Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дослiдження конформацiйноi рухливостi еукарiотичноi тирозил-тРНК синтетази у розчинi методом флуоресцентноi спектроскопii

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Дослiдження конформацiйноi рухливостi еукарiотичноi тирозил-тРНК синтетази у розчинi методом флуоресцентноi спектроскопii"

ШЖГАЛУЗЕШЙ НАУКОВО - ИИЕНЕРНИЙ ЦЕНТР 3 ЖИВОГО I ШКРОХВИЛЬОВО! РЕЗОНАНСНО! ТЕРАПИ ПРИ КАБ1НЕТ1 ШН1СТР1В УКРА11Ш

Ф13ИКИ "В1ДГУК"

На правах руиопнсу

Клименко 1лона В1ктор1вна

ДОСЛ1ДДЕННЯ К01 йОРМАЦ 1ЙН01 РУХЛИВОСТ1 ЕУКАРЮТИЧН01 ТИРОЙИЛ-тРНК СИНТЕТАЗИ У РОЗЧШН МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНО! СПЕКТРОСКОП! I

Спец1альн1сть 03.00.02 - 01оф1зика

Автореферат на здобуття наукового ступеия кандидата фХвико-ыатематичних наук

Ки1в - 1994

Робота виконана у в1дд1л1 структури 1 функц11 нукле!нових кислот 1нституту молекулярно'1 61ологП 1 генетики АН Укра'1ни.

Науков! кер!вники:

кандидат ф1зико-математичних наук,

доцент Г.С.Литвинов;

кандидат б!олог1чних наук О.I.Корнелюк.

0ф1ц1йн1. опоненти:

доктор б1олог1чних наук, професор С.М.Храпунов; доктор ф1аико-математичних наук., професор В.В.Обуховський.

Иров1дна установа: 1нститут ф1зики АН Укра'1ни

Захист в1дбудеться " <Р " 1994 року о ^ ^годин!

на зас1данн1 спец1ал1зовано1 ради для. захисту докторських дисертац1й Д 173. 01. 01. у М1жгалуэевому науково-1нженерному центр! "В1дгук" при Каб1нет1 м1Шстр1в Укра1ни за адресогаг

252601, м.Ки!в-17, вул. Володимирська, 61-6.

3 дисертац!ею можна овнайомитися у б1бл1отец! М1жгалузевого науково-1нжеиерного центру "В1дгук" при Каб1нет1 м!н1стр1в УгсраХш,

■ Автореферат роз!сланий 1994 року

Вчений секретар ■спец1ал180ван01 ради

Г.С.Литвинов

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуалыисть проблеыи. Одиею з актуальних проблем сучас-но! ф1зики живого е вивчення дииам!ки .б1лкових макромолекул. Ло них належать, зокрема фермента ам1ноацил-тРНК синтетази, що катал1зують специф1чне утворення ам!ноацил-тРНК, як! в свою чергу детерм!нують процес зборки б!лкових молекул на рибосомах /Кисельов Л.Л. 1 сШвавт., 1984/. Механ!зм функц!онування ам1-ноацил-тРНК синтетаз, що забезпечують молекулярне п!знаьання 1 пов'язану з ним високоточну реал!зац1ю генетично! 1нформац11 в процес1 б1осинтезу б1лка, залишаеться ще й дос1 повн1стю не визначеним. Тепер проблема досл!джень Шзнавання ам!ноа-цил-тРНК синтетазами гомолог!чних тРНК мае два осиовних аспек-ти: визначення д!лянок контакту транспортнсп рибонуклепгово! кислоти (тРНК) 1 ам!ноацил-тРНК синтетаз (АРСаз) 1 встановлен-ня структурних детерм1нант, що забезпечують тане п1знавання; вивчення конформац1йних зм!н в АРСазах 1 тРНК в процес! !х взаимного п1знавання.

Сл1д п!дкреслити, що саме друга стад!я процесу п1знавання тРНК АРСазами - взаемна конформац!йна тдстройка синтетази 1 гомолог!чно1 тРНК - забезпечуе високу специф!чн!сть реакцП ам1ноацилювання. Зг!дио з сучасними уявленнями: /Блюменфельд . Л. А. , 1982/ функц!оналыи властивост1 ферменпв можуть бути адекватно описан! з точки зору !х динамжи в розчин!. Мехшазм д1'1 фермент!в'визначаеться IX здатн!стю до флуктуащй конфор-мацП макромолекули, скоректованих у часи /СагеП в.', 1974/. Отже, для розум!ння ! побудови механ1зму функщонування АРСаз необх!дн! вивчення 1 опис 1х динам!чних властивостей у розчи-Ш. Розробка ц!е1 проблем« особливо актуальна для АРСаз вищих еукар!от, у котрих осташи схож! за сво'Кш структурою Д влас-тивостями з АРСазами людського срган1зму.

Мета 1 завдання роботи. Мета роботи полагала у вивченн! конформацШки рухливост! 1 флуктуацШ макромолекули тиро-зил-тРНК синтетази на модел! ферменту з печшки бика в розчши у вхлыюму стан1 1 при зв'язуванн! р1зних л!ганд!в. Основн! завдання роботи:

1. Дослг'дити параметри снектр1в флуоресценцП тирознл-тРНК синтетази в розчин!. Визначнти, якими ароматичними ашнокис-: летними запишками спричинена флуоресцетця молекули синтетази, число 1 локалхзацш хромофоров у б!лкоп!й матриц!.

г. Вивчити внутр1Шньомолекулярну рухлив!сть масрошлекули ферменту методом температурного динамшюго гас!ння флуорес-цэнцП. Визначити enepri'i активацп i ф!зичн1 процеси регуля-цП досл!джуваного пвища.

3. Досл1дити конформац1йну рухливгсть тирозил-тРНК синте-тази, 'ii часов! I просторов! характеристики методом racimm флуоресценцП пнзькомолекулярними зарядженими i нейтральними гасниками.

4. 0ц1нити ампл!туду конформа1Дйних флуктуацШ макромоле-кули тирозил-тРНК синтетази за характеристиками безвипром1ню-валыгаго переносу енергП збудження мш триптофановими аалиш-!сами ферменту i флуоресцентною'м1ткою - пиридоксаль-5'-фосфат, розташовано! в активному центр1 синтетази.

5. Визначити конформацШй зм1ни структури бшсово! матрица ферменту при взаемодП з специф1чними для нього субстратами (АТР, тирозин, тирозиладеШлат i тРНК), використовуючи характеристик безвипром1нювалыюго переносу енергП збудження м!ж триптофановими залишками ферменту i флуоресцентним зондом - N Щйодацетил)ам1но] етил.]-5-нафтилам1но-1-сульфокислота, введении у б!лкову матрицю.

, Основн! положения, то винесен! до захисту:

1. Флуоресценц1п тирозил-тРНК синтетази обумовлена в основному триптофановими залишками. Одну з двох компонент спектру вииром1нювання ферменту забезпечують внутр1шньоглобуляр!П триптофанили, а другу - ексгюнован! до розчинника триптофанов! залишки, розташван! в поверхневих шарах б1лково! матриц!.

2. Для тирозил-тРНК синтетази характерн1 швидка конформагЦйна рухливгсть, яка залетать в1д дифузШшх властивостей розчинника i мае низьк! enepri'i активацП.

'3. Взаемод1я тирозил-тРНК синтетази з гомологччними субстратами супроводжуеться конформаЩшшми змшами структури ферменту i посиленням ефективност! переносу enepri'i збудження. в1д запиши в триптофану до флуоресцентного зонду.

Наукова новизна i практична цпписть роботи. Вперше проведено детгшьшм aimis cneKTpiB власно! флуоресценцП eyi-capio-

о о

тично1 тирозил-тРНК синтетази у розчши 1 виявлено, що внесок в спектр флуоресценцП при збудженн! на довжин! хеши 296 нм роблять триптофанов! залншки. При збудженн! на довжин! хвил! 280 нм максимум спектру флуоресценцП зсуваеться на 3 нм в ко-роткохвильову д1лянку завдяки флуоресценцП тирозину, яка с!сладае б1ля 5 У. в1д загалыюго спектру випром!нювання.

Показана наявн!сть двох компонент в спектр! триптофаново! флуоресценцП синтетази, одна з котрих належить внутрШнъогло-булярцим триптофановим, а друга - експонованим триптофановим залишкам. Визначен! величини квантового виходу триптофаново'1 флуоресценцП, часу життя збудженого стану, поляризацП. флуо-ресценцП, ефективност1 м1грацП енергП збуджешш мхж хромофорами ферменту. Для тирозил-тРНК синтетази в розчшп. вивчен! 1 визначен! просторов! ! часов! характеристики конформац!йно! рухливост1 макромолекули у в!льному стан! ! при взаемодП в субстратами.

Результати робота марть теоретичне значения в аспект! з'-ясування механ1зм!в забезпечування виеокоточно! реал!зац!'1 ге-нетично! 1нформацП в процесах б1осинтезу б1лка.

Апробащя роботи. Матер!али допов!далися на Всесоюзной конфе^енцП по спектроскопП б!опол1мер!в (Харк1в, 1991), Все-союзн!й. координат йн1й нарад! по спектроскоп!! пол!мер!в (М!нськ, 1989), Всесоюзнш нарад! "Люмшесцентний анал!з в медицин! !. б!ологП та його апаратурне забезпечення" (Москва, 1992), М!жнародному "симпоз!ум! по оптичн!й спектроскоп!! (Н!-меччина, Ньюбрандербург, 1990), 22-1Й М1жнародн!й конференцп ФЕБС (ШвеЩя, Стокгольм, 1993), КИжнароднш робоч!й нарад1 по тРНК (Франщя, Кап Дат, 1993), а також на сем!нарах в!дд1л!в Пютитуту ф!зики АН Укра!ни та 1нституту молекулярно! б1ологП ! генетики АН Укра!'ни.

Публ!кацГь Основн! результати роботи викладен1 в 10 пуб-л1кац!ях, у тому числи 4 статтях у в!тчизня!шх журналах ьб тезах допов1дей Всесоюзних ! М1жнародних конфереший ! симпоз!-ум!в. .

Структура ! обсаг_дисертацП. ДисертаЩя обсягом /<~

сториюк машинописного тексту м!стить вступ, огляд л1тератури.

матер!али 1 методи дослдо.ень, результат« i 'ix обговорення, висновки, список л1тератури i список авторських роб!т. Дисер-тащл 1люстрована т? таблицами i £ 6 малюнками. Список л1тератури на / У* cTopiHKax включаёГ" / У О найменувань.

ОСНОВНИЙ 3MICT ДИСЕРТАЦП

У nepmift глав! подано огляд л!тератури з теми досл1джень. 3 нього випливае, то флуоресцентна спектроскоп!я дозволяе одержати ун!кальну !нформац!ю про структурний стан власних хромофор1в бiлкa - залишк1в тирозину i триптофану, як! е при-родними репортерннми трупами у б!лкових макромолекулах. Вико-ристання конкретних парометр!в флуоресценцП ( квантовий ви-к!д, положения ! форма спектр1в) дае можлив1сть вивчити поляр-н1сть оточення хромофор!в, релаксацШ1у рухлив!сть в локальних д!лянках структури, наявн1сть гасячих груп тощо.

В1дм!чаеться, що параметри власно! флуоресценцП б!лк1в суттево змпюються при Ix взаемод!! з р1зними л!гандами, нап-риклад, при утворенн! фермент-субстратних комплекс1в. Разом з тим анал!з даних л1тератури ноказуе, що ! до тепер те не проводилось детальне досл!джения'зв'язку параметр!в флуоресценцП i динам1чних властивостей АРСаз. Досл!дження флуоресценцП в цьому напрямку обмежувалися головним чином втЛрюванням кривих п raciinm при зв'язуванн! субстрат!в ! визначенням параметр!в останнього.

У друг!й глав! описан! матер!али i методи досл!джень.

В робот! використовували препарати функц!онально активно'! тирозил-тРНК синтетаэи з печ1нки бика. Бона е д!ыером «2- типу ! мае молекулярну масу 2 х (59.0 ± !.5) кЦа. Bei процедури по Ещцлеш® ферменту проводили при температур1 +4 °С в присут-nocTi двох inriöiTopiB протеаз - фен1лметилсульфон1лфторида I ди1зопроп1лфторфосфата. Схема вщЦлення детально описана в ро~ 6oTi Корнелюка 0.1. ! сп!вавт./ 1088/. Чистота препарат!в ферменту асладана за даними анал!тичного гель-електрофорезу в по-л1акриламшюму гел! в присутност! 0.1 % розчину додецилсуль-фат-у натргя не менше 92 Z. Флуоресцентну спектрофотометр!ю препарат1в тирозпл-тРНК синтегази проводили в • розчин1 ка-

л1й-фосфатного буферу, pH 7.5, ир м1стив Н.З мМ MgClg, 0.2 мМ дигЮтре1голу, 10 % гл!церину.

Препарати тРНКТуг одержуваш з тканини печ1нки бика шляхом посл1довно'1 хроматограф Ii на BD-целюлоз! при pH 4.5 (в присут-HocTi 10 мМ MgCl2) 1 pH 4.5 (за в1дсутност1 MgCl2), питома ак-тивнЮть складала 900 гпкоМоль [14С]-тирозину на одиницю Агео. Використовували також преперати тРНКТуг з E.coli ("Boehringer Mannheim", Н!меччина).

В роботi використан!: флуоресцентна спектроскоп1я,динам1ч-не гас1ння флуоресценцП низькомолекулярними гасниками 1 влас-ними угрупуваннями б1лково1 матриц!, поляризацП флуоресценцП , характеристики безвипром!нювального переносу енергП збудження. м1ж донором 1 акцептором, спектроскоп!я поглинання в УФ 1 видимому д1апазон1. Спектри збудження, емЮП, ступени поляризацП .часу життя збудженого ■ стану рееструвались на спектрофлуориметрах "Hitachi Model 850" (Япон1я) i "SLM-4800" (ClUA). Спектрофотометр1ю у видимому 1 УФ д1апазонах проводили на спектрофотометр! "Specord UV-VIS" (Шмеччина). У Bcix вим!-рах проводили ;корекц1ю на спектральну. чутлив!сть приладу. Час життя визначали' на фазово-модуляЩйному спектрофлуориметр! "SLM-'480Q" (США) при частот! модуляцП 30 МГц зг!дно з Лакович Дж./' 1986/. • ■ •

Bei флуоресцентн1 вим!ри проводили в кварцевих прямокутних мШрокюветах 0.5 х 0.5 см у термостатованому кюветотримач!. Температуру визначали хром1ль-алюм1льовою термопарою з точн!с-тю ± 0.1 °С.

При BHMipax 1нтенсивностей флуоресценцП ••враховувались в1-дом! оптичн1 ефекти екранування i реабсорбцП, як1 спричиняють похибки при таких досл1дженнях /Паркер С., 1972/.

3MicT третьо! глади становлять результати досл!джень i 'ix обговорення.

1. Парзыетри флуоресценцП макромолекули еукарютично! ти-розил-гРНК синтетази.

BHMipHHi спектри флуоресценцП макромолекули тирозил-тРПК синтетази при довжинах хвиль збудження 280 i 296 нм. Показано, що флуоресценщя синтетази обумовлена випроманюванням як тиро-

2*

5

зинових, так i триптофанових залишк!в при збудженн! в максимум! спектра поглинання (280 нм).При абудженнг на довжик! хвил! 296 нм в спектр! флуоресценцП ферменту ирисутня ильки трип-тофанова компонента. Р1зниця в положенн! максимум!в спектр!в при збудженн! на 280 i 296 нм обумовлена присутн!стю тирозино-Bo'í флуоресценцП,. яка становить б!ля 5 X в!д загального спектру випром!нювання [2].

Розрахован! нами на основ! експериментальних даних пара-метри власно! флуоресценцП молекули ферменту представлен! в табл.i.

Таблица 1. Иараметри власно! флуоресценцП тирозил-тРНКсинте-тази з печ!нки бика при Т-20 °С при збуджени! флуоресценцП на довжинах хвиль 280 i 296 нм.

Довжина хвил! збудження

Параметр Лех-280 нм Аех=296 нм

Положения максимуму ,

спектра Ат ,нм 335 ± 1 338 ± 1

Ширина спектру Дх.нм 56 ± 1 55 ± 1

Квантовий вихгд.д 0.24Ю.01 0.85±0.01

Ефективн!сть перено-

су енергП триптофан-

тирозин 0.85 i 0.10 --

2. Визначешш к!лькост! триптофанових залишкгв 1 Чх лока-л1_зацП в молекул! тирозил-тРНК синтетази.

Оск!льки„фдуоресценц!я ферменту обумовлена практично трип-тофановими аалишками, то доц!льним було внзначити Шльк1сть хромофор!в . 1 íx локач!зац!ю в б!Дков1й матриц!. К!льк!сть триптофанових залишк1в Еизиачали зг!дно методу /Pajot Р., 1976/. Виявилося, то у молекул! ферменту м!ститься 6 а 0.9 тринтофапогшх валишгЛс на одну субодшицю 123.

Норяд з пагашюю к1льк!стю флуоресцшючих центр!в !ншою

О

характеристикою макромолекула е 'ix локал1зац!я в б!лков!и глобул!. Для визначецня локал1зацП хромофор!в (триптофанових за-лишк!в) в молекул! ферменту проведено розкладання спектр!в триптофаново! флуоресценц1! по log-нормальних кривих методом найменших квадрат!в за алгоритмом, разробленим /Аборнев С.М., Бурштейн Е.А., 1992/. Цей алгоритм передбачае використання ряду регуляризуючих фактор1в: наб1р спектргв флуоресценцП, ви-М1ряних в присутност! гасник1в; в функц!онал м!н!м!зацП включений член, залежний в1д виконання закону Штерна-Фольмера; ма-сив експериментальних точок в розрахунку значно перевищув число шуканих параметргв. Виявилося, що спектри випром!нювання ферменту, розкладен! за даним алгоритмом на дв1 компонента, належать класам внутр1шньоглобулярним i експонованим триптофанових задишкам (у випадку raciHim KI 1 акрилам!дом). Положения максимум!в спектр!в випром1нювання цих кдас1в хромофор!в в1д-пов!дають довжинам хвиль 330 ±11 344 ± 1 нм. При цьому значения однаков1 для ёкспериментального набору спектр1в, вим!ря-них' в присутност! як KI, так ! акрилам1ду.

Таким чином, флуоресвдююч! центри, розташован! усередин1 i зовн! б!лково1 •макромолекули, е природними флуоресцентними м!тками в структур! тирозил-тРНК синтетайи, що дозволяють вив-чати внутршньомолекулярну динам1ку ферменту.

3. Внутр!шньомолекулярна динашка макромолекули тиро-зил-тРНК синтетази, що рееструвться по температурному гас!нню триптофаново! флуоресценц!i.

В!домо, що в б!лкових молекулах м1стяться групи атом!в, KOTpi гасять флуоресценцию хромофор!в при найближчому контакт! з ними. Власними гасникаш флуоресценц!'! б!омакромолекул е: тарбонильна група пептидного зв'язку, боков! радикали, кшцев! карбонильна i ам!ногрупи.та 1м!дазол Пстидину /Бурштейн Е.А., 1976/. Для динам1чного гас!ння необхшш певна рухлив!сть ото-чення хромофор!в.

1ндуковане температурою гас1ння флуоресценцП тирозил-тРНК. синтетазою було вивчено шляхом вим!ру параметр!в флуоресценц!I ферменту в д!апазон! + 18 - + 75 °0 [2,10]. Температурка за-лежк!сть положения максимуму спектру флуоресценц!! показуе, що

-501,8

7

в межах температур до +- 40 °С збер1газться нативна конформащя б!лка, тобто структура синтетази е стаСпльною, про що св1дчить незм1нн1сть положения максимуму спектру в цьому температурному лнтервал1. В д1апазон1 температур + 40 - + 50 °С спостер1га-еться зрушення максимуму на 3 нм в довгохвильову д1лянку. Ви-користовуючи дан1 про температурну залежн!сть максимуму спектру випромгнювання тйрозил-тРНК синтетези при збуджеши на хви-лях 280 i 296 нм i вважаючи, що спектрально зм1ни в 1нтервал1 +■ 20 - + 50 °С визначаються диполыюю реор!ентац1йною релакса-щею оточення триптофанових залишк1в у фермент1, були визначе-Hi часи дипольно! ор1ен'гацШю1 релаксацп в даному температурному 1нтервал1. При цьому кьрисгувались в1дпов1дним р!внян-ням з роботи /Демченко О.П., . 1986/. Розраховап! часи релакса-цП бм1нюються в межах 7 - 12 не в д1апазоьп температур + 20 -+■ 50 °С. JlinifiiiicTb залежност! часу релаксацП вхд температури в координатах Appeulyca св!дчить про активащйиий характер ди-польно-ор1ентац1йно1 рухливост! оточення триптофанових залиш-к1в в молекул! синтетази. Величина енерги асгивацН,. ощнена за тангенсом' кута нахилу прямо!, становить 14 ± 3 кДж/моль.

При встановленн! залежност! квантового виходу в1д температури як AppeniycoBCbKo'i, була визначена енерпя активацП ripo-цесу гасИшя флуоресценцП, що становила 21 ± 4 кДж/моль. Представлпючи температурну залежн1сть квантового виходу в координатах 1/q - а 4 b Т/ц /Бурштейн Е.А. i сп1вавт., 1978/, ми припускали, що динамжа бглкових груп, враковуючи i внутр1пш1, залежить В1Д коефф!ц1ента дифузП розчинника, i тому квантовий вихц б!лка пропоршйний Т/n (п - в'.язк1сть розчинника). Отри-ман1 нами KpiiBi ,л»пйн1 в межах температур до f 40°С (тут збе-р1гаеться нативна конФормавдя б1лка, нема спектральних зрушень спектру флуоресцешц i). Б1дхилення в1д лйЦйност! при температурах, еищих за + 40 °С, пов'язане, очевидно, з зб1льшенням температурно-1ндуковано1' рухливосп окремих частин (ялково! молекули i числа ixcryneniB свободи, що приводить до денату-рацП б1лково1 глобули. У випадку переходу б!лка з нативно! конформацП в депатуровану необхШи велигл енерг.П активапП (десятки кДж/моль) для розриву сил внутрпаньомолекулярних сза-

емодш, як! стабШзують глобулярну структуру ферменту. Ц1 процеси носять переважно активац!йних характер.

Отже, результат!! наших дослдаень показали [2,103, що для внутр1шньомолекулярно1 рухливостг тирозил-тРНК синтетази при температур! до + 40 °С характеры! низьк! eHepri'i активацП ! опосередкована регуляц1я дифуз!йними характеристиками розчин-ника C2,10h Це справедливо як для поверхневих, так i для внутр!шн1х д!лянок макромолекули.

4. Конформац1йна рухлив!сть тирозил-тРНК синтетази, що ре-еструвться методом гас!ння флуоресценцп низькомолеку-лярними гасниками.

Нами показано незначне зменшення iHTencHBiiocTi флуоресцен-ц!! при додаванн! в быковий зразок йодиду [1]. Це . дозволяе припустити. що йодид контактуе тШки'з невеликою частиною триптофанових запишк!в, розташованих на поверхн1 молекули ти-розил-тРНК синтетази, а основна частина триптофаншив м1стить-ся усередмй öUkoboi матриц! i для йодиду недоступна.

' Експериментальн! залежност1 !нтенсивност! флуоресценцП синтетази вгд концентрацп акрил.ам!ду мають характерн! особли-вост! згткнювального механ!зму гас!ння флуоресценцП [7,8]. ЛШййсть граф!ка в координатах Лерера св1дчить про те, що за достугапстю акрилашду в тирозил-тРНК синтетаз! можуть бути вщцлен! два типи триптофанових залишк!в - доступн! i повн!стю недоступн!. Результата розрахушив параметр1в гаспшя флуорес-ценцП молекули ферменту акрилаШдом за р1внянням Лерера /Lehrer S.S., 1971/ наведен! в табл.2.

Одержан! наш значения [1,7,8] константи гасйшя (13.2 (моль/л)-1) значно менял в!д таких для вШного триптофану у вод! (18.0 (моль/л)-1 /Lehrer S.S., 1971/).

Для з'ясування механ1зму гас!ння досл!джена залежнЮТь ефектиЕност! гасишя флуоресценцП акрилам^дом в!д в'яакост1 розчинника [1]. Останнв досягалось додаванням у розчин гл!це-рину з массвим вьистом - 0; 10; 2ä i 50 %. Як видно з табл.2, при збхдьшетц в'язкост1 розчшшика константа racintra зменшу-еться, а доля доступноси залишаетъся незм1шюю.

Якщо.взяти до уваги, що гагдння можливе при з!ткнешп хро-

3*

9

мофора 1 гасника, то залекк1сть ефективност! гасшш вгд в'яз-кост! розчинника, мохе означати, то доступна для гасника час-тина триптофаиил!в знакомиться в контакт! з гасником впродовж часу життя збудженого стану хромофора - близько Ю-9 с.

Разом э тим, як вже згадувалось, доля флуоресценцП по-верхневих триптофанил!в в тирозил-тРНК синтетаз! мала. Це дозволяв думати, що доступы акрилам!ду триптофанили.що забезпе-чують б!лп 74 X, сумарно! 1нтенсивност1 флуоресценцП (табл.2), очевидно, розгашоваШ усередин1 б1лково! матриц!. При цьому контакт акрш!ам1ду з триптофанилами може бути зд1йсненийч зав-днкп масштабним флуктуад!ям биково! структури, що вводять П в стан з в1дкритою 1 закритою 'порожяиною для розчинника [1].

Таблиц« 2. Заяежнють константи Штерна-Фольмера (К5У) ! в!д-носно! доступност! триптофанових запишйв тиро-вил-тРНК синтетаэи (а) для гасШш флуоресценцП акрилам!дом в1д в'язкост! розчинника.

Вм!ст В'язк^сть розчинника а

гл!церинуД п ДО1-1 Па-с м-1

0 0.895 13.2 0.74

10 1.249 10.0 0.74

25 1.805 7.5 0.74

50 6.024 4.5 Ог74

Встановлена гшежи1сть константи швидкост! б1молекулярно! реакцП гасПшя флуоресценцП триптофанових залишк!в акрилам!-Дом в!д температура в координатах Арренгуса. Ця залежн1сть л1-¡шша 1, можливо, свЦчить про те, що процес переходу бглка з одного стану в 1нший носить активашйний характер ! Шдбува-еться при енергП актнвацП 10 ± 3 кДж/моль. ЗмШа цих стаи 1 в в1дбуваяться впродоиж 10~9с ! пплинае на ефективн!сть гас!ннп флуоресценцП у глдпогндпост! а р!вняншш, запропонованим Демченко О.П./ 1908/. ' . .

Таким чином, результата досл!джень гас!ння триптофаново! флуоресценцП низькомолекулярними гасниками св1дчать про иаяв-nicTb швидко'1 (наносекунди) конформацгйно! рухливост! молекули тирозил-тРНК синтетази в розчин!, яка приводить б!лкову матри-цю в стан з в!дкритою 1 закритою порожниноп для розчикника.

5. Обертальна рухлив!сть триптофанових залишк!в в молекул! тирозил-тРНК синтетази.

Проведено дослгдження спектрально! залежностх ступени по-ляризацП (Р) флуоресценцП i часу життя збудженого стану (t) по спектру триптофаново'! флуоресценцП' тирозил-тРНК синтетази. В короткохвильовш д1лянц1 спектру випром1нювання Р максимальна i становить 0.240 (\ех=286 им) и 0,375 (Аех«300 им) на дов-жин1 хвил1 315 нм [3,9]. 1з зб1лъшенням довжини хвил! випром!-нювання спостер1гаеться монотонне зниження Р по спектру флуоресценцП i на довжин1 хвил1 380 нм мае значения 0.02 1 0.15 при Аех»286 нм i Аех=300 нм, в1дп0в!дн0.

За таких же умов спостер!гаеться, навпаки, зб1лыпення часу життя збудженого стану. Тагаш при довжши хвил1 315 нм стано-вив 2.16 ± 0.5 не, а при довжши хвил! 330 нм - 2.85 ± 0.5 не С31. ПодЮна зако1ЮМ1рн1сть повед1нки t i Р стосовно спектра флуоресценцП характерна для мультитриптсфа1ш1стячих 61лгав /Векшин М.Л., 1987/.

Для тирозил-тРНК синтетази можна внд1лити три види рухли-boctI, що деполярпзують флуоресценцш: самих валишк1в триптофану, окремих сегмент1в ферменту" з триптофанопими залишками 1 ферменту як ц1лого при його оберталыНй диффузП [3,9]. Але, враховуючи час життя збудженого стану (наносекунди), головним фактором, що приводить до деполяризацП в довгохвильов!й д1-ляш.и спектру флуоресценцП, с обертальна рухлшз1сть триптофа-

пових залш[1к1в 1 ix локального мперооточення в 6íjikobíii матрн-Ш-

Знаючи значения Р, можна визначити кут обертання триптофа-нових валишк1в за час життя збудженого стану флуоресценцП'. Папрнклад, при Р =* 0.29 при Аех«300 нм в максимум! спектру флуоресценцП, використовуючи в!дпов1дну формулу /Лакович Дж., 1980/, знахолммо, що 0 - - 27 Цей результат св1дчитг. про

досить високу обертальну рухливЮть триптофанових залшшив п1д час життя 1'х збудженого стану за умов значно! внутршньоб!лко-во1 М1кров'язкост1 тирозил-тРНК синтетази в наносекундному дг-апазон1, котра складае б!ля 0.5 Па-с [3!.

Отже, наявн1сть спектрально! неодноргдност!, зокрема, аа-лежност1 збудженого стану хромофоров, пов'язана з неоднор!д-нютю розподглу 1 локал!зацп триптофанових залишкгв в быко-в!й матриц! ферменту, а також з р!вним м1крооточенням внут-р1шньоглобулярних 1 експонованих триптофанил!в. ..

6. Локальн! конформац1йн! флуктуацП молекули тирозил-тРНК синтетази.

Амплхтуду конформац1йних флуктуац!й макромолекули тиро-зил-тРНК синтетази в розчин! вивчали з використанням характеристик безвипромпшвального переносу енерг!! збудження м1ж триптофановими залишками (донор) 1 пиридоксаль-5'-фосфатом М1-ченими залишками л1зину, розташованими в активному центр! ферменту (акцептор).

В наших дослхдах ефективнгсть переносу енергП в!д донора до акцептора, визначена зг1дно формули /51гуег 3.3., 1978/, становила близько 94 X. Величина Фьорстеровського рад1усу до-

О

сягала для ц!е! пари донор-акцептор 32 А. Удавана в!дстань м!ж

о

донором та акцептором дор1внювала 19 ± 1 А [б].

При зб1льшен1а температуря до + 40 °С ефектив!исть переносу зросла до 96 ± 2 %.. Амшптуди локальних конформавдйних флуктуац1й молекули тирозил-тРНК синтетази у розчин! оц1нювали за параметром Г з роботи Зошоду! et а1. /1934/, який е в!дно-шенням ефективност!.переносу енерг1! збудження м1ж донором 1 акцептором до квантового виходу донорно! флуоресценцп. Параметр ■ { пов'язаний з в1дношенням г/!? (г - ампл!туда флуктуаЩй акцептора навколо положения р1вноваги, I? - в встань донор-акцептор.) .

Достижения температурно! залежност1 параметра { показало, то осташий зростае на 35 ± 3 % при збмьшеши температури до I 40 °С. Якщо за початков! умови прийняти У0-2.5 А /РгашГеМег II. е*, а!., 1979/, то амшптуда флуктуац!й акцеп-

тора б1ля положения р1вноваги вар1юв в межах 0.5 - 2.8 А [63. Така конформаЩйнарухлив1сть модулюе, налевне, конформаЩйн! зм!ни при взаемодП з гомолог 1чною тРИКТуг i в процес! peaKui'i aMiноацилювання.

7. Конформацшн! зм!ии тирозил-тРНК синтетази при утвореи-Hi тирозиладеШлату та взаемодП з гомолоПчною тРИК.

Другим етапом роботи було вивчення конформацКншх зм!н ти-розил-тРНК синтетази при пзаемодП з субстратами: АТР, тирозином, промьжним продуктом тирозиладен1латом, гомолоПчною тРНКТуг. Для досл!дження таких 3MiH застосували метод резонансного переносу енергП збудження за механ!змом Фьорстера з триптофанових залишк1в На ковалентно приеднаний флуоресцентний зонд ДЕДА11С С4,5].

Зм1ни переносу енергП збудження в1д триптофанових залиш-KiB (донор) до ковалентно приеднаного АЕДАНС (акцептор) оц1ню-вали за: 1) зниженням 1нтенсивност1 i квантового виходу флуо-ресценцП донора в присутност! акцептора - ефекти гаспшя; ко-ефШенти розведення, екранування i реабсорбцП розчину ферменту були врахован!; 2) незмшйстю форми спектру випромиго-вання донора при гас1нн1; 3) вицикненням одночасно з гас1пням сенс1б1л13овано1 флуоресценцП акцептора 1 4) появою в спект-pi збудження акцептора смути донора, Штенсивн1сть котро! иро-порцигаа ефекткБНост! переносу енергП.

Ефективн1сть переносу енергП' в!д донора до акцептора (Е) дор1внювала 81 ±2 X, що визначено згадю формули /Stryer L., 1978/. Величину Фьорстеровського рад1уса (в1дстань нап1впере-носу енергП збудження (R0)) визначали за формулою /Förster Th., 1965/. Бона становила для паю! пари донор-акцептор 35 ±

О

1 А.

В подолыиих досл1дженнях залежност1 1нтенсивност1 флуо-ресценнП зв'язакого з ферментом АЕДАНС показано, що при взаемодП його з ATP L тирозином cnocTepiraeibca звичайне гасшш 30НД0В01 флуоресценцП, а саме на 27 ± 3 Z у ви-падку з тирозином 1 на 22 t 3 X при взаемодП з АТР. Однак, при взаемодП АЕДАНС-мШеного ферменту з промджним

13

продуктом - тирозиладеьилатом спостер1гаеться протилежна картина: флуоресцещдя БВ'язаного зонду р1зко Ндсилюеться ( на 34 ± 3 % ). При цьому ефективн!сть переносу енергП збудження з триптофановик залишк1в на флуоресцентний зонд зростае'в!д 81 до 90 %.. В!дстань донор-акцептор скорочу-бться з 27.4 до 24.4-А. При взаемодП з неспециф1чним субстратом фенилалан!ном не спостер!гаеться п1двищення 1нтенсивност1 , флуоресценцП зонду С5].

Результати розрахунк!в ефективност! переносу енергП, Фь-орстеровського раШуса 1 удавано! в1дстан1 м!ж донором (трип-тофанов1 залижи ферменту) 1 акцептором (ковалентно зв'язаний зонд АЕДАНС) представлен! в табл.3. 3 цих даних видно, що ти-розил-тРНК синтетаза зазнае конформацшщх зм1н: - стиск б!лко-во'1 глобули - при взаемодП лише з специф1чним пром!жним продуктом тирозиладеНлатом. Таке стискання б1лково! матриц! очевидно сприяе найб1льш оптимальн!й конформацП синтетази для nepeöiry ферментативно! реакцП СБ].

Досл!дження показали, що взаемод1я ферменту з гомолоПчною тРНКТуг приводить до збыьшення флуоресценцП зв'язаного зонда АЕДАНС на - 25 ± 3 X, тод! як при взаемодП з гетерогенной тРНКТуг з E.coli, котра не ампюацилюЕться ферментом печ1нки бика, спостер1гаеться гас1ння зондово'1 флуоресценцП на 8 ± 3 %. Шдсилення зондово'! флуоресценцП в1дбуваеться, очевидно, за рахунок зб1льшення ефективностг переносу енергП збудження з триптофанових залишк1в на АЕДАНС (в1д 81 до 87 %).' В1дстань м1ж триптофанилами 1 зондом зменшилась до 25.3 А при взаемодЬ ею з гомолоПчною тРНКТуг [41. .

Нами BviB4eni залежност1 хнтенсивност] зондово! флуоресценцП комплекс!в Mineiro! АЕДАНС тирозил-тРНК синтетази з гомоло-г1чною i гетеролоПчною тРНКТуг в!д концентрацП АТР. Так, при додаваий АТР до комплексу ферменту з гомолоПчною тРНКТуг слостер1гаетьс.я зб1льщення зондово! флуоресценцП на 32 ± 3 Z, а у винадку з додаваниям гетеролог1чно'! тРПК1уг - лише на 6 ± з z.

ГПдстань Mix триптофановими залишками 1 зв'язаним зондом АЕДАНС в комплекс! з гомолоПчною тРПК1уг i АТР становила 24.1 Л, ефективнзсть переносу енергП при цьому зросла з 81 до 90 X ' (тайд.З) С43.

М

Таблица 3. Флуоресцентн! властивост! AEDAHS-Mi'ieHO'i тиро-зил-тРНК синтетази з печ!нки бика i П комплекс!в з субстратами.

^max . (нм) (± 1) Е (%) (± 2) Ro(A) (± 1) R (А) (± 1)

АЕЛАНС-ТирРС 477 81 35.0 27.4

АЕДАНС-ТирРС+тРНКТуг з печШки 477 87 35.0 25.3

бика

АЕДАПС-ТирРС+тРНКТуг з печ!нки 477 90 35.0 24.1

бика + АТР

АЕДАНС-ТирРС+тРНКТуг з E.coli 477 82 35.0 27.0

АЕДАНС- ТирРС-t Тир» АТР 476 93 35.0 22.3

АЕДАНС- ТирРСШРКГир 476 90 35.0 24. 1

АЕДАНС-ТирРС+АТР+Фен 476 81 35.0 27.4

В!лышй АЕДАНС 493

Таким пином, одержан! дан! показують, щп тзнавання тиро-зил-тРНК синтетази гомологичною тРПК1уг супрсводжуеться кон-формацншими ем!нами (стиск) молекули ферменту, що приводить до посилення флуоресценцП зонда внасл!док зб!льшення ефек-, тивност! переносу енергП збудження в1д залишк!в триптофану. Така конформащйна змша, очевидно, пот!м !ндукув формувашга оптимально! конформацП для зв'язування АТР в активному центр! синтетази. Под!бний ефект недавно описаний для кристал1в комплексу гл(ота]:'Н1!л-тРНК синтетази - ■тРНКС1п /Rould М., 1991/. Допускаеться, що взаемодП антпкодону тРНК а рухливими фрагментами быка занускаить конформ?ц!йн1 зм!ни, необх1дн1 для посл!дуючого св'язування з АТР.

гаюновки

1. Доогпджен! спектралыи властивост! триптофаново! ФлуоресценцП тирсзил-тРНК синтетази з печХнки бика. Показана на-

явн!сть двох компонент в спектр! випром1нювання ферменту, одна з котрих належить внутрШньоглобулярним триптофанилам (максимум спектру 330 ш), а друга - експонованим триптофановим за-лишкам (максимум спектру 344 нм).

2. Для внутр!шньомолекулярно! рухливост! синтетази при температур! до 40 °С характер^ низьк! енергИ активацП (14 -21 кДж/моль) i опосередкована регуляц!я дифузШшми властивос-тями роэчинника, що справедливо як для поверхневих, так i для внутрШШх д!лянок макромолекули тирозил-тРНК синтетази.

3. В розчин1 тирозил-тРНК синтетаза здатна до швидко!. (на-носекундно!) конформац!йно! рухливост! И молекули, що приводить до стану в1дкритих i закритих порожнин для розчинника в б!лко-в1й глобул!.

4. Для тирозил-тРНК синтетази характерна висока обертальна рухлив!сть триптофанових залишк1в за умов значно! внутршньо! б!лково! MiKpoB'HSKOCTi ферменту.

5. Для молекули тирозил-тРНК синтетази спостер1гаються ло-кальн1 конформац1йн! флуктуац!'!, ампл!туда котрих коливаеться у межах 0.5 - 2.8 А.

• 6. Шзнавання тирозил-тРНК сингетазою гомологично! тРНК супроводжуеться конформацШною зм!ною (стиском) структури ферменту, що спричиняе посилення флуоресценцП зонду АЕДАНС, як насл!док зб1льшення ефективност! nepeHQcy енергП збудження В1д залишк!в триптофану. Таке стискання пот1м !ндукуе форму-вання оптимально'! конформацП для. зв'язування АТР в активному центр! синтетази. Утворення тирозиладен!лату також супроводжуеться конформад!йними зм!нами молекули ферменту.

Список опубл1коЕаних роб!т по тем1 дисертацП.

1.Наносекундная конформационная подвижность тирозил-тРНК син-тетазы в растворе по данным : тушения триптофановой флуоресцен-* ции /'Т.О.Гуща,И.В.Клименко,А.й.Корнелюк//Докл. А!I УССР.Сер.Б. -1090.- N 7.-С.77-00.

2.Свойства триптофановой флуоресценции двух форм тирозил-тРНК

16

синтетазы из печени быка/И.В.Клименко,Т.О.Г'уща, А.И.Корне-люк//Биополимеры и клетка.-1991.-т.7, N 6.-С. 83-88.

3.Поляризация флуоресценции и вязкость микроокружения остатков триптофана эукариотической тирозил-тРНК сиитетазы/И.В.Кли-менко//Еиополимеры и клетка.-1992.-г.8,N 3.-C.3- 6.

4.Конформационное изменение тирозил-тРНК синтетазы из печени быка при взаимодействии с гомологичной тРНК по данным флуоресцентной спектроскопии /И.В. Клименко, А.И. Корнелюк, Г.Х.Мацу-ка//Биополимеры и клетка.-1993.-т.9,N б.-С.29-33.

5.Conformational changes of manmallnn tyrosyl-tRNA synthetase In the course oi\ tyrosyl adenylate formation and cognate tRNA binding revealed from fluorescence energy transfer measurements / A.I. Kornelyuk, I.V. Kllmenko, L.G. Kalachnyuk, K.A.Odynets//Abstracts of 15th International tRNA Workshop,Cap d'Agde, France,May 30 - June 4,1993.-P.344.

6.Conformât Ion fluctuations of mammal ian tyrosyl-tRNA synthetase in solution studied by fluorescence spectroscopy / D.V. Gnatenko, I.V. Klimenko, A.I. Kornelyuk, K.A. Odynets //Abstracts of 22nd Meeting of the.FEBS,Stockholm,Sweden,July 4-9,1993.-P.190.

7.Конформационная подвижность полипептидной цепи тирозил-тРНК синтетазы по данным флуоресцентной спектроскопии/Т.0.Гуща,И.В. Клименко, А.И.Корнелюк//Тезиси докладов VI Всесоюзного координационного совещания. по спектроскопии . полимеров, Минск,25-28 октября,1989.-С.37.

8.Conformational mobility of polypeptide chain of • tyrosyl-tRNA synthetase studied by fluorescence spectroscopy / I.V. Kllmenko, Т.О. Guscha, A.I. Kornelyuk // Abstracts of VI Symposium' on Optical Spectroscopy, Ueubrandenburg, DDR, 1990. -P. 87.

9.Поляризация флуоресценции и вращательная подвижность остатков триптофана эукариотической тирозил-тРНК синтетазм/И.В.Клименко, А.И.Корнелюк//Тезисы докладов VI-го Всесоюзного совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение",Москва, 1992. -С. 19-20.

10.Равновесная динамика тирозил-тРНК синтетазы по данным тем-

нературного тушения триптофакавой флуоресценции/И.в.Клименко, А.И.Корнелюк//Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров.Харьков,1991.-С.41.