Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Строение и свойства высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз млекопитающих

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Строение и свойства высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз млекопитающих"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

Ордена Ленина Институт биохимии им. А.Н.Баха

на правах рукописи

Вольфсон Алексей Дмитриевич

УДК 577.157.07

СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КОМПЛЕКСА АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

(03.00.04 - биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.

Научный руководитель:

доктор химических наук КЛ.Гладнлшь

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Р.С.Шакулов, кандидат биологических наук А.С.Степанов.

Ведущая организация - Новосибирский Институт биоорганической химии СО АН СССР.

Защита диссертации состоится « 15» иад>Т9 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета К 002(96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР С117071, Москва, Ленинский проспект, 33, к.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР(117071, Москва, Ленинский проспект, 33, к.1).

Автореферат разослан < Л

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М.И.Молчанов.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы:

Процесс тргнсдягии начнется одним нз основополагающих молекулярных процессов протекающих в живой клетке. и, безусловно, сформировался га очень ранних этапах биологической эволюции. Это я обусловливает относительно высокую консервативность организации снс.емн трансляции и строения ее компонентов. Тем не менее, срэзнеяие процесса трансляции в отдаленных таксономических группа;:, таких каг эубоктгрса ;; архебактерии, высшие и низшие эукариоты, позволь ;т выявить р!>д сяс шфчческих отллчкй, исследование которых может помочь понять пути эволюции и, возможна, происхождения самого процесса транслящш.

Одним из необходимых компонентов системы трансляции явльются амияоацил-тРНК синтетазы - фер .¡.пты, осуществляющ«; специфическое аминоацилировзнке гРНК.и, тем самым, играющие ключевую роль з реализации генетического кода. Поэтому, аминоацил-тРНК-синтетазы были и остаются объектом клк классических исследований посвященных механизмам РНК-бклх >вого узн£зания (вЫпиле!, 1989), так и работ, посвященных новым, необычны; I фунишим этих ферментов. Например, аминоацил-тРНК синтетазы синтезируют необычный нуклеотид - диаденозинтетрафосфат и родственные ему соединениг, т.н. алармоны, которые образуются всеми клеткамч в ответ на стрессовые условия (ТатесЬшс, 1985). Недавно пс?.азано участие аминоацил- тРНК-синтетаз в сплайсинге РНК в митохондриях грибов (Ма^пкЗег, 1989).

Наиболее подробно исследованы аминоацил-тРНК-синтетазн эубзк-терий и дрожжей ( 5Ытте1. 1989 ). В настоящее время известна первичная последовательность 18 из 20 аминоацил-тРНК-синтетаз Е.соИ и 12 дрожжевых ферментов. Гораздо меньше известно об аминоацил-тРНК-снчтетазах млекопитающих и практически ничего - про аминоацил-тРНК-синтгтазы архебак-терий.

Накопленная к настоящему времени информация позволяет сформулировать ряд существенных функциональных и структурны;: особенностей аминоацил-тРНК-синтетаз млекопитающих от ферментов прокариот и низшах эукариот - дрожжей: первое - это тенденция к увеличению молекулярной мг ссы полипетидов в ряду эубактерии - дрожжи - млекопитающие; второе - это способность синтетаз эукариот, в стличие от эубактериальных, к неспецифическому взаимодействию с полианионами; и третье - это существование многих аминоацил-тРНК-синтетаз млекопитающих в виде стабильных высокомолекулярных комплексов. В настоящее время известны два таких комплекса - т.н мультиферментный, включающий в себя 9 аминоацил-тРНК-синтетаз, и комплекс валил-тРНК-синтетазы с тяжелой формой фактора элонгации 1.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования было получение данных, которые могли бы пролить свет на биологическую функцию и расширить представления о строении мультиферментного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз. В этой связи нами были сформулированы три экспериментальные задачи, касающиеся различных аспектов строения и функционирования этого комплекса:

1. Выяснить механизм взаимодействия входящих в состав комплеска аминоацил-тРНК-синтетаз с полианионами и влияние этого взаимодействия на функционирование ферментов;

2. Выяснить механизм фосфорилировании компонентов комплекса;

. 3. Исследовать сборку комлекса in vivo.

Научная новизна:

Исследован механизм взаимодействия входящих в состав комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз с РНК и полианионами, установлена специфность взаимодействия. Показано, что взаимодействие с антикодоном играет важную роль в узнавании тРНК лизил-тРНК-синтетазой. Показано фосфорилирование компонентов мультиферментного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз ассоциированной с ним, но не являющейся его компонентом казеинкиназой 1. Впервые исследована сборка комплекса аминоацил- тРНК-синтетаз in vivo, определен порядок сборки комплекса и показана ассоциация с иктермедиатами сборки комплекса двух полипептндов, возможно, играющих роль при сборке комплекса.

Апробация работы:

Результаты исследования были доложены на семинаре семинаре Института белка, представлены на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989). По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы:

Дшхертацил состоит из введения, обзора литратуры, методической и экспериментальной частей к выводов. Работа изложена на стр., содержит рис. и таблицы. Список литературы включает публикаций.

Материалы и методы.

Использованные в экспериментах по иммунопреципитации клетки линии СНО растили на среде МЕМ с 10% сыворотки до плотности 70% на чашках петри диаметром 3.5 см. Антитела к компонентам комплекса были любезно

предоставлена проф. Ж.-П.Валером и аффинно очищены на колонке с иммобилизованным комплексом.

Результаты и обсуждение.

1. Выделение и свойства комплекса

Для выделения комплекса нами был использован метод, состоящий из трех стадий: фракционного осаждения полиэтиленгликолем, хроматограф™ на гепарин- и тРНК-сефарозе. При хроматографии на тРИК-сефарозе комплекс обычно глюируется в виде двух пиков, один из которых содержит практически гомогенный комплекс. Необходимая степень очистки составляет 1000-2000 раз. Стандартный лрепарат хомплекса состоят из 11 полтеептидов с молеху-лярннмии массами 150, 135, 120, 108, 96, 76, 74, 57, 43, 38 и 18 кДа.Полипептидный состав комплекса несколько варьирует от выделения к выделению: количество полипептидов с молекулярной массой 43, 38 и 18 кДа часто было значительно меньше, чем в стандартном препарате комплекса. . Причины гетерогенности препаратов комплекса неясны - возможно, она связана с неконтролируемиым протеолизом в ходе выделения или частичной диссоциацией комплекса в ходе выделения. В некоторых случаях стандартная процедура дополнялась двумя последовательными хроматографиями на колонках MonoQ и MonoS.

При изоэлектрофокусировании стандартный препарат комплекса фокусируется в виде одной мажорной полосы и имеет нзоэлектричесхую точку 5.9.

Молекулярная масса комплекса по данным гельфдльтрации из колонке Superóse 6 HR 10/30 составляет 1100 кДа.

2. Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз с РНК и полиашгонами.

Способность неспецифически связываться с РНК и полианионами (Ciracoglu, 1985) является одним из характерных свойств аминоацил-тРНК-синтетаз эукариот. Считается, что это взаимодействие осуществляется за спет взаимодействия с полианионами особого связывающего домена. Способность к такому связыванию была продемонстрирована для нескольких аминоацшт-/РНК-синтетаз диссоциированных из комплекса.

Однако, имеющиеся экспериментальные данные не отвёчают на ряд вопросов, например, могут ли аминоацил-тРНК-синтетазы, находясь в состазе комплекса, взаимодействовать с полианионами, какова специфичность этого взаимодействия, как влияет оно на работу ферментов и, наконец, только ли связывающий домен принимает участие во взаимодействии с полианионами.

Первый вопрос, на который необходимо было ответить - как влляет взаимодействие с РНК на активность аминоацил-тРНК- синтетаз. Рибосомаль-ная 16 S РНК ннгибировала активность лизил-тРНК-синтетазы. Ингибирование было неполным и наблюдалось лишь при ненасыщающих концентрациях тРНК (рис.1) Чтобы выяснить, любая ли РНК может ингибировать активность этого фермента или существует определенная специфичность взаимодействия, в качестве ингибиторов активности лизпл-тРНК-синтетазы

Таблица 1.

1 2 3 1

. 1.00 ПолиАи 1:9

Полни 0.125 0.05

5.0 0.04 ПолиАи 6:4

ПолиА 0.125 1.05

5.0 1.15 Полиакри-

ПолиС 0.125 1.10 лозаяк-та

5.0 1.05 . Гечарин

Поли1 0.13 1.05

1.3 0.70 ПолиА+

.иМР 4.0 1.10 ПолиЦ г

2

0.125

5.0

5.0 0.8 3.3 0.5 3.0

0.125

0.25 0.05 1.00 0.20 1.05 1.00 0.65 0.40

по 0.15 0.85

1. Эффектор .2. Концентрация, мМ мономерных звеньев. 3. Активность, относительные ед.

был исследован ряд синтетических гомо- и гетерополирибонух-неотидоа. Как видно из таблицы 1, из гомополинуклеотидов только полии и поли1 обладают значительным ингиоирующим эффектом. Для проявления этого эффекта требуется, чтобы молекула полинуклеотида была в одноцепочечиом состоянии -добавление к полии эквивалентного количества полиА практически полностью подавляет ингибирование. Влияние на активность сополимеров полиАи подтверждает это наблюдение - сополимер с примерно равным соотношением нуклеотидов не обладает ипгибируюшим эффектом, тогда как сополимер с низким содержанием А является довольно сильным ингибитором. Способность к ингибирсвашно коррелирует с определенной структурой полинуклеотида в водном расворе - известно, что полии и поли1 в условиях, близких к использованным, не обладают выряженной вторичной структурой и представляют собой статистический клубок, в то время как полиА и полиС образуют жесткие фрагменты однэцепочечкых спиралей, стабилизированных за счет стэхинга оснований. Есде предположение, что способность к ингибированию коррелирует с подвижностью цени полинуклеотида, верно, то, вероятно, не только полинуклеотиды, но и сходные с ними по полиэлектролитным свойствам -плотности зарзда н шагу цепи - полианионы также будут вызывать сходный эффект. Таким полиавионом, является, напрмер,. гепарин. Как следует из данных той же таблицы, гепарин ингибирует лизил-тРНК-синтетазу, в тоже же время, полианион, сильно отличающийся от полинуклеотидов - полиакриловая кислот.. не проявляет никакого ингибирующего эффекта.

Таким образом ингибирование является достаточно специфичным в отношении структуры эффектора - к нему способны полинуклеотиды, обладающие подвижной основной цепью и сходные с ними по структуре полианионы.

А

Активность, агн ед

Рис.1 Влияние рРНК на активность лизил-тРНК-синтетазы в реакции амлноацилирования тРНК:

А- зависимость активности от концентрации рРНК; Б- зависимость начальной скорости от концентрации тРНК (1 ), в присутствие рРНК. (2).

Качествено сходная закономерность была обнаружена при исследовании влияния тех же эффекторсв на активность арпшил- валил-тРНК-синтетаз, т.е. она имеет достаточно общий характер.

Для того чтобы определить, участвует ли во взаимодействии с полианионами центр связывания тРНК, нами был подробно был исследован механизм ингибирования дцзил-тРНК-сшггетазы полии и гепарином. На рис. 2 представлен кинетический анализ механизма ингибирования лнзил-тРНК-синтетазы поли11. Как видно, из этих данных, ингибирование является преимущественно конкурентным по отношению к тРНК. Ингибирование приводит к появлению 8-образной кривой зависимости активности фермента от концентрации тРНК. Интересно, что, аналогичное влияние оказывает на кинетическую кривую гепарин (рис.2) и рРНК (рис.1), что указывает на сходство механизма их воздействия. В то же время ингибирование неконкурентно по отношению к малым субстратам. Как поли и, так и гепарин не оказывают влияние на активность лизил-тРНК-синтетазы в реакции АТФ-пирофосфатного обме-на.Конкурентный по отношению к тРНК механизм ингибирования указывает на участие центра связывания тРНК во взаимодействии с полиашюнами.

Наиболее четко указывает на участие центра связывания тРНК во взаимодействии с полианионами сравнение специфичности ингибирование лизил-тРНК-синтетазы полии и гепарином.Сравнение констант ингибирования фермента полии и гепарином (табл. 2) показывает, что лизил-тРНК-синтетаза обладает очень высоким сродством к полии, вполне сопоставимым со сродством к специфической тРНК. Наглядно это демонстрируется на рис 3, где приведено сравнение специфичности ингибирования лизил- н аргшшл-тРНК-синтетаз. С чем может быть связана столь высокая специфичность ингибирования лизил-тРНК-синтетазы полиШ Поскольку антикодоном лизиновых тРНК является 1Ш1Ч, то вполне логично представить, что именно узнавание антикодона определяет высокое сродство фермента к полни. Механизм узнавания тРНК лизил-тРНК-синтетазами мало исследован, однако, на

Таблица 2.

Кинетические константы лизил-тРНК-синтетазы и константы ингибирования фермента поли II н гепарином.

Константа М.

Эффектор М.

Субстрат А.ТФ Лизин тРНК

Км

К1

2.3 к 10"3

ноли и 4.2 X 10~8 1.8x10"8 ггпарлл 1.5 х —

-5

1.5 хЮ"5 2.5 хЮ"7 3.5 х 10~8 7.5 х 10"9 6.0 х 10"6

и'- /я:71!мл!мин

[тРНКЗ^-Ш^М*'

Рис.2 Зависимость скорости амияоацилирования тРНК лизил-тРНК-синтетазой от концентрации тРНК. А: I- без эффектороз; 2- 40 нМ полии; Б-то же, в двойных обратных координатах. На врезке - область высоких концентраций тРНК ; В: I - без эффекторов; 2 - в присутствии 15 мкМ гепарина.

основании ряда работ был сделан вывод об участии антикодона в узнавании (обзор: Киселев, 1984). Чтобы выяснить, каков вклад специфических и неспецифических взаимодействий в узнавании полии лизил-тРНК-синтетазой, мы исследовали влияние на активность фермента молекул олигои различной длины (рис.4). Как видно из этих данных олигои длиной до 8 остатков не оказывают влияния на активность фермента, в то время как молекулы длиной около 30 остатков обладают практически тем же эффектом, что и полии. Эти данные можно интерпретировать таким образом, что специфическое узнавание антикодона проявляется лишь на фоне достаточного числа неспецифических электростатических взаимодействий с зарядами в центре связывания тРНК. Эти данные позволяют сделать предположение об участии центра связывания тРНК во взаимодействии по крайней мере с полии. Независимым подтверждением этого служат эксперименты по защите лизил-тРНК-синтетазы от модификации пиридоксальфосфатом, где было показано, что полии полностью защищает фермент от модификации, в то время как тРНК - лишь частично. Это говорит о том, что полии защищает как центр связывания тРНК, так и какие-то группы вне его, вероятно, полианионсвязывающий домен. Сходство механизма ннгибирования аминоацилирования тРНК полии и гепарином позволяет предположить, что и гепарин так же взаимодействует с зарядами центра связывания . тРНК, а два порядка разницы в константах ингибирования дают оценку вклада узнавания антикодона в специфичность взаимодействия.

В целом, взаимодействие полианионов с лизил-тРНК-синтетазой представляется следующим образом - полианион с гибкой подвижной цепью способен имитировать тРНК и взаимодействовать с теми же положительными зарядами в центре связывания, что и РНК. Это взаимодействие достаточно слабое, более сильным оно делается за счет дополнительного связывания с полианионсвязывающим доменом синтетазы. Это объясняет, почему про-кариотические аминоацил-РНК-сиитетазы, не имеющие полианионсвязываю-щего домена, не связываются в тех же условиях с полианионами. Такая модель полностью объясняет полученные в данной работе результаты и полностью согласуется с данными исследования механизма взаимодействия рРНК с тре-онил-тРНК-синтетазой из ретикулоцитов кролика (Иейогоу, 1987).

Суммируя данные, представленные в данной части работы можно сказать, что аминоацил-тРНК-синтетазы, входящие в состав комплекса, могут непосредственно взаимодействовать с полианионами. Это означает,' что полианионсвязывающие домены синтетаз, как и каталитические домены, экспонированы на поверхности комплекса. Взаимодействие имеет специфический характер: к нему способны одноцепочечные молекулы полшуклеотидов, не имеющие в водных растворах вторичной структуры и сходные с ними по полиэлектролитным свойствам полианионы. По крайней мере в случае лизил-тРНК-синтетазы в этом взаимодействии принимает участие центр связывания тРНК. Показано также, что узнавание антикодона играет важную роль в узнавании тГЧК лизил-тРНК-синтетазой.

ИТЕПССТЬ Z

Рис 3. Зависимость активности лизил- и 6 г кон-

центрации полиЧ и гепарина.

1KTIBB9 СТЬ X

IHK (III uiril

Рис.4 Зависимость степени ингибирования лизил-тРНК-синтетазы от ушны олигои.Концентрация олигои ЮяМ по основаниям.

З.Фосфорилирование амнноацил-тРНК-синтстаз, входящих в состав комплекса.

Одним из возможных объяснений необходимости ассоциации амипоацпл-тРНК-синтетаз в единый комплекс является совместная регуляция их активности. Это предположение выглядит особенно привлекательно в свете данных, что один из компонентов комплекса - полипептид с молекулярной массой 38 кДа, был идентифицирован как казеинкиназа 1 (Репйе^аз!, 1987). Однако, оказалось,.что эта киназа неактивна по отношению как к казеину, так и к аминоацил-тРНК-синтетазам комплекса, в то время как экзогенная киназа 1 (¡»сформировала компоненты комплекса. Это обстоятельство, а так же то, что фосфорилирования комплекса не наблюдали другие авторы (М1гапйе,1987), делало необходимым более серьезно разобраться в проблеме фосфорилирования комплекса.

Препараты комплекса, выделеные по стандартной методике, обладают некоторой протеинкиназной активностью, величина которой варьирует от препарата к препарату. При фракционировании комплекса на колонке МопоБ нам удалось обнаружить, что основная часть протеинкиназной активности ассоциирована с минорой субфракцией комплекса. Основная фракция была названа фракцией 1, а минорная, фрахцией 2. Оказалось, что практически 90% активности протеинкиназы ассоциировано именно с фракцией 2. Интересно, что удельная активность по крайней мере двух аминоацял-тРНК-синтетаз -лизил- и аргинил-тРНК-синтетаз также значительно больше во фракции 2. Полипептидный состав обеих фракций весьма сходен: во фракции 2 имеется дополнительный полипептид с молекулярной массой 65 кДа, который, возможно, является продуктом протеолиза лизил-тРНК-синтетазы, и больше полипептидов с молекулярными массами 43,36 и 20 кДа. Эти различия могут быть связаны с протеолизом в ходе выделения, но, возможно, отражают и естественную гетерогенность комплекса. Сравнение активностей протеинкиназы, ассоциированной с обеими фракциями комплекса приведено в табл. 3. Как видно из этих данных, киназа активна как в реакции самофосфорилирования, так и в отношении казеина. Удельная активность киназы во фракции 2 примерно на порядок выше, чем во фракции 1. В качестве субстратов киназа исполь-

Таблина 3.

Субстратная специфичность ассоциированной с комплексом протеинкиназы. компоненты смеси состав инкубационной смеси

1}-32Р]АТФ, 0.1 мМ +++-■+'++-.

[у-32Р]ГТФ,0.1 мМ .--+..- +

Казеин, 66 мкг -+ - + - + - +

Гистоны, 50 мкг -. + . . - +

Белки комплекса 1, 12 мкг ++ + +

Белки комплекса 2, 10 мкг - - - - + + + +

Включение 32Р в системе, пмоль 0.4 4.9 0.0 0.0 5.1 42.7 0.0 0.0

И

зует АТФ и казеин. Гепарин, ионы кальция, цАМФ и ЭДТА не оказывают влияния на активность киназы.

Фосфорилирование казеина происходит только по остаткам серинп. Совокупность этих данных позволяет с уверенностью идентифицировать протеинкиназу, ассоциированную с комплексом, как казеинкиназу 1.

Чтобы убедиться, что киназа действительно ассоциирована с комплексом, била проведена гельфильтрация препарата комплекса . Большая часть активности киназы (90% ) элюируется в соответствии с молекулярной массой 1100 хДа и совпадает с положением комплекса. Так как молекулярная масса казеинкиназы 1 равна 37 кДа, это означает что киназа ассоциирована с комплексом.

Спектр фосфоршшруемых полипептидов в обоих фракциях комплекса приведен на рис 5. Как видно из этих данных, в составе фракции 1 комплекса в основном фосфорилируются полипептеды с молекулярными массами 108, 76, 43 и 37 кДа, а в составе фракции 2 комплекса происходит фосфорилирование значительно большего числа полипептидов - 140, 129, 108, 96, 76, 74, 65, 52, 43, 38 и 20 кДа, а также 91 кДа полипептида, представляющего, по всей видимости, минорную примесь. Таким образом, в составе фракции 1 фосфорилируются только метионил- и лизил-тРНК-сннтетазы, тогда как в составе фракции 2 -все компоненты, кроме глутамил-тРНК- синтета-зы. Добавление цАМФ, Са2+ , ЭГТА, гепарина и ингибитора фосфатаз не изменяет существенно спектра и уровня фосфорилирования полкпептидоз комплекса.

Добавление экзогенных казеинкиназ I и 2, в десятикратном избытке по отношению к эндогенной "киназе в случае фракции 1 комплекса не приводит к видимым изменениям. В случае фракции 2 действие казеинкиназы 2 приводит к Фосфорилирование усилению фосфорилирования полипептидов с компонентов комплекса во молехулярными массами 43 и 65 кДа. Ка-фракциях 1 (А) зеинкиназа 1 не дает видимого эффекта, однако в

и 2 (В) эндогенной ее присутствии наблюдается ускорение

казеинкиназой 1. фосфорилирования белков комплекса, что может свидетельствовать о том, что'оно происходит по тем же сайтам, что и эгдогенноп ки"азой. То, что полипептиды ос.чэаной фраки".! комплекса слабо фосфо d и л и«\у ются, может свидетельствовать о том, что они являются фосфсрилирозанными in vivo этой киназой.

Было исследовано влияние фосфорилирования на активность лизил- я аргинил-тРНК-синтетаз. Включение фосфата составляло для аргипил-тРНК-сшггетазы 0.2М на моль белка, а для лизил-тРНК- сннтетазы - 0.23 М для

А В

—-11е

Met ^Г L^u

Lys ««•»

N^-Met

G!n Lys

43

O O^Asp

«2»

kDa

Рис. 5

эндогенной кнназы и 0.29М в присутствии экзогенной киназы 2. При этом наблюдалось небольшое, но достоверное снижение активности лизил-тРНК-синтетазы, т.е. фосфорилнрование не сказывается существенно на активности ферментов. Это согласуетсяи с полученными ранее данными (Pendergast 1987).

Для проверки, является ли 38 кДа полипептнд комплекса казеинкииазой 1 мы провели иммуноблотгинг препарата комплекса и очищенной киназы 1 с моноклональными антителами, полученным против полипептида 38 кДа. Оказалось, что антитела узнают 38 кДа полипептид, но не узнают казеинкиназу 1, т.е полипептид 38 кДа не является киназой 1. Таким образом, идентификация субъединицы комплекса как казеинкниазы I (Pendergast 1987) была ошибочной. Это означает, что казеинкиназа содержится в составе комплекса в виде минорного, но прочно ассоциированного компонента.

Полученные нами данные можно суммировать следующим образом: препарат комплекса содержит активную, прочно ассоциированную, но не являющуюся конститутивным компонентом комплекса казеинкиназу 1. Ее активность связана преимущественно с минорной фракцией комплекса, обладающей несколько большей активностью в реакции аминоацилирования тРНК. В составе этой фракции комплекса эндогенная казеинкиназа 1 способна фосфорилировать практически все полипептиды, в то время как в составе основной части комплекса фосфорилнрование незначительно, и эта часть комплекса практически не содержит киназы. Это позволяет предположить, что основная часть комплекса уже фосфорилирована казеинкиназой 1 in vivo, а киназа ассоциирована с небольшой долей нефосфорилированных молекул комплекса. Это предположение позволяет объяснить имеющиеся различия экспериментальных данных по фосфорилированию комплекса - степень его фосфорилирования и активность ассоциированной киназы может значительно варьировать в, зависимости от физиологического состояния клеток или организма. Ассоциация казеинкиназы лишь с небольшой долей молекул комплекса может объясняться тем, что она имеет непостоянный характер: например, киназа может ассоциировать с нефосфорилированным комплексом, фосфорилировать его и после этого терять к нему сродство и диссоциировать.Такое поведение демонстрирует, например, CDC-киназа, которая на различных стадиях клеточного цикла ассоциирована с разными белками .

Фосфорилнрование аминоацил-тРНК-синтетаз комплекса казеинкиназой 1 не является, видимо, непосредственным механизмом регуляции их активности. Возможно, что степень фосфорилирования играет роль в осуществлении этими ферментами каких-либо дополнительных функций. Так, например, было показано, что фосфорилнрование треонил-тРНК-синтетазы приводит к значительному увеличению ее активности в синтезе диаденозинтет-рафосфата - соединения, играющего, по-видимому, важную роль в стрессовом ответе клеток (Dang. 1990). Однако, то, что именно казеинкиназа 1 отвечает за фосфорилирования аминоацил-тРНК- синтетаз, входящих в состав комплекса, представляется несомненным.

4. Сборка комплекса аминоацнл-тРНК-синтегаз in vivo.

Самой неприятной проблемой, с которой связано исследование комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз, является отсутствие полной уверенности в существовании комплекса в клетке. Несмотря на данные о стабильности комплекса, универсальности его состава, независимости состава комплекса от метода выделения, отсутствие конкретных функций невольно вызывает вопрос, не являются ли комплексы результатом неспецифической аггрегащш гидрофобных аминоацил-тРНК-синтетаз при разрушении клеток. Единственным доказательсвом реального существования комплекса аминоацил- тРНК-синтетаз in vivo могло бы являться обнаружение временного процесса его сборки в клетке.

Суть использованного для этой цели метода заключается в мечении клеток радиоактивной аминокислотой в течение различных интервалов времени (от нескольких минут до часов) с последующим их разрушением и иммуноп-реципитацией комплекса или интермедиатов его сборки антителами против одного кз его компонентов. Состав иммунопреципитатов анализируется с

«<í-.j> tf 4

i ...

. - M* <r"> C» fej

t i

Щ-

O tíf ti Ü L

200

_ 150

1» 129

ts8» jas Сй> 92

a

16 74

P

Ы

57

45

43

3B

20

30 40 60 160

Ш«

M

ID»

Рис.6 Состав иммунопреципитата комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз с антителами против метионил-тРНК-синтетазы в зависимости от времени пульс-мечения. М- полипептидный состав комплекса. Цифры справа обозначают молекулярные веса полипептидов.

5

С1а . № ««•

Ьец '

I»

*>

I

ЛпЦ Ме1Ю

ЗШ

& *

40 180

Рис.7 Состав иммуноп-реципитата комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз с антителами против глютамил-тРНК-синтетазы в зависимости от времени пульс-мечения. Слева» иммуноп-реципитат комплекса

аминоацил-тРНК-синтетаз антителами против метионил-гРНК-синтетазы после 40 мин

помощью 5В8-электрофореза.В случае наличия упорядоченного процесса сборки можно ожидать увидеть последовательное прибавление компонентов в составе иммунопреципитата, и, возможно, появление белков, временно ассоциированных с интемедиатами сборки - шаперонов - необходимость которых для сборки ряда белков показана фоШтапп, 1989).

В работе использовали аффино-очшценные антитела против нескольких аминоацил-тРНК-синтетаз, входящих в состав комплекса, и антитела, полученные против целого комплекса, т.е. узнающие все входящие в его состав полипептиды (антикомплекс-антитела). Результаты эксперимента по иммуноп-реципитации с использованием антител против ыетионил-тРНК-сивтетазы приведены на рис. 6. Как видно из этих данных, уже после десяти минутного ме-чения в состав иммунопреципитата включаются полипептиды, сответству-ющие метионил-, глутаминил-, лизил-, лейцал и изолейцил-тРНК-синтетазам, что свидетельствует об очень быстрой их ассоциации. Полипгптиды, соответствующие глутамил- , аргинил-, аспартил-тРНК-синтетазам появляются в составе иммунопреципитатов лишь на поздних

стадиях созревания комплекса. Зрелый

пульс-мечения. Цифры справа__комплекс обнаруживается лишь после 3

обозначают молекулярные веса часового мечения, что значит, что время, полипептидов. необходимое для полной сборки, лежит в

пределах от 2 до 3 часов. Обнаруживается также ряд полипептидов, отсутствующих в выделенном комплексе - полипептиды с молекулярными массами 200, 220 и 45 кДа. Один из них, 220 кДа полипептид, обнаруживается как в составе интермедиатов сборки, так и в составе зрелого комплекса, его присутствие в иммунопреципитатах комплекса наблюдалось и ранее. Что касается двух других полипептидов, то они присутствуют явно в относительно большем количестве в составе интермедиатов сборки, чем в зрелом комплексе. Результаты этого эксперимента позволяют определить время, необходимое для сборки комплекса и выделить две группы белков - быстро- и медленно ас-социрующих в комплекс. ,

Эти выводы нашли подтверждение в экспериментах с антителами глутамил-тРНК-синтетазы (рис.7). Глутамил-тРНК-синтетаза также входит в состав комплекса на поздних стадиях сборки - из приведенных данных видно, что даже после трех часов большая ее часть находится в свободном виде. Интересно, что первыми компонентами комплекса, ассоциирующими с глутамил-тРНК- сиктетазой, являются изолейцил- и лейцил-тРНК-синтетазы. Возможно, они более тесно взаимодействуют друг с другом в комплексе. Подтверждающие данные были Рис.8 Состав иммунопреципитата комп- получены и в экспериментах лекса аминоацил-тРНК-синтетаз сантикомп- с антителами против аргинил-лекс антителами в зависимости от времени тРНК-синтетазы - компонен-пульс-мечения. Цифры справа обозначают ты комплекса обна-молекулярные веса полипептидов, руживались в составе

иммунопреципитата лишь

после часового мечения.

Для проверки, существуют ли полипептиды ассоциированные с интер-медиатами сборки комплекса, были использованы антитела против всего комплекса (антикомплекс-антитела). Как видно из рис.8, они четко выявляют наличие двух таких полипептидов - 200 и 45 кДа. Внутренним контролем может служить настоящий примесный полипептид, связываемый антителами - 100 кДа. В отличие от 200 и 45 кДА полипептидов, его содержание относительно других полипептидов не изменяется со временем, Для того, чтобы более точно выяснить временное поведение этих полипептидов, был использован другой тип эксперимента - пульс-чейз мечение. Клетки метили метионином в течении 20 мин, затем добавляли избыток немеченого метионина и прослеживали судьбу меченых за 20 мин полипептидов с помощью антикомплекс-антител. Как видно из рис.9, относительное содержание этих полипептидов резко уменьшается по мере созревания комплекса, что позволяет отвести этим белкам роль потенциальных шаперонов. Поскольку известно, что ассоциация шаперонов с белками является АТФ-зависимой - АТФ*М£ диссоциирует их комплексы (Лоотапп, 1989), это было проверено и в настоящем случае. Как видно из рис. 9, обработка иммунопреципитата АТФ'Мй приводит к диссоциации из его состава 200 и 45 кДа полипептидов.

.„>• ■ дам** *

= 20«

„.. -»*-1 -А ... ***** ■ «А»-* ■ - .

«п» «аза»

* %еда ¿я|

***** сга* ^^

.«*» С.;* с.-У

О- - щ Щ

<*-•» "ЛЬГ

- В Й о

*г ъ* С»

—45

о в

—¿2*. Ю.

5 10 20 30 40 60 180 тю

«Mt ям* фт

kDa

30 45 120 min

В

i

6»

в

3

Рис.9 А Состав имму-нопреципитата комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз с антикомплекс -антителами в зависимости от времени пульс-чейз мечения. Клетки метили в течение 15 мин ., далее - чейз.Рис.9В Состав иммуноиреципита-та комплекса после 20 млн пулъс-мечения: 1 - стандартная отмывка + АТР*\^; 2 - состав элюата; 3 - стандартная отмывка.

Таким образом, показано, что комплекс аминоацил-тРНК- синтетаз образуется in vivo в результате длительного упорядоченного процесса сборки, требующего около трех часов. Показано, что с интермедиатами сборки комплекса ассоциированы два полипептида с молекулярными массами 45 и 200 кДа, ATC>*Mg диссоциирует их из состава иммунопреципитатов. Предположительно, эти белки участвуют в процессе сборки комплекса.

Выводы.

1. Обнаружена структурная специфичность связывания амироацил-тРНК-синтетаз с полианионами - показано, что к взаимодействию с лизил-тРНК-синтетазой способны одноцепочечные РНК, не имеющие жесткой вторичной структуры и сходные с нчми го свойствам полианионы. Во взаимодействии принимает центр связывания тРНК.

2. Показана существенная роль антикодона в узнавании тРНК лизил-тРНК-синтетазой.

3. Показано, что аминоацил-тРНК-синтетазы комплекса фосфорилируются ассоциированной с ним, но не являющейся его конституитивным компонентом казеинкиназой 1.

4. Разработан метод исследования сборки мультиферментного комплекса вминоацнл-тРНК-синтетаэ in vivo. Определено время сборки комплекса, порядок сборки и показана ассоциация с интермедиатами сборки двух шаперонопо-добных белков.

Работы, опубликованные по материалам диссертации.

1. Вольфсон А.Д., Моторин Ю.А., Орловский А.Ф., Гладилик К.Л. 1987 , Биохимия, 52, 1847-1864. Выделение, полипептидный состав и свойства комплекса амяноацнл-тРНК-синтетаз из печенн кролика.

2. Вольфсон А.Д.,. Моторин Ю.А., Цыганков А.Ю.,Орловский А.Ф., Гладшшн К.Л. 1988 , Биохимия, 53, 799-805. Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз из печени кролика с РНК и полианионами.

3. Елизаров С.М., Вольфсон А.Д., Моторин Ю.А. 1989, Биохимия, 54, 774-783. Фосфорнлирование компонентов высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-сшгтетаз из печени кролика ассоциированной казеиновой киназой типа 1.

4. Elisarov S.M., Wolfson A.D., Motorin Yu.A. Phospborilation of the components of the high molecular mass aminoaeyl-tRNA synthetase complex by associated protein kinase. Iternational Symposium "Molecular organization of biological structures", June 19-24, 1989, Moscow, USSR. Abstact book 11 p.343.

5. A.Yu. Tsygankov, Yu.A.Motorin, A.D.Wolfson, D.B.Kirpotin, A.F.Oriovsky. High-performance ion-exchange chromatography of oligoribonucieotides using linear and hyperbolic saltr gradients. J.Chrom., 1989, 465,325-329.

Подписано в печать 5.02,Э1г. Заказ 512 Формат 60x90/16 Тираж 100

Москва. Типография ВАСХНШ1