Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспортные РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы и их высокомолекулярные комплексы в регенерирующей печени крыс

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яремчук, Анна Дмитриевна

Список употребляемых сокращений

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Регуляторная функция тРНК.

1.2. Аминоацил-тРНК-синтетазы эукариотов.

1.3. Особенности биосинтеза белков и нуклеиновых кислот в регенерирующей печени.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Транспортные РНК регенерирующей печени крыс.

3.2. Аминоацил-тРНК-синтетазы регенерирующей печени крыс.

3.3. Высокомолекулярные комплексы /кодосомы/ регенерирующей печени крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транспортные РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы и их высокомолекулярные комплексы в регенерирующей печени крыс"

К настоящему времени в целом изучены и охарактеризованы структура, свойства и функции белков и нуклеиновых кислот - биополимеров, участвующих в основных процессах жизнедеятельности клетки. На первый план выдвигается вопрос о регуляции функционирования этих макромолекул в клетке и, с другой стороны, о их роли в регуляции клеточного метаболизма в целом. Известно, что регуляция экспрессии генома является каскадной и осуществляется на разных уровнях. У высших организмов особое значение приобретает посттранскрипционная регуляция, в том числе на уровне трансляции. Накоплен большой экспериментальный материал о том, что одним из компонентов, участвующих в такой регуляции, являются транспортные РНК. Есть веские основания считать, что синтез тРНК не является конститутивным, а взаимосвязан с качественными и количественными изменениями набора мРНК, трансляция которых , происходит в данный период жизнедеятельности клетки. Этот вывод сделан на основе открытия явления "функциональной адаптации" тРНК к синтезу специфических белков в узкоспециализированных тканях /1-4/, таких как эпителий молочной железы, грануляционная ткань, шелковы-делительная железа, хрусталик глаза и др. Возникает вопрос, характерна ли адаптация только для узкоспециализированных тканей или это явление носит универсальный характер и свойственно всем клеткам при изменении в них качественного набора синтезируемых белков. Удобной моделью для выяснения этого вопроса является регенерирующая после частичной гепатэктомии печень, поскольку первые сутки после операции характеризуются существенной стимуляцией белкового синтеза в целом, а максимумы синтеза отдельных белков разобщены во времени. Так, через 6 ч наблюдается усиленный синтез рибосомальных белков, через 15 ч - первый, а через 21-23 ч - второй, более значительный пик синтеза гистонов /5/.

В литературе имеются сведения о свойствах транспортных РНК регенерирующей печени крыс, однако они очень ограниченны и противоречивы, а в указанные сроки регенерации биологическая активность тРНК никем не изучена. Кроме роли тРНК, регуляторная функция которых косвенно и прямо показана в значительном количестве экспериментальных работ, интерес представляет вопрос о функционировании эукариотических АРСаз при существенных изменениях биосинтеза белка. В ряде работ показано, что АРСазные активности в клетках эукариотов отличаются при различных физиологических и патологических состояниях организма, в частности, при гормональных воздействиях, в процессе онтогенеза, дифференцировки и т.д. Однако практически ни в одном случае не показано, связаны ли эти различия с изменением количественного содержания ферментов в клеточном пуле или с изменением их молекулярной активности. Кроме того, известно, что в отличие от прокариот большинство АРСаз в клетках эукариот функционируют в составе высокомолекулярных комплексов так называемых кодосом, составными частями которых также являются тРНК /6/, метилтрансферазы /7/, протеинкиназы /8/ и др. Однако биологический смысл надмолекулярной организации АРСаз и других компонентов белкового синтеза не известен, а вопрос о функционировании высокомолекулярных комплексов при существенных изменениях биосинтеза белка совершенно не изучен. Выбранная нами экспериментальная модель удобна и для решения этого вопроса, поскольку в печени крыс обнаружены и достаточно хорошо охарактеризованы высокомолекулярные комплексы АРСаз, а изменения биосинтеза белка в процессе регенерации дают возможность сравнить их состав и свойства в зависимости от характера белкового синтеза.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение биологической активности и свойств транспортных РБК, АРСаз и их высокомолекулярных комплексов в регенерирующей печени крыс через 6, 15 и 21 ч после частичной гепатэктомии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Определить акцепторную активность тРНК in vitro, количественное содержание эндогенных аминоащтл-тРНК in vivo и наличие тРНК в высокомолекулярных комплексах.

2. Изучить аминоацшг-тРНК-синтетазные активности в суммарных препаратах АРСаз и в составе высокомолекулярных комплексов.

3. Получить высокоочшценные препараты глутамил-тРНК-синтета-зы из нормальной и регенерирующей печени 1фыс и изучить свойства ферментов в свободном и ассоциированном состояниях.

4. Определить белковый, фосфолипидный состав высокомолекулярных комплексов и наличие в них метилтрансферазной, протеинки-назной, протеазной и рибонуклеазной активностей.

В результате проведенной работы установлено, что колебания в биосинтезе белка в ранние сроки регенерации печени (6 и 15 ч после операции ) не связаны с изменениями биологической активности и свойств тРБК и АРСаз. Лишь через 21 ч после частичной гепатэктомии в период максимального синтеза гистонов наблюдается слабо выраженная адаптация клеточного состава тРНК и АРСаз к их биосинтезу. Впервые показано, что изменение аминоацил-тРНК-синте-тазной активности в эукариотических клетках, в частности возрастание глутамил-тРНК-синтетазной активности в регенерирующей печени 1фыс, не связано с изменением молекулярной активности фермента, а, по-видимому, определяется увеличением его количественного содержания. Через 21 ч после частичной гепатэктомии существенно возрастает уровень метилирования тРНК и метилтрансферазная активность как в растворимой фракции гомогената печени, так и в составе высокомолекулярных комплексов. Последние выделены и охарактеризованы из регенерирующей печени крыс впервые. Показано, что из изученных компонентов кодосом наиболее существенные изменения наблюдаются для метилтрансферазной и протеинкиназной активностей.

Не все обнаруженные нами изменения носят выраженный характер, однако эффективность процесса трансляции зависит от многих факторов, поэтому даже малые изменения, если они действуют одновременно и в одном направлении, могут привести к амшшфицирован-ному результату. В этом плане заслуживают внимания и дальнейшего изучения результаты по исследованию метилтрансферазной и протеинкиназной активностей кодосом. Изменение количественного содержания и набора этих ферментов, входящих в их состав, может иметь прямое отношение к регуляции биосинтеза белка.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Яремчук, Анна Дмитриевна

Заключение.

В настоящей работе впервые проведено детальное изучение транспортных РНК, аминоацил-тРНК-синтетаз и их высокомолекулярных мультиферментных комплексов в пререпликативный период регенерации печени крыс, вызванной частичной гепатэктомией.

Полученные результаты свидетельствуют об определенной стабильности содержания и активности, данных компонентов аппарата трансляции в печени на ранних стадиях регенерации. Пререпликативный период характеризуется подготовкой гепатоцитов к митозу и последующему восстановлению массы органа. Для него характерны существенные изменения многих биосинтетических процессов, в том числе так называемое перепрограммирование генома гепатоцитов, усиленный синтез /либо подготовка к нему/ ряда компонентов хроматина и аппарата трансляции. Однако изучение компонентов аппарата трансляции, ответственных за первый этап биосинтеза белка - образование аминоацил-тРНК, показало, что концентрация тРНК и АРСазз, по-видимому, не лимитирует скорость белкового синтеза, т.е. достаточна для обеспечения интенсификации этого процесса. Так, известно, что увеличение скорости биосинтеза белка в регенерирующей печени начинается уже через I ч после операции ¡118/, к 12 ч содержание общего белка достигает, максимума и сохраняется на высоком уровне, до 36 ч. Через. 6 ч после частичной гепатэктомии наблюдается максимум синтеза рибосомных белков, через 15 ч - первый максимум синтеза гистонов. Однако как содержание тРНК /в мг на I мг ДНК/, так и ее акцепторная активность in vivo и in vitro не изменяются в печени крыс через. 6 и 15 ч после частичной гепатэктомии. На уровне контроля остается и аминоацил-тРНК-синтетазная активность. Определенные изменения биологической активности изученных в работе компонентов аппарата трансляции обнаружены лишь, через

21 ч после операции - в период, характеризующийся вторым максимумом синтеза гистонов. Как известно, аминокислотный состав гистонов носит специфический характер и отличается высоким содержанием лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, аланина; низким содержанием фенилаланина, гистидина, метионина и практическим отсутствием триптофана, цистина и цистеина. В связи с этим для изучения биологической активности тРНК и АРСаз нами были выбраны аминокислоты, по-разному представленные в составе гистонов: аланин, глутаминовая кислота, лизин, фенилаланин и триптофан. Изучение уровня аминоаци-лирования по данным аминокислотам тРНК in vitro и in vivo, определение соответствующих АРСазных активностей как в целом клеточном пуле, так и в составе высокомолекулярных комплексов показало наличие определенной адаптации наборов тРНК и АРСаз к синтезу гистонов. В частности, нами показано возрастание TPHKGlu,Lys и. эндогенных глутамил- и лизил-тРНК, отсутствие изменений фенил ал анил-тРНК и снижение триптофанил-тРНК. В отличие от узкоспециализированных тканей, где подобная адаптация носит резко выраженный характер, в печени не устанавливается полная корреляция между составом тРНК и АРСаз; и аминокислотным составом гистонов. Например, практически отсутствуют изменения аланил-тРНК и аланил-тРНК-синте-тазной активности, хотя аланин. содержится в достаточно большом количестве. в гистонах. Однако следует подчеркнуть, что печень не является узкоспециализированным органом. В ней синтезируется большое количество разных по аминокислотному составу и по функциям белков. Поэтому трудно представить себе возможность строгой адаптации к синтезу одного вида белков даже в период их максимального синтеза. В то же время ясно, что синтез тРНК в печени не является конститутивным и регулируется в зависимости от потребностей клетки.

Что касается аминоацил-тРНК-синтетаз, то нами впервые показано на эукариотическом организме, что изменение АРСазной активности органа, скорее всего, связано с изменением количественного содержания фермента, а не его молекулярной активности. При решении этого вопроса наш были получены высокоочшценные препараты глута-мил-тРНК-синтетаз из интактной и регенерирующей через 21 ч после частичной гепатэктомии печени крыс. Для получения ферментов 9С$-ной чистоты по данным аналитического электрофореза в полиакрилами-дном геле /в денатурирующих условиях/ было использовано пять стадий очистки, в том числе хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе и окси-апатите. Следует подчеркнуть, что глу тамил- тРНК- синте таз а является ферментом, прочно ассоциированным в высокомолекулярном мульти-ферментном комплексе, поэтому получение ее в индивидуальном состоянии связано с определенными трудностями и сопровождается большими потерями. Так, выход высокоочшценного фермента по активности составил всего лишь 0,14$. Глутамил-тРНК-синтетаза из печени крыс в высокоочищенном состоянии получена нами впервые. Низкий количественный выход индивидуального фермента не позволил нам провести его детальный физико-химический анализ, однако мы и не ставили такую задачу в данном исследовании. В работе проведено сравнение молекулярной массы и ряда каталитических свойств вдут.амил-тРНК-син-тетазы из интактной и регенерирующей печени. Оказалось, что Кт по всем субстратам, V и молекулярная активность для обоих ферментативных препаратов практически одинаковы. В то же время глутамил-тРНК-синтетазная активность в печени крыс через 21 ч после частичной гепатэктомии возрастает как в суммарном клеточном наборе, так и в составе высокомолекулярных комплексов. Это возрастание, судя по нашим данным, нельзя объяснить изменением молекулярной активности глутамил-тРНК-синтетазы. Вероятно, возрастает ее количественное содержание в гепатоцитах, хотя мы не можем исключить появление активатора /либо исчезновение ингибитора/ данного фермента при усиленном биосинтезе гистонов в этот, период регенерации печени. Вопрос о регуляции активности АРСаз в клетке только начинает изучаться и. требует специального исследования.

Данная работа является одной из первых попыток определить функциональное значение аминоацил-тРНК-синтетазных комплексов.Одним из подходов к изучению этого вопроса является сравнение свойств АРСаа в очищенном и ассоциированном состоянии. В связи с этим нами были изучены константы Михаэлиса и термостабильность высокоочи-щенных лизил- и глутамил-тРЖ-синтетаз и в составе кодосом. Оказалось, что Кт по всем субстратам для указанных АРСаз в комплексах, практически не отличаются от таковых для очищенных ферментов. Полученные результаты согласуются с данными других авторов для лизил-, метионил- /иб / и изолейцил-тРНК-синтетаз /134 /. Нами не обнаружено также различий в термостабильности глутамил- и лизил-тРНК-синтетаа в составе комплексов и в очищенном состоянии. Эти данные, наряду с литературными, дают, нам основание отдавать предпочтение гипотезе, компартментализации.

Для выяснения возможной роли высокомолекулярных комплексов в интенсификации белкового синтеза был изучен их состав в печени крыс в норме и через 21 ч после частичной гепатэктомии.

В составе комплексов из пяти наученных АРСаз не обнаружена лишь триптофанил-тРЖ-синтетазная активность, что согласуется с литературными данными об отсутствии этого фермента в агрегированном состоянии, либо его слабой ассоциации в комплексе. По схеме, предложенной в работе /но/, триптофанил-тРЖ-синтетаза расположена во внешнем слое структурной организации кодосом и может диссоциировать уже при гомогенизации ткани.

Установлено, что изменения АРСазных активностей в составе кодосом при регенерации печени крыс соответствуют изменениям в суммарном цитоплазматическом пуле. Следует подчеркнуть, что глута-мил-, лизил- и фенилаланил-тРЖ-синтетазы в печени контрольных и частично гепатэктомированных животных находятся полностью в ассоциированном состоянии. Аланил-тРНК-синтетазная активность в комплексах: составляет 70%.

В отличие от. АРСаз в составе кодосом нами обнаружены только tPHKG1u и TPHKLys из всех изученных тРНК. Увеличение содержания этих тРНК в суммарном клеточном наборе при регенерации печени сопровождается увеличением их содержания и в составе комплексов. Можно предположить, что те тРНК, которые наиболее эффективно используются в процессе трансляции, более прочно ассоциированы в высокомолекулярных комплексах. Однако в отличие от АРСаз относительное содержание тРНК в комплексах значительно ниже и составляет около 2%, как установлено на примере tPHKG1u и тРНКЪуБ. п#угим цитоплазматическим компонентом, почти полностью ассоциированным в высокомолекулярные комплексы, являются метилтранс-феразы. Их содержание /либо активность/ существенно возрастает при регенерации печени, что соответствует повышенному уровню метилирования тРНК in vivo через 21 ч после частичной гепатэктомии. Использование в качестве субстрата субметилированной тРНК показало, что характер изменения отдельных метилтрансферазных активностей не одинаков. Эти исследования требуют дальнейшего развития для установления как молекулярных механизмов, лежащих в основе возрастания метилтрансферазной активности, так и для выяснения вопроса, к каким последствиям приводит увеличение уровня метилирования тРНК. Например, отличаются ли такие тРНК по их способности связываться с рибосомами и по точности трансляции определенных кодонов.

Кроме тРНК-метилтрансфераз, важным компонентом кодосом являются протеинкиназы. Нами был изучен уровень эндогенного фосфорилирования белков кодооом и. зависимость этого процесса от циклических. нуклеотидов. Кодосомы, выделенные из печени крыс через 21 ч после частичной гепатэктомии, характеризуются снижением уровня эндогенного фосфорилирования in vitro в 2,3 раза. Однако этот результат нельзя однозначно интерпретировать как снижение протеин-киназной активности кодосом, поскольку при добавлении экзогенного субстрата /протамина/ уровень фосфорилирования возрастает в 3 раза. Можно предположить, что в составе кодосом из регенерирующей печени либо снижено содержание специфических субстратов, либо эти белки уже находятся в фосфорилированном in vivo состоянии. Заслуживает внимания тот факт, что добавление в реакционную смесь циклических нуклеотидов не оказывает заметного влияния на процессы фосфорилирования в кодосомах печени контрольных животных-, в то время как при регенерации печени протеинкиназы проявляют значительную чувствительность к,циклическим нуклеотидам. Эти результаты могут послужить началом новых: исследований, так как известно, что процессы фосфорилирования и дефосфорилирования лежат в основе регуляции активности ряда ферментативных систем и регуляции биосинтеза белка на уровне трансляции, в частности процессов инициации синтеза полипептидной цепи. Возможно, что существенные изменения биосинтеза белка при регенерации печени связаны не столько с изменениями акцепторной активности тРНК и: АРСаз, сколько с изменением скорости отдельных этапов процесса трансляции в результате активации белковых факторов.