Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дослiдження активацii Glu-плазмiногену тканинним активатором плазмiногену на рiзних моделях фiбринового згустка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дослiдження активацii Glu-плазмiногену тканинним активатором плазмiногену на рiзних моделях фiбринового згустка"

РГ 6 од

7Ґ» « ? *> / /г -♦ ►

;: И О Г-:./: -

АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНЛ

На правах рукопису

Дружина Надія Миколаївна

Дослідження активації Ои^плазміногену тканинним активатором плазміногену на різних моделях фібринового згусгка

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття ученого ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ 1993

Науковий керівник: кандидат біологічних наук

Макогоненко Є.М.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Кібірєв В.К.

кандидат біологічних наук Позднякова Т.М.

Провідна установа:

Київський державний університет ім. Т.Г. Шевченка

Захист відбудеться 1994р. о___год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 016.07.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна АН України за адресою: 252030, Кнїв-30, вул. Леонтовнча, 9

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці вказаного інституту Автореферат було розіслано " ^^^1993р.

Вчений секретар спеціалізованої ради КІРСЕНКО О.В

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Головною функцією фібршюлітнчітї системи в організмі є ферментативний лізис фібринового згустка. Фібринолітнчиа система наявна у кросі всіх ссавців та виконує роль протилежну системі зсідання крові. В основі системи регуляції гемостатичного балансу лежить механізм формування та руйнування фібрину, що включає систему зсідання, яка призводить до утворення фібрину, та фібринолітнчиу систему, яка обумовлює розчинення фібрину, з усіма проферментами, ферментами, активаторами та інгібіторами.

На сьогодні досягнуті значні успіхи у вивченні молекулярних та кінетичних аспектів функціювашія фібрииолітичної системи. На основі численних експериментальних даних була сформульована регуляторна модель фібринолізу (\Уітап, Соїіеп, 1977), яка зараз уточнюється та деталізується, У загальному вигляді вона передбачає сорбцію плазміногену та його фізіологічного активатора на фібрині, де і відбуваються процеси активації та фібринолізу. Плазмін, який утворюється, будучи т яганим з фібрином, розщеплює його на розчинні фрагменти, а згодом, вивільнюючись у кровоток, плазмін швидко і необоротно інактнвуепься аг-антиплазміном.

Активація плазміногену тканинним активатором плазміногену (ьРА) відбувається не в розчині, а на поверхні фібрину. Спочатку фібрин виступає як ефектор (стимулятор) активації, а згодом - як субстрат для плазміну. Протягом полімеризації фібрину та наступного гідролізу фібринового Згустка плазміном, що утворюється, ефекторні та субстрати! функції фібрину змінюються.

Остаточно не з'ясовано, як у ході полімеризації фібрину відщеплення фібршюпептидів В і перетворенна дезААфібрину в дезААВВ форму впливає на стимулюючі властивості фібрину в процесі активації патионого Сій* плазміногену 1*РЛ, Серед літературних даних існують суттєві протиріччя щодо зміни ефекторних. властивостей фібрину в процесі активації після ковалентної прошивки його фактором ХШа. Не виключено, що залученим до фібринового згустка деяких інших білків плазми крові, зокрема фібронектину, може, до деякої міри, впливати на здатність фібрину прискорювати активацію.

Ефекторні властивості фібрину в процесі активації пояснюють виникненням потрійного циклічного комплексу тканинний активатор плазміногену-плазміноген-фібрин (Hoylaerts, et.al., 1982). Ділянки зв'язування на молекулі фібрину, які комплементарні афінним структурам плазміногеиу і t-PA та важливі для активації, остаточно не локалізовано. Вважають, що ними можуть бути олігомери аС-доменів, Д-Е-Д тріади полімерного фібрину (Suenson, Petersen, 1990), міждомеїша суперспІралізована ділянка, яка прилягає до Д-домену та містить Lys 157 а-ланцюга фібрину (Voskuilen, et.al., 1987), а також ділянка у-ланцюга, що локалізована у Д-домені (Yonekawa, et.al., 1990). Встановлено існування двох фаз активації плазміногену t-PA: па нативному фібрині та на частково зруйнованому (Norman, et.al., 1985). Вважають, що стимулююча дія частково деградованого фібрину зумовлюється збільшенням кількості Glu-плазміиогену та t-PA, які з ним зв'язуються, за рахунок появи нових ділянок зв'язування та зміною конформації Glu-плазиіиогену.

Дослідження процесу активації Glu-плазміпогену t-PA за наявності різних моделей фібрилового згустка, що відповідають тим. чи іншим структурам полімерного фібрину, дало пагоду розширити уявлення про роль деяких структур фібрину у процесі активації.

Метою роботи стало вивчення сфекториих функцій фібрину щодо активації Glu-плазмшогеііу t-PA у процесі формування фібрннового згустка та дослідження стимулюючих властивостей окремих структур полімерного фібрину на процес активації. В роботі були поставлені наступні задачі.

1. Дослідження активації GIu-плазміногену t-PA на фібрипових згустках з різним ступенем прошивки фактором ХІІІа. •. • .

•2. Вивчення впливу фібронектину, залученого до фібрннового згустка, на ефекторні властіївості фібрину в процесі активації.

•. 3. Встановлення кінетичних параметрів активації Glu-плазміногену t-

•РА на фібринових.згустках, утворених з.дезАА- та дезААВВфібрипу.

■ . 4-.Дослідження 'ефекторних-властивостей. комплексу фібриноген-

ЫДСВ.ф'бр.ину.у процесі активації."’ . . У \

*5. Вивчення активації СІи-пмазічіногену t-РА'за наявності комплексів NflOB фібрину з фрагментами фібрин(оген)у, які містя ть Д домен. . •

Наукова новизна роботи. Було встановлено, що ковалентна модифікація полімерного фібрину фактором ХІІІа знижує стимулюючу

з

здатність фібрину в процесі активації Сіи-плазміиогену І-РА. Нулі» внянлеио, що фібронектин, який залучено до ковалентно прошитого за допомогою фактора ХІИа фібринового згустка, на відміну від залученого до непрошнтого ФХІІІа згустка, погіршує ефективність активації Оіи-плазміногену г-РА. Вперше було показано, що комплексам фібршюген-ЫДСВ фібрину та Д-Д-ОДСВ фібрину притаманна стимулююча зда шість щодо процесу активації. Було виявлено, що у фібрннових згустках, утворених з Мономерів дезАА- та дезААВВфібрину, кінетичні параметри активації Сіи-плазміногену ЬРА залишаються без змін.

Визначення кінетичних параметрів активації Сіи-плазміїюгену і-РА за наявності різних моделей фібринового згустка дозволило конкретизувати уявлення про структури активаторного комплексу тканинний активатор плазміногену-фібрнн-ллазміногеи і запропонувати схему просторовою взаємного розташування компонентів комплексу на різних етапах процесу активації плазміногену 1-РА та гідролізу полімерного фібрину плазміном, що утворюється.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати поглиблюють наші уявлення про процес активації нативного Оіи-плазміногену тканинним активатором плазміногену, роль полімерного фібрину та окремих його структур, як прискорювача реакції активації на різпнх стадіях утворення та руйнування фібринового згустка; дають можливість висловити припущення про локалізацію та взаємне . розташування складових активаторного комплексу, які необхідні для . забезпечення активаційного процесу, що, відповідно, дає можливість більш

• ефективному запобіганню та лікуванню серцево-судинних захворювань.

• Апробація роботи. Основні результати та окремі положення дисертаційної роботи були -викладені та обговорені на Всесоюзній конференції "Методи .одержання, аналізу -та в!)'корнсдову.ваііня.(|>ермсмгів"

• (Юрмала, 1990р.), на X Міжнародному .кошресі по фібринолізуЧІнліанаполіс,

1990р.), на VI Українському біохімічному • з'їзді (Київ, 199?р.) та на спільному семінарі відділів <^уктурч;га. функції бїлкуГ хімії та біохімії 'ферм'ентів і молекулярної імунолоіії.Ічсіту ї-у біохімії ім, ()!В. Мял-лллі»л АН.Укр'аїниЧ.Кнїв, 19.93р.); ’ ■ ' . . ". . ■ . •

. Публікації.-Тя мятгр^лпми днорріамії бу;і»і нп\блік.г)вдгн» 5'ро$>г..

Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 121 сторінках друкарського тексту та складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, що викладені у 2 главах, заключної частини, висновків, списку основної літератури, що використовувалась (197 джерел). Робота проілюстрована 28 рисунками та 3 таблицями.

Матеріали та методи дослідження

Glu-плазміііоген людини виділяли з плазми донорської крові шляхом афінної хроматографії на лізші-сефарозі 4В (Deutch, Merts , 1970) з наступною гель-фільтрацією на сефадексі G-150.

Плазмін одержували активацією Glu-плазміногену стрептокіназою ("Стреитаза" Швейцарія), або урокіназою ("Абокіиаза” США), яка була {мобілізована на ссфарозі 4В.

Ткаиннний активатор плазміногепу t-PA виділяли з ацетоиового порошку, який одержували з сердець свиней (Куд'шов, Макогоиенко та інш,’ Авт.св., 1987).

Протеолітичну активність плазміногену (потенційну) і плазміну оцінювали за їх здатністю гідролізуватн казеїн (по Гаммерстену) (Robbins, Summaria. 1979).

, Актнваторну активність ткашшного активатора плазміногену визначали методом фібрниових плівок (Haverkate, Brakman, 1975)

Фібрииоген виділяли з цитратної донорської крові шляхом фракційного висолювання сульфатом натрію (Варецька, 1960).Прспарат фібриногену очищали від домішок плазміногену на колонці з лізші-сефарозою, а від домішок фактора XIII - на колонці з п-ХМБ-сефарозою.

Фібрин-мопомер дезААВВ одержували^обробляючи фібриноген а-тромбіном фірми "Calbiochcm"(CIlIA) за наявності контрикалу та п-хлормеркурійбензоату натрію; утворений згусток розчітялн в 20мМ оцтовій кислоті (Pozdnjakowa et.al., 1979).

Фібрнн-мочомер пезАА одержували;обробляючи розчин фібриногену в

0.03М трис-ацетатному буфері, pH 5,3, що містив 0,ЗМ NaCl, тромбіном (

0,05 Nih од. на 1 мг фібриногену) протягом 35хв при 35°С (Луговской и др., 1978). Згодом висолювали сульфатом амонію і двічі переосаджувалн 0.06М

фосфатним буфером, pH 7,0,'та іонною силою 0,22. Препарат дезАЛ фібрин-моиомеру розчиняли в 20мМ оцтовій кислоті.

іІІі-мічений Фібриноген одержували з фібриногену, який мітили Na'25l за допомогою хлораміну Т (McConachey, Dixon, 1980)

NHCD Фібрину (Н-кінцевий дисульфідпий вузел) одержували шляхом розщепленім фібрии-мономеру BiCN в 70% мурашиній кислоті з наступною гель*фільтрацієк» на сефадексі G-100 (Тішрі, Fietzek, 1977). ЬІДСВ очищали методом іонообмінної рідинної хроматографії високої роздільної здатності (Чудиовец и др., 1991).

Х2 фрагмент фібриногену одержували з 45 хвилинною плазмінового гідролізату фібртюгену (молярне співвідношення плазміну до фібриногену 1:500, концентрація фібриногену Юмг/мл) шляхом гель-фільїрації через біогель Р-300 з наступною рехроматографією на сефадексі G-200 (Lucas etal., 1983)

' Д-Д фрагмент одержували шляхом плазмінолізу прошитого фактором ХИІа фібрину; гідролізат розподіляли гель-фільтраціею через сефакрнл S-300 за високої іонної сили (р=1), фрагмент Д-Д доочищали іонпообмінною хроматографією на КМ-сефадексі.

Фактор XIII вилучали з плазми крові великої рогатої худоби у декілька етапів, які включали фракціонування сульфатом амонію, теплову денатурацію фібриногену, іонообмінну хроматографію на DEAE-Toyopearl (Lorand et.al., 1970).

Фібронектнн вилучали з плазми донорської крові шляхом афінної хроматографії у неденатуруючнх умовах (Vuento, Vaheri, 1979).

Електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) провадили у трис* ацетапіій системі за наявності 0,1% ДС-нагрію (Weber, Osborn, 1969).

Термін напівлізнсу згустка визначали спектрофотометрично, вимірюючи зміну оптичної густини середовища при 350нм (Bouvier et.al., 1975, Макогоненко та інш., 1987).

Активацію Glu-плазміногену і-РА вивчали на Ші-мічених Фібринових згустках за вивільненням продукт ів деградації фібрину. У вічках планшета для імуноферментного аналізу утворювали фібринові згустки з різним ступенем прошивки, оброблюючи фібриноген тромбіном та екзогенним фактором Xltla і додаючи 1*10^імп./хв. ^їі фібрннотену (об'ємі згустка станомів 0,4 мл). Для отримання згустків і фібрпнекіичоч останній

додавали до інкубаційного середовища у концентрації 100 мкг/мл. Як робочий буфер використовували 0,02М веропаловий буфер, pH 7,4, що містив 0,13N NaCJ та '0,001 М СаСіг. Гідроліз згустків провадили, нашаровуючи на поверхню фібринової плівки 0,2 ил реакційної суміші, яка містила Glu-плазміноген у концентраціях від 0 (контроль) до 24 мкг/мл та t-РА (1,5 Ш/мл). Реакція відбувалася при 37°С. Через певні проміжки часу відбирали аліквоту (ІОмкл) надосадової рідини та реєстрували у.ній радіоактивність за допомогою лічильника "Gamma 550" ("Beckman” США). На прикладі гідролізу пепрошитого фактором ХШа 1251-мічспого фібрнпового згустка Gtu-плазміногеном, що активується тканинним активатором плазміногспу наведено загальну схему визначення кінетичних параметрів процесу активації. На рис. І подано одержані криві залежності вивільнення 125І-міченнх продуктів деградації фібрину з гелю в розчинну фазу середовища при гідролізі непрошнтого фібрину Glu-ллазміногеном, що активується t-PA. Використовуючи графічне диференціювання па ділянці кривої від 20хв до ЗОхв, за калібрувальною кривою вираховували швидкість утворення плазміну для певної концентрації плазміноге/ty. Для побудови калібрувальних кривих фібринові згустки, утворені за тих самих умов, гідролізували плазміном у концентраціях від 0 (контроль) до 3,2мкг/мл.Иа рис. 2 наведено графіки збільшення радіоактивності розчинної фази системи непрошнтого фібрину в ході його гідролізу плазміном. У вибраних концентраціях плазміну залежність вивільнення ІИі-мічених продуктів деградації фібрину від терміну гідролізу (у межах до близько 20хв) має лінійний характер. На підставі одержаних графіків будували калібрувальні криві у координатах tga/ [плазмін], де a - кут нахилу кривої збільшення радіоактивності для кожної концентрації плазміну до осі абсцис. На рис. З наведено калібрувальну криву, що отримана за гідролізом непрошнтого фактором ХШа фібрину плазміном. .

Крипі залежності швидкості утворення плазміну в процесі активації Glu-плазміногену t-PA від концентрації Glu-плазміногену за постійної концентрації t-РЛ мали вигляд типових кривих Міхаеліса-Меїпен для кожного типу згустків. Ці криві лінеаризували у координатах [SJ/V-JS] (рнс.4.), за-лкимн розраховували кінетичні параметри активації Glu-плазміногепу тканинним активатором плазміногену у вибраних системах.

А.срт/тіп , А срт/тіп

7009

і ,ті п

Рис. 1, Залежність вивільнення 125І-^ мічених продуктів деградації фібрину з гелю в розчинну фазу середовища протягом гідролізу испрошитого фактором ХШ фібрину Оіи-плазміногеном (у концентраціях і, -0.5; 2.-1; 3. -4; 4.-8; 5. -24мкг/нл), що активується і-РА.

Рис. 2. Зміна радіоактивності розчшпшх ♦. І^І-мічеіпіх продуктів деградації фібрину в реакційному се|іеловищі, яке нашароване на непрошіпнй фібрииовий гель, у процесі його гідролізу плазміном у 1 концентраціях; 1. -0,4; 2. -0,8; 3.

1 -1,6; 4. -3,2 мкг/мл/

Рис. 3. Калібрувальна крива залежності Іва від концентрації плазміну для непрошитого фактором ХШа фібрину

[Рті,ткМ

г.

*

[Б],ткМ

Рис.4. Крива залежності швидкості утворення плазміну від концентрації Ои-плазмиюгеиу, в процесі його активації і-РА та її лінеаризація у координатах [8]ЛЧ$? для иепрошитого фактором ХІІІа полімерного фібрину.

[8],ткМ

Дослідження активації віи-плазміногену і-РА за допомогою хромогенного специфічного дляплззиікусубстрзту 1.

У вічках планшета для імуноферментного аналізу формували ефекторні системи: комплекси фібриногеи-НДСВ фібрину, Д-Д-ІЯДСВ фібрину, Хг-NДCB фібрину, фрагменти Д-Д і Хг взягі окремо, а також фібргтові згустки, утворені з мономерів дезАА- та дезААВВфібршіу; Реакційне середовище містило 0,02М вероналовий буфер, рН 7,4 з 0,13N На СІ .і 0,001М СаСІг. Коицеїгфація фібриногену, дезААфібрину. дезЛАВВфібрину, Хг та

Д-Д фрагментів становила ІООмкг/мл, ЫДСВ фібрину - ЗОмкг/мл. Для визначення швидкості активації на дезААфібрині, дезААВВфібрниі та на комплексі фібрииогек-КДСВ фібрину концентрацію Glu-плазміногену у реакційному середовищі змінювали від 1 до ЗОмкг/мл, у випадках, активації на комплексах Хг-ЬЩСВ фібрину, Д-Д-ЫДСВ фібрину, Хг і Д-Д фрагментах взятих окремо - від 1 до 200мкг/мл. Концентрація t-PA у всіх випадках становила 5 IU/мл. Специфічний хромогенний субстрат S2251 містився у кожній системі у концентрації 0,3 мМ. Об'єм реакційної суміші становив

0,2мл. Реакцію провадили при 37°С. Через певні проміжки часу вимірювали оптичну густину проб при 405нм (Е405) на мікрорідері для ELlSA-апалізу (DYNATECH PRODUCT ) у двопроменевому режимі, в якому автоматично вилучається мутність проби. На рис. 5 наведено графіки швидкості руйиувашія S2251 плазміном, що утворюється у процесі активації Glu-плазміногену t-PA за наявності комплексу фібриноген-І^ДСВ фібрину за різних концентрацій плазміногену. Аналогічні серії кривих було одержано за наявності інших ефекторів, які досліджувалися.Кількість плазміну, що утворюється у процесі активації, визначали, використовуючи графічне диференціювання, за калібрувальними кривими. Для побудови калібрувальних кривих системи, які вивчали, гідролізували за наявності S2251 плазміном у концентраціях від 0,5 до 5,0мкг/мл. На рис. 6 наведено графіки залежності зміни Е405 середовища від терміну гідролізу комплекса фібриноген-ИДСВ фібрину плазміном. За даних концентрацій плазміну графіки мають лінійний характер в інтервалі часу до близько 30хв. На підставі одержаних графіків будували калібрувальні криві у координатах tga-Іплазмін], де a - кут нахилу криво! збільшення оптичної густини П405 від терміну реакції для кожної концентрації плазміну. На рис. 7 наведено калібрувальну криву для системи фібрнногеи-МДСВ.Усі графічні побудови та обробку одержаних графіків провадили на ЕОМ IBM PC викорнстоьумчи пакет програм CoPlot 1.02. CoHort Software.

Кінетичні параметри активації Glu-плазміногену ткашінннм активатором плазміногену за наявності різних ефекторів ніпрчхову«а.чн за допомогою програми Enzfltter R.J. Leatherbanow /и я IBM PC

І, т і п

Рис.5. Швидкість руйнування 82251 плазміном.що утворюється в процесі активації Ои-плазмшогеяу (в концентраціях: 1.-1» 2.-1.5; З.-З;

4.-5; 5.-10; 6.-15; 7.-30 мкг/мл) і-Ра за наявності комплексу фібрнноген-ИДСВ фібрину.

Рйс.6. Залежність зміни Е405 середовища від терміну гідролізу 52251 плазміном (у концентраціях:

1.-0.5: 2.-1; 3.-1,5; 4.-2; 5.-3;

6.-5 мкг/мл) за наявності комплексу фібрююген-ВДСВ фібрилу.

Рис.7. Калібрувальна кріпш залежність tga від концентрації плазміну для комплексу фібріпюген-НДСВ фітину

[Рт],ткМ

и

Результати та Тх обговорення

ї.Дослідження активації Сіи-плазміногену ткашпптм активатором плазміногену на моделях фібрпиових згустків з . різним ступенем прошивші фактором .ХШа за наявності та без

фібронектину

Суттєві суперечності серед літературних даггих не дають однозначної відповіді на питання про вплив ковалентної модифікації фібрину фактором ХШа на Лого ефекторні функції в процесі активації. Працюючи з високоочіїщешіми білковими препаратами, ми створювали моделі фібрикових згустків, що прошиті фактором ХШа лише по у-ланцюгам, по у-та а-ланцюгам, та непрошиті зовсім. Чистоту препаратів та ступінь прошивки згустків контролювали електрофоретично (Рис. 8).Актнвацію нативного Сіц-плазміногену 1-РА досліджували за швидкістю вивільнення І25і-мічеішх продуктів деградації фібрину в розчинну фазу реакційного середовища та реєструючи швидкість утворення в ході активації плазміну за розщепленням специфічного хромогенного субстрату Э2251 і вивільненням р-пітрсашліну. Кінетичні константи реакції активації Ои-плазміпогену І-РА, що обраховані за результатами, одержаними першим методом! склали для пепрошитого згустка Кш=0,019мкМ, ксаі=0,1с'1, прошитого по у-лаицюгам Кт=0,065мкМ, ксаі=0.09с-1, прошитого по у-та а-ланцюгам Кш=0,08мкМ, кса^О.ОЗс-*. Метод з використанням 52251 дозволив розмежити дві фази реакції активації та визначити кінетичні параметри реакції активації СІи-плазміпогену і-РА на непрошнтому та повністю прошитому полімерному фібрині для першої та другої стадій активації. Результати подано у табл. 1.

Одержані результати свідчать про те, що прошивка фібрину по у- і а-ланцюгаи (у відсутність аг-аитиплазміну) помітно гальмує швидкість ахтнвації Сіи-плазміногеиу І-РА та погіршує ефекторні властивості фібрину. Варто зазначити, що прошивка згустка тільки по у-ланцтогам призводіггь до деякого зменшення спорідненості ьРА до плазміногену. Певно, що прошивка фібрилу фактором ХШа модулює взаємодію тканниного активатора з плазміиогеиом; прошивка «-ланцюгів фібрину блокує або робить менш

рухомими, в тому менш доступними ділянки зв'язуванім на аС-доменах для І-РА та плазміногеиу.

Таблиця 1. Кінетичні параметри активації Сіи-плазиіпогену І-РА на цепрошіггому та повністю прошитому фактором ХІІІа полімерному фібріші

Кт (икМ) кса< (с-1) ксаі/Кт (икМ^с-*)

| фаза II фаза І фаза II фаза І фаза II фаза Непрошнтнй 0,075 0,0(8 0,016 0,01 0,21 0,5

Прошитий 0,37 0,067 0,052 0,017 0,14 0,25

Ковалентна модифікація фібрину фактором ХІІІа порушує взаємне розташування аС- та Д-доменів, стерично утруднює доступ Оіи-плазміногену І і-РА до ділянок зв'язування на коровій частині молекули фібрину.

1 2 3 4

у-1 •м* Г-»

а Р К & 4*0 в

Рис. 8. Електрофореї рама зразків полімерного фібрину: непрошитай (1), прошитий лише по ’/-ланцюгам (2), та повністю прошитий як по у-так і по а-ланцюгам фактором ХІІІа. Електрофореграма фібрину (4), що був проінкубовашй при 37°С протягом 120хв. за наявності тромбіну подано як контроль очистки фібрину від домішок фактора Х1П . Згустки утворювали за наявності фібронектнну. Розподіл провадили у 10% ПААГ з ОЗ-Ыа, за наявності йідновлювача - дигіспрейголу. .

У процесі формування фібрипового згустка, крім фібрину, до нього залучаються і деякі інші білки плазми крові, зокрема фібронектші, вміст якого у згустку складає 4% від маси білків (Mosher, Johnson , 1983). Відомо, що фібронектіш не прискорює активації плазміногену t-PA у розчині (Beckman, et.al., 1991). Ми досліджували вплив фібропектину, що залучений до згустка за відсутності фактора ХШа, на активацію Glu-плазміногену тканинним активатором плазміногену та на швидкість лізису згустка плазміном. Методом визначення терміну напівлізису згустка було показано, що ні швидкість гідролізу фібрину, що відбувався по всьому об'єму згустка, плазміном, ні кінетичні параметри активації Glu-плазміногену t-PA не змінювалися за наявності у реакційному середовищі фібропектину.

Проте, відомо, що фібронектіш є субстратом для фактора ХШа, який ковалентно приєднує його до а-лаїщюга фібрину. Прошивка фібропектину з а-ліііцйгамн фібрину під дією фактора ХШа відбувається із швидкістю блнзькЬіо'ііо Подібної для прошивки самих а-ланцюгів фібрину. У роботі вивчали;'прОцес активації Glu-плазміногену t-PA на моделях фібриновнх згустків з різним ступенем прошивки фактором ХШа та залученим до них фібронектином (Рис. 8). Швидкість вивільнення 125[.міЧених продуктів деградації фібрину з иепрошнтнх фібриновнх згустків, що містять фібронектші, не відрізнялась від подібної фібриновнх згустків без фібропектину. Повністю прошитий фактом ХШа фібрнновий згусток, модифікований фібронектином, гальмує швидкість активації Glu-плазміногену t-PA. Константа Міхаеліса у такому згустку збільшувалася від Кш=0,08мкМ (згусток без фібропектину) до Кт=0,21мкМ за наявності фібропектину (Табл. 2). Таким чином було показано, що фібронектші у непрошитому фібриновому згустку не впливає па ефекторні властивості фібрину, а ковалентне включення фібропектину в фібриновнй згусток, прошитий по у- та а-ланцюгам фактором ХІІІа( гальмує активацію Glu-плазміногену t-PA і зменшує швидкість руйнування фібрину. Одним з можливих пояснень цього факту може бути припущення про включення фібропектину в аС-домени фібрину під дією фактора ХШа, що зменшує прошивку аС-доменів між собою і зберігає-структурну відокремленість аС-доменів. Ймовірно, що прошивка фібропектину з а-ланцюгамн фібрину поряд з прошивкою самих а-ланцюгів фібрину, блокує ділянки зв'язування

на аС-доменах для плазміногену і тканинного активатора плазміногену. Залучення фібронектину до згустка модулює зв'язування плазміногену і t-РА з фібрином. З іншого боку було показано (Salonen et.al., 1985), що •мобілізований фібронектин зв'язує тканинний активатор плазміногену. Не виключено, що на модифікованому фактором ХШа згустку за наявності фібронектину, частина t-PA і плазміногену зв'язується не з фібрином, а з фібронектином, що гальмує активацію. ■

Залучення фіброиектиііу до фібринового згустка має значення для стабілізації згустка і збільшення його резистентності до плазміиолізу.

Таблиця 2, Кінетичні параметри активації Glu-плазміііогеііу t-PA па полімерному фібрині з різним ступенем прошивки фактором ХШа за наявності та без фібронектину

НепрошитнП Частково прошитий іі&ііїїістіо прочіптніі з Фн з Фц з Фи

Кш(мкМ) 0,019 0,019 0,065 0,078 0,08 0,21

ксаі(с-І) 0,1 0,1 0,09 0,08 0,06 0.05

Kcat/Km

(мкМ*»*с-1) 5,3 5,3 1,38 1,02 0.75 0,24

2. Роль деяких структур полімерного фіброїну в активації Сіц-плазміногену тканиншш активатором плазміногену

2.1. Дослідження активації Єіи-плазміногеиу І-РА па фібрнновіїх згустках, утвормшх з дгзАА- І дезААВВфІбрніїу .

Початковий етап полімеризації фібрину полягає в утворенні мономеру дезААфібрииу та його полімеризації у протофібрнлн, які потім латерально асоціюють, формуючи фібрили. Відщеплення В-пептидів тромбіном та перехід фібряпу в дезА А В В -форму важливий для забезпечення високої швидкості формування структури я устка і для стабілізації внутрішньо- та міжпротофібриляриих взаємодій молекул фібрину. Для того, щоб

визначити, чи змінює перехід дезААфібрииу в дезААВВформу ефекторні властивості фібрину, ми вивчали кінетику активації Glu-плазміноіену і-РА па фібринових згустках, які утворені із мономерів дезДА- та дезА А В В фібрину. У вибраних нами умовах, з використанням модифікованого методу визначення кількості плазміну, що утворюється в процесі активацій за швидкістю руйнування специфічного хромогенною субстрату S2251, швидкість активації Olu-плазміногену 1-РА виявилась однаковою на фібринових згустках, що ут ворені з мономерів як дезАЛ-, і ак і дезААВВфібрииу. Кінетичні константи активації складали иа дезААфібриіп Кт=0,05<5МкМ, Kcat=0,l С'1, на дезААББфібрині Кт=0,053мкМ, Kcat=OJc-'.

Тонкі відмінності у структурі дезАА- та дезЛЛВВфЙрпну, зокрема наявність В-пептидів у дезА Л фібрині, Са2 + , що зв'язаний з дезААВВфібрином (Shainoff, Dardik, 1983), певно несуттєві для ефекторннх властивостей полімерного фібрину.

2.2. Активація С1а-плазміногсиу тканинним активатором илазміногсіту за наявності комплексів N ДСП фіСіршіу з фіГірнпогспом та фрагментами фїбрнн(<огсн)у, ЯКІ МІСТЯТЬ Д домен

У вивчені стимулюючої здатності, що притаманна фібрину в процесі активації плазміногепу І-РА, нашу увагу припернуло дослідження ролі окремих структур полімерного фібрину, які відповідають за зв'язування плазміногепу та t-PA та важливі для забезпечення активаційного пронесу. Серед таких структур у літературі виділяють олігомери аС-домеиів, Д-Е-Д тріади полімерного фібрину (Suenson, Peterson, 1989), міждомеїшу суперспіралізовану ділянку, яка прилягає до Д-домеиу та містить Lys 157 а-ланціога фібрину (Voskuilen et.al., 1987), а також ділянку у-ланцюга 311-379, що локалізована у Д-домені (Yonekawa, et.al., 1990).Для дослідження ролі певних структур фібрнпового згустка в активації нативного GIu-плазміногену тканинним активатором плазміиогену були вибрані декілька моделей - комплекси фібриноген-МДСВ фібрину, Д-Д-МДСВ фібрину та Хг-NflCB фібрину.

Комплекс фібриногец-ИДСВ фібрниу - це модель полімерного фібрину (Позднякова и др., 1985), яку одержано сополімеризацією фібриногену та вилученого з фібрину за допомогою ВгCN високомолекулярного фрагменту, що містить Б-Б зи'язаиі N-кінцеві ділянки поліпептидиих ланцюгів фібрииу (М-кінцевий дисульфідішй вузел). ОДСВ фібрииу - схожий з Е фрагментом і зберігає Е-центри полімеризації. У комплексі фібриноген-ИДСВ фібрину молекула фібриногену має видовжену, як і молекула фібрину, форму. Д-домеїш сусідніх молекул з'єднані кіиець-до кінця фрагментами ЫДСВ, створюючи подібність однолапцюгових протофібрил і Д-Е-Д тріад. Протофібрили здатні латерально асоціювати у великі агрегати, які містять основні елементи фібрили полімерного фібрину: Д-Е-Д тріади, міжпротофібрнлярні контакти Д-Е-Д тріад і в незначній мірі «6%\аС-доменів.

Додавання ЫДСВ фібрину до розчину фібриногену або фібриногену до розчину N ДСВ фібрину супроводжується зміною ступеня мутності середовища подібно до того, як змінюється мутність середовища (Е350) при дії тромбіиу на фібриноген.

Попередньо було встановлено, що фрагменти фібрин(оген)у, які містять Д домен, здатні утворювати комплекси з N ДСВ фібрину (Позднякова и др., 1983). До таких фрагментів належать Хг фрагмент фібриногену, який позбавлений аС-домеиів і Ы-кшцевнх (1-42) пептидів В(5-ланцюга, та Д-Д - фрагмент прошитого фактором ХІІІа фібрину, що являє собою ковалентно з'єднані два фрагменти Д. Комплекси Х2-ЫДСВ фібрину і, в найбільшій мірі, Д-Д-ЫДСВ фібрину є аналогами Д-Е-Д тріади, містять Ьу$157 і Уа1152 а-лаїщюга, які доступні для взаємодії з плазміногеном і І-РЛ. Проте ці комплекси ле змінюють мутності середовища протягом 24год при 37 °С.

Для вивчення активації Оіи-плазміногеиу тканинним активатором плазміногену на комплексах фібрииоіен-МДСВ фібрину, Хг-НДСВ фібршіу, Д-Д-ЫДСВ фібрину та на фрагментах Хг і Д-Д, узятих окремо, використовували метод реєстрації швидкості утворення плазміну за швидкістю руйнування специфічного хромогенного субстрату 32251 • Підраховані кінетичні параметри активації Оіи-плазміно» єну тквшшним активатором плазміногену за наявності різних ефектОріе представлені у табл. 3.

Таблиця 3. Кінетичні параметри активації Ои-плазміногеїіу 1-РА за наявності різних ефекторів

Ефекгор активації Км Ккат . Ккат/Км

(икМ) (с*1) - (мкЛИс*!)

Фібрішоген-ИДСВ 0,125 0,06 0,45

хг^дсв 0,83 0,04 0,046

д-д-едсв 0,15 0,06 ' 0.37

Х2 1.2 0,02 0,017

Д-Д ■ 0,62 0,04 0,071

Фібршюген+тромбін 0,017 0,13 7,64

дезААВВфібрті 0,053 0,1 1,88

дезААфібрин 0,056 . 0,1 1,78

Вперше було показано, що комплекси фібршюген-МДСВ фібрину та Д-Д-1ЧДСВ фібрину здатні стимулювати активацію плазміпогену ткаиішпнм » активатором плазміпогену. Комплекс Хг-ИДСВ фібрину і фра'гменти Хг та Д-Д, узяті окремо, мали менш виражені ефекторні властивості у процесі активації. Вцілому швидкість реакції збільшувалась (ксаі/Кш), а Кш зменшувалась у ряду ефекторів, що досліджувалися, таким чином: Х2 -» Хг-ЬЩСВ -» Д-Д -» Д-Д-Г-ЩСВ, фібрішоген-НДСВ -» фібриновнЯ згусток.

Для того, щоб поясниш відмінності у ефекторних властивостях, слід розглянути особливості у структурах полімерного фібрину, комплексів фібрнногсн-І'ЩСВ фібрину, Хг-ЩСВ фібрину і Д-Д-ІЧДСВ фібрину. У комплексі фібрнногеи-МДСВ фібрину суперспіралізопані міждомешіі діляикн І Д-Е-Д тріади розташовані вдвічі далі одне від одного, ніж у полімерному фібрині. У цьому комплексі деяка частина аС-доменів («20%) може бути у формі олігомерів. У комплексі Хі-МДСВ фібрину утворюються нестійкі розчинні лише олігомерні структури, що містять аналога Д-Е-Д тріад та міждомешіі суперспіралізовані структури з Ьу5І57 а-ланцюга, які доступні для плазміногену і і-РА. Комплекс Д-Д-МДСВ фібрину є аналогом тріади полімерного фібрину і містить ділянки 311-379 у-лаіщюга та 1^157, Уа1152 а-лашрога.

Як уже згадувалося, процес активації плазміиогену t-PA двостадійний. Перша стадія - із низькою спорідненістю і-РА до шіазміїїогеиу та невеликою швидкістю* починається після відщеплення фібринолептндіа А від фібриногену та формування протофібрил (Suenson et.al., 1990); друга - з високою спорідненістю t-PA до плазміиогену і значною швидкістю активації-триває після початкової деградації полімерного фібрину плазміном, що утворився. Можна припустити, що кожній фазі (стадії) процесу активації відповідає свій активзторний комплекс. Протягом першої стадії до активаторного комплексу, певно, залучені аС-домени. Свідченням цього є те, що аС-домени полімерного фібрину афінно зв'язую ть плазміноген і t-PA

. • ' ‘

(Lloyd et.al., 1981), а часткове відщеплення аС-доменів призводить до переходу реакції до другої більш швидкої стадії (Norman et.al., 1985), і підвищення спорідненості t-PA до шіазміїїогеиу (Suenson et.al., 1984), що, очевидно, є результатом збільшення спорідненості Оіц-плазміногеиу і t-PA до фібрину. Збільшення спорідненості тканинного активатора та плазміногену до частково деградованого фібрину спричинене окрім збільшення доступності локуса на а-ланцюгу фібрину, який містить Lys 157, утворенням С-кінцевого лізину на а-ланцюгу на поверхні Д-домену. .

У наших дослідженнях Km і ксаі активації Glu-плазміногену t-PA відповідають другій фазі реакції активації, що пов'язано з високою концентрацією тканинного активатора пламіногсиу та особливостями метолу, який не давав можливості точно зареєструвати швидкість реакції на її початковій стадії. Подібні величини підрахованих кінетичних констант реакції активації Glu-плазміногену t-PA за наявності комплексів фібриноген- • ЫДСВ фібрину і Д-Д-МДСВ фібрину дають підстави припустити, що • актнваторннй комплекс другої фази локалізований на'Д;Е-Д тріаді.На рис. Я 10 запропоновані гіпотетичні схеми розташуваїпія^ОІи-гілазуіногену та t-PA . на комплексі фібрнноген-ЬЩСВ фібрину .і •Д-ЕД тріаді. На поверхні комплексу фібрнноген-ОДСВ фібрину Glu -плазміноген U-PА-розташовані на Д-Е-Д тріадах, що підтверджується даними Вейселя (Weise), Papsun, І987); аС-домеііи фібриногену прилягають до Д-доменів, скоріше за все олігомери аС-доменів, які можуть утворюватися .у -цьому комплексі, не беруть участі у формуванні актнваіррнбгб..комплексу. Активація плазміне» ему і ■утвпрешшя.плазміну спричиню*; відщеплення пС-доменів та М-кінцевнх і М

пептидів Вр-ланцюга, розташованих поруч. Після вилученя останніх, хоча це питання остаточно не з'ясоване, комплекс фібрнноген-МДСВ фібрину розпадається. У випадку Д-Е-Д тріади, Glu-плазміиогеи локалізований на "бічній" поверхні тріади і звернений до міжтріадного простору у протофібрилі, a t-PA - на субдомені ТБД фрагмента Д.Утворений в процесі активації плазмін відщеплюе Р(1-42) пептиди, і іріада розпадається. Слід відзначити важливу роль фрагмента Е в утворенні активаторного комплексу на тріаді, оскільки швидкість активації па Д-Д димері на порядок нижча.

Для полімерного фібрину Km активації менша за таку для комплексів і фрагментів, що досліджувалися. Можна припустити, що у полімерному фібрині утворенню активаторного комплексу другої фази активації і збільшенню спорідненості t-PA до плазміиогену сприяє більш близьке розташування суперспіральних міждомешшх ділянок та Д-Е-Д тріад.

Втрата стимулюючої дії комплексу Хг-ЬЩСВ фібрину на процес активації напевно відбувається через нестабільність цього комплексу, який не утворює полімерних структур при заданих умовах проведення експериментів (t^T^C, ц=0,15), аолігомери швидко розпадаються.

Рис. 9. Схема розташуваїшя'ОІи-плазміїюі еку і t-PA на поверхні комплексу фібрмногеи-МДСВ. G!u-плазміноген. і. t-PA' ■ розташовані на Д-Е-Д тріадах, аС-домсни.фібриногену прилягають до Е-доменів. . . ' '

Рис. 10. Схема Д-Е-Д тріади та локалізація Оіи-плазміногену і 1-РА на її поверхні. ОІи-плазміиоген розташований на "бічній" поверхні тріади, і-РА - на субдомеиі ТБО Д-фрагменту.

Отже, на основі зроблених припущень можна конкретизувати уявлення про структури активаторішх комплексів тканинний активатор плазміиогену-фібрин-плазміноген і запропонувати схему просторового взаємного розташування компонентів комплекса на різних етапах процесу активації Сіи-плазміногеиу і-РА та гідролізу полімерного фібрину плазміном, що утворився.

На першому етапі реакції активації активаториий комплекс локалізований на структурах, що містять олігомєрм еС-доменів. На рис. 11 наведено схему активаторного комплексу першої фази; аС-димери, певно, створюють стеричиі перешкоди для оптимальної орієнтації 01и*плазміногену і і-РА. Відщеплення аС-доменів відкриває С-кінцевий лізші, зв'язування з яким викликає зміну конформації молекули Ои-плазміногену. Процес активації переходить у другу фазу, де активація прискорюється в 15-20 разів. Активаториий комплекс переміщується на міждоменні суперспіралізоваиі ділянки, які прилягають до Д-Е-Д тріад.

Рис. 11. Схема активаториого комплексу першої фази реакції

активації. аС-димери, певно, створюють стеричні перешкоди для оптимальної орієнтації Сіи-плазміногену і і-РА.

ВіІСІІОПКІ!

1. Показано, що ковалентна прошивка фібрину по у- та а-ланпюгах гальмує швидкість активації Ои-плазміиогену тканинним активатором плазмїногену і погіршує ефекторні властивості фібрину в процесі активації у порівнянні з пепрошитим фібрином.

2. Виявлено, що фібронектип у непрошитому фібриновому згустку І!Є впливає на ефекторні властивості фібрину в процесі активації; включення фібропектшіу в фібриновий згусток, в умовах його прошивки по у- і а-ланцюгх фактором ХШа, гальмує активацію Ои-плазмшогену І-РЛ та зменшує швидкість руйнування фібрину.

3. У фібринових згустках, утворених з мономерів дезАЛ* та пезААВВфібрину, кінетичні параметри активації Оіи-плазміиогену І-РА залишаються без змін.

4. Вперше показано, що комплексам фібршюген-МДСВ фібрину та Д-Д'-ЬЩСВ фібрину притаманна стимулююча здатність щодо процесу активації Ои-плазмиюгену тканинним активатором плазміногепу.

5. Запропонована схема взаємного просторового розташування компонентів потрійного циклічного активаторного комплексу І-РЛ-фібршг-

плазміноген на різних етапах процесу активації: на першому етапі комплекс утворюється за участю аС-доменів, на другому - за участю Д-Е-Д тріад та міждомешшх суперспіралізованш ділянок сусідніх ниток протофібрил.

Основні положення дисертації надруковано в наступних роботах:

1. Колесник Л.А., Дружина Н.Н., Макогоненко Е.М. Выделение и очистка фибринстабилнзирующего фактора (ФХІИ) нз плазми бычьей крови // Тез.докл. Всесоюзной конференции "Методы выделения, анализа и применения ферментов", Юрмала, 1990, С. 65.

2. Makogonenko Е.М., Lugovskoy E.V., Druzhina N.N., Kolesnik L.A., Kudinov S.A. Fibrinogen-NDSK complex stimulates the plasminogen activation by t-PA // Abstracts of the Tenth International Congress on Fibrinolysis: Indianapolis, USA. Fibrinolysis. -1990. -4, suppl. 3. -P. 86.

3. Макогоненко E.M., Дружина H.H., Луговской Э.В., Колесник Л.А., Кудинов С.А. Активация плаэминогена тканевым активатором и эффекторные свойства комплекса фибриноген - N-концевой дисульфидный узел (N-ДСУ) фибрина. //Укр.бнохим.жури. -1991. -63, N3. -С. 17-23.

4. Дружина Н.М., Яковлев С.О., Колесник Л.О., Макогоненко Є.М., Кудінов С.О. Кінетичні характеристики-активації Глу-плазміногену тканинним активатором плазміногену на полімерному фібрині, що модифікований ФХШау присутності фібронектину// VI Український біохімічний з'їзд. Київ, 1992, С. 12.

5. Дружина Н.Н., Маког оненко Е.М., Яковлев С.А. Роль отдельных структур полимерного фибрина в активации Глу-плаэмииогена тканевым активатором плазминогеиа // Докл. АН Украины. -1993. -2. -С. 151-154.

Піди, до друку і5. /2 '/А йормаг 60x34/16. Папір друк. С$с. друк. Ум. друк. арк. . Ум. фарбо-відб./л/ . Обл.-вид. врк.ґ/ Івраї І00 пр. Зам. Безкоштовно.

. віддруковано в Іясгятуїі математики Ж України 252601 Київ 4, ГСП, вул. Терещенківоька, З