Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм дискриминации тРНК аминоацил-тРНК синтетазами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизм дискриминации тРНК аминоацил-тРНК синтетазами"

РОССИЙСКДЯ АКАДЕМИЯ ШУЕ Ленина Институт биохимии им. А.Н.Бала

/

на правах рукописи УДК 557.157.(1" ХВОРОБА Анастасия Нашсоьна

МЕХАНИЗМ ДИСКРИМИНАЦИИ тРНК АМШЮАШЛ-тРНК СКНГЕТАЗАНК 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Р Г 0

I

Москва 1993

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии Института биохимии их. А.Н. Баха РАН

ч

.Научные руководители:

доктор химических наук К.Л.Гладилин кандидат биологических наук А.Д. Вольфсон

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.И.Лаврик кандидат биологических наук Г.К.Ковалева

Ведшая организация - кафедра молекулярной биологии Биологического Факультета Московского Государственного университета ни. И.В. Ломоносова.

Завдта диссертации состоится " в 10 часов на заседании специализированного совета К 002.96.01 по присуждению Ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха.РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, к. 2).

г

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы ран (.117071, Москва, Ленинский проспект, 33, к.1)

Автореферат разослан " *

1993

Учений секретарь специализированного совета доктор биологических наук И.И.Молчанов.

1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одним из основных этапов реализации генетической информации является процесс трансляции. Б свое очередь, одним из необходимых компонентов системы трансляции, обеспечивающих точность воспроизведения генетической информации, являются аминоацил-тРНК-синтетазы - Ферменты, осуществляющие аминоацилирование тРНК и тем самым играющие ключевую роль в реализиции генетического кода. Несмотря на большое количество работ, посвященных специфичности, а также механизму дискриминации тРНК аминоацид-тРНК-сн.чтетазам]!. (5с1ипе11, 1939: 5спи1тап, 1992), проблема эта далека от окончательного реоения.

Ведущим подходом к ревению этой проблема являются методы, основанные на введении направленных мутаций как в молекулы тРНК, так и Фермента, а так же использование искусственных модельных субстратов (тГНК).

В работах (5сЬи1гаап, 1992; ваеге, 19ЭЗ) было показано, что для осуществления специфичного

аминоацилирования тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами

необходимым и достаточным условием является инвариантность наличия и положения лишь небольшого числа нуклеотидов (так называемых элементов узнавания) локализованных, в основном, в антикодоновой петле и акцепторном стебле молекулы тРНК. Однако роль и индивидуальное значение различных элементов узнавания до конца не ясна (5Ь1а1ги, 1932). Для ряда синтетаз (аланиновой, гистндинозой, аспартиловой. валиновой. метиониновоЯ) была продемонстрирована возможность специфического аминоацилирования так называемых

акцепторных млниспиралей, содержащих фактически единственный элемент узнавания - дискриминаторкую пару около ССа конца (Schimmel, 1Э8Э; Frugeir, 1990; Shimizu. 1993). Еопрос же о возможности узнавания Ферментом искусственной молекулы, содержащей антикодон в качестве единственного элемента узнавания до настояаего времени остается открытым. 2. цели я задачи исследования.

Процесс аминоацилирования тРНК является сложной, многостадийной реакцией. Накопленная за последние несколько дет информация о роли различных участков тРНК для специфичного узнавания Ферментом, а гак же наличие хорошо разработанных методов получения аналогов кутантвых тРНК, дает возможность подойти к изучению кинетических аспектов взаимодействия Фермента с большим набором модельных субстратов, и определению роли различных элементов узнавания тРНК ка различных стадиях реакции.

Е связи с -этим, цель настоящей работы состояла в проверке предположения о возможности аминоацилирования исскуствеиного субстрата, имеющего в качестве единственного элемента узнавания антикодон и изучении особенностей механизма дискриминации мутангных или гетеродогичных тРЕЕ дрожжевыми Фенилаланил- и аспартил-тРНК-синтетазакк.

Б связи с вашесказаиным, в настоящей работе были поставлены еледух>вие :-кспс-р>:ментальные зьлачи:

1. Исследовать возможность специфического

аминоацилирования модельного субстрата. состоящего из антикодонз, соединенного гибкой гомополимерной

j

псдинуклеотидной цепью с ССЙ триплетом, расположенным на 3' конце молекулы РНК на примере лизил-тРНК-синтетазы из Дрожжей.

2. Изучить механизм пирофосфорилирования аииноацил-тРЯК-синтетаз при использовании Фенилаланил-тРКК и аспартил-тРНК-сннтетаз из дрожжей.

о. Исследоьать наличие- корреляции между изменениями механизма реакции аминоацилирования, приводящими к пирофосфат-зависимой инактивации ферментов с определенным классом структурных замен * тРНК. 3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Получен и охарактеризован модельный субстрат для лизил-тРНК-синтетазы, состоящий из ацтикодона (UUu), соединенного гибкой (poly(020)) цепью с ССА концом. Показана специфичность аминоацилирования такого

модельного субстрата дрожжевой лизил-тРНК-синтетазой. Впервые установлено, что в процессе образования промежуточного интермедиата реакции аминоацилирования (аминоациладенилата) происходит пирофосфорилирование дрожжевых Фенилаланил- и аспартил-тРНК-синтетаз. Установлено, что пирофосфорилированный фермент является нормальным интермедиатом реакции. Пирофосфорилирёванная Форма Ферментов обладает меньшей активностью по отношению к гетерологичной и мутантной тРНК. Предложен механизм дискриминации гетерологичных и гомологичных tFHK, основанный на различии кинетических механизмов реакции пирофосфорилирования синтетгз. Установлена корреляция между структурными изменениями тРНК и изменениями механизма реакции, приводяцик к пирофосфат-зависимой

инактивации амнноацилирования тРКК.

4. АПРОБАЦНЯ РАБОТЫ

Результаты исследования были представлены на ЕМЕО симпозиуме по РНК (Geideiberg, 1992), на международном совещании по • тРКК (Cap d'Agde, 1993). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

5. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей (включая обсуждение результатов), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на /5*0 СТр. машинописного текста, содержит /7 рисунка и .5* таблицы. Список литературы включает ¡3 Тнаименований.

6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистха плазмид осуществлялась по стандартным методам получения препаратов для транскрипции in vitro (Ruff. 1939). . Препаративное получение искусственного субстрата для лизил-тГНК-синтетазы и транскриптов мутантных тГНК осудествляли с помоиью in vitro транскрипции Т7 РНК-полимеразой. До индивидуального состояния транскрипты очищали с помощью препаративного гельэлектрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии (FFLC). Фенилаланил-тРНК-синтетазу из дрожжей выделяли путем ступенчатого осаждения сульфатом аммония, последовательных хроматографий на DEAE-тойоперл, НА-ультрагеле, mono Q, raono S. Фенилаланил-тРНК-синтетаза E.coli была любезно предоставлена проф. О.И. Лаврик (Новосибирск), дизил-тРНК-синтетаза из дрожжей доктором. П. Кержанок (Gif sur Yvett), асг.артнл-тРНК-синтетаза

проф. Е. Giege (Strasburg). Анализ и получение пирофосфорилированной формы акиноацил-тРКК-скнтетаз осусествлялк при инкубации Ферментов в стандартных условиях для аминоацилирования, но в отсутствии тРКК. Определение тип?. ридиоактивно-меченнсго соединения, связывающегося с Ферментом проводили с помопью тонкослойной хро:«тограФш: на пластинках с целлюлозой (Avicel), после отделения фермента путей гельфильтрацик или равновесного центрифугирования в пробирках типа centricoü.

Реакции амнноацилирования осуществляли в стандартных условиях (Perret, 1990). При работе с аспартпл-тРНК-сннтетазой перед осаждением аминоацилированной тРНК трихлоруксосной кислотой для исключения эффекта увеличения уровня самозспартилирОБания фермента в присутствии неорганической пирофосфатазы и некоторых мутантных тРНК проводили дополнительную фенольную экстракцию каждой пробы. 7. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Аминоацилирование олиго(и)гоССА лизил-тРНК- синтетазой.

Для того, чтобы исследовать возможность специфического амнноацилирования модельного субстрата единственным элементом узнавания которого является антикодон была синтезирована и получена в препаративных количествах молекула РНК, состоящая из антикодона UUU, соединенного гибкой поли(и)го цепь» с ССА концом.

Ранее нами было показано, что лизиз-тРНК-сннтетаза млекопитаюдих обладает очень высоким сродством г. полни, причем во взаимодействии с полии принимает участие центр

связывания тРНЕ . Анализ констант ингкбирования фермента полиО показал, что лизкл-тРКК-синтетаза обладает сродством к роЦ'Ц, сопоставимым со сродством специфической тРНК (Волырсон и соавторы, 1983), Мы интерпретировали высокое сродство дизил-тРНК-оинтетазы к ро1уЦ как результат узнавания ферментом антикодоновой последовательности (НОТ), происходяиего на Фоке более слабых веспецифических взаимодействий с полинуклеотидной цепью. Исходя кз этого, мы предположили, что молекула олкгоО-ССй будет специфично аминоацилироеаться. лизил-тРКК-сннтетазой, поскольку содержит необходимый элемент узнавание - антикодон, соединенный с универсальной акцепторной последовательностью ССА.

мин.

Рнс.1 Екаеткка амкноз.цклированкя одиго(и)гоССА: дрожжевая лизид-тРЗЕ-синтетаза+олигои-ССА (в), кроличья лизил-тРЯК-синтетаза +ояиго{0)гоССп (а), дрожжевая дкзкл-тРНК-синтетаза. + одигоСОаоССА (О), пять различных индивидуальных акиноацил-тРНК-сиктетаз (Е.coli РпеЕЗ и GlnES, Teist. PheES, YblRS, Are ES) + ojmro(U)ioCCA IX).

Нами било продемонстрировано аминоаинлкрование такого . модельного субстрата с Юз порядка -3,1 * Ю-7, сопоставимой с Кт для дрожжевой тРНК1-'"' (таблица 1. рис. 1) Било показано, что аминоацилирование этой РНК является специфичны«, как по отношению к Ферменту (другие аминоацил-тРНК-синтетазы не способны осуществлять эту реакцию), так и по отношению к субстрату: РНК- олигоСг«А не является субстратом для лизил-тРНК-сннтетазы (ск. рис. 1).

Включение меченной аминокислоты нменно в молекулу олигоЦ-ССА было подтверждено с помощью кислого электрофореза аминоацили-рованной РНК в 20% ПАйГ (БсЫшеИ, 1991) (рис. 2). Молекула модельного субстрата была также охарактеризована с помощью определения первичной последовательности по ДНК матрице, и, частично, по РНК (определены

3* конец и длина молекулы). Обращает на себя вникание тот Факт, что в то время как значения Кга практически совпадают, значение ко»ъ для - аминоацилирования олигоО-ССА- в 500 раз ниже, чем для тРНЕ. Эти результаты, отличаются от данных, полученных при аниноааилнровании полиокриламидном аланиновых миниспиралей, которые геле по Мл^1л1з характеризуются значениями кмс, и 5сЫ.пте1. близкими к тРНК, в то время как

Рис.2 Кислый электрофорез аминоацилиро-ванной олиго (1)2о)ССА в 20%

величина, lio ддг. них примерно на порядок выше, чем для тРНК {таблица 1). Таблица 1

• Кинетические характеристики аминоацилирования тРНК

и олигоСОгоССА дрожжевой лкзил-тРНК-синтетазой

ТРКК-У» о.чиго( U ¡zcCCA

Km íti) 1.3 к 10-7 3.1 х 10-7

коь- (мин-1) 13.2 0,03

Возможно, что наличие элементов узнавания необходимо именно на стадии катализа, а остальная часть тРШС за счет неспецифических контактов обеспечивает требуемое високое сродство к Ферменту (Ггаас1;1уп. 1989). В нашем случае молекула олигои-ССА, возможно, содержит лиаь один, хотя и •основной, элемент узнавания - антикодон, в то время как другие модулирующие активность элементы в ней отсутствуют.

Таккм образом, молекула олиго(0)гоССА содержит структурную информацию, необходимую для специфичного аниноацилнрогания лизил-тРНК-синтетазой. По-видимому, эта специфичность определяется последовательность»

нуклеотндов антнкодона - НТО. Аминоацилирование олигоО-ССА авлнется первым примером возможности

аминоацизнроБания одноцепочечной РНК, в качестве модельного субстрата.

2. Механизм дискриминации тРНКРМ £.со1л фгпилаланил-тРНК-синтетазой дрожжей.

Процесс аннноацилирования тРНК описывается схемой, включаюаей: стадии присоединения субстратов, несколько мономолекулярных промежуточных реакции и стадию огиепления продуктов. Полная кинетическая схема процесса акиноацнлнрования сложна для анализа, поэтому при исследовании специфичности взаимодействия аминоааил-тРНК-синтегаз с мутантными тРНК с точечными заменами используют упрощенную кинетическую схему (Киселев, 1934):

тРНК + Е -э— тРНК*Е -5»- аминоацил-тРНК + Е.

Е данной реакции выделяются две основные стадии связывание тРКК с ферментом и перенос аминокислоты на тРНК, которые характеризуется значениями К» и ко« (являющимися сложной комбинацией констант элементарных реакций).

Известно, что активность многих амнноаиил-тРНК-синтетаэ по отношению к гетерологичным тРНК значительно ниже, чем по отношению к гомологичным (Kuli, 19Б9).

Кинетика аминоацилирования дрожжевой и бактериальной тРНК дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазой представлена на рис. 3. Как видно из данных, представленных на этом рисунке, и скорость, и предел аминоацилирования тРНК E.coli дрожжевым Ферментом примерно на два порядка "ниже, чем гомологичной тРНК. При этом оказалось, что внесение в реакционную смесь неорганической пирофосфатазы приводит к значительной, примерно на порядок, активации аминоацилирования тРНК E.coli. Поскольку пкроФосФат является продуктом реакции, можно предположить, что активация связана со сдвигом равновесия реакции в результате расщепления пирофосфата. Однако, учитывая

i.5

л с о X с

^С

X а.

-с

Рис. 3 Кинетика аминоааалнроваккЕ дроххесэй Фенилала-нил-тРЗЕ-скктетазой дрожжевой тРНКрь-

(1), тРЯЕРЛ» E.coli

(2), тРШ:*»»- E.coli в присутствии неорганической пирофос-Фатазы 13) и тРНЕРЛ< Е. coli Фенихаланил-тРНК синтетазой E.coli НЧ.

0 Ю 20 0

мин

?мс.-1 Канеткка «лнноацилирования дрохьевой фениай-пан>:.я~ тРНК-сиитетазой TpHKPtvi Е.соЛ: а - стрелкой указано зиессние коьсй псрш.м фермента. Концентрация Фермента 40 нН; б - после 15 мкк реакции б реахционну.о смесь добавлен нссчг^ьическаг. пирофссфатаза. Концентрация Фенидадаиил-тРКК-сннтетй!^ с- мм.

il

малую глубину протыкания реакции, и, соответственно, низкую, порядка Ю-8 М, концентрацию пирофосфата, это. предположение представляется маловероятным.

Другой возможностью является образование неактивного прочного комплекса Фермента с пирофосфатом в ходе реакции. Это предположение подтверждается экспериментами",

г

результаты которых приведены на рис. 4 а. Как видно из этих данны;:, добавление новой порции Фермента после выхода реакции аминоацилированкя на плато првводит к появлению идентичной кинетической кривой. Такая кинетика полностью исключает возможность равновесного ингибирования пирофосфатом как продуктом реакции и характерна для случаев самоинактнвации Фермента в ходе реакции (Варфоломеев, 1382). Добавление в систему неорганической пирофосфатазы после выхода реакции на плато приводит к активации Фермента (рис. 46.), что подтверждает предположение об его инактивации б результате образования прочного комплекса с пирофосфатом.

Для того, чтобы определить, образуется ли кокплекс с пирофосфатом только в присутствии гетерологичной тРНК или является нормальным интермедиатом реакции, фермент предварительно инкубировали в присутствии ЙТФ и Фенилаланина, и затек вносили в реакционную смесь тРНК. Было обнаружено (рис. 5), что прединкубация дрожжевой Фенилаланил-тРНК-емнтетазы с АТФ и аминокислотой не влияет на активность аминоацклирования гомологичноа тРНК, но полностью инактивирует Фермент при использовании в качестве субстрата гетерологичной тРНК E.ccli. В то же время, если прединкубация проводилась в присутствие

мин

Рис.5 Еннетика акинС'ацилироЕанш! дрожжевой Фенклаланил-тРНК-скнтетазой дроххеЕой тРНКР1>® (1). TPEKPh* E.coii <2), и тРНКгг*- E.coii в при сутстбии неорганической пирофосфатаэи (3) после- 15 мин инкубации Б реакционной смеси без тРНК.

О Qfi 1.0

Количество фермента, пмоль

Рис.6 Зависимость предельного уровня аминоацилнроьания трНКРЬ-> E.coii ст количества Феннладанил-т?НК-синтетазы в реакционной смеси

пирофосфатази, инактивации Фермента отмечено не было. 5 случае, если фермент прединкубировали только с аминокислотой или йТФ, инактивации Фенилаланил-тРНК-синтетази также не наблюдалось

Таблица 2. -

Кинетические константы дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазы в реакции аминоацилирования тРпЕр11* дрожжей и Е. coli.

трак**" дрожжей тГгГкрг'^> S.coli ,?НКРГ.С 5". coli. + пирофосфатаза

Кт.мкМ 0.17 3.2 1.8

Vmax

пмоль/мин 3.36 0.35x10-2 0.43

Vraax/Km

отн.ед. 1.0 1.1x10-* 1.0x10-2

Кинетические константы аминоацилирования различных тРНК фенилаланид-тРНК-синтетазой приведены в табл. 2, Как видно из этих данных, пирофосфатаза увеливает величину каь-с. и практически не влияет на величину Km.

Было также обнаружено,что уровень предельного аминоацилирования тРКК В.coli прямо пропорционален количеству внесенного в реакция Фермента (рис. 6). йз анализа стехиометрии реакции аминоацилкрования в гетерологичной системе следует, что Фермент инактивируется после первого же каталитического акта. Эти результаты позволили предположить, что инактивация фенилаланил-тРНК-синтетазы происходит в результате

образований прочие с:го кок::.";::» • Фермента с пирофосфаток, что силе г.едтгорздеао ан-.-.иго:-: ь:;лкчен;;г. метки С Х = : &ТФ в полкпептвды с пококыз ЗВЗ-электрофореза с последующей радиоавтографией '.рис. 7).

Ранее, дл.-. трпптофанил-тРШ.-синтетазы клекопитаюди); бы-, о показано образование пирофосфсридкрованной фср(-ш Фермента б ходе реакции аккнсаиилированкя тРНК (Ковалева, 1937). Для этого белка был"; установлено существование двух пирофссфорклированних форн фермента. Е- случае одной, из форм наблвдалось Еитесненне " ковалентко связанного пирофосфата под действием тРШС (Ковалеву., 1559).

Для доказательства, что именно пирсфосфат ответственен за включение радиоактивно меченного фосфора в Фенилаланил-тРНК-синтетазу, Фермент, после инкубации в реакционной снеси, содержасей [ ДТФ подвергли

гельфильтрацик на сефадексе . С-25. Фракции, соответствующие выходу высокомолекулярного

радиоактивномеченного соединения объединяли и после осахденик и щелочного гкдролйза подвергали анализу с помощью тонкослойной хроматографии с последующей радиоавтографией. Меченное: производное было

идентифицировано как пг.рофосфат (рис. 5). При добавлении к очищенному радиоактивно-меченному препарату Фенилаланил-тРЕК-снктетазы акиноацклированной т?НКРГ'- в присутствии ЙК* наблюдалось включение метки в АТФ- в обратной реакции, что -свидетельствует о локализации пирофосфата в активном центре Фермента.

Активирующее влияние пирофосфатазы на

аминоаиилирование тРКК б гетерологичнш: системах хорошо -

Рис.7. Включение [32Р]-фосФата из сУ-32РЗ-АТФ

Фенилаланил-тРНК-скнтетазу (система фореза по Лэмли)

12 3 4

рис. 3 Радчоавтогракма тонкослойной хроматограммы селочного гихролизата. пирофосфорилироваь'кой формы дроте вой Фекилаланил-тРН'К-сйнтетазу. : [,<- ] АТР - 1, С31?] ггх - 2. РЬе НЗ-С32Р]РР1 - 3. РЬе Н5-С32РЗР?1 * тРпКрпл * АМФ - 4.

известно (Kall, 1969), Однако, ранее эти данные объяснял* как следствие активации Фермента в результате сдвига положения равновесия за счет гидролиза пирофосфата -возможного конкурента тРНК в реакции с аминоациладенилатом (Dignam, 1979).

Наши результаты показывают, что механизм активации реакции аминоацилироЕання значительно сложнее. Разница в скорости аминоацилировання тРНКрлв дрожжей и Е.coli определяется, в первую очередь, резким падением ke*.t, что соответствует как данным полученным для фенилаланил-тРНК-.синтетазы, так и вообае результатам замен нуклеотидов в сайтах узнавания тРНК (Schulrnem, 1973). Эффект действия пирофосфатазы проявляется почти исключительно в увеличении ls.ee.-t., что свидетельствует о том, что диссоциация пирофосфата является лимитирующей стадией в реакции аминоацилировании гетерологичной тРНК. В то же время, эта стадия не является лимитирующей в гомологичной системе. Вероятно, гомологичная тРНК легко вытесняет пкрофосфат из комплекса с ферментом, в то время как гетерологичнак тРНК £.coli не может вытеснить пирофосфат или делает это очень медленно, что и приводит к инактивации Фермента.

В случае Фенилаланил-тРНК-синтетазы , единственная разница в двадцатом положении G-Ü тРНК дрожжей и E.coli приводит к практически полной .неактивности дрожжевого Фермента по отношению к тРНК E.coli (ülenbeck, 1990). Видимо, т?ЯК с заменой Uzo-Gzo не может индуцировать определенное изменение конформации . фермента,

способствующее отщеплению пирофосфата. Пирофосфатаза,

возможно, гидролизует связанный с Феркектоя пироФосФат, что позволяет реактивировать фермент s реакции аминоацилирования.

Полученные результаты позволили предположить следующую упрощенную кинетическую схему реакции:

тРНК дрожжд )Е + saTpHK Е + АТР + аминокислота —> Е - РР, • ва-АМР АРНК Е, coli-

\тРНК Е. ссЧ-^Е + аа-тРНК

+ пирофосфатала

Конкретный механизм ингибирования аминоацилирования""" тРНК пирофосфатом, связанным с Ферментом (ингкбирует ли он связывание тРКК с Ферментом или блокирует перенос аминокислоты) не ясен и требует дальнейших исследований.

3. Структурные элементы тРНК и пирофосфорилирование а спартил-тРЯК-синтетазы.

При исследовании дискриминации гетерологичной тРНК S.coli дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазой было

показано, что, в случае аминоацилирования тРНК E.co,li пирофосфорилированная форма Фермента не способна осуществлять дальнейшие каталитические акты (см. предыдущий раздел). Как было указано выше, единственное Функционально значимое отличие в структуре гетеро- и гомологичной тРНКРЛв E.coli и дрожжей составляет замена G-U в 20 положении тРНК (Uhlenbecl;. 1939). Локализация этой замены в области так называемой D-петли позволила предположить значимость этого структурного элемента тРКК для правильной дискриминации тРНК и, тем самки, игравшим существенную роль в реактивации фермента перед каждым

каталитическим актом за счет вытеснения пирофосфата из комплекса с амнноацил-тРНК-синтетазой.

Для локализации места расположения мутаций, важных для реактивации пирофосфорилированного Фермента, и проверки предположения о роли конФормации тРНК в области D-петлк для этого процесса, мы использовали коллекцию кутантных тРНК с заменами оснований в элементах узнавания, а также с заменами оснований б области D-петли, существенных для поддержания правильной третичной структуры молекулы тРНК. Коллекция мутантных .тРНК-4»» дрожжей была любезно предоставлена проф. Р. дихк (Strasburg).

Необходимо отметить, что для аспартил-тРНК-синтетазы дрожжей нами также было обнаружено явление пироФосФорилироЕаник фермента в ходе реакции аминоацилнрования тРНК. Как и в случае Фенияаланил-тРНК-синтетазы, меченное соединение, связанное с ферментом, было с помощью' тонкослойной хроматографии идентифицировано как пирофосфат (рис. 9, 10). Локализация пирофосфата в активном центре фермента была подтверждена экспериментами по образованию ЙТФ из йМФ при реакции аминоацилированной тРНК с пирофосфорилированной Формой Фермента (рис 10).

В таблице 3 представлены данные по влиянию неорганической пирофосфатазы на предельные уровни аминоацилированпя тРНК.

На рис. 11 приведен один из призеров активации аминоацилнрования мутанта с делегированной D петлей в присутствии неорганической пироФ.осФатазн. К мутациям.

(«О- —

Рис. 9. Включение [32РЛ-ФосФата из [ -32Р]-АТФ в аспартил-тРНК-синтетазу Сфосфат-ПААГ-электрофорез в нативных условиях 5Х ПААЕ рН 5.0)

12 3 4

рис. 10 Радиоавтограмма тонкослойной хроматографии щелочного гидролизата пирофосфорилированной Формы дрожжевой аспартил-тРНК-синтетазы :[¡S-32P] RTP - 1, [32Р] PPi - 2, Asp P.S-C32P]PPi - з. Asp RS-[32P]F?i + tPHKa»i> + АМФ - 4.

Таблица 5

Влияние . неорганической пирофосфатазы на предел аминоацилирования мутантных тРНК дрожжевой аспартил-тРНК-синтетазой.

название мутация предел аминоацилирования

мутанта замены с пирофосфа- без пирофосфа-

тазой тазы

рТЛ-ЫП- 01А72 - Й1С72 10(1% 100%

рТгИаЭ 573-1373 4 ОХ 40%

рТО1а14 С36-И36 16% 20%

рТРНа2 534-А34 20% •20%

рТ]?Ма20 035-С35 50% 50%

рТИ5а204 А10-025 5% 15Х рТИШб А14,А15,в20,А21,-

С14,С15,620,С21 55 20Х

ША4"» Е.соП 40% 40%

Азр/РИе» 60% 63%

5 делегирована й-петля 4% 15%

Н °049(делетированЛ- 30% 30%

* ЬВДАР1">, содержащая элементы узнавания ЪЕНАа»р

жирным шрифтом выделены мутанты, для которых был обнаружен эффект активации аминоацилирования в присутствии неорганической пирофосфатазы.

нин.

Рас. 11. Кинетика аииноацилирсвания мутантной тРНК с делегированной Ю-петлей в присутствии (а) и отсутствии (•) неорганической пироФосФотазы.

■Л

С--'

4

А С С в

в -с с-в с-в в-с и-в

4 и'(Г£г! ЙА

!■• Г;Г: * )■

4 -•^••-е

всссс 1111!

сввзс

аА

и и А-

А

и и

в-и с-с

I

и

Рис. 12. Мутации тРНКА=1>, ответственные за изменение каталитического механизма реакции для аспартил-тРНК-синтетазы. Стрелками, точками и штрихами отмечены отдельные группы мутаций, приводящие к понижению активности синтетазы по отнопению к данному транскрипту.

приводящим к аналогичному эффекту откосятся замени в положении А10 в I) стебле, мутация, приводящая к усилению взаимодействия 0 и Т петли, мутант S с делегированной D петлей и Asp миниспираль (рис. 12).

Для всех этих мутантних тРНК характерно изменение угла L-форми тРНК по сравнению с диким типок тРКНАаР, что

с л/гто acirii

Рис. 13. Вторичная и третичная структура тРНК. может слугить стерическим препятствием для проникновения акцепторного стебля в активный центр Фермента (РиеНвз., 1933), (Рис. 13). По-видииоку, в случае данной группы мутантов наличие пирофосфата, связанного в активном центре е. спартил-тРНК- сиктетази, приводит к нарушению правильной ориентации ССй конца или, возможно, препятствует индукции определенных конфориационных изменений Фермента, необходимых для осуществления аминоацилкрования.

Можно предположить, что пирофосфорилирование как механизм дискриминации или же редактирования не является

уникальным для аминоацил-тРНК-синтетаз, а зозкожен и для других NTF-зависимых Ферментов, гидролизупцих !*Т? до КК? и FPi.

выводы

1. Показано, что синтезированный модельный FHK-миннсубстрат (слиго(и)зоССА), состояний из антикодона тРНК1-5"1 (UDO), соединенного гибкой полинуклеотидной цепью с ССА, способен специфически аминоацилироваться лизил-тРКК-синтетазой.

"2. На примере дрожжевых фенилаланил- и аспартил-TFHK-синтетаз показано существование козалентногс пирофосфорилированного производного, образующегося как нормальный интермедиа! в реакции активации аминокислоты (образования аминоациладенилата).

3. Показана обратимая пнрофосфат-зависимая инактивация ряда аминоацил-тРНК-синтетаз (фенилаланил-, тирозил- и аспартил-тРНК-синтетазы) при аниноацилировании гетерологичных и мутантных тРНК.

4. Установлена корреляция между определенную; классом структурных мутаций в тРШСА"р и пирофосфат-зависимыми ингибированием амнноацилнрования мутантных т?Ж.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Хворсва А.К., Историк ¡O.A., Болььсон А. Д. Пнрофосфат-зависимая инактивация тирезил-тРНК-синтетазк при аминоааилнрованим гетерологичной тРНК. Биохимия, т. 57, с. 1333-1916, 1992.

2. Хворова ü.M., Которин К.ft., ВольФсон ft.Д. , Гдадклкн К.Д.' Специфическое аминоацилнрование молекул олигои-ССА лизил-тРНК-синтетазой. Докл. РАН, т.325, с. 179-131, 1992. ■

3. Хворовг ft.К., Ыоторин Ю.А., Больфсон ft.Д. Механизм дискриминации TPHKPhe E.coli дрожжевой фенилаланил-тРКК-синтетазой. Биохимия, т.58, N4, с Б13-619, 1993.

4.. Khvorova A.M., Motorin Yu.A. , Violfson A.D. Crucial role of pyrophosphate in aminoacylation of tRNAFhe E.coli by yeast phenylalanyl-tRNA synthetase FEB3 betters,v. 311, p. 135-142, 1992.

5. Khvorova A.H., Motorin Yu.A., Wolfson A.D., Gladilin K.L. Anticodon-dependent aminoacylation of RNA minisubstrate by lysyl-tRNA synthetase. FEB3 Letters, v. 314, p. 256-258, 1992.

5. Wolfson A.D., Khvorova A.M., Motorin Yu.A., The simplest EH A substrate for aminoacyl-tRNA synthetases. , ЕМБО-RNA Symposium (Heidelberg) 1992, Abstr, 255.

7. Khvorova А.Ы., Motorin Yu.A., Wolfson A.D., Gladilin K.L., Anticodon-dependent aminoacylation of the RNA minisubstrate by lysyl-tRNA synthetase. 15th inthernational tRNA workshop (Cap d'Agde), 1993, Abstr, E6.

8. . Khvorova A.M., Motorin Yu.A., Wolfson A.D., Crucual role of the pyrophoshate in the discrimination of tRNAs by aminc3cyl-tRNA synthetases. 15th inthernational tRNA workshop (Cap d'Asde), 1993, Abstr, E7.