Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль отдельных участков плазминогена в активации его стрептокиназой
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Роль отдельных участков плазминогена в активации его стрептокиназой"
£ 0& НАЦИОНАЛЬНА АКАДЕМШ НАУК УКРА1НИ
,, . , ШСТИТУТ БЮХПуШ ¿меш О.В.ПАЛЛАД1НА
( ■•
Яковлев Сергш Олексшович
УДК 577.151.57
Роль окремих дклянок плазмшогену в активаци його етрептокшазою
03.00.04. - Бюи\пя
Автореферат дисертацн на здобутгя наукового ступеня кандидата бюлопчних наук
Кшв -1997
Дисертащею с рукопис.
Робота виконана у в:дшл1 структури i функцп бшка 1нститугу 6ioximii ¡м.О.В.Паллащна Надюнально1 академп наук Украши
Науковий кср1виик - кандидат бюлопчних наук
Офщшш опоненти: доктор бюлопчних наук, професор Веремеенко Кузьма Микнтович, НЩ отоларингологи im. О С. Колом1Йчснко, МОЗ Украши,
головний науковий сшвробггник,
Проидна установа - 1нституг бюоргашчно1 ximu та нафтохшп, в1дшл xiMii битка, HAH Украши, Кш'в
Захист вщбудеться "27 " жовтня 1997 року о 14 годиш на засщанш спешал130ван01 вчено: ради Д 01 84 01 в 1нституп 6ioximii iM.O В. Палладша HAH Украши (252601, Кит-30, вул Леонтовича,9)
3 дисертащею можна ознайомитися в б1бл1отеш 1нституту бюхшп im .О В Палладша HAH Украши (252601, Кшв-30, вул Леонтовича,9)
Алтореферат роз1СЛаний " 26 " вересня 1997 року.
рирний г.р.кт1рггяп
Макогоиснко Свгеи Митрофанович, 1нститут 6ioxiMii ¡м O.B Паллашна HAH Украши, в о. завщуючого в1дшлом структури i функцп битка.
кандидат бюлопчних наук Верьовка Ceprifi Викторович,
1нсгитуту 6ioxiMÜ ш.О.В.Палладша HAH Украши, старший науковий сгпвробиник
ЗАГАЛЫ1А ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
АКТУАЛЬШСГЬ ПРОБЛЕМИ. Профермент 4»бринолггичнси системи плaзмiнoreн наслщок протеол^тячного розшеплення пептидного зв'язку А^561-Уа15б2 пщ шею <тиваторт плазмшогену перетворюеться на фшринолничний фермент плазмш, шо викоггус изку важливих функцш, пов'язаних насамперед з руйнуванням фгоринового згустку. Реакция ягивацй плазмшогену с найважлквшгаю ланкою механпму активацй ф1бринол1тично1 лстёми.
Ь В1ДОМИХ титв активатор!в плазмшогену особливу увагу за даного часу привертае грептоюназа, бшок, який продукують деяга види (З-гемолп-ичних стрептокоюв. Цей штерес ,'мовлений, по-перше, використанням стрептоюнази в клипш як одного з ефективних х)моол1тичних агента при шфарктах мюкарда i розробкою на и основ1 нових сучасних зомбол1тичних препарата, що потребуе кращого розумшня мехашзма н до, по-друге, на дмшу В1Д фшолопчних акгиватор1в прямо! да стрептоюназа не е ферментом. Вона формуе сгивний центр в молекул1 плазмшогену шляхом конформацшних змш, що не е типовим -осовно переходу проферменту в акгивну форму для протешаз родини хилотрипсину. ктиващя плазмшогену стрептоюназою с зручною моделлю для вивчення 1 розумшня зоцеав зв'язування проферментов з бшками-активаторами, що супроводжуеться насгупною сгиващею профермент«.
Biдпoвiднo до ¡снуючих уявлень про молекулярний механпм активаып плазмшогену ■рептомназою, яи грунтуються на запропонованш 1971 року МкЮпнтоком I Беллом схем;, -рептокшаза утворюе еквшолярний комплекс з плазмшогеном, попм внаслщок жформащйних змш екслонуеться активний центр у сериновому протеазному домеш 1азмшогену без розщеплення пептидного зв'язку А^561-Уа1562. Кшетику цього процесу (вчено, але водночас з цим струкгурш основи взаемодп плазмшоген-стрептокшаза на .огодт не з'ясоват, дшяики молекули плазмшогену та стрептоинази, яга беруть участь у эрмувашп комплексу 1 в]дповщають за його функшювання, точно не локалповаш.
Дослщження локашзацп дшянок зв'язування 31 стрептоюназою на молекул1 ¡азмшогену з використанням моноклоначьних антитш, взаемодп цих дшянок 31 рептокшазою, вивчення ¡х первинно'! структури та рол1 в мЬкбшковш взаемодп, пор^вняння Шово1 специф1чносп стрептоюнази щодо плазмшогену дозволило розширити уявлення про № окремих дшянок 1 висловити припущення про участь деяких залишюв амшокислот [азмшогену в активацц його стрептоюназою, що е важливим для з'ясування механизму тивади плазмшогену V теоретичнях тдстав створення тромболгтичних агенпв
МЕТА РОБОТИ ТА ЗАДАЧ! ДОСЛ1ДЖЕННЯ. Метою робота було локалпувати тяпки зв'язування для стрептоинази на плазмшогеш та з'ясувати роль окремих дшянок [азмшогену у формуванш активного центру в плазмшоген-стрептоиназному комплекс]. Для сягнення ц1С1 мети були поставлен! таю завдання:
1. Охарактеризувати антиплазмшогенове моноклональне антитшо IV-1с. Локашзувати го еттоп.
2. Досшдити локаизацио дшянок зв'язування стрептокшази в легкому ланцюз плазм1ну.
3. Виявити, яи посл1довност1 в молекул! плазмшогену е важливими для активаш останнього стрептокшазою.
4. Адаптувати метод для визначення констант зв'язування та молярной сшввцшошення стосовно реакци утворення комплексу М1ж стрептокшазою i плазмшогеном.
5. Провести кшыасний аналп здатносп плазмшогетв р1зних видав ссавшв формувап комштекси з антиплом IV-1с та 3i стрептокшазою.
НАУКОВА НОВИЗНА ТА ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМЮТЬ РОБОТИ. У результат проведених дослщжень 13 застосуваяням синтетичних пептшцв, що вщповщают; амшокислоттк постдовносп важкого ланшога плазкпну, та бютишльовано1 стрептоганаз] вперше було локализовано шють дшянок молекул к плазмшогену, яю, жовфно, беруть участь; плазмшоген-стрептоыназнш взаемодд - His571-Cys588, А1з601-А1аб20, Val635-Asp660 Gly689-Ala700, Asn71 ]-Glu724 i Tyr759-Trp782. Три з них включали oKpeMi амшокислоти, щ< були 1деитиф1кован1 шшими авторами як важлив1 для зв'язування стрептокшази Визначен< локалвашю ештопа антитша IV-1с, що шпбуе активацно плазмшогену стрсптокшазою Va!709-Gly718. Встановлено, що еттоп IV-lc перекривався з шляпкою зв'язуваши стрептокшази - Asn711-Glu724. Ц1 даш разом 13 результатами дослщжень щодо шггоуванн: активацп плазм1ногену стрептокшазою синтетичним пептидом, що вшповщав послщовност плазмшогену Cys710-Cys726, дали змогу зробити висновок про фуныдональну важлив!ст1 посл]довност1 аминокислот Val709-GIu724 у формуванш активаторного комплексу плазмшоге! - стрептоиназа.
Вперше встановлено, що плазшногени 8 вщцв Ссавшв, вюпочаючи xi, шо hi активуються стрептоиназою, здатт формувати комплекси 3i стрептокшазою. Здаттсп плазмшогетв ссавщв зв'язувати антктшо IV-lc вщбивае '¿хню здатшсть до активаш стрептокшазою.
Вперше описано здатшсть моноклоналыюго анпгши IV-lc, яке не мае каташтични? властивостей, акгивувати плазмшоген. Запропоновано орипнальний мехшшм цьогс феномену.
На тдстав! цих результат було висунуто ппсггезу, що формування комплекс) плазм1ноген - стрептоиназа мае мультицентровий характер. Вирнпальна роль належип дшянт плазмшогена Val709-Glu724, приеднання до яко* активатора шдукуе конформащйн перебудови в молекул! плазмшогену i шдукуе каталггичну актившеть проферменту.
АПРОБАЩЯ РОБОТИ ТА ПУБЛ1КАЦ11. Материи ддеертащз були прсдставлеш ш м1Жнародних конференциях та симпоз1умах : "Fibrinogen and Fibrinolysis" (Ялта, 1995) "Fibrinolysis" (Барселона, 1996), "Thrombosis and Haemostasis" (Флоренщя, 1997). Тако» матер!али дисертадп допошдались на наукових семшарах 1нституту 6ioxiMii ¡м.О.В.Палладшг НАН Укратни. За матергатами дисерташйно! роботи опуол1ковано 3 crarri та 4 тези доповщей.
СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦП. Дисерташйну роботу викладено на 135 сторшках :ашинописного тексту. Робота складасться з) вступу, 5 роздиив, висновив, списку икористаних джерел (238 джерел). Робота мостить 32 рисунки та 6 таблидь.
ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК ДИСЕРТАНТА. Експер «ментальна часгина робсгги иконана дисертантом особисто. Анал>з та об говорения проведет спшьно з науковим гриником. Друковаш npaiii тдготовлен1 за безпосередныи учасп. автора.
ОСНОВНИЙ 3MICT
У першому роздЫ дисертацшно1 роботи подано огляд Л1тератури, включаючи роботи 1 1997 pi к, що висвптпоють структурну оргатзашю, основш властивосп плазмшогену, його ¡аемодио з шшими битками плазми кров1 та юптинами. Розглянуто питания активацн назмшогену до плазмнгу, як основно! лаики в ф1бринолпгичнш систем1 плазми Kpoei людяни. собливу увагу придшено стрептокшаз1, яка е ефективним тромболггичним агентом, ii ;ае.чодп з плазмшогеном та аналгзу осковних протирая в наявних даних лл-ератури по цим этанням
Другнй розд1л описуе матер1али та основш методи дослцскення
У робот! було використано таю матер1али та реактиви К-пдроксисукцишмичобютин, 4-дрокс1азобензен-2-карбоксильну кислоту, ашдин-лужиу фосфатазу, авшин, кoзячi ггимишач1 ¿муноглобулши, кои'гоговаш з пероксидазою хрону, о-фешлещцамш тдрохлорид, тетраметилбензидин дипдрохлорид, я-нлрофенш фосфат (p-NPP), трис, [ротинш, дизопрошлфторфосфат (DFP), п-ттрофенотуанщшобензоат (p-NPGB), 1азмшовий хромогений субстрат S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNa), а-казеш ("Sigma", США); abikinase ("KabiVitrum", Швещя), уроюназу i проурокшазу ("American Diagnostica", США), t-("Genentec", США); авшин-лужну фосфатазу, LmimmoPure Fab Preparation Kit ("Pierce", IIA); карбоксипептидазу Б, сироватковий альбумш бика ("Calbiochem", США), лпин-фарозу, протеш-А-сефарозу, цибакрон-сефароза i сефакрит S-300 ("Pharmacia", Швешя). :шта peaKTHBiB ступеню чистоти "хч" чи вище. Синтетичт декапептиди, яи в1дповщали слщовносп В-панцюга плазмшу були прикреплен! до полхстеринових иггифтзв, адаптсваних я роботи з планшетами для 1ФА, як i синтетичная пептид H-VCNRYIFLNGRVQSTELC-Ij, що вщповшав амшокислотнш послщовносп Val709-Cys726 плазмгаогену, синтезоват на ердофазнш 0CH0Bi методом tBoc chemistry("Multi-Pin System, Chiron, Mimitops Ltd.", Cleyton, ctoria, Лвстра'ия). Планшети для 1ФА (Linbro, "Flow Laboratories, Inc.", США)
Отримання та характеристика препарзпв плазмшогену. Глу-плазмшоген (Глу-Пг) 5дини видшяли з плазми донорсько1 KpoBi за допомогою афшно! хроматографа на лп-iapo3i 4В (Deutch, Merts, 1970) 3 наступною гелъ-фшьтрашею на сефакрш S-300.
ДЕз-плазм1ноген (/Кз-Пг) людини видшяли з фракцп НЬ,з плазми Kpoei по Кону за тодом, що наведено вище
Плазмшогени ссавщв видшяли на Lys-Sepharose 4В з пула (п = 6) цитратно! плазми.
Вал442-плазмшогек було одержано i3 еластазного пдрол!зату ГТг (Sottrup-Jensen,1978)
Отримання та характеристика плазмшу. Плазшн одержували за акгивацн Глу плазмшогену уроюназою, яка була шобшзованана Сефарозт 4В (Norman et al., 1985).
Стрептоюназ-у (CK) вилучали з комерщйного препарату Kabikmase шляхом афшно хроматографа на цибакрон-сефароз1 (Castellino et al, 1976).
EioTHHunoBamta стрегггокщази здшснювали з застосуваняям сукцишмщобютину (Giltinj et al., 1987).
Отримання та характеристика антиплазмшогенових моноклональних антитш IV-1с Пбридоми, яга продукують моноклональне антитхло IV-lc (МКА IV-1с), були сприман кандидатом бюл. наук Колесшковою I.M. (1нститут 6ioximu HAH Украши). Первинну очистю антитш здшснювали висолюванням сульфатом амонио з фракдп, сгтриман01 теля осадженш кл1тин пбридоми з культурально1 рщини за допомогою центрифугування. Подальпгу очистк; здшснювали шляхом афшн01 хроматографи на протеш-А-сефарозг4В (Еу et al., 1978).
1зотип отриманих антитш визначали за допомогою мта ISO-1 ("Sigma", США) Антитшо IV-1 с належить до типу IgGi.
Fab фрагмента антитша IV-1с отримували за допомогою ImmunoPure Fab Preparation Ki ("Pierce", США).
Дослшкення ефекту моноклонаяьного антитша IV-1с на акгиващю плазмшогену Активащю плазмшогену реестрували за звшьненням параттроанипну з хромогенноп субстрату пщ шею плаз.м1ну, який утворювався. Через пев!И пром!жки часу вимхрюваш оптичну гусгину проб при 405 нм на мiкpopидepl для ELISA ("Titertek Multiskan MC" Ф^шшшя). У Bctx ексггериментах реакцию проводили при 37 °С у планшетах дл; муноферментного анал1зу в 50 мМ Tpic-HCl буфера pH 7,4, з 150 мМ NaCl. Концентрат) компонент реакшйно'] сумшп становила : плазмшогену - 0,1 мкМ, активатор1в плазмшогену (уроганаза, t-PA) - 20 IU/мл, стрептоинази - В1Д 10 до 20000 IU/мл залежно вщ умо: експеримевту, стимулятора акгивацн плазмшогену t-PA (FCB-2) - 100 мкг/мл, МКА IV-lc - 0.' мкМ i S-2251 - 0,3 мМ. Кшцевий об'ем дор1внював 250 мкл Визначення амщол1Тично активносп плазмшу в присутносп та без антитш проводили за схемою, наведеною вище, : використанням субстрату S-2251 в концентрацй вщ 0,02 до 1 мМ; кондентраци плазмш; становила 0,05 нМ. Кшетичш параметри разраховували графтчно, лшеаризацпо ртняши М1хаелюа-Ментен проводили за методом Хейнса.
Зв'язування антиплазмшогенових моноклональних антитш IV-lc i бтотитльовано стрептоинази з декапептидами легкого ланхдога плазмшу. Зв'язування проводили за мегодо\ Norton et al., 1993, з незнаниями модифжашями.
Кшыасть 1моб1Л!зованого плазмшогену на поверхш мвдюпланшетгв визначали : використанням азотнокислого срйла за методом Krystal et al., 1985.
1муноферментний аналп (ELISA) проводили зпдно 13 рашше запропонованим методо% (Wisdom, 1976) з незначними модифшацгями.
Методи електрофорезу в пол1акриламцщому r&rci . Гомогеншсть BCix отриманих битюв контролювали за допомогою диск-електрофорезу в потакриламщному гел1 в присугносп 0,1% додецилсульфату натрио. Електрофорез проводили за методом Leamli, 1970 та Weber & Osborn, 1969. Для вушовлення S-S- зв'язюв у битках використовували ß-меркаптоетанол, молекулярну масу визначали за допомогою набору маркерних бшив LMW ("Farmacia"). . Для щентифшадн Глу- та Лп-форм плазмшогену використовували 7,5 % ПААГ з 6,25 М сечовиною та оитовою кислотою, pH 3,2 (Panyim & Chalkley, 1969). . Присуттсть у препаратах антитш можливих домпдок активаторгв плазмшогену контролювали за допомогою ензим-електрофорезу, ф!брин використовували як субстрат (Huessin & Dowdle, 1980).
Вестерн-блотшг здшснювали зпдно ¡з стандартним протоколом (Burnette, 1981). Для етекцп полшептидних зон, яю взаемодшли з антигшами IV-1с, використовували исокочутливий метод (Gillespie & Hudspeth, 1991) з хемипомшесцентнкм субстратом до ероксидази хрону (ECL western blotting detection system, "Aniersham", Beликoбpiтaнiя).
Транем1С1Йна електронна м1кpocкoпiя■ Молекули плазмшогену, антитш IV-1с та омплекси плазмшоген - антитшо IV-lc вивчали методом просв1чуючо1 слектронно! пкроскопп теля ix негативного контрастування (Позднякова та in., 1997). Молекули бшюв ивчали в електроиному м1кроскот Н-600 ("Hitachi", Японк) при збшыпенш 50000.
У третьему , четвертому та п'ятому роздйах приведен; основш результата ослшкення та ix обговорення.
Локалпашя дыянок зв'язування для стрептокшази на молекул! плазмшогену.
Наявн1 суперечносл в даних лзтератури не дозволяють однозначно вщпошсти на итання про амшокислсггю послщовносп в сериновому прстеазному домеш плазмшогену, яи ключей у зв'язування 3i стрептоиназою. Дтя локашзацй делянок зв'язування ми икористовували шобшзоват декапептиди, що в1дповщають легкому ланшогу плазм1ну юдини, та дослшкували зв'язування з ними бкггатльоважм стрептоюнази i моноклональних нтитш IV-lc, ям шпбували активацио плазмшогену стрептоиназою.
Анагпз до антиттл клону IV-lc на активацио плазмшогену рпяими активаторами иявив, що антиттло IV-lc шэтенщюе активацию плазмшогену t-PA на 13%, уроюназою - у 4,5 аза. Антиттло IV-lc 1нлбуе активашю плазмшогену стрептоюназою на 90% (рис. 1). Ми також оказали, що це антиттло прискорюе швидость розщеплення хромогенного субстрату S-2251 лазмжом удвое (рис.1), а прегтеолпична актившеть плазмшу (казешолтг-гна) зростае в рисутносп антитша з 11,3 до 16,3 к о. /мг бшка. Кшетичний ананз впливу МКА IV-lc на аталггичну актившеть плазмшу сшдчить про збшыпення К^, з 22 с"1 до 27 с1 та зниження Км 1,25x1с4 М до 0,05x10"^ (у 25 раз1в). Таким чином, в результат! взаемодк МКА IV-lc з
плазмшом збшьшуе афшшсть субстрату до активного центру плазмшу та катагатнчв ефекгившсть останнього.
За данвмн ¿муноферментного анализу та весгерн-блотингу (рис.2 1 рис.3) зв'язувани МКА IV-! с з плазмшогеном та плазмшом не блокусться 20 мМ 6-АГК, то вказуе в вщсутшсть зв'азування антитша з плазмшогеном за рахунок л1зинзв'язуючих дщянок аятигснних детершнаитах. Антитшо зв'язуегься з Глу-Пг та .Шз-Пг людини, з пепси ланщогом плашшу, не взаемодае з йога важким ланцюгом та не зв'язуегься з плазмшогено: бика МКА IV-1с не зв'язуегься зi стрегггоыназою. Огже, еттоп для МКА IV-1с
1.2
Рис. 1. Вплив МКА IV 1с на активацио Глу-Пг р1зннки активаторами та на амдазну акгиввасть плазмшу в при-сутносп 8-2251. Незапприховаш символи -активащя у вщсутносп антити заиггриховаш - за наявносп останшх.
МКАГУ 1с з Б-2251; 1,2 - плазмш; 3,4 - г-РА, 5,6 - урогаваза; 7,8 - СК
метиться в сериновому протеазному домеш плазмшогену ¡, ймовфно, в структурно важливи для акгивацй Пг стрептокшазою дшяшц.
Для точно! локал1заш1 ештопа ми викорнстовували наб1р ¡мобшзованих на поверхн поластсрскоБНх шшв десятячленних пептида, що вцщовщали амшокислотшй послщовност легкого ланцюга плазмшу. Було знайдено, що амшокислотна послщовшсть У^ТС^-ИуТИ (рис. 4А) молекули плазмшогену являла собою ештоп для цього антитша у вигляда лшшно дшянки. Пряме зв'язування бютишльовано! стредтокшази з декапептидами легкого ландюп дало змогу ваявити пасть посшдовностей ачшокнслот: №$571-Суз588, А1а601-А1аб20, Уа1635 АярббО, 01уб89-А1а700, Ая1711-С1и724 1 Туг759-Тгр782 з високим ршнем зв'язування з стрептокшазою (рис.4 Б). Одна з цих дшянок, Азп711-01и724, частково перекривалася : декапептидом, що е ештопом для МКА Г\Мс. До складу шдшх двох , А1а601-АЬ.б20 1 Уа1635-АзрббО, входять НЬбОЗ 1 Аэр64б - амшокислотя активного центру
1.0 -
оз-
9 0.6-
н
0.4 -
0.2 -
0.0 i
А-ф '■ А—ф —■—■ 0.0001 0.0010 0.0100 0.1000 1.0000 10.0000
JÄAIV-Ie (юг/tu)
.2 Зв'язування MKAIV lc з Глу-Пг, Пм i CK. 1 - Пг, 2 - Пг у првсутносп 20мМ 6-АПС, 3 ■ 4 - Пм з 20мМ 6-АПС, 5 - CK. Концентр ащя антитша подана у лoгapифмiчнiй шкал1.
1 2 3 4 S б
«Д»
1 2 3 4 6 В
67 ^ .
43 ^
30 ^
20 __
es
3. А - Елекгрофореграма бшюв в 10% DS-Na-ПААГ: 1 - маркери, 1 - Глу-Пг, 3 - Шз-Пг, 4 -aisa, 5 - Пм, б - CK. Bei зразки було вютовлено ß-меркапгоетанолом. Вестерн-блотшг. Бшки з гелю (А) перекосили елеетрофоретично на штроцелюлозну эрану та шкубували з MKA IV I с. Нумеращю треюв подано вщювшно до гелю А. 1естерн-блотшг Глу-Пг. Гнкубаццо з MKA IV -1с проводили в присугносп 20 мМ 6-АГК.
Номер» досшмггвдв
Рис.4. Зв'язування MKAIV-1 с (А) i б1отиншьовадо1 СК (Б) з дека-пептидами легкого ланцюга плазмшу. КожвиЗ наступния декапептид охотное посшдовшсть зсунуту на дв1 амшокислоти в напр ямку С-кшця плазмшу.
Б
1 -
Нааери дехадеягядй
плазмшу. Отримащ результати узгоджуються з даними лгсератури про наявшсть трьо> потеншйних дшянок зв'язування для СК у протеазному домеш Пг (Wohl, 1984; Summaria. 1982; Dawson, 1994). Тахож було выявлено дв1 додатков! посл!довносп : GIy689-Ala700 i Tyr759-Trp782, яю не mí стили вщом! функционально важлив1 амшоки слоги протеазногс домену. Прштущення про мупьтисайтове зв'язування СК у протеазному домеш плазмшогену добре узгоджуегься з результатами дослщжень локалззаца на протеазному домеш СК-зв'язуючих дшянок i ¡x pcuii в зв'язуванш та активацп стрептоияазою.
Роль окремих дшянок зв'язування для СК у протеазному домеш плазмшогену щодо експонування в профермекп активного центру залишасться невдомою. Ми досгаджували вплив синтетичного пептиду H-VCNRYIFLNGRVQSTELC-NHj на акгиващю плазмшогену стрептоганазою, осылькн вш вщповщае послщовносп Val709-Cys726 плазмшогену, в якш були локашзоваш одна з дшянок зв'язування для СК - Asn711-Glu724 i ештоп для МКАIV-1с. За умов предшкубацш протягом 20 хвилин при 37°С 0,02мкМ СК з пептидом до привнесения 0,1 мкМ плазмшогену та 0,ЗмМ S-2251 показ ник 1С5о доршнюе 2,5 х 10* М. 100% шпбування, ímobípho, не вщбувалось тому, шо kpím зазначено! послщовносп можлива участь ше 5 дшянок,
) залучеш у взаемодао з СК, що дозволяе ш випсмти пептид з комплексу пептид - СК. [ходячи з того, що пептид з амшокислотною послшовностто Val709-Cys726 плазмшогену ециф1чно дапбуе активащю Пг стреятоганазою, можна припусгити, що ддлянка зв'язування я СК, яка е важливою для активаци Пг стрептокшазою, М1ститься в послщовносп Val709-u724.
»слщження видово1"спеииф'|чност! формування актнваторного комплексу плазмшоген -
стрептокшаза
Стрептоюназа мае високу видову специф1чн1сть при активаци плазмшогену. Бона являе 5ою зручну модель для дослшження pont окремих далянок зв'язування СК в утворенш, збилзацп та функщонуванш активаторного комплексу Пг - С К. Молекулярний мехашзм ого процесу ще не повною Miporo з'ясований, немае однозначно'! вдоювца на запитання про 1жлив1сть утворення комплексу Пг ссавщв ргзних вида з СК. Незважаюч! на те, що для ремих видав ссавщв, плазмшогени яких не активуються СК, комплекси Пг -СК не показаш, яю з aBTopiB вважаюгь, шо таи можуть ¡снунати (Cederholm-Williams et al., 1979, Wang et al., 95). Для з'ясування рол1 окремих амшокислотних залишив на дшянщ Val709-Glu724 в гивацп' Пг стрептоганазою було досл1джено утворення комплексш мш 8 видами Пг ссавшв иш1, кроля, собаки, cbhhî, bîbiù, бика, коня та людини) i СК, активашю ïx р1зною ильистю С протягом тривалого часу та здатюсть зв'язувати МКА IV-1 с.
Для ошнки спор1Диеност1 СК з Пг ми визначали парамегри зв'язування кзлыасно. Для значения констант дисошахш та молярного сшввцщошення в кoмплeкci було модиф1ковано шоактивний метод ¡з застосуванням ав1дин-бютиново1 системи дегекцн. Пг ссавшв було эбшзовано на поверхя1 шчок планшета для 1ФА; визначено кшыасть зв'язаного бшка (вщ ,8 нг/в1чко для Пг людини до 35 нг/шчко для Пг мипл). Бютиншьовану СК (0-640нМ) субували протягом ноч! при 4°С з 1мобшзованим Пг у присутносп 0,1 мМ pNPGB, ¡нпбггора эинових протешаз. Поим теля шкубацп з кон'югатом авгдином-лужна фосфатаза протягом т>дини при к!мнатшй температур! додавали p-NPP, проводили яетекщю при 405 нм через 1 пину теля початку реакци з субстратом для лужжя фосфатази . Кшыасть бютиниьваноУ СК, а зв'язалася з Пг, визначали за допомогою кагпбруватьних кривих залежносгп р№ня оптично! :тини, зумовлен01 шею лужног фосфатази вщ илькосп зв'язано!' СК за бшком. Для значения Кд ¿зотерми зв'язування б!отиншьовано1 СК з шобшзованим Пг ссавшв исформували в координатах Лангмюра ([Пг0]/[Пг-СК] - [СК]'1), де [Пго] - загальна ильисть [янок зв'язування на ¡мобиизованому Пг, [Пг-СК] - юльысть молекул СК, адсорбованих на ; [СК] - ршноважна концентращя СК. Тангенс кута нахилу прямо! дор^внюе Кд, а вщр^зок, ) в1дикасться прямою вщ oci ординат, вшповщае [Пго]/[Пг-СК]. Вщповцшо до одержаних яих, Пг Bcix доапджуваних видав ссавщв здатш формувати комплекси з СК в умовах :перименту, хоча i з р13ною спор1дненшстго. Найбшьшу спорщненшсть i найменьшу Кд, як i редбачалось, мае Пг людини - 2,09+0,12 нМ, одержане значения леребувае в межах значень [ 0,05 - 21+3 нМ, що були одержан! шшими авторами за допомогою р!зних металле
(Cederholm-Williams et al., 1979, Lijnen et al., 1994; Reed et al., 1995). Зпдно з одержали даними, тшьки Пг людини формуе комплекс 13 СК в еквшолярному сптвщпошеин1, i узгоджусться з даними ттератури та шдгверджуе коректшсть запропонованого методу.
Ми дослщжувалк активуючу дао СК (сшввщношення СК до Пг 0,025/1, 1/1, 10/1) продовж тривалого часу. За здатшстю активуватися стрептоганазою Пг розглянугих вш ссавщв можна розмкггити в ряд : людина-собака-юнь-вшця-кршь, Пг мшш, свиш та би стрептоганазою практично не активувались. Зпдно 13 одержанный даними, Пг мож розподоштн на 3 групи, яи практично сшвпали з градашею, наведеною ¡ншими авторш (Wohl et al., 1983) . 1 - погребують каталгтичну гальккггь СК (людина), 2 - потребую надоишок СК (кршь, собака, инь, втця), не активуються СК (миша, бик, свикя)
Методом 1ФА було досшджено здатшсгь Пг вищезгаданих видав ссавшв зв'язува МКА IV-1с. Вяявилося, що найбшьша спорцщеншсть до анталл властива Пг людини - С: доршнюе 0,5 нМ. Пг бика та свиш не зв'язували МКА IV-lc. Таким чином, МКА IV-притаманна висхжа видова виб1рков1Сть, яка е подабною до активуючо! дл СК.
Для пор1вння здатносп Пг зв'язувати СК, активуватися СК i зв'язувати МКА IV-lc табл 1 наведено основш дан1 для 8 видш ссавщв. Отримаш результата свщчать про те, що С здатна формувати комплекси з ус!ма проанал1зованими Пг, хоча i з р1зним молярш стввщюшенням в них, до того ж не ви комплекси виявляють активаторну активность i маю ргагу здаттсть до експонування активного центру, про що свцрнпъ час виявлення ам1даз*. активностт (lag-перюд). Спостерггаеться висока сгупшь вшювщносп мыс здатнкл плазмшогешв до активацн СК i зв'язуваннжм МКА IV-lc. Спираючись на анаг законом1рностей, що простежуються в отриманих за цими трьома важливими показникад даних - здатносп зв'язувати СК, активуватися СК i зв'язувати МКА IV-lc, ми висловлюо припушення, що дшянка Пг людини Val709-Glu724 виконуе ключову роль в утворен активаторного комплексу Пг - СК. 1мов1рно, саме в цш дшянш М1стяться аминокислот залишки, приеднання до яких веде до конформащйних перебудов у молекула Пг, внаслщок
Таблица 1. Основш параметри зв'язування Пг р'пних виаю ссавщв з СК i МКА IV-lc.
Параметри Види ссавщв
зв'язування _
миша кроль собака свиня в^вця бик юнь людина
Кд(нМ) 18,48 10,21 7J 7 67,25 21,74 36,00 7,89 2^09
Пг/СК 2,60 1,74 1,38 1,44 1,89 2,63 1,81 1,10
lag-фаза (мин) 150 30 10 н.о. 15 н.о. 15 <5
с5о«днм) 5,0 2,5 1,8 н.о. 4,0 н.о. 2,0 0,5
Ка> Пг/СК - константа дисошацп тамолярне сгпввщношення Пг до СК у комплекс!; lag-фаза - час до початку пдролву S-2251 при активам! Пг стрептоганазою при моляр Hot. сшввщношешц 1:10;
С»».. - концентрашя МКА IV-lc, при якш досягаегься 50% р1вень зв'язування МКА IV-lc.
чого формуегься активний центр.
Ми проанал1зували амшокислотну послщовшсть для 7 дослшженних нами Пг ссавшв i Пг макаки-резус на далянщ, що вщповщае Val709-Glu724 Пг людини. У табл. 2 наведет амшокислотш послшовпосп Пг людини (Petersen et al., 1990), собаки (Shaller et al., 1989), bîbib (Shaller et al., 1992), коня (Shaller et al., 1991), свшн ( Marti et al., 1985), бика (Shaller et al., 1985), мини (Degen et al., 1990) i макаки-резус (Tomlinson et al., 1989) наш далянш. Ha bijmihv вщ легкого ланцюга плазмпгу, який загалом е консервативним фрагментом молекули, дитянка Val709-Glu724 е вар1аб1льною, mo i зумовлюе видов! особливосп щодо активаци Пг гтрептоиназою, утворення активаторного комплексу Пг - СК, йоге функцюнування та характер взаемодп з МКА IV-1с. Замша пдрофобного Phe на пдрофшьний Тут в 715 толоженш, ÎMOBipHO, знижуе здаттсть МКА IV-lc зв'язувати Пг собаки, В1ВЩ, коня, в тор!внянн) з Пг людини, замма Asn на Asp у положенш 717 у Пг свит та бика робить земожливим комплексоутворення з антштламн, активацио Пг. Дуже велика рпниця в штивацй Пг людини проти активаци' Пг шших видт ссавщв обумовлена, на наш погляд, юслиювтстю розташування зарядш на вказанш дшянщ ( у Пг макаки-резус, який активуеться гак само як i людський Пг каталпичною ильмстю СК, е замени в трьох положениях - Arg на [Ъг в 719, Gly на Lys в 721 i Ser на Thr в 722, але послщовшсть розташування заряд1в |алишасться незмшною), виникнення додаткового позитивного заряду, який несе залишок
Таблица 2. Послиовшсть амшокнслот на дишнш Val709-Glu724 Пг людини та »¡дповщним за тополопсю дшянках Пг собаки, вшцц коня, cbhhï, бика, миип та макаки->езус. Залишки амшокнслот, яю, 1мовфно, е ключовими в активаци катаптячною юлькостю Ж позначено жирним шрифтом, залишки амшокнслот, яи вщрпшпоться вщ вцщовщних ïm у 1г людини шдкреслено. Вертикальна лш!я позначае межу дитянки зв'язування для МКА IV-lc ia Б-ланцюгу плазмша
[юдина "обака
(1вця
!шь !виня ик
1иша
1акака-рез Val-Cys-Asn-Ars-Tyr-Glu-Phe-Leu-Asn-Glvl-Thr-Val-Lys-Thr-Thr-Glu
+ [ +
709 718| 724
Val-Cys-Asn-Arg-Tyr-Glu-Phe-Leu-Asn-Gly|-Arg-Val-Gln-Ser-Thr-Glu + - |+0 Val-Cys-Asn-Arg-Tyr-Glu-Tyr- Leu-Asn-Gly|-Arg-Val-Lys-Ser-Thr-Glu
+ - I + +
Val-Cys-Asn-Arg-Tyr-Glu-Tyr- Lcu-Asn-Glvl-Arg-Val-Lys-Ser-Thr-Glu + - ( + +
Val-Cys-Asn-Arg-Tyr-Glu-Tyr- Leu-Asn-Glvl-Arg-Val-Lys-Ser-Thr-Glu
+ - I + +
Val-Cys-Asn-Arg-A^-Glu-Tyr-Leu-AsE-Glyl-Arg-Val-Ljs-Pro-Thr-Glu
+ - I + +
Val-Cys-Asn-Arg-Asn-Glu-Tyr-Leu-Asp-Glvl-ArR-Val-Lvs-Pro-Thr-Glu
+ - I + +
Val-Cys-Asn-Arg-VM-Glu-Tyr-Leu-Asn-Asnl-Arg-Val-Lys-Ser-Thr-Glu + I + +
лпину, для Bcix дослцшених вщцв ссавщв у положенш 721 спричинюе уповшьнеш утворення активаторного комплексу, впливае на його стабшыисть i як результат, - призвода до неможливосп активуватись каталггичною кшьюстю CK.
Активашя плазмшогену некатал ¡тичним антиплазмшогеновим моноклональним антитиом IV-lc: механпм активацй
Вщомо, що моноклональш антитша здатш моделювати даю специфтошх Л1ПШД1В1 реиептори, до яких ix одержували, змшювати катал1тичш властивосп ферментгв, са> виявляти каталгтичш властивосп до субстрата. МКА IV-lc було охарактеризоване s антитшо, шо шпбувало активащю Пт стрептокшазою, прискорювало активащю Пг уроиназо) та t-PA, змшювало каталгтичш параметри плазмшу При подальшому дослиюкенш цих аитип ми знайшли ушкальний ефект, а саме : вони були здатш безпосередньо активуваги Пг.
На рис.5 зoбpaжeнi крив1, що описують активащю Глу-плазмшогену рпним концентрашями МКА IV-lc у присутносп S-2251 (рис.5А), i водночас електрофоретични контроль реажцшш» cyMimi 3i стввдаошенням Пг : МКА IV-lc =1.1 (рис.5.Б). Активащ починалась пюля 120 хвилин lag-фази, що свщчить про досить тривалий час для формуванн активного комплексу Пг - МКА IV-lc. Електрофоретичш даш вказують на те, що як початковому моменп, так i теля шкубацп протягом 2 годин, теля чого експонуеться активни центр, Пг залшшаегься в комплека Пг- МКА IV-lc, не перетворюючись на плазмш. ГЬсля годин шкубаци enoerepirann деяке зменшення кшькосп бижа в зош Пг, за 20 годин шкубац практично весь Пг був розщеплений до плазмшу, в той час як контрольний препарат (бс антитш) залишався штактним. Таким чином, на вшм1ну в1д бакгер1альних неферментни активатор1Б Пг - CK i стафйююнази, Korpi з високою швидыстю перетворюють'Пг на плазм1 (Lijnen et al., 1991), у комплекс! Пг - МКА IV-lc перехщ Пг у плазма здшснюеться протяга тривалого час>- та е подабний до такого переходу у комплекс! Пг - CK на початковш стад ¡снування останнього (nepmi 10 хв., +22°С) (Collen et al., 1993). Знайдений нами ефек забезпечуеться тшьки специфгчною шею антитша, а не за рахунок можливих домшо aKTHBaTopiB. Антитшо саме не виявляе амщазно! активносп по в1дно11!енню до S-2251 Одержан! препарата МКА IV-lc були едектрофоретично гомогенними, i'x специф1чн активность збер!гаеться шсля обробки дпзопротлфторфосфатом з наеггупним даажзом та шел додатково1 очистки на лп-сефароз1 4В. Анал1з препаратш високочутливим методом ензим електрофорезу домнпок вщомих активатор« не виявив. Препарата МКА IV-lc не утворюют зон газису, в той же час еквгмолярний комплекс Пг-МКА IV-lc шсля попередным шкубац; протягом 2 годин виявде протещаз!г/ актившеть на pism бшково! зони Пг.
Синтетичний пептид H-VCNRYIFLNGRVQSTELC-NH2 (0,1 мкМ) повшепо блоку активащю Пг антитшом (рис.6), ICso доршшое 2 нМ.
МКА IV-lc, як i CK виявляло видову специфмшсть по вццюшеншо до Пг ссавщв, щ узгоджуегься з даними про зв'язування, одержаними методом 1ФА.
180 240 Час(х»)
Рис.5. Акгнвуючкй ефектрпних концентр ащй МКАIV-1 с на Глу-Пг(0,1 мкМ).
А - Молярне сшввщношення Пг: МКА IV-lc складало 1,1:0(7); 1:0,33 (¿); 1 : 0,5 (J); 1 : Jgo 1 (-0; 1 : 2 (J) Реакццо проводили при 37°С.
94
Б кДа 1 2 3 4 5 6
......■ Б - Електрофореграма зразмв Пг
(0,1 мкМ) 1 МКА 1У-1с(0,1 мкМ). 1
_ ,_ ^^, _ . . - LMW; 2 - Глу-Пг; 3 -Глу-Пг з
~ МКА IV-1с, 4 - Глу-Пг з МКА IV-
67
» ___1с, час шкубадц 2 годнни; 5 - час
43 ^е» шкубацц 6 годин; б - час шкубацп
21 година; 7 - Глу-Пг, час шкубаш! 30 ^ 21 година. Инкубацйо проводили
при 37°С. Зразки вшювлено.
20
Комплекс Пг з МКА IV-lc мае не ильки амгдазну актившстю, аде и активаторну в [стеки з Пг бика, який традицшно викорисговуеться як субстрат для вивчення дц pi3HHX тивзгорш на 0CH0Bi CK, до дц яко! вш е шертаим.
Активней центр комплексу Пг-МКА IV-lc мае характеристики такого сериново! хггешазн, оскшьки його ашдазна аетившсть повтспо ¿нгибуеться 10'J М аопрошлфторфосфатом i 10"4 М pNPGB (рис.7). На ввдмшу вщ CK, яса захищае Пг/Пм у мплекс! вщ до апротиншу та aj-антиплазмшу - шгибггор^в плазмшу, комплекс Пг-МКА IV-13 ними взаемодош.
Осилькн Пг виязяяе високу конформацшну рухливкггь при до низькомолекулярннх -андав (Markus, 1996) i в сво'ш структур! мае Л1зинзв'язук>41 дшянки, ми вивчаяи даю 6-АГК провес активацц антитиом IV-lc. Виявилось, що вона пригшчуеться в ко!хцентращях жчих за таку, що шгибуе активннй центр плазмшу (до 10 мМ), 50% шгибуючо! до остеригаеться при концентрата 6-АГК 80 мкМ. Проте, 20 мМ 6-АГК не впливае на
360
Рис.6. Ефект синтетичного пептиду, я кий вцшовщае посшдовносп Уа1709-Сув726 Пг людини, на активащю МКАIV-1с. А - Контроль (без пептиду) (7); Концентрация пептиду: 10'5 М (2); 10"*М (3); 10'7М (4); Ю^М (5); 10"5М(б).
Рис.7. Ефект низькомолекулярних, пепгидних 1 бшкових шгибитор1в плазмщу на активащю Пг (0,1 мкМ) МКА1У-1с(0,1 мкМ). 1 - Пг з МКА IV-1с; 2 - у присутиосп 10"3М ОБР; 3 -10"4 рМЮВ, 4-100 КИЕ/мл апротишну; 5 - 0,2 мхМ а:-антиплазмшу. У випадку 4,5 ¡нпб'.тори додавали тетя 2 годин ш кубаци Пг з МКА IV-! с.
зв'язування антитша IV-1с з Пг \ плазмшом в 1ФА та вестерн-блотингу (Рис.2, 3). Цей ефеш анпшл ве е зумовлеаий перетворенням шд даао Л1ганду Пг ¿з закрито* конформаци (Глу-Пг) на вщхриту (Л13-Пг), тому що активашя Шз-Пг шпбуегься 6-АГК подобно до таки Глу-Пг Таким чином, у випадку з антиплом IV-1с ми зпкнулись 31 протир1ччям М1Ж даними щодс зв'язування 1 активащ! МКА 1У-1с у присутиосп 6-АГК. Тому ми припустили, що дш акгиваци Пг антитиом взаемоди на однш дшянщ (ештопу) недосгатньо. Осильки МКА IV-1с належать до 1£01, ми припустили, що знайдений нами аюгивуючий ефект антитгп забезпечуеться окрхм зв'язування в ештош прстеазного домена Пг ще 1 взасмодаао з газш-зв'язуючимн дшянками кршшпв своею Бс-дшяккою. Можпивсть утворення такого комплекс) тдгверджуеггься даними елекгронжя мжроскош!.
Запропововашш мехашзм активапи Пг МКА IV-1с був експеримептадшс шдгвержекий з викорисганням РаЪ-фрагмееттв МКА IV-! с, та антитш, у яких вщсуты С-иицев1 тзияи, що IX видаляли карбоксипепгщшою Б. РаЬ-фрагмекти та МКА IV-1с без С-кшдевих шзишв втрачають здагшсть до формування активного центру в комплекс! з Пг, при цьому 1х здагшсть зв'язувати Пг, шпбуватя активащю Пг стрептоюназою та посшповати амцшну актившсть плазмшу в поршнянш з нативними анптлами не зшнюсться. На користь
потези про двоцентрове зв'язування свщчать досиди да антн-пла IV-1с на pbiri формн тазмшогену людиня - Глу-Пг, Лгз-Пг, Вал^з-Пг, як пор1вняти з даао СК (рнс.8). Вал»«-Пг, жн не мае в структур! високоафших лпин-зв'язуючнх далявок, ве формуе активного ¡мплексу з МКА IV-lc. У Шз-Пг, на в ¡дао ну вщ взаемодц з СК, повшьшше експонуегься ггивний центр у комплекс! з антитшом, як nopiBmrra з Глу-Пг.
60 120 180 240 300 360 Час(хь)
Рис.8. Активация Глу, JIÍ3, Вапиг-Пг (0,1 мкМ) стрептокшазою (10Щ/мл) i МКА IV-lc (0,1 мкМ). Активащя СК(/-3); МКА IV-lc {4-6). Глу-Пг - 1,4; Шз-Пг-2,5; Вал442-Пг - 3,6.
На шдстав! вшценаведеного, ми припускаемо, що приеднання моноклонального гтшгла IV-lc до дшянкн Val709-Gly718 шдукуе конформацшш перебудовн в молекул! Пг з :спозшцоо активного центру з властивостями сериново! протешази, частково моделюючи юцеси в комплекс! Пг - СК. Для налагая необхиакн просторово'1 ор!ентацй цих реагуючих шюнештв, для шдукци каталиичнсл активносп необидною е взаемодк С-кшцевого л1зину мнцюга антитша з крингловими структурами Пг, що м!стять л!зинзв'язуюч! дошлей. Висока дова специф1чшсть цього процесу вказуе на роль далянки Val709-Gly718 Пг як ключово! у >рмуванш активного центру проферменту.
ВИСНОВКИ
Вперше локашзовано ппсть потенщнних дшянок зв'язування стрептокшази в сернвовому ютеазному домеш плазмшогену : His571-Cys588, А1а601-А1а620, Val635-Asp660, Gly689-а700, Asn711-Glu724 i Тут759-Тгр782.
Локашзовано ештоп антнтша IV-lc, що ¿нпбуе акгивацно плазмшогену стрептокшазою, bíh ститься в дошли Val709-Gly718 легкого ланцюга плазмшу i псрекриваеться з одшею з инок зв'язування стрептокшази Asn711 -Glu724.
Розрсблеко внеокочугливнй метод визначення констант дисощацц для б^молекулярких акцш на ochobí реакци авццш-бютин, якин дозволяе також розраховувати молярш 1вв!дношення компонентов у комплексах, що утворюються.
Вперше показано утворення комалексЬ мЬк стрептокшазою i плазмшогенами 8 видав авцш (мили, кроля, собаки, вшщ, cbhhí, бика, коня та людини) i визначено Кд реакшй
комплексоутворення, Тшьки плазмшоген людини угворюе екв1молярний комплекс стрептоиназою
5 На тдстав! пор1внялького аналву здатносп плазмшогешв ршшх вшив ссавшв активувата стрептоиназою, зв'язувагги стрегггокшазу i антитша IV-lc та первинно! структур плазмшогешв висловлюеться припущення про те, що наявшсть аспарагиново1 кислоти положениях 717 е важливим для блокуваиня активадй плазмшогену свит та бш стрептоиназою.
6 Виявлено ун1кальну здатшсть некаталшгшого антитша IV-lc ¡ндукувати утвореш активного центру в молекул! плазмшогену людини. Комплекс плазмшоген - антитшо IV-lc м; активаторну здатшсть по вщношенню до плазмшогешв шших вида ссавшв.
7. Запропоновано i експериментально пщтверджено орипнальний мехашзм утвореш ахтиваторного комплексу плазмшоген - антитшо IV-lc за участю паратопу антитша, ештопу сериновому протешазному домен1 плазмшогену i С-кшцевого лпину антитша ■ л!зинзв'язуючих дшянок кринглових структур плазмшогену.
8 Показано важлив1сть ран1ше не описано! дшянки VaI709- Glu724 в активацп плазмшоге! стрептоиназою.
ПЕРЕЛ1К РОБ1Т, ЩО ОПУБЛ1КОВАН1 ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАВД1.
1. Yakovlev S., Rublenko М., Izdepsky V., Makogonenko Е. Activating effect of tf plasminogen activators on plasminogens of different mammalia speciesII Thromb. Res - 1995 Vol.79, N4 - P. 423-428
2. Яковлев С.А., Рубленко M.B, Издепский В И., Макогоненко Е.М. Особенное! действия активаторов плазминогена на плазминогены из разных видов млекопитающих // До: НАН У крайни. - 1995 - 12. - С.96-99
3 Druzhina N., Makogonenko Е., Yakovlev S. Studies of the t-PA-catalysed Glu-plasminoge activation on different models of polymeric fibrin. //Thromb. Res. - 1997. -Vol.87, N1. - P. 131-13S
4 Druzhina N., Makogonenko E., Yakovlev S., Kolesnikova I. and Cederholm-Williams S. . streptokinase binding site is located in the Val709-Glu724 sequence of plasmin B-chain. Fibrinolysis. - 1996. - 10. - Supple 3. - P.8
5. Druzhina N., Makogonenko E., Yakovlev S., Kolesnikova I. and Cederholm-Williams i Investigation of the plasminogen-streptokinase interaction // Укр.биохим.журн. - 1996. - 68, N4. - ( 20.
6. Yakovlev S., Korolchuk V., Makogonenko E. and Cederholm-Williams S. Study of specif specificity of plasminogen-streptokinase activator complex formation.// Thromb. Haemostas. - 1997 Supplement - P.746-747.
7. Yakovlev S., Makogonenko E., Kolesnikova I. and Cederholm-Williams S. The ant plasminogen monoclonal antibody IV-lc, direct to Val709-Gly718 site, induces catalytic activity i plasminogen.// Thromb. Haemostas. - 1997 - Supplement. - P.745.
Яковлев С О Роль окремих дшянок плазмшогену в активацц його стрептокшазою. -
(тсопис.
Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за шщальшстю 03.00.04 - бюхлкпя. - 1нституг бюХ1мп ш. О.В. Палладша НАН У кратки, Кшв, >97.
Дисертащю присвячено достижению взаемода плазмшогену (Пг) 1 стрептокшази Ж). 3 засгосуванням набору синтегичних пептидав , що вщповщають Б-данцюгу плазм1ну, герше було локализовано б потенцшних дшянок зв'язування СК в протеазному домеш Пг, гтановлено, що ештоп антиплазмшогенового моноклонального антитша 1У-1с, що шпбуе гтиващю плазмшогену стрептокшазою, перекриваеться з одтею !з дшянок зв'язування СК на >огеазному домеш Пг. За допомогою розробленого високочутливого методу анатаа ворення комплексов мгж Пг 1 СК на основ1 реакцп ав1дин-б10тин визначен! Кд 1 молярш нввцшошення в комплексах СК з Пг восьми видав ссавщв. Виявлено ушкальну здатшсть :катал1тичного антитша IV-!с шдукувати активний центр в молекул! плазмшогену людини. шропоновано та експериментально тдтверджено оригшальний двоцектровий механизм дуют активного центру в комплекс! Пг - антитшо IV-1с. Вперше описано ключову роль 1Н1Ш0 не 1дентиф1ковано\' дшянки зв'язування СК Уа1709-0!и724 в активацц плазмшогену рептоюназою.
Ключовг слова : плазмшоген, стрептоганаза, активация плазмшогену,' структура бшгав, лгаклональш антитша, с гринов! протешази.
Яковлев С. А. Роль отдельных участков плазминогена в активации его сгрептокиназой. "укопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по ециальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им.А.В. Патладина НАН Украины, 1ев, 1997.
Диссертация посвящена исследованию взаимодействия плазминогена (Пг) и рептокиназы (СК). С использованием набора синтетических пептидов, соответствующих Б-пи плазмина, впервые бьшо локализовано б потенциальных участков связывания СК в отеазном домене Пг. Установлено, что эпитоп антиплазмяногенового моноклонального титела IV-! с, которое ингибирует активацшо Пг сгрептокиназой, перекрывается с одним из астков связывания СК на протеазном домене Пг. С помощью разработанного 1сокочувствительного метода анализа образования комплексов между Пг и СК на основе акции авидин-бнотин определены Кд и молярные соотношения в комплексах СК с азминогенами 8 видов млекопитающих. Выявлена уникальная способность каталитического антитела IV-! с индуцировать активный центр в молекуле плазминогена ловека. Предложен и экспериментально подтвержден оригинальный двухцентровый
механизм индукции активного центра в комплексе Пг - антитело IV-1с. Впервые описа ключевая роль ранее не идентифицированного участка связывания СК Val709-Glu724 активации плазминогена стрептокиназой.
Ключевые слова : плазминоген, сгрептокиназа, активация плазминогена, структура бели моноклональные антитела, сериновые протеиназы.
Yakovlev S.A. The role of separate plasminogen sites in its activation by streptokinase Manuscript.
Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00 0-biochemistry. - A.V.Palladm Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1997.
The dissertation is devoted to the investigation of the plasminogen-streptokinase (Pg-S interaction. The 6 potential SK binding sites on serin protease domain of Pg are determined using t synthetic plasmin В-спаю decapeptids. It was found that the epitope for the inhibiting Pg activation SK mAb IV-1 с overlaps with one of SK-binding sites on Pg protease domain. High sensitive meth of analysis of Pg-SK complexes formation was developed on the base of avidin-biotin reaction. Kd, and SK molar ratio were determined by this method for Pg of 8 mammalia species. The unique abil of noncataiytic antibody IV-1 с to induce the active center in human Pg molecule was shown. It w proposed and experimentally confirmed the original two-sites mechanism of the active cen induction in the Pg - antibody IV-1 с complex. First the Val709-Glu724 SK binding site on Pg v, identified and established its key role in Pg activation by SK.
Key words: plasminogen, streptokinase, plasminogen activation, protein structu monoclonal antibody, serin proteases
- Яковлев, Сергей Алексеевич
- кандидата биологических наук
- Киев, 1997
- ВАК 03.00.04
- Исследование компонентов протеолитических систем крови в качестве субстратов цистеиновых катепсинов
- Биологические эффекты бациллярных протеиназ
- Экстрацеллюларные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами
- Получение фибрин-мономера и анализ результатов фотометрического определения компонентов фибринолической системы крови
- Изучение роли крингловых структур молекулы плазмина в процессе протеолитического разрушения фибринового сгустка