Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экстрацеллюларные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Батомункуева, Баирма Пурбодоржиевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фибринолитическая система организма человека и животных и роль протеина «С» в этой системе.

1.2. Тромболитические и фибринолитические средства из микроорганизмов.

1.2.1 Бактерии, синтезирующие ферменты фибринолитического и тромболитического действия.

1.2.2. Морские микроорганизмы, синтезирующие протеиназы тромболитического и фибринолитического действия.

1.2.3. Актиномицеты, синтезирующие ферменты тромболитического и фибринолитического действия.

1.2.4. Грибы, синтезирующие ферменты тромболитического и фибринолитического действия.

1.3. Биосинтез микробных протеиназ, обладающих фибринолитической и антикоагулянтной активностью.

1.3.1. Регуляция биосинтеза фибринолитических ферментов.

1.3.2. Пути повышения образования протеолитических ферментов микроорганизмами.

1.4. Методы выделения протеолитических ферментов.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы исследования.

2.1.1. Объекты исследования и условия их культивирования.

2.1.2. Выделение препаратов протеолитических ферментов.

2.1.3. Методы определения концентрации белка.

2.1.4. Метод определения фибринолитической активности в тонком слое.

2.1.5. Определение казеинолитической активности.

2.1.6. Определение антикоагулянтной активности протеолитических ферментов.

2.1.7. Определение рН-оптимума и рН-стабильности действия протеолитических ферментов.

2.1.8. Определение температурного оптимума и термостабильности действия протеолитических ферментов.

2.1.9. Сорбенты, использованные для выделения и очистки протеолитических ферментов.

2.1.10. Получение препарата протеиназ методом аффинной хроматографии.

2.1.11. Диск-электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.1.12. Разделение комплекса протеиназ методом колоночной хроматографии.

2.1.13. РЕАХром - Протеин «С» метод определения активности протеина «С» в плазме крови.

2.2. Результаты и их обсуждение.

2.2.1. Скрининг коллекции микромицетов с целью выявления культур, продуцирующих прогеиназы с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами.

2.2.2. Изучение некоторых физико-химических свойств выделенных протеиназ грибов Aspergillus ochraceus и Aspergillus alliaceus 7 dNl.

2.2.3. Разделение комплекса протеолитических ферментов

Aspergillus alliaceus 7 dNl методом колоночной хроматографии с использованием смолы DEAE Toyopearl 650 М.

2.2.4. Выделение и очистка протеолитических ферментов Aspergillus ochraceus 513 методом аффинной хроматографии на бациллихин-силохроме.

2.2.5. Разделение комплексного препарата протеиназ Aspergillus ochraceus 513 (после аффинной хроматографии) методом колоночной хроматографии с использованием смолы DEAE Toyopearl 650 М.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экстрацеллюларные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами"

Широкое распространение в настоящее время сердечнососудистых заболеваний, часто сопровождающихся тромбоэмболическими осложнениями, является частой причиной летальных исходов и инвалидности людей во многих странах. Все это выдвигает как одну из важнейших задач современной биологии и медицины расширение арсенала противотромботических средств, поиск новых биологически активных соединений и получение препаратов, растворяющих тромбы, предотвращающих их образование, а также позволяющих проводить быструю и адекватную диагностику нарушений системы гемостаза человека.

В отечественной и зарубежной медицине сейчас находит применение ряд тромболитических средств микробного происхождения. На основе микробных протеолитических ферментов могут быть получены тромболитики, осуществляющие, аналогично плазмину крови человека, прямой гидролиз тромбов за счет расщепления аргинилглициновых связей в молекуле фибрина (Jtoh Seiga, 1990; El-Aassar Samy A., 1995) или действующие как тканевые активаторы плазминогена крови человека, расщепляющие аргинилвалиновые связи в молекуле плазминогена (цит. Ландау и Егоров, 1996). Наиболее распространенным средством терапии тромбозов являются препараты типа стрептокиназы из гемолитического стрептококка. Эти ферменты представляют собой сериновые протеиназы, утратившие полностью казеинолитическую и эстеразную активности и способные к комплексообразованию с проактиватором и превращению его в активатор плазминогена (Millet, 1990). Перспективными представляются препараты тканевых активаторов плазминогена крови человека - проурокиназы и имеющие фирменные названия "Активаза" и

Эминаза", которые получены с использованием рекомбинантных микроорганизмов (Millet, 1990; Itoh Seiga, 1990).

В последнее время в связи с открытием функциональной роли системы протеина «С» в гемостазе человека весьма перспективными в лечении, предупреждении и диагностике тромбообразования становятся средства, активирующие эту антикоагулянтную систему, осуществляющую первую линию защиты от гиперсвертывания крови в организме (Коган и др., 1993). К настоящему времени известны активаторы протеина «С», выделенные из ядов змей некоторых видов щитомордников (Kogan et al., 1991). Общим для этих активаторов протеина «С», как и для комплекса тромбин-тромбомодулин, образующегося при физиологической активации протеина «С» в организме человека, является то, что добавление активатора к плазме крови приводит к удлинению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) вследствие инактивации активированным протеином «С» активных форм факторов V и VIII свертывания крови (Va и Villa), необходимых для образования тромбина. Кроме того, в экспериментах на животных выявлена антитромботическая активность препаратов активатора протеина «С» из яда щитомордника (Kogan et al., 1993).

Целью данной работы было: во-первых, изучение спектра действия протеиназ коллекции микроскопических грибов и поиск культур, продуцирующих внеклеточные продукты жизнедеятельности с выраженной антикоагулянтной активностью; во-вторых, получение некоторых характеристик протеиназ исследуемых культур микроскопических грибов; 7 в-третьих, разработка методов выделения, очистки и разделения мультиэнзимных комплексов из культуральной жидкости отобранных микромицетов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Батомункуева, Баирма Пурбодоржиевна

ВЫВОДЫ

1. Биосинтез протеиназ исследуемыми микромицетами на различных средах свидетельствует, что спектр образуемых ими (изучено 117 штаммов микроскопических грибов) ферментов в большой степени зависит от состава среды. Использование определенного субстрата для культивирования грибов существенно влияет не только на образование ферментов в целом, но и на преобладание в комплексе протеиназ с искомыми свойствами.

2. Показано, что подавляющее большинство культур грибов продуцирует одновременно несколько протеолитических ферментов. Вместе с тем обнаружены штаммы микромицетов, которые обладают только казеинолитической, плазминоподобной активностью или образуют только протеиназы с антикоагулянтной активностью. Штаммов, образующих только тканевые активаторы плазминогена крови человека и быка, среди 117 исследованных культур выявлено не было.

3. Выявлено два штамма микроскопических грибов (Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 1 dNl), которые обладают высокой антикоагулянтной активностью по типу активаторов протеина «С» и не проявляют значительной казеинолитической и плазминоподобной активности, а также активаторной по отношению к плазминогену.

4. Установлено, что влияние протеиназ, продуцируемых Aspergillus ochraceus 513, на время образования тромбина в плазме крови человека носит дозозависимый характер.

5. Изучены рН - оптимум активности и рН - стабильность выделенных препаратов протеолитических ферментов грибов Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 7 dNl, а также температурный оптимум активности и температурная стабильность действия этих препаратов.

93

6. Разработана методика выделения, очистки и разделения комплексного препарата протеиназ методом аффинной хроматографии на сорбенте бациллихин - силохроме и колоночной хроматографии с использованием смолы DEAE Toyopearl 650 М из культуральной жидкости микромицета Aspergillus ochraceus 513 с целью получения ферментов направленного действия по типу активаторов протеина «С». Впервые выделен гомогенный белок - активатор протеина «С» с молекулярной массой - 36,5 кДа, эффективность которого выше таковой у активатора протеина «С», выделенного из яда змеи Agkistrodon contortrix contortrix. Полученный микробный активатор протеина «С» из Aspergillus ochraceus 513 в дальнейшем может найти применение как для функционального определения протеина «С» в крови человека, так и в качестве активатора протеина «С» для коррекции нарушений гемостаза и фибринолиза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Батомункуева, Баирма Пурбодоржиевна, Москва

1. Авилова Т.В., Егоров A.M. Методы выделения и очистки ферментов // В кн.: Введение в прикладную энзимологию. М.: Изд-во МГУ, 1982, с. 13-25.

2. Алиханян С.И. Селекция промышленных микроорганизмов // М.: Изд-во Наука, 1968, с. 391.

3. Андреенко Г.В. О тромболитических свойствах стрептокиназы // В кн.: Энзимология тромболизиса и стрептокиназа. Минск, 1982, с. 127-134.

4. Аравина А.А., Пономарева В.Д. Способ получения нейтральной протеазы фибринолитического действия // Авт. свид. СССР № 613596, 1977.

5. Богачева Т.И., Москвичева И.В. Ковалентное связывание протеолитических ферментов с антителами // Биоорганическая химия, 1980, т. 6, с. 623-625.

6. Буяк Л.И. Совместное культивирование микроорганизмов как способ стимуляции биосинтеза экзопротеаз // Дисс. канд. биол. наук; Москва, 1979, с. 127.

7. Вольф М, Рансбергер К. Лечение ферментами // М.: Мир, 1976.

8. Выборных С.Н. Синтез внеклеточных протеолитических ферментов Actinomyces thermovulgaris Т-54 // Дисс. канд. биол. наук; Москва, 1976, с. 132.

9. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкен Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул//М.: Мир, 1983, с. 235-239.

10. Ю.Галаев И.Ю. Новые методы очистки белков. Вытеснительная хроматография //Биохимия, 1998, вып. 63, №11, с. 1480-1489.

11. П.Гешева В.И., Максимов В.Н., Ландау Н.С., Егоров Н.С. Оптимизация состава среды для биосинтеза тромболитических ферментов в чистой и смешанных культурах //Микробиология, 1982, т.51, вып. 2, с. 206-211.

12. Глемжа А.А. Использование аффинной хроматографии в очистке микробных гидролаз // Прикл. биохимия и микробиология, 1982, т. 18, № 6, с. 792-805.

13. Гребешова Р.Н., Сальседо-Торрес Л.Э., Идальго М.А. Сериновая протеаза Bacillus subtilis R // Прикладная биохимия и микробиология, 1999, вып. 35, №2, с. 150-154.

14. Н.Демина Н.С., Лысенко С.В. Микроорганизмы, синтезирующие ферменты тромболитического действия // Биологические науки, 1991, №9, с. 136-153.

15. Денисова Н.П., Псурцева Н.В., Фалина Н.Н., Петрищев Н.Н., Киянов В.И. Штамм базидиального гриба Coprinus domesticus (Fr) Gray BKMf 2459D продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов // Авт.свид. №3642122/13, опубл. 07.08.91. Бюл. № 29.

16. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты//М.: Мир, 1966, с. 31-53.

17. Дунаевский Я.Е., Павлюкова Е.Б., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Внеклеточная протеаза микромицета Alternaria alternata II Биохимия, 1996, вып. 61, №10, с. 1904-1910.

18. Егоров Н.С. Протеолигические ферменты микроорганизмов, обладающие фибринолитической и коагулазной активностью //В кн.: Итоги науки и техники. Микробиология. М.: ВИНИТИ, 1978, т. 9, с. 5-39.

19. Егоров Н.С., Аль-Нури М.А., Кривова А.Ю. // Микробиология, 1976, т. 45, №4, с. 607-613.

20. Егоров Н.С., Аль-Нури М.А., Прянишникова Н.И. Селекция Streptomyces spheroides продуцента внеклеточных протеаз с фибринолитическим действием // Микробиология, 1984, т. 53, № 3, с. 572-577.

21. Егоров Н.С., Ландау Н.С. Влияние различных концентраций глицерина и источников азота на биосинтез фибринолитическоговещества Aspergillus oryzae штамм МГУ // Прикл. биохимия и микробиология, 1965, т. 1, с. 487-493.

22. Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология, 1982, т. 18, вып. 6, с. 835-849.

23. Егоров Н.С., Ландау Н.С. О способности бактерий, обитающих в море, к биосинтезу фибринолитических ферментов // Микробиология, 1986, т. 55, вып. 3, с. 445-449.

24. Егоров Н.С., Стрижаченко Н.М., Афанасенко Б.А. Активаторы плазминогена: их характеристика и свойства // Успехи соврем, биологии, 1987, т. 104, вып. 2 (5), с. 201-216.

25. Егоров Н.С., Ушакова В.И.- Научные доклады высшей школы // Биологические науки, 1970, № 3, с. 97.

26. Егоров Н.С., Ушакова В.И., Мирчинк Т.Г., Клечковская В.В. Научные доклады высшей школы // Биологические науки, 1973, № 9, с. 103.

27. Егоров Н.С., Ушакова В.И., Смирнова И.П. // Прикл. биохимия и микробиология, 1968, т. 4, с. 549.

28. Жукова Р.В., Коммунарская А.Д., Пронина М.И. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов // Л.: Изд. Медицина, 1978, с. 158.

29. Загнитько О.П., Честухина Г.Г. Тиолзависимые сериновые протеиназы // Биоорганическая химия, 1984, т. 10, № 3, с. 383-390.

30. Имшенецкий А. А., Броцкая С.З. Селекция микроорганизмов, обладающих тромболитической активностью // Микробиология, 1969, т. 38, вып. 6, с. 1043-1049.

31. Имшенецкий А.А., Демина Н.С. Морская бактерия Alteromonas piscicida- продуцент ферментов тромболитического действия // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1982, № 3, с. 415-420.

32. Имшенецкий А.А., Демина Н.С., Лысенко С.В., Евдокимова М.Д. О фибринолитической активности бактерий рода Pseudomonas II Прикл. биохимия и микробиология, 1991, т. 27, № 6, с. 845-849.

33. Ицкович Е.Л., Балабан Н.П., Марданова A.M., Шакиров Е.В., Шарипова М.Р., Лещинская И.Б., Ксенофонтов А.Л., Руденская Г.Н. Энзиматические свойства тиолзависимой протеиназы Bacillus intermedius 3-19 //Биохимия, 1997, вып. 62, №1, с. 60-65.

34. Касаткина И.Д., Имшенецкий А.А., Броцкая С.З., Желтова Е.Д. Мутанты Aspergillus terricola, образующие протеазы с фибринолитическим действием // Микробиология, 1969, т. 38, вып. 5, с. 766-774.

35. Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов // Киев: Наук. Думка, 1978, с. 263.

36. Коган А.Е., Струкова С.М. Протеин «С»: механизм активации и антикоагулянтного действия // Биохимия, 1993, т. 58, вып. 6,с. 827-844.

37. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии // М.: Высшая школа, 1980, с.272.

38. Крейер В.Г. Внеклеточные протеолитические ферменты Streptomyces spheroides штамм 35 // Дисс. канд. биол. наук; Москва, 1985, с. 98.

39. Кривова А.Ю. Биосинтез протеолитических ферментов культурой Actinomyces spheroides шт.35 //Дисс. канд. биол. наук; Москва, 1977, с. 144.

40. Кузнецов В.Д., Гуреева М.П. Образование литических ферментов актиномицетов // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1982, № 3, с. 440.

41. Кураков А.В. Выделение микроскопических грибов различных эколого-трофических групп // Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Изд-во МГУ, 1991, с. 172-175.

42. Кураков А.В., Болобова А.В., Анкело М. Поиск микроскопических грибов продуцентов термостабильных целлюлаз // Прикл. биохимия и микробиология, 1996, т. 32, вып. 4, с. 397-405.

43. Кэрлтон, Браун. В книге: Герхарт Ф. Методы общей бактериологии в трех томах, т. 1. Прямой подсчет // М.: Мир, 1983, с. 450-454.

44. Лагутина JI.C. Выделение и характеристика внеклеточных протеаз Actinomyces fradiae 119 // Дис. канд. биол. наук, М.,1980, с. 135.

45. Ландау Н.С., Горнова И.Б., Егоров Н.С. Особенности биосинтеза протеиназ клетками Bacillus firmus, включенными в Са- альгинатный гель // Прикл. биохимия и микробиология, 1997, т. 33, № 6, с. 611-615.

46. Ландау Н.С., Егоров Н.С. Фибринолитические ферменты непатогенных микроорганизмов // В кн.: Стрептокиназа и другие тромболитические ферменты, Минск, 1979, с. 26-33.

47. Ландау Н.С., Егоров Н.С. Особенности накопления в среде и некоторые свойства протеолитических ферментов, образуемых Nocardia minima II Микробиология, 1996, т. 65, № 1, с. 42-47.

48. Лысенко С.В., Демина Н.С., Васина С.В. О специфичности действия внеклеточных протеаз из Streptomyces sp. // Прикл. биохимия и микробиология, 1992, т. 28, № 1, с. 33-36.

49. Лысенко С.В., Саливоник С.М. Выделение актиномицетов, синтезирующих протеазы с тромболитическим действием // Микробиология, 1988, т. 57, вып. 4, с. 571-573.

50. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты //М.: Наука, 1971.

51. Мосолов В.В. Аффинная хроматография сериновых и цистеиновых протеиназ и их природных ингибиторов // В кн.: Аффинная хроматография. Тезисы докладов наВсесоюзн. конф., Вильнюс, 1982, с. 6-7.

52. Музыкантов В.Р., Сахаров Д.В. Совместная иммобилизация стрептокиназы и антител к коллагену на поверхности эритроцита: локальный лизис фибринового сгустка в зоне коллагеновой мишени // Биотехнология, 1986, т. 6, с. 89-96.

53. Никандров В.Н. Дискуссионные вопросы структурных и каталитических свойств стрептокиназы // В кн.: Энзимология тромболизиса и стрептокиназа. Минск, 1982, с. 23-24.

54. Новикова Т.М., Выборных С.Н. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei В-724. //Прикл. биохимия и микробиология, 1986, т. 22, вып. 6, с. 772777.

55. Петров Д.А. Новые методы селекции и использование их для решения некоторых прикладных задач // В кн.: Генетика и селекция микроорганизмов. Новосибирск. Изд-во Наука, 1975, с. 145.

56. Петрова И.С. Протеолитические ферменты актиномицетов // М.: Наука, 1974.

57. Петрова И.С., Зуева Л.С. Очистка протеолитических ферментов Actinomyces jradiae на сефадексах // Прикл. биохимия и микробиология, 1968, т. 4, № 3, с. 286-294.

58. Радзявичус К.И., Шатаева Л.К., Самсонов Г.В., Жукова Н.Г., Зорина А.И., Ласкорин Б.Н. Структура и сорбционные свойствамакропористого карбоксильного катионита КМ- 2П // Высокомолекул. соединения, 1982, т. А 24, № 5, с. 1066-1071.

59. Реми Е.Ю., Лукницкая О.Ф., Селезнева А.А. Внеклеточные протеазы Streptomyces sp. //Прикл. биохимия и микробиология, 1991, т. 27, вып. 5, с. 651-657.

60. Розенфельд М.А. Термодинамика образования и лизиса фибрина // В кн.: Энзимология тромболизиса и стрептокиназа. Минск, 1982, с. 11-17.

61. Руденская Г.Н., Гайда А.В., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из базидиального гриба Russula decolorans Fr 0456 // Биохимия, 1980, т. 45, № 3, с. 561-568.

62. Руденская Г.Н., Степанов В.М. Аффинные сорбенты для выделения протеолитических ферментов, содержащие бацитрацин в качестве лиганда // В кн.: Химия белков и пептидов. Тез. докл. на 6 Всесоюзн. симпозиуме по химии белков и пептидов, Рига, 1983, с. 93-94.

63. Самсонов Г.В., Кольцова С.В., Шатаева Л.К., Кузнецова Н.Н., Рожецкая К.М., Парадеева И.К., Федорова З.Д. Способ выделения фермента тромболитического действия // Авт. Свидетельство 3 584034, МКИ С 12 Д 13/10. Бюл. изобр., 1977, № 46, с. 60.

64. Самсонов Г.В., Селезнева А.А., Пономарева Р.В., Шатаева Л.К., Орлиевская О.В., Козлова Т.А. Выделение и свойства препарата терррилитина // В кн.: Ферменты микроорганизмов. М.: Наука, 1973, с. 205-210.

65. Старостина Н.Г., Кононова С.В., Ратнер Е.Н., Циоменко А.В. Новые ферментные препараты из актиномицетных культур, вызывающих протопластирование и лизис аскомицетных дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология, 1999, вып. 35, №2, с. 141-145.

66. Степанова Ц.Н., Юликова Е.П. Фракционирование «трихолизина» методом изоэлектрического фокусирования // Биохимия, 1977, т. 42, вып. 1, с. 167-170.

67. Струкова С.М., Коган А.Е., Тара А.А., Аавиксаар А. А. Противотромботический эффект активатора Протеина «С» из змеиного яда // Вопр. мед. химии, 1989, т. 35, № 5, с. 115-119.

68. Терешин И.М. Создание иммобилизованной стрептокиназы и ее тромболитические свойства // В кн.: Энзимология тромболизиса и стрептокиназа. Минск, 1982, с. 139-143.

69. Троицкий Г.В., Ажицкий Г.Ю. Боратнолиольный рН- градиент. Теоретические основы и применение для изоэлектрического фокусирования //Биоорг. химия, 1982, т. 8, № 6, с. 863-869.

70. ТурковаЯ. Аффинная хроматография//М.: Мир, 1980, с. 471.

71. Хамидулин В. А. Синтез внеклеточных ферментов штаммом Aspergillus oryzae 824-32, гидролизующих белок и крахмал // Автореф. дис. канд. биол. наук, Москва, 1990.

72. Цыманович С.А., Никандров В.Н., Максимова Р.А., Шаркова Т.С., Андреенко Т.В., Серебрякова Т.Н. Физико-химические свойства тромболитического препарата лонголитина // Вопр. мед. химии. 1992, т. 38, № 3, с. 44-45.

73. Чазов Е.И., Лакин К.М. Антикоагулянты и фибринолитические средства // М.: Медицина, 1977.

74. Шатаева Л.К., Кузнецова Н.Н., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии // Л.: Наука, 1979, с. 286.

75. Шатаева Л.К., Маринина В.П., Радзявичус К.И., Мельникова С.К, Самсонов Г.В. Влияние набухания анионита ФАФ на его сорбционные свойства//Прикл. биохимия и микробиология, 1982, т. 18, № 1,с. 65-70.

76. Шатаева Л.К., Самсонов Г.В. Использование карбоксильных катионитов для разделения белков // Хим. фарм. жур., 1977, т. 11, № 4, с. 78-90.

77. Abdel-Fattah Ahmed F., Ismail Abdel-Mohsen S., Salch Soad A. Purification and properties of two fibrinolytic enzymes from Fusatium oxysporum N.R.C.J. //Zbl. Microbiol. 1993, v. 148, N 2, p. 123-128.

78. Ali Abdel Aziz, Ali Roushdy Mohamed. Fermentation of milk permeate by proteolytic bacteria for protease production // Appl. Biochem. an Biotechnol. A., 1998, v. 74, №2, p. 85-93.

79. Astrup Т., Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity // Arch. Biochem. 1952, v. 40, p. 346-351.

80. Barnett H.L., Hunter B.B. Illustrated genera of Imperfect fungi // Minneapolis. USA: Burgess Publishing Company, 1972, p. 241.

81. Bergkvist R. The proteolytic enzymes of Aspergillus oryzae. 1. Methods for the estimation and isolation of the proteolytic enzymes // Acta Chem. Scand., 1963, v. 17, N 1521, p. 223-239.

82. Biotechnol. Lett.- 1995, v. 17, N 9, p. 943.

83. Booth C. Fusarium // Kew, Surrey, England, 1977, p.57.

84. Buckley D.E., Jeffries L. // FEMS Microbiol. Letts, 1981, v. 12, p. 405.

85. Chen J.S., Chen M.G.N, et al. Some effects of the fungal proteinase EL 2579 on human blood // Enzymes, 1985, v. 34, p. 39-44.

86. Dixon M., Webb E.C. Enzymes // London; 1979, v. 3.

87. El-Aassar Samy A. Production and properties of fibrinolytic enzymes in solid state cultures of Fusatium pallidoroseum II Biotechnol. Zett. 1995, v. 17, N9, p. 943-948.

88. Ellis M.B. Dematiaceous Hyphomycetes // Kew, Surrey, England, 1971, p. 581.

89. Fredericq P. La coagulation du sang en. 1. Absence decalcium // Arch. Intern. Physiol., 1942, p. 73-81.

90. Gertler A., Trop M. The Elastase- like Enzymes from Streptomyces griseus (Pronase). Isolation and Partial Characterisation 11 Bur. J. Biochem., 1971, v. 19, p. 90-96.

91. Giovan B.Q., Massacci A. Proteolysates from slaughter- hous blood // Journ. Sci. Food. Agric., 1982, v. 33, p. 634-638.

92. Holmes W.E., Nelles L. Primary structure of human L2- antiplasmin, a serine protease // Journ. Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 1659-1664.

93. Hui K.Y., Haber E., Matsueda G.R. Monoclonal antibodies to a synthetic fibrin- like peptide bind to human fibrin but not fibrinogen // Sciens, 1987, v. 222, p. 4628-4629.

94. Hynes M.J. Transformation of filamentous fungi // Exp. Mycol. 1986, v. 10, N l,p. 1-8.

95. Jtoh Seiga. Creation of new drugs by protein engineching // Kobunci. High Polum. Jap. 1990, v. 39, N 7, p. 508-511.

96. Kaulla K.N., Well J. Pyrogen- induced fibrinolysis in man // Federat. Proc. 1956, v. l,p. 194-198.

97. Kogan A.E., Makarov A.N., Bobruskin I.D., Strukova S.M. Comparative study of protein "C" activators from the Agkistrodon snake venoms // Thromb. Res. 1991, v. 62, p. 775-780.

98. Kokubu Т., Karube J., Suruki S. // Biotechnol. and Bioeng. 1981, v. 23, N1, p. 29-39.

99. Laemly U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of bacteriophage T4 // Nature, 1970, v. 227, N5259, p. 680-685.

100. Lijnen H.R. // Verh. Kon. acad. geneesk. Belg. 1995, v. 57, p. 303-314.

101. Lorand L. Proteolytic enzymes // In: Methods in Enzimology. V. 45. Part B. N. Y. San-Franc. Lond.; Acad. Press, 1976.

102. Matsueda G.R. Bode Chr. Antibody directed urokinase: a specific fibrinolytic agent // Sciense, 1985, v. 229, p. 765-767.

103. Meister A. In: Advances in Enzymology // N. Y.: Acad. Press, 1974, p. 179-243.

104. Michalik I., Szabova E., Polakova A., Urminska D. Bacterial proteases: Production, isolation and utilization in animal nutrition // Укр. биохим. ж., 1997, вып. 69, №3, с. 28-35.

105. Mikes О., Strop P. Rapid chromatographic separation of technical enzymes on spheron ion- exchangers // J. Chromatogr., 1978, v. 148, p. 237-241.

106. Millet A. Trombose: a la recherche de la fluidite // Biofutur. 1990, N 90, p. 54-56.

107. Moroi M., Aoki N. Isolation and characterization of alpha plasmin inhibitor from human plasma // Journ. Biol. Chem., 1976, v. 251, p. 5956 - 5965.

108. Neurath H., Walsh K.A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review) //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73,p. 3825-3832.

109. Nishizawa M., Ozawa F., Nishinuma F. Molecular cloning of amylase gene of Bacillus circulans IIDNA. 1987, v. 6, N 3, p. 255-265.

110. Okada Y., Tsuda Y., Nagamatsu Y., Okamoto U. Converient purification of human spleen fibrinolytic proteinase and human leucocyte elastase by affinity chromatography // Chem. Pharm. Bull. Tokyo, 1982, v. 30, N 4, p. 1528-1530.

111. Pettersson E. Isoelectric fractionation analysis and characterisation of ampholytes in natural pH- gradient // Acta Chem. Scand., 1969, v. 23, N 8, p. 2631-2635.

112. Porath J., Sundberg L. Biospecific adsorbens based on enzyme inhibitor interaction // Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq., 1970, v. 18, p. 401-407.

113. Pulverer G., Wegrzunovicz Z. Influence of Pseudomonas aeruginosa proteases on prothrombin, plasminogen and fibrinogen I I Zbl. Bact. Hyg., 1980.1. Abt. Orig. A. Bd., v. 248, p. 99-109.

114. Radola B.J. Isoelectric Focusing in Layers of Granulated Gels. 1. Thinlayer Isoelectric Focusing of Proteins // Biochim. et biophys. Acta, 1973, v. 295, N2, p. 412-428.

115. Raper K.B., Fennel D.I. The genus Aspergillus //Baltimore, The Williams & Wilkins Company, 1965, p. 686.

116. Raper K.B., Thom C. A manual of the Penicillia II Baltimore, The Williams & Wilkins Company, 1949, p. 875.

117. Rifai M.A. A revision of the genus Trichoderma II Mycological Papers, 1969, v. 116, p. 1-116.

118. Shibua V., Yamamoto Т., Morimoto Т., Nishino N., Kambara Т., Okabe H. Pseudomonas aeruginosa alkaline proteinase might share a biologicalfunction with plasmin // Biochim. Biophys. Acta. Protein Struct, and Mol. Enzymol. 1991, v. 1077, p. 316-324.

119. Stefanini M., Adamis D.M. Purification of aspergillin О // Lancet, 1959, v. 11, p. 443-444.

120. Stefanini M., Marin H. Fibrinolysis activity of extracts from nonpathogenic fungi // Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med., 1958, v. 99, p. 504-507.

121. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Process for purification of proteolytic enzymes // British Patent 1536386, June 9, 1977; U.S. Patent 4, 100, 028, July 11, 1978.

122. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N., Gaida A.V., Osterman A.L. Affinity chromatography of proteolytic enzymes on silicabased biospecific sorbents //J. Biochem. and Biophys. Meth., 1981, v. 5, p. 177-186.

123. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Proteinase Affinity Chromatography on Bacitracin- Sepharose // J. Appl. Biochem., 1983., v. 5, p. 420-428.

124. Svensson H. Isoelectrical separation. Analysis and characteristics of Ampholytes in natural pH- gradient // Acta chem. scand., 1961, v. 15, N 2, p. 325-341.

125. Vali Z., Patthy L. Isolation of a membrane- bound cofactor for thrombin-catalysed activation of protein С // J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 659-864.

126. Walter H.E., Roschlau M.D. Trombolytic therapy with CA-7, a fibrinolytic enzyme from Aspergillus orysae: a report of two representative cases // Canad. Med. Ass. Journ., 1968, v. 98, N 16, p. 757-761.107

127. Yatagai F., Glickman B.W. Mutagenesis by 8- methoxypsoralen plus hear-UV treatment: analysis of specificity in the lac 1 gene of Esherichia coli // Mytat. Res. 1986, v. 163, N 3, p. 209-224.