Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноэлектронномикроскопическое изучение внутриклеточной локализации аминоацил-гРНК синтетаз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноэлектронномикроскопическое изучение внутриклеточной локализации аминоацил-гРНК синтетаз"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

Р Г Б ОД

2 7 ю--;?

па ирапах рукописи

ИВАНОВА ЮЛИЯ ЛЬВОВНА

ИММУНОЭЛЕКТРОШЮМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ АМИНОАЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗ

03.00.03 - Молекулярная биология 03.00.25 — Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996 г.

абога выполнена в Группе электронномикроскопических исследований иополимеров и макромолекулярных структур клетки нститута молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта оссийской Академии Наук

аучные руководители: кандидат биологических наук В.И.НОПЕНКО доктор биологических наук, профессор

А.С.ТИХОНЕНКО

фициальные оппоненты: доктор биологических наук И.А.ПРУДОВСКИЙ

кандидат биологических наук А.А.МИНИН

едущая организация: Институт общей генетики РАН

ащита состоится " ^^^^ \99!/> г. в часов на заседании

иссертационного Совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной иологии им. В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук по адресу: 17984, Москва В-334, ул.Вавилова, д.32.

диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института олекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

втореферат разослан " ^^^^^ 1996 г.

;

ченый секретарь Диссертационного совета' ^ андидат химических наук I

с У/

Л .-МгКрицын'

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аминоацил-тРНК синтетазы ( АРСазы ) играют существенную роль в процессе синтеза белка, обеспечивая строго специфическое амино-ацилирование тРНК на дорибосомном этапе биосинтеза. Эукариотичес-кие АРСазы характеризуются более сложной структурной организацией по сравнению с ферментами из прокариот. Некоторые из эукариотичес-ких АРСаз выделяются из клеток биохимическими методами в виде свободных ферментов ( например, триптофаиил-тРНК синтетаза (ТгрРС, КФ 6.1.1.2)), тогда как другие - в составе высокомолекулярных мульти-ферментных комплеков.

Сложная внутренняя структура эукариотической клетки, наличие большого количества внутриклеточных органелл и компартментов дают дополнительные возможности для регуляции белкового синтеза у эукариот. Изучение внутриклеточной локализации аминоацил-тРНК синтетаз имеет большое значение для понимания пространственной организации аппарата белкового синтеза и выяснения возможностей регуляции трансляции у эукариот за счет пространственного разделения биохимических процессов внутри клетки.

Биохимическими методами, при исследовании фракционированных клеточных экстрактов, аминоацил-тРНК синтетазы были обнаружены в цитоплазме, ядрах, хлоропластах и митохондриях, в ассоциации с рибосомами и полисомами, а также фрагментами мембран. Однако биохимические данные не позволяют сделать однозначного вывода о локализации синтетаз в интактных клетках, так как разрушение и фракционирование клеток может приводить к перераспределению ферментов между различными клеточными компонентами.

Иммуноэлектронномикроскопический подход позволяет проводить исследования без повреждения нативной структуры клеток, а высокая разрешающая способность метода обеспечивает точное картирование

внутриклеточных макромолекул. Принцип метода состоит в обработке ультратонких срезов клеток и тканей специфическими антителами, конъюгированными с электронноплотными маркерами.

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было электронномикроскопическое изучение локализации аминоацил - тРНК синтетаз на ультратонких срезах с помощью комплексов специфических антител с коллоидным золотом. В ходе исследования мы решали следующие задачи:

1. Сравнительное изучение локализации свободной цитоплазматической триптофанил-тРНК синтетазы (ТгрРС, КФ 6.1.1.2) в клетках, принадлежащих к трем эволюционно различным царствам - бактериям (E.coli), архебактериям (M.halophi lus) и эукариотам;.

2. Сравнительный анализ распределения ТгрРС в разных типах эукари-отических клеток: культуре фибробластов. и клетках поджелудочной железы крысы и культуре клеток эпителия почки кролика.

3. Сравнительное изучение локализации в клетках млекопитающих ТгрРС и компонентов мультиферментного комплекса: слабо ассоциированной с комплексом аргинил-тРНК синтетазы (ArgPC, КФ 6.1.1.19), прочно связанной с комплексом глутамил - пролил - тРНК синтетазы ( GluProPC, КФ 6.1.1.17 ) а также двух несинтетазных компонентов комплекса - полипептидов с молекулярными массами 38 и 43 кДа.

Научная новизна и практическая ценность исследования. Для решения поставленных научных задач нами был разработан метод статистической обработки экспериментальных электронномикроскопиче-ских данных, который имеет универсальный характер и может успешно применяться для тонкого картирования различных макромолекул.

Проведено сравнительное изучение локализации триптофанил-тРНК синтетазы в клетках бактерий (Б. coli) и архсбактерий (M. halophi-lus). Показано, что распределение ТгрРС в бактериальных и архебак-

термальных клетках практически совпадает: основная часть фермента располагается в цитоплазме и на границе цитоплазмы и нуклеоида.

Изучено распределение ТгрРС в разных типах клеток млекопитаю-ютцих. Выявлена локализация фермента в рибосомных зонах цитоплазмы, митохондриях и в ядре - в районах диффузного хроматина и на его границе с компактным хроматином.

Изучена локализация в клетках млекопитающих синтетаз мульти-ферментного комплекса: ArgPC и GluProPC. Показано, что распределение синтетаз комплекса и ТгрРС практически совпадает, что свидетельствует в пользу мультиферментной природы всех изученных амино-ацил-тРНК синтетаз в интактных клетках.

Исследовано распределение в клетках эпителия почек кролика двух несинтетазных компонентов мультиферментного комплекса - полипептидов с молекулярными массами 38 и 43 кДа. Показано, что полипептид р38 имеет такое же распределение в клетке, что и все исследованные синтетазы, в то время как полипептид р43 распределяется отличным от синтетаз образом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на:

1. X Европейской конференции по электронной микроскопии, Гранада,

1992.

2. XIV Конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, 1992.

3. V Конференции по электронной микроскопии стран Тихоокеанского региона, Пекин, 1992.

4. III Национальной конференции по электронной микроскопии, Цюрих,

1993.

5. XIII Международном конгрессе по электронной микроскопии, Париж,

1994.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания результатов и выводов. Работа изложена

на 14;1 странице машинописного текста, содержит 40 рисунков и микрофотографий и 5 таблиц. Библиография включает 161 работу.

Основные результаты диссертации изложены в 8 печатных работах.

МАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ

Антитела к АРСазам были получены и охарактеризованы в Лаборатории молекулярных основ онкогенеза ИМБ РАН (Заведующий - чл.корр. РАН Л.Л.Киселев) С.Ф.Берестенем, О.О.Фаворовой и В.В.Филоненко.

Фиксация клеток и приготовление ультратонких срезов. Условия фиксации и заключения клеток в полимерные смолы были подобраны таким образом, чтобы обеспечить одновременно хорошую сохранность ультраструктуры клеток и иммунореактивность внутриклеточных АРСаз. Клетки фиксировали 1 ч при 18° С в 1 % ( Е. coli, клетки культуры почек кролика RK-1 и поджелудочной железы крысы) или 2.5 %. глутар-альдегиде (U. halophilus и фибробласты) на 0.1 M фосфатном буфере, pH 7.2 ( ФБ ) с добавлением 0.05 M сахарозы ( фибробласты ) или 7% NaCl (M.halophilus), промывали 0.1 M ФБ, заключали в агар ( 2 % на 0.1 M ФБ), обезвоживали в градиенте спиртов (30-100 %) при охлаж-ждении от 0°С до -35°С, пропитывали образцы смолой "Lowicry 1 К4М" (в смеси с этанолом в отношении 1:1 - 60 мин, в отношении 2:1- 60 мин, чистой смолой - 60 мин и 12 ч при -35°С). Полимеризовали при ультрафиолетовом облучении 16 ч при -35°С, и еще 16-24 ч при 18°С.

Приготовление коллоидпого золота и его комплексов с белками.

Коллоидное золото с размером частиц 7, 15, 22 и 30 нм получали восстановлением BAnCl^ цитратом натрия с добавлением танниновой кислоты ( при 100°С ). Размер частиц золота зависел от количества добавляемой ташшновой кислоты [Slot and Geuze, 1981].

Комплексы антител с коллоидным золотом готовили при pH 8.5-9, добавляя 100 - 200 мкг антител к 5 мл раствора золота. Комплексы белка А с золотом получали, добавляя 25 - 70 мкг белка А к 5 мл

раствора золота ( при pH 6.2 ). Для дополнительной стабилизации комплексов прибавляли раствор полиэтиленгликоля 20000 (ПЭГ) до концентрации 0.02 %. Избыток антител удаляли центрифугированием комплексов (от 10 000 g для АиЗО до 45000 g для Аи7). Осадок ресу-спендировали в 0,05 М <№ (pH 7,2), 0,02 % ПЭГ 20000, 0.01 % NaN3 и хранили при 4°С.

Маркирование ультратонких срезов проводили при условиях, обеспечивающих наилучшую интенсивность и воспроизводимость результатов при отсутствии неспецифического мечения. УТ срезы (50-70 им) помешали на медные или никелевые электронномикроскопические сетки, покрытые формварово-угольной пленкой - подложкой и инкубировали 10 мин в 0.2 М глицине и 30 мин в 0.5-1 % растворе бычьего сывороточного альбумина (на 0.01 М ФБ-0.15 М NaCI). Далее при одноступенчатом маркировании срезы обрабатывали комплексами антител с коллоидным золотом (30-60 мин), при двуступенчатом - инкубировали с антителами (5-20 мкг/мл), а затем с комплексами белка А с коллоидным золотом (30-45 мин). После инкубации и промывки срезы контрастировали 2 % водным раствором уранилацетата (1час) и цитратом свинца (15 мин).

Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM - 100СХ ('Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Статистическая обработка микрофотографий. Данные об относительной концентрации АРСаз получали, измеряя плотность метки ( число

2

частиц золота на 1 мкм площади среза ) в каждом из компартментов клетки. Для построения гистограмм использовали результаты, усредненные по 10-50 клеткам. Однако данный подход позволяет статистически обрабатывать распределение метки лишь в достаточно четко ограниченных компартментах и не учитывает, в частности, сложного структурного строения цитоплазмы.

Для более точного картирования АРСаз мы разработали метод, позволяющий оценить плотность метки в каждом из участков клетки и, т.о., выявить места функционирования ферментов. Кроме того, этот подход позволяет определить относительное содержание АРСаз (в %) в каждом из клеточных компартментов и сравнить с имеющимися биохимическими данными. Для картирования на микрофотографию с увеличением 25000 или 41500 накладывали сетку из квадратов со стороной соответственно 80 или -48 нм. Каждый квадрат был охарактеризован как принадлежащий к рибосомной области цитоплазмы, цитозолю, и т.п. Частицу золота рассматривали как расположенную в соответствующей области клетки, если в квадрат попадал центр частицы золота. Предложенный метод имеет универсальный характер и может применяться для изучения внутриклеточной локализации различных макромолекул.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИММУНОЭЛЕКТРОШЮМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК

СИНТЕТАЗЫ В КЛЕТКАХ ЭУБАКТЕРИЙ, АРХЕБАКТЕРИЙ И ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ

Для выявления эволюционных аспектов внутриклеточного распределения ТгрРС мы изучали локализацию фермента в прокариотических ( Е. coli ), архебактериалъных ( M. halophilus ) и эукариотических клетках. Выбор архебактерий был обусловлен тем, что им присущи признаки, характерные как.для прокариот, так и для эукариот.

Для локализации ТгрРС мы использовали моноклональные антитела Ami (МКАТ Ami) против ТгрРС быка, которые способны взаимодействовать с эукариотическими, прокариотическими и архебактериальньши ТгрРС [Beresten et al, 1989]. Это довольно необычное свойство МКАТ Ami позволило использовать их для сравнительного изучения локализации триптофанил-тРНК синтетазы в эволюционно различных организмах.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК

СИНТЕТАЗЫ В КЛЕТКАХ ЭУБАКТЕРИЙ И АРХЕБАКТЕРИЙ.

Как в эубактериальных, так и в архебактериальных клетках

ТгрРС в основном локализуется в цитоплазме, плотность метки в этих

районах составляет 2.75 ( для Б. coli ) и 3.45 (для М. halophilus)

2

частиц золота на 1 мкм ( Рис. 1, Таб. I ). Фермент распределен по цитоплазме диффузно, иногда - с некоторой концентрацией по перифе-ферии клетки. Нуклеоид метится слабо, плотность метки в нем обычно сравнима с уровнем фона и не превышает 10-20$ от плотности метки в цитоплазме-(Рис.1, Табл.1).

Практически одинаковое распределение ТгрРС в клетках М.halophilus и Б.cali подтверждает вывод, сделанный ранее [Черни и др., 1986], что хотя по биохимическим свойствам многие элементы транск-рипционно - трансляционного аппарата архебактерий отличаются от эубактериальных, морфоструктурная организация этого аппарата универсальна для эубактерий и архебактерий.

Для более детального изучения локализации ТгрРС в клетках эубактерий и архебактерий все подсчитанные частицы золота были распределены на 3 группы: локализованные в области нуклеоида, в цитоплазме и в участках цитоплазмы шириной 25-35 нм, граничащих с нуклеоидом. Данные по локализации 200 случайно взятых частиц золота в клетках Е. coli и М. halophylus представлены в таблице I. Основная часть ( 75 % ) всей метки располагается в цитоплазме. В нуклеоиде содержится не более 9 % от общего количества метки. Около 20 % метки сосредоточено в участках, прилегающих к нуклеоду. В связи с этим следует отметить, что РНК-полимераза и топоизомера-за I в клетках Е. coli, как показывают данные иммуноцитохимических исследований [ Durrenberger et al., 1988], локализуются не в зоне нуклеоида, а в участках цитоплазмы, прилегающих к нуклеоиду, что

указывает на наличие процессов транскрипции в этих районах. Таким образом, по крайней мере часть ТгрРС в эубактериях' и архебактериях располагается в участках клеток, где идут активные процессы транскрипции.

Как видно из рис.1, плотность метки на УТ срезах прокариоти-ческих клеток невелика. Мы попытались оценить, какую плотность метки можно было бы ожидать, исходя из имеющихся литературных данных Комплексы коллоидного золота с антителами позволяют выявлять только те антигенные детерминанты, которые находятся на поверхности или вне среза. Таким образом, если размер локализуемой молекулы равен Н мкм, то на срезе .могут быть выявлены только те молекулы, которые располагаются в поверхностном слое среза толщиной Н ( Рис. 2). Отсюда можно легко определить, какова должна быть максимальная ожидаемая плотность метки на поверхности среза. Примем для простоты, что одна частица золота соответствует одной маркированной молекуле на срезе, причем молекулы распределены по всему объему

равномерно. Считая, что плотность вещества клетки равна в среднем 3 —12 3

р = 1г/см = 10 г/мкм , а белки составляют 15 % от всей массы

бактериальной клетки, получим, что масса всех белков, содержащихся

в слое й мкм и площадью 1 мкм , составит 0.15 р Н граммов. Если

доля локализуемого белка от суммарного количества белков равна Р,

2

то для числа частиц золота на 1 мкм среза [И] получим оценку:

к 0.15 р Н Р А (Щ ...-----и

23

где А = 6,02"10 - число Авогадро;

М - молярная масса локализуемых молекул;

.к - коэффициент, учитывающий эффективность связывания антител

Таблица I

Распределение частиц золота на ультратонких срезах бактериальных

клеток

Тип клетки и измеряемый параметр

нуклеоид цитоплазма граница цито- всего

плазма/нуклеоид

Escherichia coli

частиц золота шт(%) 18(9%)

2

измеренная площадь 47 мкм

134(7396) 57 мкм

31(18%) 183(100%)

Methanococcus halophylus частиц золота шт(%) измеренная площадь

11(4,5%) 22 мкм^

192(76%) 66 мкм^

49(19,5%) 252(100%)

Число частиц золота на 1 мкм

Цитоплазма Нуклеоид

ШЗ E.coli +Aml-Au30 ГП E.coli +Aml-Au30+TrpPC

GE3 M.halophilus +Aml+pA-Au22 ЩШ M.h*lopbilus+pA-Au22

Рис.1. Гистограмма распределения частиц золота на УТ срезах клеток E.coli, обработанных комплексами Ам1-Аи30 и М.halophylus, обработанных МКАТ Ami и комплексами рА-Аи22.

Рис.2. Схематическое изображение процесса маркирования белка антителами и комплексами коллоидного золота с белком А.

с антигенными детерминантами, а также сохранность антигенш

детерминант после фиксации, обезвоживания и полимеризации;

Считая М = 60 ООО г, й=0,01 мкм, к = 0,3 (Craig et al., 198:

получим [N]= ( 0.3 х 0,15 х Ю-12 х 0,01 х 6 х 1023 Р ) : 60 000 3 2

4,5 х 10 Р шт/мкм . Внутриклеточная концентрация каждой из амищ

ацил-тРНК синтетаз в клетках Е. coli приблизительно равна 2-5 mkJ

-5 -3

что составляет 2 х 10 - 2 х 10 от общего количества белка в клетке [Jakubowski et al, 1984]. Таким образом, для ожидаемо] значения интенсивности метки получим [N] = 0,09 - 9 шт/мкм , чч очень хорошо совпадает с результатами, полученными в опыте (Рис.; ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ В КЛЕТКАХ МЛЕК0Ш1ТАЮЩ1 Локализацию ТгрРС в клетках млекопитающих мы изучали на уль-ратонких срезах фибробластов крыс RAT-1, клеток эпителия поч] кролика RK-1 (Рис. 3(a), 4) и клеток ткани поджелудочной желе крысы. Срезы обрабатывали либо комплексами МКАТ Ami с коллоидш •золотом (Рис.3,а), либо сначала МКАТ Ami, а затем комплексами бе.

ка А с коллоидным золотом, либо комплексами поликлональных антител с коллоидным золотом.

Электронная микроскопия обработанных срезов выявила сходное распределение ТгрРС во всех изученных типах клеток. Подавляющая часть метки (-78 %) локализуется в цитоплазме, но ее распределение неравномерно: цитоплазматические районы, обогащенные рибосомами, как свободными, так и ассоциированными с мембранами эндоплазмати-ческого ретикулума, метятся наиболее интенсивно: в них концентрируется около 48 % от общего количества метки (Табл. II). Цитоплазматические районы с кластерами полисом содержат наибольшее количество метки, хотя частицы золота метят также и отдельные рибосомы.

Каков может быть механизм, способствующий концентрации ТгрРС вблизи рибосом? Известно, что ТгрРС, в отличие от остальных синте-таз эукариоТ, не ■обладает афинностью к высокомолекулярным РНК [ Федоров и Фаворова, 1988 ], следовательно, концентрация иокруг

Рис.3. Ультратонкие срезы клеток RK-1, обработанные комплексами коллоидного золота с МКАТ Ami (a), F8 (б) и F7 (в).

рибосом не может осуществлятся за счет ассоциации с рРНК. Был обнаружено, что один из из ферментов гликолиза - D-глицеральдегид 3-фосфат-дегидрогеназа (ГАДФ) связывается с ТгрРС, и в то же врем обладает РНК-связывающей активностью. Описано существование трой ного комплекса ТгрРС-ГАДФ-рРНК. Возможно, внутриклеточная ассоциа ция ТгрРС с рибосомами стабилизируется через образование промежу точного комплекса между ТгрРС, ГАДФ и рибосомной РНК [Filonenko е al., 1991].

Ассоциацию некоторой части ТгрРС со свободными рибосомам можно объяснить тем, что после терминации биосинтеза молекул ТгрРС остается связанной с рибосомной частицей.

Биохимические данные, полученные при исследовании лизатов ил гомогенатов клеток животных, показывают, что не входящая в соста высокомолекулярного мультиферментного комплекса ТгрРС в основно локализуется в цитозоле (Бере ень и др., 1978). Однако такое рас пределение фермента може- оыгь следствием разрушения клеток, чт приводит к серьезному искажению истинного характера локализации, наших экспериментах мы иногда наблюдали частицы золота в цитоплаз матических районах, свободных от рибосом, микрофиламентов, фагосо и каких-либо других клеточных органелл. Таким образом, по крайне мере часть ТгрРС в интактных клетках не связана ни с какими внут риклеточными органеллами. Однако необходимо заметить, что плот ность метки в цитозоле в 2-3 раза ниже, чем в рибосомных областях

Мы не наблюдали частиц золота над областями цитоплазмы содержащими микрофиламенты ( Табл.11 ). Ранее Палей с соавторам [1991] выявляли ассоциацию ТгрРС с филаментами кортикальной зон клеток, обработанных Triton Х-100. Однако обработка детергентам может приводить к вымыванию и перераспределению внутриклеточны

Таблица II. Распределение частиц золота над различными органеллами и компартментами клеток ЕК-1

АНТИ- ЧИСЛО ЧАСТИЦ ЗОЛОТА (% ОТ 06ЩЕГ0 КОЛИЧЕСТВА 2 SD) ТЕЛА_______

Рибо- Цито- Зона Мито- Цито- Диффузный Компакт- Ядрыш- Все ядро

соыная зольная микро- хонд- плазма хроматин ный ки

область область фила- рии в целом) хроматин ментов

Ami 47.7-9.0 21.2*4.7 0.9*0.3 6.9-2.1 77.7*11.9 19.3*10.5 0.7*0.2 2.2*1.4 22.2*11.9

F7 42.4*6.1 25.0*6.5 1.2*0.4 Т.2*3.4 80.0*3.6 16.4*3.8 0.8*0.7 1.0*0.2 20.0*3.6

wF31 54.8*6.3 27.6*2.4 0.7*0.9 5.0*5.0 83.0*3.4 9.7*2.8 0.3*0.3 0.9*0.7 11.0*3.4

F3 49.9*4.5 22.0*5.7 0.4*0.5 8.2*4.7 60.9*6.1 17.0*5.0 0.6*0.4 0.9*0.3 19.1*6.2

F12 44.8*8.0 25.0*2.9 0.5*0,8 5.3*2.4 76.5*7.1 18.9*5.8 0.5*0.7 1.5*0.9 23.5*7.2

F6 18.4*4.7 10.2*1.2 0.3*0.7 2.2*0.4 31.0*2.2 64.8*5.5 1.4*1.1 2.4*0.6 68.2*4.7

компонентов и искажать истинный характер локализации фермента.

ТгрРС также не обнаружена в пространстве между цистерн, , эндоплазматического ретикулума, в аппарате Гольджи и в зимогенных гранулах клеток поджелудочной железы (Табл.II).

Большое количество фермента было обнаружено в аутофагосомах фибробластов крыс, что согласуется с ранее полученными данньми [ Палей и др., 1985 ] и, вероятно, объясняется протеолизом ТгрРС в фагосомах.

Довольно интенсивно метятся митохондрии, в них локализуется около 7 % от общего количества частиц золота. В среднем плотность метки в митохондриях составляет 70 % от ее плотности в цитоплазме (Рис.4), однако в одной и той же клетке можно видеть как митохондрии совсем без метки, так и такие, где плотность метки равна цито-

100%

Относительная интенсивность метки в органеллах клетка

40%

20% -

Митохондрии Ядрышко Комп.хром. Дифф.хром. КЗ ТгрРС (Ami) И ArgPC (Т7) ЕЗ ArgPC (Г31)

1Ш GluProPC (FS) ЁШЗ р38 (F12)

Рис.4. Гистограмма распределения различных аминоацил - тРНК синтетаз в клетках КК-1. За 100% принят уровень метки в цитоплазме интактных клетках.

плазматической или даже превосходит ее. Полученные результаты додтверждают биохимические данные о присутствии ТгрРС в митохондриях различных тканей [ ОаЫиБ а!., 1982].

Нам удалось ясно продемонстрировать присутствие ТгрРС в ядрах всех исследованных типов клеток млекопитающих ( Рис.3,а ). В ядрах локализуется около 10-15 % всех частиц золота ( Табл.II ), которые расположены в основном в районах диффузного хроматина . Плотность метки в этих областях может достигать до 50 % от плотности метки в цитоплазме ( Рис.4 ). Бо-видимому, ТгрРС в ядрах ассоциирована с зухроматином и/или с ядерным матриксом в зонах диффузного хроматина. В районах компактного хроматина метка практически отсутствует, хотя можно наблюдать частицы золота на границе компактного и диффузного хроматина (Рис.3,а, Табл.II).

Небольшое количество метки выявляемся также в ядрышках (Табл. II), хотя нельзя исключить, что некоторая часть этой метки может быть ассоциирована с околоядрыппсовым диффузным хроматином.

Ранее некоторые АРСазы уже были обнаружены в ядрах клеток животных с помощью иммуноцитохимических методов. Так, например, Миранд с соавт. визуализировали на световом уровне РЬеРС в ядрах быстро делящихся клеток культуры почек хомяка [ 1985 ]. Палей с соавт. электронномикроскопически выявляли ТгрРС в ядрах бычьих клеток с помощью иммунопероксидазного метода [1988, 1991]. Однако разрешающая способность примененных методов не позволила исследовать точное распределение ферментов внутри ядра. Кроме того, этим авторам удавалось обнаружить АРСазы в ядрах лишь после обработки детергентами, которая могла приводить к частичному вымыванию метки, связанной с диффузным хроматином и ее перераспределению внутри клетки. Так, в экспериментах Палей метка концентрировалась по периферии ядра, где находится компактный хроматин, тогда как наши

данные показывают, что ТгрРС в области компактного хроматина отсутствует и сосредоточена в основном в районах диффузного хроматина.

В эукариотических клетках районы диффузного хроматина связаны с такими процессами, как транскрипция, процессинг, транспорт РНК и РНП из ядра в другие клеточные компартменты. Возможно, что присутствие ТгрРС в ядрах млекопитающих связано с дополнительными функциями, которые этот фермент выполняет в клетках эукариот. Косвенным свидетельством в пользу этого предположения могут быть данные о существовании в клетке комплекса между ТгрРС и полимеразой а [Rapaport et al., 1981]. Мы уже отмечали, что хотя в прокариотиче-ских клетках ТгрРС отсутствует в зоне нуклеоида, некоторая часть фермента локализуется в участках цитоплазмы, прилегающих к нуклео-иду, где идут активные процессы транскрипции. Таким образом, мы предполагаем, что локализация бактериальной ТгрРС в пограничной зоне между нуклеоидом и цитоплазмой соответствует присутствию ТгрРС в области эухроматина ядер клеток высших эукариот.

Совпадение результатов при использовании поликлональных антител, одноступенчатого и двуступенчатого маркирования моноклональ-ными антителами и отсутствие специфического мечения в контрольных экспериментах подтверждает, что наблюдаемое распределение ТгрРС соответствует внутриклеточной локализации этого фермента in vivo.

Выявленное распределение ТгрРС характерно как для клеток разных тканей одного вида, так-, и для клеток различных видов млекопитающих и, видимо, является типичным для высших эукариот.

Таким образом, хотя в гомогенатах клеток животных ТгрРС была обнаружена только в форме цитозольного фермента, в интактных клетках млекопитающих распределение ТгрРС компартментализовано.

ИММУНОЭЛЕХТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО АМИНОАЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗНОГО КОМПЛЕКСА В КЛЕТКАХ ВНСШИХ ЭУКАРИОТ

В клетках высших эукариот АРСазы формируют мультиферментные комплексы, одной из гипотетических функций которых является их участие в компартментализации синтетаз. В связи с этим одной из задач представленной работы было изучение внутриклеточного распределения компонентов мультиферментного комплекса и сравнение его с локализацией свободной цитоплазматической ТгрРС.

Мы изучали локализацию прочно связанной с мультиферментным комплексом 01иРгоРС, слабо ассоциированной с комплексом А^РС, а а также несинтетазных компонентов комплекса, функциональное значение которых неизвестно - полипептидов р38 и р43.

Локализацию компонентов мультиферментного комплекса мы проводили на ультратонких срезах культуры клеток эпителия почки кролика ЙК-1 с помощью комплексов специфических НКАТ и белка А с коллоидным золотом (Рис.3,6,в). Мы использовали пять клонов антител, специфичных к А^РС (И и Р31), 01иРгоРС (Р8 ), полипептидам р38 (Р12) и р43 (Р6). На иммуноблоттинге каждое из МКАТ узнает единственный полипептид, идентифицированный как соответствующий фермент [Р11 о— пепко е1 а1, 1991]. Контрольные эксперименты подтвердили высокую специфичность связывания комплексов МКАТ-коллоидное золото с соответствующими антигенами на УТ срезах.

Статистическая обработка распределения метки на УТ срезах показала, что относительные количества и относительные концентрации А^РС, 01иРгоРС и р38 в клеточных органеллах и компартментах оказались сходными (Рис.4). Метка сосредоточена в основном в цитоплазме (76 - 89 % от общего количества метки) в зонах расположения рибосом (46-54%) (Табл.И). Плотность метки в рибосомных областях

цитоплазмы составляет 8-18 частиц на мкм .

Участки с комплексом Гольджи и микрофиламентами практически не метятся. При анализе микрофотографий мы не могли с достаточной точностью идентифицировать микрофиламенты, находящиеся в районах цитоплазмы, обогащенных рибосомами и кластерами полисом. Однако в тех участках цитоплазмы, где расположены только микрофиламенты и элементы цитоскелета, мы не обнаружили АРСаз. Данные Миранда об ассоциации значительной части находящегося в клетке мультифермент-ного комплекса с сетью цитоскелета [1985] можно объяснить перераспределением комплекса между фрагментами клеточных органелл после разрушения ультраструктуры клетки детергентами.

Довольно большое количество частиц золота (5 - 8 % от общего количества метки) содержится в митохондриях ( Табл.11 ). Плотность метки в митохондриях по отношению к цитоплазме равна 75 - 90 % для ArgPC и 45 - 65 % для GluProPC и р38 ( Рис.4 ). Поскольку МКАТ F7, F31 к ArgPC и F8 к GluProPC обладают высокой видоспецифичностью, [ Filonenko et аI, 1991 ], можно предположить, что соответствующие митохондриальные АРСазы идентичны или очень близки цитоплазматиче-ским ферментам и, вероятно, могут кодироваться одними и теми же генами, что установлено для некоторых синтетаз дрожжей [Chat ton et al., 1988]. Детальное изучение распределения метки в митохондриях показало, что в пределах одной клетки плотность метки в разных митохондриях может колебаться от нуля до значения, равного или даже превышающего среднецитоплазматическое ( Рис.5 ). Вероятно, наблюдаемые колебания количества АРСаз в митохондриях отражают различное функциональное состояние этих органелл.

ArgPC, GluProPC и р38 были также обнаружены в ядрах (Рис.3, б, в), где плотность метки составляет 30-45 % от цитоплазматичес-кого уровня для ArgPC и GluProPC и 25% для р38 (Рис.4).

Статистический анализ распределения АРСаз комплекса в ядре озволил выделить три участка их локализации 1) непосредственно бласть деконденсированного хроматина и/или ядерного матрикса; ) граница между компактным и диффузным хроматином; 3) интерхрома-иновые гранулы.

Некоторое количество метки содержится в ядрышке, плотность етки в нем составляет 50-65 % от плотности метки в диффузном хро-атине для ArgPC и 80% - для GluProPC (Рис.4)

Мы уже обсуждали возможную роль ТгрРС в ядре. Другие АРСазы акже проявляют некоторые неканонические функции, например, AlaPC епосредственно взаимодействует с ДНК, регулируя транскрипцию соб-твенного гена [ Putney et а 1., 1981 ], митохондриальные ТугРС и еиРС дрожжей участвуют в сплайсинге [ Lambowitz, 1990], человечес-

ая GluProPC связывается со своей мРНК [Schray et al, 1991]. Можно

Уровень летки в шггозсондриях (частиц/кв.ики)

Рис.5. Гистограмма распределения ArgPC в митохондриях

предположить, что локализация ЛРСаз мультиферментного комплекса в области диффузного хроматина и на границе компактного и диффузного хроматина может отражать регуляторную роль АРСаз, связанную с активацией-деактивацией хроматина, участием в транскрипции, сплайсинге и т.п.

Другие участки ядра, где концентрируются АРСазы - скопления интерхроматиновых гранул размером ~ 25 нм. Плотность метки над ними в 3.5 раза превышает плотность частиц золота над эухроматином и сравнима со средней плотностью метки в цитоплазме, а иногда и превышает ее. Функциональное значение локализации АРСаз в этих участках пока не ясно. Цитохимические данные свидетельствуют о рибонуклепротеидной природе гранул [Риу1оп е1 а1, 1984]. Известно, что почти все эукариотические АРСазы проявляют афинность к высокомолекулярным РНК [А^Ьапоуа, 1980]. Возможно, за счет способности АРСаз взаимодействовать с РНК и осушествляется ассоциация этих ферментов с интерхроматиновыми гранулами, однако это вопрос требует дальнейшего изучения.

Неизвестно, в каком виде в ядре существуют АРСазы входящие в состав высокомолекулярного комплекса: либо эти ферменты, могут выходить из ассоциата и переходить в ядро как индивидуальною белки либо мультиферментные комплексы присутвуют не только в цитоплазме но и в ядре.

Неожиданные результаты получены по локализации в клетке другого несинтетазного компонента мультиферментного комплекса- полипептида р43. Его распределение резко отличается от распределения А^РС, й1иРгоРС и р38 прежде всего тем, что р43 концентрируется в ядре, в области диффузного хроматина ( Рис.б, Таб. II ), плотность метки в этих районах в 5 раз превышает плотность метки в цитоплазме . Для митохондрий и ядрышек характерен невысокий уровень содер-

И

10

12

О

2

С

-1

8

Цнгопгтаама Митохондрии Ядрышко Ксмп.хром. Дифф.хром. Ш Г8-Аи15 ИЗ Г6-Аи15 + МК СП Гв * рА-*и15 ЕЯ рА-Ач15

Рис.6. Гистограмма распределения р43 в клетках 11К-1.

кания белка р43. Такие результаты были получены как при использовании комплексов моноклональных антител Б6 к р43, так и при последовательной обработке срезов МКАТ Б6, а затем комплексами рА-Аи15 ' Рис.б ). Локализация р43 в ядре может служить свидетельством в тользу его самостоятельной, не связанной с аминоацил-тРНК синчета-эами роли во внутриядерных процессах. Очевидно, р43 находится не только в составе мультиферментного комплекса, где, возможно играет >оль в ассоциации АРСаз в функциональную глобулу, но и содержится ! ядре, где он может быть адапторным или регуляторным белком, вов-1еченным в процессы регуляции синтеза ДНК, транскрипции, процес-:инга и т.п. К сожалению, нет биохимических данных, касающихся »аспределения р43 между различными клеточными фракциями. Поэтому [ля выдвижения определенных предположений о возможной роли р43 в :летке необходимо его выделение, в частности, из ядра и дальнейшее

изучение.

В заключение подчеркнем, что в наших экспериментах продемонстрировано ярко выраженное сходство внутриклеточной локализации АРСаз мультиферментного комплекса и ТгрРС (Рис.3, 4, табл.II). Как отмечалось выше, биохимическими методами в клеточных лизатах ТгрРС была обнаружена исключительно в свободной форме, тогда как активность GluPro выявляли только в составе мультиферментного комплекса, а активность ArgPC распределялась пополам между свободной ци-тозольной и ассоциированной с комплексом формами фермента [Mírande 1991]. Совпадение внутриклеточного распределения ТгрРС и АРСаз комплекса позволяет предположить, что ТгрРС in vivo ассоциирована с мультифермектным комплексом, а при разрушении клеток легко от него отделяется. Таким образом, наши результаты свидетельствуют в пользу мультиферментной структуры большинства АРСаз, а может быть и всех, в интактных клетках.

ВЫВОДЫ

1. С помощью метода маркирования белков на ультратонких срезах комплексами специфических антител и белка А с коллоидным золотом была изучена внутриклеточная локализация аминоацил- тРНК синтетаз. Для получения количественных данных о распределении АРСаз нами был разработан метод статистической обработку экспериментальных элект-ронномикроскопических данных. Предложенный метод имеет универсальный характер и может успешно применяться для тонкого картирования различных макромолекул.

2. Проведено сравнительное изучение локализации свободной не ассоциированной с мультиферментным синтетазным комплексом трипто-фанил - тРНК синтетазы ( ТгрРС, КФ 6.1.1.2 ) в клетках эубактерий (Б.col i ) и архебактерий (M: haîophilus ). Показано, что распределение ТгрРС в бактериальных и архебактериальных клетках практически

ювпадает. Характерным является отсутствие ТгрРС в области прока-зиотического нуклеоида и концентрация фермента в цитоплазме и уча-:тках цитоплазмы, граничащих с нуклеоидом.

3. Изучено распределение ТгрРС в разных типах клеток млекопй-гающих. Установлено, что фермент в основном локализуется в рибо-:омных зонах цитоплазмы, в митохондриях и в ядре - в районах диффузного хроматина, на границе диффузного и компактного хроматина

I в участках расположения интерхроматиновых гранул. В области ком-гактного хроматина ТгрРС практически отсутствует. Таким образом, готя в гомогенатах клеток животных триптофанил-тРПК синтетаза была )бнаружена только в форме растворимого цитозольного фермента, в ттактных клетках млекопитающих ТгрРС ассоциирована с определенны-ш клеточными компаргментами и ор^анеллами.

4. Изучена локализация в клетках эпителия почек кролика АРСаз 1ультиферментного комплекса: слабо ассоциированной с комплексом фгинил-тРНК синтетазы (А^РС, КФ 6.1.1.19) и прочно связанной с юмплексом глутамил-пролил-тРНК синтетазы (01ц-РгоРС, КФ 6.1.1.17). [оказано, что распределение синтетаз мультиферментного комплекса и [е ассоциированной с комплексом ТгрРС практически совпадает, Полу-:енные результаты свидетельствуют в пользу мультиферментной приро-Ы всех изученных синтетаз в интактных клетках.

5. Исследовано распределение в клетках эпителия почек кролика вух несинтетазных компонентов мультиферментного комплекса - поли-ептидов с молекулярными массами 38 и 43 кДа. Показано, что олипептид р38 имеет такое же распределение в клетке, что и все сследованные синтетазы, в то время как полипептид р43 распределятся отличным от синтетаз образом.

6. Локализация прокариотических ТгрРС в пограничной зоне межу нуклеоидом и цитоплазмой соответствует содержанию ТгрРС в обла-

сти эухроматика ядер клеток высших эукариот. Обнаружение АРСаз в определенных участках клеточного ядра может быть связано с неканоническими функциями синтетаз ( регуляция собственной транскрипции, сплайсинг РНК, транспорт тРНК из ядра в цитоплазму в форме тРНК-синтетазного комплекса).

Список публикаций по теме диссертации.

1. Попенко В.В., Н.Черни, Ю.Л.Иванова, С.Берестень, В.В. Филоненкс йммуноэлектронномикроскопическое определение локализации триптофа-нил тРНК синтетазы в клетках эубактерии Escherichia со 1i и архе-бактерии Methanococcus halophilus. Мол. Биол. 26(1), 83-92 (1992),

2. Popenko V.I., J.L.Ivanova, N.Cherny, V.Filonenko, S.F. Berestei L.L.Kisselev. Immunoelectron microscopic localization of differeni aminoacyl-tRNA synthetases in mammalian cells. Proc. of the lOtl European Congress on Electron Microscopy. Granada. 3, 197—195 (1992).

3. Попенко В.И., Черни Н.Е., Иванова Ю.Л. Использование иммунокол-лоидного золота для изучения внутриклеточной локализации макромолекул на примере аыипоацил - тРНК синтетаз. XIV Конференция ш электронной микроскопии, Черноголовка, 13 (1992).

4. Popenko V.I., N.Cherny, J.L.Ivanova, V.Filonenko, L.L.Kisse1ev Immunoelectron microscopic location of tryptophany1-tRNA synthetase in mammalian, procariotic and archaebacterial cells. Eur.J.Cel Biol. 62(2), 248-258 (1993).

5. Иванова Ю.Л., II.Черни, Б.И.Попенко, Б.Филоненко, О.Г. Вартанян Сравнительное изучение локализации триптофанил-тРНК синтетазы компонентов высокомолекулярного аминоацил-тРНК синтетазного комп лекса в животных клетках. Мол. Биол. 27(3), 666-684 (1993).

6. Popenko V.I., J.L.Ivanova, N.Cherny, V.Filonenko, S.F.Beresten