспечивается в основном антикодоновой петлей. Большая эффективность AD тРНКИе1, по сравнению с акцепторным доменом, может быть связанна с повышением локальной концентрации концевого аденозина около активного центра фермента за счет связывания антикодоновой петли. Специфичность влияния антикодона на акцептоную активность AD TpHK*et подтверждается тем, что при нуклеотидной замене C20G аминоацчлирование не обнаруживается (Рис. 9, Б.).

ДТ тРНК"*1, в противоположность AD тРНКВе', эффективна в реакции аминоацилирования - ее показатель каталитической эффективности Kcat/Km всего в 10 раз меньше, чем у TPHK"ct—транскрипта (Табл. 4). Из сравнения субстратных свойств AD и ЛТ тРНК**1 следует, что D-шпилька важна для узнавания тРНК1""-. Трехмерная структура комплекса тРНК -MetRS не известна, однако сходство структур MetRS и GlnRS £. coli (Регопа et аl., 1993) равно как и элементов узнавания в тРНКн,:1 и тРНК01", позволяет предложить модель данного комплекса: после связывании антикодоновой петли, домен MetRS, состоящий из двух спиралей НЕ и Н'. соединенных f-складчатым слоем, взаимодействует с внутренним углом L-образной структуры тРНК (позиции 10, 11, 12 и 13), и эгот контакт определяе+ ориентацию тРНК на поверхности фермента. Вероятно, контакты образуются между сахарофосфатныг.: остовом тРНК и .аминокислотными остатками, поскольку., нуклеотидная последовательность D-петли тРНа"" отличается от ДТ тРНКНс1.

Таблица 3. Кинетические параметры модельных РНК-субстратов дрожжевой Met P.S.

тРНКЬе1 -Предельное Kcat, Km, Kcat/Km уменьшение

аминоацилирование, 4L сек дМ (дМ^сек"') активности '"V в X раз

тРНК1"" 100 0,3. 10 0,031 1

АА шпилька 0,01 - - - >6000

AD (CAU) 4 - - 0,0001 300

ДО (GAU ) - - - -

ДТ 29 0,016 5.2 0,031 10

рассчет параметра субстрата не возможен из-за низкой активности

2. Роль третичных взаимодействий в акцепторной функции тРНК"5'.

Образование пространственной структуры тРНК обеспечивается третичными взаимодействиями - водородными связями, которые реализуются при определенной ориентации донорно-акцепторных групп. Заменяя нуклеотиды, принимающие участие в формировании третичных взаимодествий, можно определить их функциональную роль. Путем одиночных и двойных замен (Табл. 4) были нарушены 3 третичных взаимодействия и определены кинетические параметры полученных мутантных тРНК. Взаимодействие A20G57A59A60 уникально для инициаторной тРНКИе1 и, как видно из Табл. 5, замены соответствующих нуклеотидов приводят к потере акцепторной активности. Это взаимодействие связывает D- и ТФС-петли, и, вероятно, играет определяющую роль во взаимной ориентации антикодонового и акцепторного доменов тРНК (Basavappa and Sigler, 1991).

Таблица 4. Кинетические параметры тРНКи°1-тран скриптов с мутациями по положениям, образующим третичные взаимодействия. Выделены нуклеотиды, образующие взаимодействия.

замена в тРНК-транскрипте Км,мкМ Kcat,сек Kcat/Км, сек^мкН"1

тРНК^-транскрипт 10 1,3 " 0,13

C13-G22-G46

G12 14 0,6 0,04

G13 С22 15 0,6 0.04

U45-G10-C25

СЮ 17 0,2 0,012

СЮ G25 17 0,08 0,005

A20-G57-A59-A60

U20 - - <2x10~*

U20-G60 - - <0,6хЮ"4

- амияоацилирование не определяется при концентрации тРНК""-транскрипта 10 дМ и 0,2 дМ MetRS.

Эффект нуклеотидных замен, определенный по потере аминоацилирующей активности тРНК, может иметь различные причины: изменение третичнои структуры, подвижности отдельных участков и

т.д. Предположение об изменении конформации мутантных тРНК проверяли с использованием частичного гидролиза РНКазами в нативных условиях. На Рис. 11. представлены результаты картирования тРНК"е1-транскрипта и двойного мутанта по третичному взаимодействию А2(Ю57А59А60 (см. Табл.4).

А. Б.

123456789 1011 1234567&

30

29 -а»

«я

26 и»

22 о—

19

*>ват'яемй-»**-' '

15

Рисунок 11. Структурное картирование дрожжевой тРНКи,1-траи с крипта с нуклеотидными заменами А20У н АбОС. А. Гидролиь РНКазой Т1. 1 -.контроль, 2 - Гидролиз в денатурирующих условиях, 3 - шелочной гидролиз, 4-7 - гидролиз t нативных условиях тРНКм=1-тргнскрипта, 8-11 - гидролиз в нативных условиях мутантнего тРНКй<!1-транскр1шта. Б. Гидролиз РНКазой Т2. 1-4 -тРНКМе1-транскрипт, 5-8 - мутантный тРНК""~транскрипт.

Наиболее существенные различия между мутантной тРНК и "диким типом" наблюдаются р области Б-петли (Ряс. 11, положения 15, 18 и 19). При использовании РНКаз в качестве структурных проб доступность определенных участков РНК для гидролиза свидетельствует о степени компактности их структуры. Из Рис.11 следует, что в мутантной тРНК Р-петля более структурирована

(менее подвержена расщеплению), чем в тРНК "дикого типа". Это показывает, что взаимодействие между D- и ТФС-петлями не нарушено, возможно за счет образования других связей, но конформация тРНК изменилась. Основываясь на структуре тРНКИе1 (Basavappa and Sigler, 1992) возможно предположить образование водородной связи между 04 уридина^ув 20-ом положении и зкзоциклической аминогруппой G57. Вероятно, некоторая гибкость трехмерной структуры тРНКи" является необходимым условием для ее эффективного узчавания метионил-тРНК - синтетазой.

Применив метода "статистически расщепленных

тРНК-транскриптов" для идентификации функционально-важных фосфодиэфирных связей в тРНК"®1 показывает, что вклад различных связей в поддержание акцепторной функции тРНК не одинаков. Однако, при использовании таких же концентраций MetRS, как и в опытах с минисубстратами, молекула тРНК*е' с разрывами любых фосфодиэфирных связей способна аминоацилироваться. Следовательно, отсутствие ковалентной связи между двумя функциональными доменами тРНК не может быть причиной низкой активности отдельно взятого акцепторного домена в реакции аминоацилирования.

Исследования модельных тРНК, содержащих антикодоновую шпильку и акцепторный стебель, но без D- или Т- шпилек, свидетельствуют о важности D-петли и/или D-стебля для процесса узнавания. Исходя из модели взаимодействия TPHKMet и MetRS Е. coli, последовательность событий можно представить следующим образом: после связывания антикодоновой петли тРНК'*"' с MetRS, определенный домен фермента взаимодействует с сахарофосфатньми остатками D-шпильки. Это приводит к требуемой ориентации тРНК на поверхности фермента и попаданию акцепторного конца в активный центр фермента. Возможно, именно это взаимодействие необходимо для активации комплекса и стабилизации переходного

состояни реакции.

Выводы

1. Впервые экспрессированна в дрожжах и выделена фенилаланил-тРНК- синтетаза из митохондрий дрожжей (продукт гена MSF1). Установлены его кинетические параметры и „ элементы узнавания в тРНКгае. Определено положение первичного присоединения аминокислотного остатка к

тРНК . Показано, что: а) каталитическая эффективность мономерной PheRS из митохондрий дрожжей существенно ниже, чем у цитоплазматического аналога, но

сопоставима с ыономерными аминоацил-тРНК-синтетазами дрожжей (МеШЕ);

б) основным элементом узнавания в тРН!!"* служит антикодон;

в)'аминокислота присоединяется к 2'-гидроксильной группе, но для эффективного аминоацилирования тРНКРЛе необходимо присутствие как 2', так и З'-гидроксилов концевой рибози.

2. Разработан новый подход для идентификации функционально-важных фосфодиэфирных связей в молекуле тРКК. Метод основан на использовании статистически расщепленных тРНК-транскриптов как субстрата в реакции аминоацилирования с последующим разделением и структурным анализом аминоацил-тРНК и неацилкрованных тРНК. С использованием предложенного подхода в тРНКТгр быка и тРНККе' . сегеУ151ае определены фосфодиэфирныо связи, существенные для сохранения аминоацилируюией активности тРНК. Показано, что "набор" необходимых связей может служить специфической характеристикой взаимодействия тРНК - аминоацкл-тРНК-синтетаза.

3. При изучении роли различных доменов и третичных взаимодействий дрожжевой тРНКИе1 в реакции аминоацилирования, установлено, что для продуктивного взаимодействия с Ме1Я5 важен не только антикодок, но и ЕМшпилька молекулы тРНК"''".

4. Предложена модель взаимодействия согласно которой антикодон необходим для специфического связывания с ферментом,, а активация комплекса происходит в результате взаимодействия рибозофосфатной цепи О-шпильки с метионил-тРНК-синтетазой.

Основные результаты диссертации изложении в следующих публикациях:

1. Aphasizhev, R., Beresien, S., Pugachev.V. and Kisselev, L. Random-splitled tRNA-transcripts zs an approach for stuo'ing of tRNA-protein interactions (1993) FEES Letters 323, 175-179.

2. Senger, В., Aphasizhev, R., V,'alter, P. and Fasiolo, F. The presence of a D-stem hut not of a T-stem is essential for trigerring aminoacylation upon anticodon binding in yeast methionine tRNA(I995). J. Mol . Bioi.

3. Афасияев- P. Д. Стабильность фосфодиэфирных связей тРНК; не содержащих минорных нуклеозидоь, в комплексах с аминоацил-тРНК -сингетазамм ( 1995). Мол. Еиол.,25, 991 -996.

Подписано к печати ЛС . 1ВД Отпечатано на ротапринте в Формат бумага 30x42/4 . Произволвтаэинон комбинате обьен.З 5"п. л. ■ Литературного Фонга закГ пф. ЮО