Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo"

На правах рукописи

Суров Степан Сергеевич

Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC. Исследование свойств in vitro и in vivo

03.01.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Москва - 2012

005044625

005044625

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук (ЦТПФХФ РАН)

Научный руководитель:

кандидат химических наук Синауридзе

Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Макаров

Владимир Александрович

Антоненко Юрий Николаевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « 1 » М АуЗ_2012 года в ^ часов

на заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4 (корп. 1, Ленинский просп., д. 38А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦГПФХФ РАН Автореферат разослан « _ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

И.С. Николаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарушения в системе свёртывания крови являются причиной более чем трети смертей при различных патологических состояниях: сердечнососудистых заболеваниях, травмах различной природы и хирургических операциях, сепсисе, ожогах, онкологических заболеваниях, заболеваниях, связанных с патологией гемостаза, и т.п. Возникающие при этом гиперкоагуляционные состояния способны приводить к тромбозам - патологическому свёртыванию крови различной локализации. Изменения, происходящие при функционировании стенок сосудов и в системе свёртывания крови и приводящие к тромбозам, не до конца изучены, однако понимание этих процессов необходимо для разработки и усовершенствования антитромботических средств.

В качестве основных направлений воздействия на систему гемостаза для предупреждения и лечения тромбозов можно выделить: применение ингибиторов сериновых протеиназ системы свёртывания; применение антагонистов витамина К, снижающих синтез печенью предшественников прокоагулянтных факторов системы свертывания; применение антитромбоцитарных препаратов, снижающих активацию и агрегацию тромбоцитов и препятствующих дальнейшему тромбообразованию; применение фибринолитических агентов.

В настоящее время в клинике используются, в основном, три антитромботических препарата: нефракционированный гепарин или его аналоги низкого молекулярного веса, оральный антикоагулянт варфарин (антагонист витамина К) и ингибитор активации тромбоцитов - аспирин. Эти лекарства имеют ограничения в применении и побочные эффекты, что лимитирует их использование и побуждает к поиску и разработке новых препаратов, не менее эффективных, но свободных от недостатков стандартных средств. Современные представления о гемостазе и тромбозе и опыт использования антитромботических средств (антикоагулянтов, тромболитических и антитромбоцитарных агентов) говорят о том, что перспективной является разработка синтетических низкомолекулярных прямых ингибиторов тромбина, так как именно этот фермент является ключевым в системе свёртывания крови, а его повышенная активность способна приводить к тромбозам. Синтетические низкомолекулярные ингибиторы тромбина имеют целый ряд преимуществ перед антикоагулянтами, используемыми в клинике в настоящее время: это быстрота наступления действия, высокая эффективность, предсказуемая фармакокинетика, отсутствие необходимости постоянного мониторинга состояния гемостаза. На сегодняшний день в мире клинически используются только два таких ингибитора - вводимый внутривенно аргатробан и пероральный антикоагулянт

(пролекарство) дабигатран этексилат. Ни один из них не лицензирован в России. Однако эти препараты также имеют ряд недостатков: аргатробан обладает низкой стабильностью и коротким временем жизни в плазме, что требует его частых инфузий для поддержания терапевтических концентраций; дабигатран этексилат может быть использован пероралыю, однако пока только для ограниченного числа патологий, кроме того, он имеет низкий процент биодоступности. Таким образом, поиск новых, эффективных и безопасных низкомолекулярных синтетических ингибиторов тромбина является весьма актуальной задачей современной фундаментальной науки и клинической медицины.

Цель работы. Ранее, в результате совместной работы нескольких институтов и лабораторий (ЦТПФХФ РАН, Лаборатории физической биохимии ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ, Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им. М. В. Ломоносова, Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН), был осуществлен компьютерный дизайн и синтез нового ряда синтетических низкомолекулярных ингибиторов тромбина. Цель настоящей работы состояла в исследовании функциональных свойств одного из новых ингибиторов (HC-019s-IOC), его способности оказывать антикоагуляционное действие как in vitro, так и in vivo.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Определить тип механизма ингибирования и параметры ингибирования тромбина под действием исследуемого соединения в чистой буферной системе (по влиянию на скорость гидролиза хромогенного субстрата).

2. Определить параметры антикоагулянтного действия данного соединения в плазме in vitro (в стандартных временах свертывания, а также в тестах генерации тромбина и тромбодинамики).

3. Оценить стабильность растворов исследуемого соединения при стерилизации автоклавированием и последующем длительном хранении.

4. Определить острую токсичность HC-019s-IOC (при внутрибрюшинном введении на мышах).

5. Исследовать антикоагулянтные свойства ингибитора в опытах in vivo при внутривенном введении кроликам и в модели гемодилюции при кровопотере у крыс.

Научная новизна. В работе впервые подробно экспериментально исследованы свойства нового низкомолекулярного синтетического прямого ингибитора тромбина HC-019S-IOC. Доказан конкурентный тип ингибирования и определена константа

ингибирования тромбина в чистой системе. Показано, что данное соединение может являться эффективным антикоагулянтом в плазме как in vitro, так и в опытах in vivo.

Впервые разработана модель для изучения изменений свертывания при умеренной гемодилюции в ходе восполнения кровопотери (на крысах). С помощью этой модели показано, что умеренная гемодилюция in vivo физиологическим раствором вызывает состояние гиперкоагуляции, которое может быть успешно преодолено путем добавления в стандартный плазмозамещающий раствор ингибитора тромбина.

Все полученные результаты показывают, что исследованный новый ингибитор тромбина является перспективным для клинического применения, т.к. он более эффективен и стабилен, а также не более токсичен, чем применяемый в клинике аргатробан.

Научио-практическое значение. Научное значение данной работы состоит в разработке методики испытаний препаратов с целью исследования их возможного антитромботического действия. Кроме того, впервые показано, что умеренная гемодилюция in vivo стандартным плазмозамещающим раствором (ПЗР) может являться риск-фактором для развития гиперкоагуляции, и что этого можно избежать, добавляя в стандартные ПЗР ингибитор тромбина.

Практическое значение работы состоит в разработке отечественного препарата для лечения тромботических осложнений на основе нового ингибитора тромбина НС-019s-IOC. Доклинические испытания показали, что данный ингибитор является перспективным для клинического применения и превосходит по своим параметрам применяемый в мировой практике аргатробан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследуемое вещество - HC-019S-IOC - является высокоэффективным конкурентным ингибитором тромбина в буферной системе и практически не ингибирует фактор Ха.

2. HC-019S-IOC является эффективным антикоагулянтом в плазме in vitro: он удлиняет стандартные времена свертывания, снижает эндогенный тромбиновый потенциал и скорость пространственного роста сгустка пропорционально концентрации добавленного в плазму ингибитора.

3. Новый ингибитор имеет приемлемую острую токсичность.

4. Водные растворы ингибитора (в микромолярных концентрациях) способны переносить стерилизацию автоклавированием и оставаться стабильными при длительных временах хранения как при +4°С, так и при комнатной температуре.

5. Внутривенное введение HC-019s-IOC кроликам оказывает антикоагулянтное действие (снижает эндогенный тромбиновый потенциал плазмы).

6. Восполнение умеренной (23%) кровопотери физиологическим раствором приводит к гиперкоагуляции у крыс; восполнение кровопотери физиологическим раствором, дополнительно содержащим HC-019s-IOC, отменяет возникновение этой гиперкоагуляции.

Апробация работы состоялась 28.03.2011 г. на совместном заседании проблемной комиссии № 2 «Биохимия, биофизика и реология крови» ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России и Ученого Совета ЦТПФХФ РАН.

Материалы диссертации были представлены на ряде российских и международных научных конференций: 54rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research, Nürnberg, February 24-27, 2010; XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13, 2010; а также на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" в 2009 и 2010 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов в сборниках трудов отечественных и международных конференций.

страницах машинописного текста и состоит из следующих основных разделов: введение; литературный обзор; материалы и методы; результаты; обсуждение; выводы и список цитированной литературы. Материал иллюстрирован 1 таблицей и 22 рисунками. Список литературы включает 202 источника.

Литературный обзор. Представлен обзор литературных данных о гемостазе человека и его центральном элементе — тромбине; описаны структура, функции и регуляция активности этого фермента. Рассмотрены антитромботические средства, дано подробное описание существующих ингибиторов активности тромбина, отмечены преимущества и недостатки их применения. Приведены сведения об инфузионно-трансфузионной терапии кровопотери, применяемых инфузионных

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

растворах, а также проанализированы данные о влиянии плазмозамещающих растворов на гемостаз.

Материалы и методы. Предметом исследования является низкомолекулярный прямой синтетический ингибитор тромбина НС-019з-ЮС (19з), который был разработан совместно сотрудниками ЦТПФХФ РАН (Москва, Россия), лаборатории физической биохимии Гематологического научного центра МЗСР РФ (Москва, Россия) и Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ (Москва, Россия) и синтезирован в Институте органической химии РАН (Москва, Россия). Структура ингибитора приведена на рис. 1.

Рис. 1. Структура низкомолекулярного прямого ингибитора тромбина НС-019з-ЮС с обозначением отдельных фрагментов молекулы ингибитора (Р1, Р2 и РЗ), связывающихся с различными участками активного центра в молекуле тромбина (81, 82 и 83, соответственно)

Измерение ингибирующей активности соединения 19£ по отношению к тромбину и фактору Ха в буферных растворах. Для исследования кинетики ингибирования сериновых протеиназ - тромбина и фактора Ха (фХа) - использовали реакции расщепления тромбином и фХа специфичных хромогенных субстратов Хромозим ТН (СТН) и 82765, соответственно. В ячейки планшета последовательно помещали 40 мкл буферного раствора (20 мМ НЕРЕ8, 140 мМ ЫаС1 и 0,1% полиэтиленгликоля (М.В. 6000 дальтон), рН 8,0), 10 мкл раствора ингибитора 19з или растворителя (0,01% этанол), 50 мкл раствора тромбина (финальная концентрация 0,2 нМ) или раствора фХа (финальная концентрация 5нМ). Перед активацией смесь инкубировали 10 минут при 37°С, после чего добавляли 100 мкл раствора хромогенного субстрата (финальная концентрация СТН 100 мкМ, 82765 300 мкМ).

Начальную скорость гидролиза субстрата измеряли спектрофотометрически на длине волны 405 нм. Определяли процент ингибирования скорости гидролиза в присутствии различных концентраций (относительно скорости в пробе без ингибитора) и величину концентрации 19Э, снижающую скорость гидролиза на 50%

РЗ

Р2

Р1

(1С50).

Определение типа ингибирования и кинетических констант для соединения 19s по отношению к тромбину. Тип ингибирования и кинетические константы реакции ингибирования определяли методом Лайнуивера-Берка путем построения в двойных обратных координатах зависимостей скоростей гидролиза тромбин-специфичного хромогенного субстрата от его концентрации (в присутствии различных концентраций 19s). Характер пересечения всех прямых, полученных в присутствии различных концентраций ингибитора, указывает на тип ингибирования. При конкурентном механизме ингибирования точки пересечения каждого из графиков с осью абсцисс в отсутствие и в присутствии ингибитора дают значения 1/Кт и 1/Кт е|т, соответственно, где Кт С,Т = Km(l+I/Ki) — эффективная константа Михаэлиса в присутствии ингибитора (в концентрации I). Таким образом, в этом случае константа ингибирования Ki может быть определена из выражения Ki= 1/(Кте1т/ Km -1).

Кроме того, при конкурентном механизме ингибирования константа ингибирования К] по отношению к тромбину может быть вычислена по уравнению Ченга-Прусоффа (К, = IC5,/(l+S/Km)) [Cheng YC, Prusoff W. 1973], в котором S -концентрация субстрата, Km - константа Михаэлиса-Ментен субстрата по отношению к тромбину, величина которой может быть получена на основании литературных данных или определена методом Лайнуивера-Берка.

Устойчивость ингибитора в водных растворах. Сохранение активности водных растворов ингибитора при стерилизации и долгосрочном хранении было проверено на 1 мкМ и 2 мкМ растворах 19s. Разведенный в этиловом спирте (конечная концентрация 0,001%) I мкМ раствор ингибитора разделили на две части, первую из которых хранили при комнатной температуре, вторую - при +4°С. Разведенный в ДМСО (конечная концентрация 0,02%) 2 мкМ раствор ингибитора был проавтоклавирован 15 минут при 120°С и 1 атм, после чего хранился при комнатной температуре. По мере хранения растворов измеряли их ингибирующую активность по отношению к тромбину и сравнивали с исходной активностью до автоклавирования и постановки на хранение.

Определение стандартных времен свертывания. Определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ) проводили па размороженных пулах плазм (человеческий пул - 4 донора, кроличий пул - 4 особи), используя наборы реагентов НПО «Ренам». К 100 мкл бедной тромбоцитами плазмы добавляли 10 мкл раствора ингибитора 19s или растворителя. Смесь инкубировали 5 минут при 37°С, после чего измеряли времена свёртывания в агрегометре (Chrono-Log Corporation, США) в соответствии с предписаниями производителя реагентов. Итоговые объемы проб доставляли 310 мкл при измерении АЧТВ и ПВ и 210 мкл при измерении ТВ.

Антикоагулянтную активность вещества характеризовали его концентрацией, необходимой для удвоения измеряемого времени свертывания плазмы (СТ2, нМ).

Измерение генерации тромбина. Измерение кинетики генерации тромбина в бедной тромбоцитами плазме проводили, регистрируя расщепление флюорогенного субстрата Z-Gly-GIy-Arg-AMC-HCl (где Z - остаток бензилоксикарбонила, AMC -остаток 7-амино-4-метилкумарина) образующимся в ходе свертывания тромбином. В 6 ячеек 96-луночного планшета помещали по 90 мкл плазмы и по 10 мкл раствора флюорогенного субстрата (исходной концентрации 5 мМ) в смеси диметилсульфоксида и буфера (20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, pH 7,5) в соотношении 1:3 по объему. В две из этих ячеек вносили по 15 мкл того же разбавляющего буфера и по 10 мкл 100 мкМ раствора AMC в ДМСО. Сигналы флюоресценции, записанные в этих ячейках, использовали для измерения калибровочного сигнала AMC в данной плазме. Еще в две ячейки добавляли по 25 мкл разбавляющего буфера для измерения фонового свечения данного образца плазмы. Пробы в планшете инкубировали 10 минут при 37°С. Затем в две оставшиеся ячейки одновременно вносили по 25 мкл активатора, в качестве которого использовали разбавленный в 250 раз «активирующим» буфером (20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 100 мкМ СаС12, pH 7,5) раствор тромбопластина из стандартного теста измерения ПВ (финальная концентрация 4 пМ). В активатор добавляли также фосфолипиды в концентрации 4 мкМ (80% фосфатидилхолина и 20% фосфатидилсерина). Запись флюоресценции AMC, возникающей при гидролизе субстрата тромбином, образующимся в ходе свертывания, осуществляли при 37°С непрерывно на протяжении 90 минут с помощью флюориметрического ридера Appliskan (Thermo Scientific, США) (Х,016=355 нм, >.„,„,.»=460 нм). Измеренную в условных единицах флюоресценции концентрацию AMC переводили в абсолютные концентрации, нормируя полученные сигналы на величину калибровочного сигнала, соответствующего концентрации 1 мкМ AMC. Концентрацию тромбина в каждый момент времени рассчитывали, дифференцируя кривую накопления AMC.

Описанной методикой пользовались при исследовании антикоагулянтных свойств ингибитора 19s при внутривенном введении кроликам (см. ниже). При исследовании антикоагулянтной активности 19s in vitro в каждую пробу вносили дополнительно 5 мкл раствора 19s (различной концентрации) или чистого растворителя без ингибитора.

Приведенная методика предполагает разбавление плазмы в измерительной ячейке в 1,4-1,5 раза. Величина эндогенного тромбинового потенциала немонотонно зависит от степени разбавления плазмы, что особенно важно при исследований плазм с различными степенями разбавления после гемодилюции. Поэтому для анализа тромбинового потенциала в модели гемодилюции на крысах (см. ниже) была

использована модификация методики измерения генерации тромбина без дополнительного разбавления плазмы. Согласно этой модификации, в ячейки планшета помещали по 200 мкл плазмы и по 2 мкл раствора флюорогенного субстрата исходной концентрации 41 мМ. В ячейки, служащие для определения калибровочного сигнала АМС и фонового свечения, добавляли по 3 мкл АМС в концентрации 615 мкМ или буфера, соответственно. Объем вносимого активатора составлял 3 мкл, в качестве активатора использовали разбавленный буфером (20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl и 1.4 М CaC'lj, рН 7,5) в 20 раз раствор тромбопластина из стандартного теста ПВ (его финальная концентрация при этом составляла 4 пМ).

По кривой зависимости концентрации тромбина от времени можно определить суммарное количество тромбина, существовавшего в пробе за 90 минут эксперимента (эндогенный тромбиновый потенциал, ЭТП), максимальную концентрацию тромбина, достигаемую в пробе (Amax). а также время достижения этой максимальной концентрации (tMax) и лаг-период свертывания - время, за которое концентрация тромбина в пробе достигает величины 5нМ (tIag)

Измерение пространственной динамики роста сгустка (тромбодинамики). Пространственная динамика свертывания была измерена в специально сконструированном приборе по методике, подробно описанной в работах [Ovanesov M.V., et al. 2002; Ovanesov M.V., et al. 2003]. В свободную от тромбоцитов плазму добавляли растворы 19s различных концентраций (добавка составляла 6 мкл на каждые 150 мкл плазмы), а также ингибитор трипсина из кукурузы в финальной концентрации 200 мкг/мл (в объеме 6 мкл), чтобы заингибировать контактную активацию свертывания от стенок измерительной кюветы. Полученную смесь инкубировали 10 мин при 37°С, после чего рекальцифицировали добавлением 3 мкл 1 М раствора СаС1г и помещали в кювету с прозрачной стенкой, находящуюся в водяном термостате. Сверху в кювету помещали вставку, несущую на торцевой грани активатор - иммобилизованный тканевый фактор. Растущий от активатора вглубь плазмы фибриновый сгусток регистрировали по светорассеянию специальной видеокамерой. Обработка изображений растущего сгустка позволяла получать профили светорассеяния в различные моменты времени после активации свертывания и рассчитать основные численные параметры тромбообразования, такие как время начала свертывания у активатора (t|ag) и пространственная скорость роста сгустка: начальная (V„a4) или стационарная (Vcrau).

Измерение острой токсичности ингибитора 19s. Безопасность ингибитора 19s определяли на мышах линии С57 В16 (самки, 26-28г), измеряя острую токсичность соединения по методике [Прозоровский В.Б. 1994]. Определяли дозу ингибитора, вызывающую гибель половины животных за время не более 2 часов (1Л}502ч)-

Модель гемодилюции на крысах. Самцам беспородных крыс (250-450 г), анестезированным тиопенталом натрия (40 мг/кг, i.p.), в правую бедренную артерию вводили полиэтиленовый катетер, через который забирали 4.5 мл крови, чтобы вызвать кровопотерю и оценить состояние исходного гемостаза. Для возмещения кровопотери животным вводили равный объем стандартного физиологического раствора (контрольная группа) либо физиологического раствора, содержащего 2 мкМ ингибитора тромбина 19s (опытная группа). Пробы для повторного анализа состояния гемостаза забирали у каждого животного только один раз: через 10, 30 или 60 минут после переливания плазмозамещающего раствора. Состояние системы свертывания оценивали, измеряя эндогенный тромбиновый потенциал. Объем кровопотери (относительно оцененного объема крови каждого животного) рассчитывали, исходя из предположения, что общий объем крови крысы составляет 6,5% от веса тела животного.

Исследование антикоагулянтных свойств ингибитора при внутривенном введении кроликам. Антикоагулянтную активность изучаемого ингибитора проверяли также при внутривенном введении его кроликам (порода Советская Шиншилла, самцы 4.2-5 кг). Из ушной вены животных отбирали кровь для первоначальной оценки состояния гемостаза, после чего в ту же ушную вену вводили 10 мл раствора 19s (финальная концентрация в крови 40 мкМ) в ДМСО (финальная концентрация в крови 0,4%). В контрольных экспериментах вводили растворитель (ДМСО в физиологическом растворе), либо чистый физиологический раствор. Отбор крови для диагностики системы гемостаза (тест генерации тромбина) производили через 10, 30, 60, 120, 240 мин и через 24 часа после введения.

Результаты

Изучение тромбин- и фХа-ингибирующей способности соединения ¡9s в буферном растворе. Способность соединения 19s ингибировать тромбин и фактор Ха была испытана экспериментально по снижению скорости гидролиза тромбином или фактором Ха специфичных хромогенных субстратов в буферном растворе. На рис. 2 представлены кинетические кривые гидролиза тромбин-специфичного хромогенного субстрата в присутствии различных концентраций соединения 19s, а также зависимость степени ингибирования тромбина от концентрации этого соединения. Анализ полученной зависимости позволяет определить значение концентрации 19s, ингибирующей активность фермента на 50 % (IC50). Величина 1С50 оказалась равна 9 нМ.

Приведенные зависимости показывают, что степень ингибирования возрастает при увеличении концентрации ингибитора; кроме того, существовали концентрации, при которых активность тромбина полностью подавлялась. Подобное поведение

характерно для ингибитора с конкурентным механизмом ингибирования. Предполагая этот механизм, можно рассчитать константу ингибирования (К^ тромбина для исследуемого соединения по уравнению Ченга-Прусоффа: К,=1С50/(1+5/Кт), где 1С50 — экспериментально определенная концентрация ингибитора, вдвое снижающая активность фермента (9 нМ); Б - концентрация субстрата при измерении (100 мкМ); Кт - константа Михаэлиса используемого хромогенного субстрата по отношению к тромбину (усредненная величина константы, полученная из литературных данных и на основании собственных экспериментов, была принята равной 9.44 мкМ). Рассчитанная таким образом К[ оказалась равна 0,8 нМ.

Рис.2. Ингибирование активности тромбина соединением НС-0198-10С в буферной системе. А - характерные кинетические прямые накопления продукта, получаемые при гидролизе тромбином хромогенного субстрата СТН в присутствии различных концентраций НС-0195-10С; Б - зависимость степени ингибирования тромбина от концентрации НС-019з-ЮС, полученная на основании этих кинетических данных. Приведены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=8).

Способность 1ингибировать другую важную для свертывания сериновую протеазу - фактор Ха - была проверена аналогичным образом по его способности снижать скорость гидролиза соответствующего хромогенного субстрата (52765) фактором Ха. На основании полученных кинетических кривых была построена зависимость степени ингибирования фХа от концентрации 19в и определены величины Ю50И К[ (рис. 3.).

Константа ингибирования для фактора Ха оказалась более чем в 105 раза больше, чем для тромбина, что говорит о высокой селективности соединения 19$ по отношению к тромбину.

О 200 400 600 800

[НС-0193-ЮС], нМ

Рис. 3. Зависимость ингибирования активности фактора Ха в буферной системе от концентрации соединения 19$. Представлена величина концентрации 198, вдвое снижающая активность фактора Ха (1С50), и константа ингибирования фактора Ха для данного соединения (К^). Приведены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=4).

Определение типа ингибирования и кинетических констант для соединения 19.5 по отношению к тромбину. Предположение о том, что изучаемый ингибитор тромбина является конкурентным ингибитором, было проверено экспериментально. Для этого были измерены скорости гидролиза тромбин-специфичного хромогенного субстрата при постоянной концентрации тромбина и различных концентрациях субстрата и исследуемого ингибитора. Полученные результаты представлены на рис. 4 в координатах Лайнуивера-Берка.

Хорошо видно, что прямые, аппроксимирующие полученные значения, пересекаются в одной точке на оси ординат, что подтверждает предположение о конкурентном механизме ингибирования. По пересечению полученных прямых с осью абсцисс можно определить величины Кт и К| (константа Михаэлиса субстрата по отношению к тромбину и константа ингибирования, соответственно). Рассчитанные таким образом кинетические параметры оказались равны Кт=9.6 мкМ, К[=0.97 нМ, что вполне согласуется с данными, полученными в предыдущем разделе.

Влияние НС-0195-10С на стандартные времена свёртывания. Влияние ингибитора тромбина 19э на величины АЧТВ, ПВ и ТВ было изучено на пулах человеческой и кроличьей плазм. Ингибитор удлинял времена свертывания дозозависимым образом. Его активность характеризовали концентрации, вызывавшие удвоение каждого из исследованных времен свертывания плазмы (СТ2, нМ) (табл. 1).

1/S, мкМ"1

Рис. 4. Определение типа ингибирования тромбина под действием HC-019S-IOC. Скорости гидролиза при различных концентрациях хромогенного субстрата в присутствии постоянной концентрации тромбина и различных концентраций соединения 19s приведены в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка.

Таблица 1. Концентрации НС-019s-IOC, вызывающие in vitro удвоение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ) в плазмах человека и кролика (СТ2, нМ). Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=4).

Вид АЧТВ ПВ ТВ

СТ2, нМ СТ2, нМ СТ2, нМ

Человек 282±20 550±50 25±2

Кролик 755±80 1100±108 13±1

Полученные данные показывают, что более чувствительным к наличию ингибитора тромбина является тромбиновое время, далее идут АЧТВ и ПВ. В тестах АЧТВ и ПВ большую антикоагулянтную активность ингибитор проявляет в человеческой плазме, однако в тесте ТВ действие ингибитора оказалось сильнее в кроличьей плазме.

Влияние НС-019в-ЮС на генерацию тромбина. Антикоагулянтная активность соединения 19з в плазме была оценена по его способности снижать эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина. На рис. 5 представлены изменения характерных кривых генерации тромбина в плазмах различных видов при увеличении концентрации ингибитора.

Плазма человека

Плазма крысы

Время, мин

Время, мин

Плазма кролика

Время, мин

500 1000 1500 2000 Концентрация 19s, нМ

Рис. 5. HC-019s-IC)C снижает генерацию тромбина в плазме in vitro. А, Б и В -характерные кривые генерации тромбина в человеческой, крысиной и кроличьей плазмах, соответственно, в присутствии различных концентраций ингибитора тромбина; Г - зависимости снижения эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) в плазмах различных видов от концентрации ингибитора 19s в плазме. Представлены средние значения ± стандартная ошибка среднего для 2-5 экспериментов с двумя повторами в каждом.

Эти данные показывают, что увеличение концентрации 19s в плазме любого вида приводит к зависящему от концентрации ингибитора снижению эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) и максимальной концентрации тромбина в пробах (Атж) практически до полного отсутствия свёртывания. Одновременно увеличивается время достижения максимальной концентрации (t^) и время лаг-периода свёртывания (t|ag).

Таким образом, при повышении концентрации ингибитора 19s в плазме свертывание ослабляется и замедляется. Для характеристики исследуемого ингибитора в тесте генерации тромбина было выбрано его влияние на эндогенный тромбиновый потенциал, который рассчитывается как площадь под кривой генерации тромбина. Были оценены концентрации ингибитора, снижающие ЭТП в два раза (1С5о) (рис. 5Г). Наименее чувствительной к присутствию ингибитора 19s в тесте

15

генерации тромбина оказалась плазма человека (1С5о=550±10 нМ), в то время как при тех же концентрациях ингибитора ЭТП в плазмах крысы и кролика снижался примерно в два раза быстрее (величины 1С50 составляли 220±30 нМ и 250±120 нМ, соответственно).

Изучение антикоагулянтной активности 19я в плазме методом тромбодинамики. Помимо измерения антикоагулянтной активности 19в стандартными методами, влияние соединения 19в на коагуляцию было также изучено новым методом, при котором исследуется пространственная динамика свертывания крови (метод тромбодинамики). Этот метод позволяет определить влияние исследуемого соединения как на формирование сгустка в целом, так и на отдельные фазы его роста (начальную и/или стационарную скорость).

На рис. 6 представлены зависимости начальной и стационарной скоростей свёртывания, времени задержки свертывания и размера образовавшегося за 1 час фибринового сгустка от концентрации 19Э. Увеличение концентрации 19э снижает скорости роста сгустка вплоть до полного отсутствия свёртывания. Концентрации, при которых скорости замедляются вдвое, составляют 21±1 мкМ и 15±2 мкМ для начальной и стационарной скоростей, соответственно. Время начала свёртывания при этом увеличивается более чем в 30 раз, что, в сочетании с уменьшающимся размером сгустка (концентрация 19Б, снижающая этот параметр вдвое, составляет 11±1 мкМ), говорит о том, что исследуемое вещество эффективно замедляет рост фибринового сгустка в пространстве.

Устойчивость ингибитора в водных растворах. Одним из направлений использования нового синтетического низкомолекулярного ингибитора тромбина НС-0195-ЮС является его введение в состав плазмозамещающих растворов с целью коррекции нарушений, возникающих в системе гемостаза (в частности, при гемодилюции). Это значит, что получаемый раствор должен быть устойчив при стерилизации и длительном хранении; поэтому была исследована возможность стерилизации такого раствора автоклавированием и возможность длительного хранения нового ПЗР при различных температурах - при +4°С и при комнатной температуре. Полученные результаты показывают, что активность ингибитора в стерилизованном растворе не отличается от таковой до стерилизации и сохраняется также при длительном (около 2,5 лет) хранении при обеих исследованных температурах (рис. 7).

50 -40-

та 20

х

>

5 10 15 20 25 30 35

[НС-019Э-ЮС], мкМ

5 10 15 20 25 30 35 40

[НС-019в-ЮС], мкМ

20 15 -

5 10 15 20 25 30 35

[НС-0198-10С], мкМ

3 2,0

ч

5 10 15 20 25 30 35 40

[НС-0195-ЮС], мкМ

Рис. 6. Ингибитор 19э ухудшает пространственную динамику роста сгустка. Зависимости снижения начальной (А) и стационарной (Б) скоростей роста фибринового сгустка, удлинения лаг-тайма (В) и уменьшения размера сгустка, образовавшегося за 1 час (Г), от концентрации 19э в плазме. Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=5-10).

Исследование токсичности соединения 195. Для испытания антикоагулянтной активности 19э на животных необходимо оценить токсичность данного вещества. С этой целью на мышах линии С57В1/6 была определена доза, вызывающая гибель половины животных за время менее 2 часов (1Л35о 2ч)- Эта величина оказалась равна 419±33 мг/кг. Определенная острая токсичность соединения 19в вполне приемлема для использования данного ингибитора в составе плазмозамещающего раствора, т.к. его ЬО50 2ч превышает 1С50 для снижения эндогенного тромбинового потенциала в плазме более чем в 3000 раз.

Сертифицированное токсикологическое исследование, выполненное Лабораторией лекарственной токсикологии НИИЭК ФГУ "РКНПК Росмедтехнологий", показало, что однократное внутрибрюшинное введение мышам линии ВАЬВ/с и крысам \Vistar препарата в диапазоне доз 90-150 мг/кг вызывает интоксикацию и гибель животных, наступающую через 24-48 часов после введения:

при этом установлены на уровне 93,0-102,5 мг/кг (мыши, самцы и самки) и 110120 мг/кг (крысы, самцы и самки). Эти данные свидетельствуют об умеренной токсичности 19э и не выявляют существенных видовых и половых отличий в чувствительности указанных животных к токсическому действию вещества. Также это исследование не выявило влияния вещества на биохимические показатели и функциональное состояние внутренних органов или наличия аллергизирующих, иммуно-, эмбриотоксических и тератогенных свойств и воздействия на репродуктивную функцию животных.

5 80 -

£ 40 -

Ё <

%

Авто «лавирование

I хранения: —+20° С —- +4° С

100 200 0 0 0 400 5 00

0 200 400 600 800 1000 Время, дни

Рис. 7. Сохранение ингибирующей способности НС-195-ЮС по отношению к тромбину после автоклавирования (120°С, 15 мин) и длительного хранения водных растворов ингибитора при разных температурах. Хранение ингибитора осуществлялось в физиологическом растворе в концентрации 1 мкМ. На вставке представлены результаты отдельного опыта, в котором 2 мкМ раствор 19э хранили при комнатной температуре. Первые две точки на вставке представляют активность 19в до и после автоклавирования.

Антикоагулянтные свойства ингибитора при его внутривенном введении кроликам. Способность 19э ингибировать тромбин в живых организмах анализировали по состоянию системы гемостаза до и спустя различные промежутки времени после внутривенного введения этого соединения кроликам. За состоянием гемостаза следили по величине эндогенного тромбинового потенциала.

При внутривенном введении 10 мл раствора 19в в ДМСО (финальные концентрации в крови 40 мкМ и 0,4%. соответственно) у кроликов развивалось гипокоагуляционное состояние, характеризующееся резким падением эндогенного тромбинового потенциала, с последующим монотонным возвратом к

нормокоагуляции в течение 24 часов (рис. 8). Время, за которое гипокоагуляционный эффект снижается в два раза и которое может определять время полужизни вещества в кровотоке, составляет 80 минут.

Рис. 8. Изменение эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) в плазме кроликов с течением времени после внутривенного введения 10 мл раствора 19э в физиологическом растворе, содержащем 10% ДМСО, 10 мл чистого растворителя (10% ЭМвО в физиологическом растворе) или 10 мл физиологического раствора. Представлены средние значения ± стандартные отклонения среднего (п=2-5).

Модель гемодияюционной гиперкоагуляции при возмещении кровопотери на крысах. Для изучения влияния умеренной гемодилюции на гемостаз и проверки гипотезы о возникновении при этой гемодилюции гиперкоагуляционного состояния была разработана животная модель, в которой вызываемая у крыс кровопотеря (4.5 мл крови) быстро возмещалась равным кровопотере объемом стандартного физиологического раствора или физиологического раствора, дополнительно содержащего 2 мкМ ингибитора тромбина. Средняя величина оцененного объема потерянной крови составляла 23.0±4.5 % - это объем кровопотери в процентах по отношению к оцененному теоретически полному объему крови животного. Для выявления изменений, происходящих в системе гемостаза в условиях данной модели, использовали тест генерации тромбина, в частности, анализировали изменение интегрального параметра этого теста - эндогенного тромбинового потенциала.

При восполнении кровопотери стандартным физиологическим раствором у животных развивается гиперкоагуляционное состояние, что видно по увеличению эндогенного тромбинового потенциала с течением времени после переливания раствора (рис. 9, левая диаграмма). При восполнении кровопотери физиологическим

шаэд io мин

I I 30 мин

] 60 мин

0.9% NaCI

0.9% NaCI + 2 мкМ 19S

п=6 п=7 п=7

-20-

Рис. 9. Изменение эндогенного тромбинового потенциала в плазме крыс при восполнении кровопотери различными плазмозамещающими растворами. Представлены средние значения ± стандартные отклонения среднего. * - достоверные различия с соответствующими группами контроля (ANOVA, р<0.05).

раствором, содержащим дополнительно 2 мкМ ингибитора 19s, гиперкоагуляция не наблюдается ни при одном из исследуемых времен (рис. 9, правая диаграмма), кроме того, система свертывания может оказываться в состоянии слабой гипокоагуляции.

Полученные результаты демонстрируют возникновение гиперкоагуляционного состояния при умеренных степенях гемодилюции стандартным кристаллоидным раствором после кровопотери. Это состояние можно скорректировать добавлением в раствор ингибитора тромбина, концентрацию которого, по-видимому, можно снизить, чтобы избежать гипокоагуляционных состояний системы свертывания.

Обсуждение

В настоящей работе проведено подробное экспериментальное исследование нового оригинального низкомолекулярного прямого синтетического ингибитора тромбина, имеющего кодовое название HC-019s-IOC (19s); для этого была разработана специальная стратегия, которая состоит из нескольких последовательных ступеней и может быть применена не только для исследования 19s, но и для испытания других ингибиторов тромбина.

Первой ступенью исследования было прямое изучение антитромбиновой активности нового соединения. Было проверено, насколько эффективно оно ингибирует активность тромбина в чистой буферной системе. Была определена концентрация ингибитора, вызывающая 50% ингибирование фермента - 1С50 = 9 нМ.

Степень ингибирования увеличивалась с повышением концентрации соединения и при определенных концентрациях достигала 100%. Это указывало на возможность конкурентного механизма ингибирования. Дополнительные эксперименты по проверке этого предположения доказали, что мы действительно имеем дело с конкурентным ингибитором тромбина (см. рис. 4). Это позволило рассчитать константу ингибирования тромбина по измеренной в эксперименте величине ICjq. Величина константы ингибирования по отношению к тромбину человека оказалась равна 0.8-0.97 нМ, что говорит о высокой ингибирующей активности данного соединения.

Мы не проводили полного исследования специфичности нового ингибитора, однако проверили его активность по отношению к другой важнейшей сериновой протеазе каскада свертывания - фактору Ха. При этом было обнаружено, что константа ингибирования фактора Ха под действием соединения HC-019s-IOC более чем в 100000 раз превосходит аналогичную константу для тромбина, что говорит о гораздо меньшей эффективности ингибирования фактора Ха по сравнению с тромбином. Стоит отметить, что подобное соотношение для аргатробана составляет около 5250 раз [Jeske W., et. al. 1999; Kikumoto R„ et. al. 1984].

Наличие высокой антитромбиновой активности в чистом буферном растворе еще не доказывает, что исследуемое соединение будет являться эффективным антикоагулянтом в плазме крови. Это связано с тем, что плазма представляет собой многокомпонентную смесь различных факторов системы свертывания и других белков. Если исследуемое вещество способно взаимодействовать с другими факторами свертывания и сильно активировать их, то суммарный наблюдаемый эффект введения такого вещества на систему свертывания заранее предсказать невозможно. Кроме того, эффективность ингибитора может катастрофически снижаться, если оно сильно связывается с белками плазмы, например, с альбумином. Это может привести к тому, что для достижения в плазме терапевтической концентрации ингибитора потребуется введение очень большого количества вещества. Таким образом, необходима проверка антикоагулянтного действия ингибитора в плазме.

На второй ступени исследования эта активность была проверена в экспериментах in vitro. В качестве тестов для исследования влияния соединения НС-019s-IOC на свертывание в плазме были выбраны стандартные коагулогические тесты (стандартные времена свертывания: АЧТВ, ПВ и ТВ), а также два современных интегральных теста, характеризующих гемостаз: тест генерации тромбина (гомогенный тест) и тест, измеряющий тромбодинамику (т.е. скорость роста сгустка в пространстве в неперемешиваемой плазме при активации свертывания локально зафиксированным активатором). Последний тест является уникальным. Он был

разработан в лаборатории физической биохимии ФГБУ ГНЦ МЗСР и не имеет аналогов в мире.

Исследование влияния нового ингибитора на стандартные коагулогические тесты показало, что все стандартные времена свёртывания при внесении ингибитора в плазму удлинялись. Эксперименты были проведены на плазме человека и кролика. Наиболее чувствительным к присутствию ингибитора (в плазме обоих видов) оказался тест ТВ, что хорошо согласуется с данными литературы [Castellone DD., et al. 2010]. Величина эффекта при измерении любого из стандартных времен свертывания увеличивалась с повышением концентрации ингибитора. Эффекты в плазмах разных видов были качественно аналогичны, хотя плазма человека оказалась более чувствительной, чем плазма кролика, к присутствию ингибитора в тестах АЧТВ и ПВ, но хуже чувствовала ингибитор в тесте ТВ (см. таблицу 1). Таким образом, во всех проведенных тестах соединение 19s проявило себя как антикоагулянт.

Эксперименты по определению эндогенного тромбинового потенциала в тесте генерации тромбина также показали, что соединение 19s обладает антикоагулянтной активностью в плазмах различных видов (рис. 5). Данный тест измеряет кинетику образования и ингибирования тромбина в плазме после активации в ней свертывания. Уровень активации всегда стандартен и строго дозирован. Самым главным при этом является то, что он сильно ниже, чем уровень активации в стандартных клотгинговых тестах, и близок к величине той активации, которая имеет место в сосудах в условиях реального свертывания in vivo. Это делает данный тест чувствительным как к гипо-, так и к гиперкоагуляционным сдвигам в системе свёртывания.

Присутствие ингибитора в плазме дозозависимым образом снижало максимальную концентрацию тромбина, образующегося в пробе; удлиняло время достижения этой концентрации и лаг-тайм генерации тромбина; а также уменьшало эндогенный тромбиновый потенциал (суммарную площадь под кривой генерации тромбина (рис. 5Г)). Все эти изменения говорят об антикоагулянтном действии введенного соединения. Эффективность антикоагулянтного эффекта ингибитора характеризовали величиной его концентрации, которая снижала ЭТП на 50% (1С50 этп). Оказалось, что наиболее эффективно ингибитор работал в плазме крысы и кролика (соответствующие ICjo этп составляли 220 и 250 мкМ), тогда как в плазме человека IC50 этп была примерно в 2 раза выше (550 мкМ). Несмотря на это, общая картина ингибирования в плазмах всех исследованных видов была качественно сходна. Измеренная для 19s 1С50 этп была даже немного ниже, чем аналогичная концентрация для аргатробана, равная 650 мкМ [Nagashima Н. 2002]. Это означает, что ингибирующая активность HC-019S-IOC не уступает аналогичной активности аргатробана и при измерении генерации тромбина в плазме.

Еще одним тестом, с помощью которого была измерена антикоагулянтная активность нового ингибитора в плазме крови in vitro, стал тест тромбодинамики. В настоящее время этот тест проходит всестороннюю верификацию, претендуя на то, чтобы в ближайшее время стать стандартным клиническим тестом. Он является не гомогенным, как все другие тесты исследования коагуляции, а пространственно-распределенным. При его постановке плазма в ходе свертывания не перемешивается, а активатор, несущий на своей поверхности иммобилизованный тканевой фактор, строго локализован в пространстве. Эти условия, до некоторой степени, имитируют те, при которых происходит свертывание в мелких сосудах организма. На результат теста влияют не только концентрации участников свертывания, но и неоднородность их пространственного распределения, и скорости диффузии различных факторов свертывания. Таким образом, этот тест еще более снимает противоречия между измеряемыми in vitro параметрами коагуляции и реальным свертыванием в организме in vivo.

Оказалось, что ингибитор 19s довольно сильно влияет на все параметры этого теста (рис.б). Он удлиняет лаг-тайм и снижает скорости свёртывания (как начальную, так и стационарную), а также уменьшает размер сгустка, образовавшегося после фиксированного времени свертывания (который является интегральной характеристикой процесса в целом). Несмотря на то, что данный тест, так же как и тест генерации тромбина, проводится в плазме in vitro, эффективные концентрации ингибитора (IC50) при этом оказались выше, чем в тесте генерации тромбина. Это может быть связано с тем, что даже незначительных следовых концентраций тромбина достаточно для образования регистрируемого фибринового сгустка, и только достаточно сильное снижение концентрации тромбина (при высоких концентрациях ингибитора) может существенно повлиять на скорость образования фибрина. Примечательно, что под действием ингибитора начальная и стационарная скорости, а также размер сгустка уменьшаются в 3-5 раз, тогда как лаг-период, характеризующий начало свёртывания от поверхности с тканевым фактором, удлиняется примерно в 25 раз. Объяснить подобное различие возможно только тем, что на разных стадиях образования сгустка ведущими являются различные реакции, которые могут быть по-разному чувствительны к присутствию ингибитора. Исследование этих фундаментальных процессов в настоящее время еще не закончено.

Следующая стадия испытаний нового ингибитора была посвящена исследованию его антикоагулянтного действия в животных моделях in vivo. Необходимость таких испытаний связана с тем, что, в отличие от опытов в плазме in vitro, в организме может происходить накопление препарата в различных органах и тканях, а также его метаболические превращения. В результате этого может сильно снижаться концентрация свободного ингибитора в плазме крови, или же он может

быстро превращаться в неактивный метаболит. Таким образом, для достижения нужных терапевтических концентраций может потребоваться увеличение дозы вводимого вещества. Это может сделать испытуемое вещество малопригодным для антикоагулянтной терапии.

Однако прежде, чем начать испытания in vivo, необходимо было убедиться в безопасности нового соединения при введении его в организм в дозах, способных вызывать антикоагуляцию. Одним из стандартных показателей безопасности может служить острая токсичность. Ее можно определить по-разному. В нашей работе острая токсичность была определена как доза препарата, после введения которой половина животных умирает в течение < 2 час (LD5[¡ 2ч). Величина этой дозы для нашего ингибитора составила 419±33 мг/кг веса животного (мыши). Аналогичная величина для аргатробана составляет 475 мг/кг. При введении препарата мыши в дозе из расчета данной величины LD50 2ч, концентрация препарата (при расчете на целое животное) будет составлять 0.82 мМ, что более чем в 1000 раз превышает концентрацию, снижающую эндогенный тромбиновый потенциал на 50%. Таким образом, мы посчитали новый ингибитор достаточно безопасным. В пользу этого вывода указывает и тот факт, что при работе с кроликами каждое животное получало препарат неоднократно на протяжении, по крайней мере, 1-1.5 лет (с перерывами между введениями около месяца), и ни одно из них не демонстрировало признаков проявления токсического действия препарата.

Всеобъемлющая проверка различных возможных токсикологических эффектов ингибитора HC-019s-IOC была также проведена в специальной сертифицированной лаборатории (Лаборатория лекарственной токсикологии НИИЭК ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий») под руководством д. м. н., проф. Е.В. Арзамасцева. Она показала, что препарат хорошо переносится животными и не оказывает влияния на биохимические показатели и функциональное состояние внутренних органов, не обладает аллергизирующими и иммунотоксическими, а также эмбриотоксическими и тератогенными свойствами, не влияет на репродуктивную функцию животных. Таким образом, данная проверка подтвердила, что новое вещество является достаточно безопасным для применения in vivo.

Так как одним из способов применения нового ингибитора может стать добавление его в стандартный плазмозамещающий раствор, немаловажной оказалась высокая устойчивость препарата к условиям автоклавирования, необходимого для стерилизации нового ПЗР, а также его стабильность при длительном хранении в водных растворах (рис. 7). Антикоагулянтная активность в растворах сохранялась, по меньшей мере, на протяжении 3 лет при хранении не только в холодильнике, но и при комнатной температуре. Это доказало возможность создания нового ПЗР,

содержащего данный ингибитор тромбина, для коррекции различных гиперкоагуляцонных нарушений.

Сначала антикоагулянтные и фармакодинамические свойства ингибитора были определены in vivo при внутривенном введении кроликам (рис. 8). Эффект, производимый ингибитором при внутривенном введении, наступает сразу. Уже через 10 минут после введения отмечается снижение ЭТП на 37%, после чего наблюдается монотонное возвращение от возникшей гипокоагуляции к состоянию с нормальным свёртыванием. Можно сказать, что в течение первых 30 мин возникает устойчивая гипокоагуляция (снижение ЭТП через 10 мин и 30 мин составляет 37 и 33%, соответственно), снижающаяся вдвое за время порядка 70-90 мин (снижение ЭТП за 60 мин и 120 мин составляет 20% и 15%, соответственно). Таким образом, время полужизни ингибитора в организме кролика (для первой быстрой фазы снижения) составляет около 80 мин. При этом введение в контрольных экспериментах физиологического раствора или физиологического раствора, содержащего 10% ДМСО, не приводило к достоверному изменению свертывания.

Следующий этап проверки антикоагулянтного действия нового ингибитора in vivo был проведен в модели гемодилюции на крысах (рис. 9).

В ряде работ было показано, что при разбавлении плазмы физиологическим раствором in vitro возникает гемодилюционная гиперкоагуляция. В данной работе была разработана модель гемодилюции in vivo, в которой контролируемая кровопотеря у крыс восполнялась стандартным физиологическим раствором. На первом шаге было доказано, что, аналогично опытам in vitro, при умеренных степенях гемодилюции физиологическим раствором in vivo развивается гиперкоагуляция, которая может быть зарегистрирована по снижению ЭТП (рис. 9, левая диаграмма). Для того чтобы избежать возникновения этой гиперкоагуляции и вернуть ЭТП к нормальному значению, мы провели возмещение кровопотери равным объемом физиологического раствора, содержащего дополнительно 2 мкМ ингибитора тромбина 19s. Новый ПЗР, действительно, не вызывал развития гиперкоагуляции -наоборот, на всех исследованных временах ЭТП был снижен относительно исходного уровня (рис. 9, правая диаграмма). Это говорит о том, что новый ингибитор оказывал свое антикоагулянтное действие после переливания в составе ПЗР. Исходя из результатов нашего исследования, можно предположить, что концентрация ингибитора HC-019s-IOC в ПЗР подобрана не оптимальным образом. Ее можно несколько снизить, чтобы избежать гипокоагуляционных изменений свёртывания. Однако это не изменяет основного вывода о существовании антикоагулянтного эффекта нашего ингибитора в разработанной модели умеренной гемодилюции in vivo.

Полученные результаты позволяют надеяться, что новый прямой низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-IOC может оказаться перспективным для клинического применения.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что 19s является высокоэффективным конкурентным ингибитором человеческого тромбина в буферной системе, но практически не ингибирует фактор Xa (Ki составляют 0,8 нМ и 92,5 мкМ для тромбина и фХа, соответственно).

2. Новый ингибитор тромбина обладает антикоагулянтными свойствами в плазме in vitro:

а) удлиняет стандартные времена свертывания (концентрации, вызывающие удвоение АЧТВ, ПВ и ТВ в плазме человека, составляют 282 нМ, 550 нМ и 25 нМ, соответственно);

б) снижает эндогенный тромбиновый потенциал в плазме человека (ICsn = 550 нМ), кролика (1С5о = 250 нМ) и крысы (ICj(1 = 220 нМ);

в) снижает параметры теста тромбодинамики - начальную и стационарную скорости роста сгустка в пространстве и его размер после 60 мин свертывания (IC50 составляют 21 мкМ, 15 мкМ и 11 мкМ соответственно).

3. Показано, что новый ингибитор стабилен при стерилизации автоклавированием и сохраняет свою активность при более чем двухгодовом хранении в водных растворах как при +4°С, так и при комнатной температуре.

4. Показано, что ингибитор 19s является достаточно безопасным. Величина острой токсичности 19s при внутрибрюшинном введении мышам (LD5Ü 2ч) составляет 419 мг/кг, что более, чем в 1000 раз превышает его предполагаемую терапевтическую концентрацию.

5. Показано, что исследуемый ингибитор может быть использован в качестве антитромботического средства, так как способен снижать генерацию тромбина у кроликов in vivo;

6. Продемонстрировано, что при умеренных степенях гемодилюции (23±4,5%) физиологическим раствором у крыс развивается состояние гиперкоагуляции. Добавление ингибитора тромбина 19s (2 мкМ) в физиологический раствор позволяет скомпенсировать вызываемые гемодилюцией гиперкоагуляционные нарушения.

Материалы диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Синауридзе Е.И., Суров С.С., Грибкова И.В.,. Горбатенко А.С, Монаков М.Ю., Атауллаханов Ф.И. Функциональные испытания нового синтетического ингибитора тромбина HC-019s-IOC in vitro и in vivo в составе плазмозамещающего раствора на модели гемодилгации у крыс. Технологии Живых Систем, 2009, т. 6, № 8, стр. 67-77.

2. Синауридзе Е.И., Романов А.Н., Кондакова O.A., Грибкова И.В., Суров С.С., Горбатенко A.C., Кузнецов Ю.В., Боголюбов A.A., Сулимов В.Б., Атауллаханов Ф.И. Новые прямые низкомолекулярные синтетические ингибиторы тромбина. Технологии Живых Систем, 2011, т. 8, № 3, стр. 34-47.

3. Sinauridze EI, Romanov AN, Gribkova IV, Kondakova OA, Surov SS, Gorbatenko AS, Butylin AA, Monakov MY, Bogolyubov AA, Kuznetsov YV, Sulimov VB, Ataullakhanov FI. New synthetic thrombin inhibitors: molecular design and experimental verification. PLoS One. 2011; 6(5):el9969. Epub 2011 May 16.

4. Атауллаханов Ф.И,. Синауридзе Е.И, Суров С.С., Грибкова И.В., Горбатенко A.C. Функциональные испытания нового синтетического ингибитора тромбина НС-019s-IOC in vitro и in vivo в составе плазмозамещающего раствора на модели гемодилюции у крыс. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", Москва, «Слово», декабрь 2009 г., стр. 107-108.

5. Gribkova I.V., Surov S.S., Sinauridze E.I., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I Supplementing normal saline with synthetic low-molecular-weight thrombin inhibitors for use as a plasma volume expander. 54'd Annual Meeting Society of Thrombosis and haemostasis Research, Nürnberg, February 24 - 27, 2010, Hemostasiology, 1, 2010, p.A99.

6. Gribkova I.V., Sinauridze E.I., Surov S.S., Gorbatenko A.S., Ataullakhanov F.I. Examination of a new plasma substituting solution (PSS) with thrombin inhibitor in rat models of hemodilution. Материалы конференции XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13,2010, poster 57.

7. Surov S.S., Vuimo T.A., Gribkova I.V., Gorbatenko A.S., Sinauridze E.I., Ataullakhanov F.I. Experimental study of the new synthetic low-molecular-weight thrombin inhibitor HC-OI9S-IOC. Материалы конференции XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, Jerusalem, Israel, October 10-13,2010, poster 96.

8. Атауллаханов Ф.И., Синауридзе Е.И., Сулимов В.Б., Романов А.Н., Грибкова И.В., Суров С.С., Кондакова O.A., Горбатенко A.C., Кузнецов Ю.В., Боголюбов

A.A.. Поиск новых высокоэффективных низкомолекулярных синтетических прямых ингибиторов тромбина. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", Москва, «Слово», декабрь 2010 г, с. 125-127.

Подписано в печать:

27.04.2012

Заказ № 7319 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суров, Степан Сергеевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии

Российской академии наук

61 12-3/910

На правах рукописи

Суров Степан Сергеевич

Новый синтетический низкомолекулярный ингибитор тромбина HC-019s-ЮС. Исследование свойств in vitro и in vivo

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук Е.И. Синауридзе

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Москва 2012

Содержание

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................10

1.1. Современные представления о гемостазе человека.............................10

1.1.1. Тромбоцитарное звено гемостаза......................................................11

1.1.2. Плазменное звено гемостаза..............................................................13

1.1.3. Роль сосудистой стенки в гемостазе.................................................18

1.1.4. Патологическое функционирование системы свёртывания крови: тромбоз...........................................................................................................19

1.2. Тромбин как мишень антикоагулянтной терапии.................................20

1.2.1. Структура, функции и регуляция активности тромбина................20

1.2.2. Антитромботические средства..........................................................26

1.2.2.1. Антитромбоцитарная терапия ...............................................26

1.2.2.2. Антикоагулянтные средства....................................................28

1.2.2.3. Ингибиторы активности тромбина: принципы и практика. 31

1.3. Инфузионно-трансфузионная терапия кровопотери............................45

1.3.1. Основные цели.....................................................................................45

1.3.2. Общие сведения о современных инфузионных растворах.............45

1.3.3. Влияние плазмозамещающих растворов на систему гемостаза.....52

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................58

2.1. Материалы.....................................................................................................58

2.2. Методы...........................................................................................................60

2.2.1. Компьютерный дизайн и синтез нового прямого низкомолекулярного ингибитора тромбина...............................................60

2.2.2. Измерение ингибирующей активности соединения 19б по отношению к тромбину и фактору Ха........................................................63

2.2.3. Определение типа ингибирования и кинетических констант для соединения 19б по отношению к тромбину................................................64

2.2.4. Устойчивость ингибитора в водных растворах...............................64

2.2.5. Устойчивость ингибитора в водных растворах...............................65

2.2.6. Определение стандартных времен свертывания..............................65

2.2.7. Измерение генерации тромбина .......................................................66

2.2.8. Измерение пространственной динамики роста сгустка (тромбодинамики).........................................................................................70

2.2.9. Измерение острой токсичности ингибитора 19s..............................73

2.2.10. Исследование антикоагулянтных свойств ингибитора при внутривенном введении кроликам..............................................................74

2.2.11. Модель гемодилюции на крысах.....................................................75

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.................................................................................................76

3.1. Исследования свойств нового синтетического низкомолекулярного ингибитора тромбина НС-019s-IOC in vitro...................................................76

3.1.1. Изучение тромбин- и фХа-ингибирующей способности соединения HC-019s-IOC в буферном растворе............................................................76

3.1.2. Определение типа ингибирования и кинетических констант для соединения 19s по отношению к тромбину................................................79

3.1.3. Влияние HC-019s-IOC на стандартные времена свёртывания.......80

3.1.4. Влияние HC-019s-IOC на генерацию тромбина...............................81

3.1.5. Изучение антикоагулянтной активности 19s в плазме методом тромбодинамики............................................................................................83

3.1.6. Устойчивость ингибитора в водных растворах...............................87

3.2. Исследования свойств нового синтетического низкомолекулярного ингибитора тромбина НС-019s-IOC in vivo....................................................88

3.2.1 Исследование токсичности соединения 19s......................................88

3.2.2. Антикоагулянтные свойства ингибитора при его внутривенном введении кроликам........................................................................................88

3.2.3. Модель гемодилюционной гиперкоагуляции при кровопотере на крысах.............................................................................................................90

ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................................92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................104

ВЫВОДЫ............................................................................................................105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................106

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Нарушения в системе свёртывания крови являются причиной более чем трети смертей при различных патологических состояниях: сердечнососудистых заболеваниях, травмах различной природы и хирургических операциях, сепсисе, ожогах, онкологических заболеваниях, заболеваниях, связанных с патологией гемостаза, и т.п. Возникающие при этом гиперкоагуляционные состояния способны приводить к тромбозам -патологическому свёртыванию крови различной локализации. Изменения, происходящие при функционировании стенок сосудов и в системе свёртывания крови и приводящие к тромбозам, не до конца изучены, однако понимание этих процессов необходимо для разработки и усовершенствования антитромботических средств.

В качестве основных направлений воздействия на систему гемостаза для предупреждения и лечения тромбозов можно выделить: применение ингибиторов сериновых протеиназ системы свёртывания; применение антагонистов витамина К, снижающих синтез печенью предшественников прокоагулянтных факторов системы свертывания; применение антитромбоцитарных препаратов, снижающих активацию и агрегацию тромбоцитов и препятствующих дальнейшему тромбообразованию; применение фибринолитических агентов.

В настоящее время в клинике используются, в основном, три антитромботических препарата: нефракционированный гепарин или его аналоги низкого молекулярного веса, оральный антикоагулянт варфарин (антагонист витамина К) и ингибитор активации тромбоцитов - аспирин. Эти лекарства имеют ограничения в применении и побочные эффекты, что лимитирует их использование и побуждает к поиску и разработке новых препаратов, не менее эффективных, но свободных от недостатков стандартных средств. Современные представления о гемостазе и тромбозе и

опыт использования антитромботических средств (антикоагулянтов, тромболитических и антитромбоцитарных агентов) говорят о том, что перспективной является разработка синтетических низкомолекулярных прямых ингибиторов тромбина, так как именно этот фермент является ключевым в системе свёртывания крови, а его повышенная активность способна приводить к тромбозам. Синтетические низкомолекулярные ингибиторы тромбина имеют целый ряд преимуществ перед антикоагулянтами, используемыми в клинике в настоящее время: это быстрота наступления действия, высокая эффективность, предсказуемая фармакокинетика, отсутствие необходимости постоянного мониторинга состояния гемостаза. На сегодняшний день в мире клинически используются только два таких ингибитора - вводимый внутривенно аргатробан и пероральный антикоагулянт (пролекарство) дабигатран этексилат. Ни один из них не лицензирован в России. Однако эти препараты также имеют ряд недостатков: аргатробан обладает низкой стабильностью и коротким временем жизни в плазме, что требует его частых инфузий для поддержания терапевтических концентраций; дабигатран этексилат может быть использован перорально, однако пока только для ограниченного числа патологий, кроме того, он имеет низкий процент биодоступности. Таким образом, поиск новых, эффективных и безопасных низкомолекулярных синтетических ингибиторов тромбина является весьма актуальной задачей современной фундаментальной науки и клинической медицины.

Цель работы

Ранее, в результате совместной работы нескольких институтов и лабораторий (Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Лаборатории физической биохимии ФГБУ Гематологический научный центр МЗСР РФ, Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им. М. В. Ломоносова, Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН), был осуществлён

компьютерный дизайн и синтез нового ряда синтетических низкомолекулярных ингибиторов тромбина. Цель настоящей работы состояла в исследовании функциональных свойств одного из новых ингибиторов (HC-019s-IOC), его способности оказывать антикоагуляционное действие как in vitro, так и in vivo.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Определить тип механизма ингибирования и параметры ингибирования тромбина под действием исследуемого соединения в чистой буферной системе (по влиянию на скорость гидролиза хромогенного субстрата).

2. Определить параметры антикоагулянтного действия данного соединения в плазме in vitro (в стандартных временах свертывания, а также в тестах генерации тромбина и тромбодинамики).

3. Оценить стабильность растворов исследуемого соединения при стерилизации автоклавированием и последующем длительном хранении.

4. Определить острую токсичность HC-019s-IOC (при внутрибрюшинном введении на мышах).

5. Исследовать антикоагулянтные свойств ингибитора в опытах in vivo при внутривенном введении кроликам и в модели гемодилюции при кровопотере у крыс.

Научная новизна работы

В работе впервые подробно экспериментально исследованы свойства нового низкомолекулярного синтетического прямого ингибитора тромбина HC-019s-IOC. Доказан конкурентный тип ингибирования и определена константа ингибирования тромбина в чистой системе. Показано, что данное соединение может являться эффективным антикоагулянтом в плазме как in vitro, так и в опытах in vivo.

Впервые разработана модель для изучения изменений свертывания при умеренной гемодилюции в ходе восполнения кровопотери (на крысах). С помощью этой модели показано, что умеренная гемодилюция in vivo физиологическим раствором вызывает состояние гиперкоагуляции, которое может быть успешно преодолено путем добавления в стандартный плазмозамещающий раствор ингибитора тромбина.

Все полученные результаты показывают, что исследованный новый ингибитор тромбина является перспективным для клинического применения, т.к. он более эффективен и стабилен, а также не более токсичен, чем применяемый в клинике аргатробан.

Научно-практическое значение

Научное значение данной работы состоит в разработке методики испытаний препаратов с целью исследования их возможного антитромботического действия. Кроме того, впервые показано, что умеренная гемодилюция in vivo стандартным плазмозамещающим раствором (ПЗР) может являться риск-фактором для развития гиперкоагуляции, и что этого можно избежать, добавляя в стандартные ПЗР ингибитор тромбина.

Практическое значение работы состоит в разработке отечественного препарата для лечения тромботических осложнений на основе нового ингибитора тромбина HC-019s-IC>C. Доклинические испытания показали, что данный ингибитор является перспективным для клинического применения и превосходит по своим параметрам применяемый в мировой практике аргатробан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследуемое вещество - HC-019s-IOC - является высокоэффективным конкурентным ингибитором тромбина в буферной системе и практически не ингибирует фактор Ха.

2. HC-019s-IOC является эффективным антикоагулянтом в плазме in vitro: он удлиняет стандартные времена свертывания, снижает эндогенный тромбиновый потенциал и скорость пространственного роста сгустка пропорционально концентрации добавленного в плазму ингибитора.

3. Новый ингибитор имеет приемлемую острую токсичность.

4. Водные растворы ингибитора (в микромолярных концентрациях) способны переносить стерилизацию автоклавированием и оставаться стабильными при длительных временах хранения как при +4°С, так и при комнатной температуре.

5. Внутривенное введение HC-019s-IC)C кроликам оказывает антикоагулянтное действие (снижает эндогенный тромбиновый потенциал плазмы).

6. Восполнение умеренной (23%) кровопотери физиологическим раствором приводит к гиперкоагуляции у крыс; восполнение кровопотери физиологическим раствором, дополнительно содержащим HC-019s-IC)C, отменяет возникновение этой гиперкоагуляции.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о гемостазе человека

Под термином «гемостаз» подразумевают, как правило, комплекс реакций организма, направленных на предупреждение и остановку кровотечений. Всякий раз при повреждении и разрыве сосуда развивается гемостаз, в котором участвуют несколько механизмов: (1) сужение сосуда; (2) образование тромбоцитарной пробки; (3) формирование кровяного сгустка в результате коагуляции крови; (4) врастание в кровяной сгусток фиброзной ткани, что окончательно закрывает место разрыва в сосуде. В целом, традиционно выделяют первичный - сосудисто-тромбоцитарный - и вторичный - плазменный - гемостаз.

При повреждении сосуда первым срабатывает первичный гемостаз -вазоконстрикция (резкое сужение сосуда) позволяет уменьшить объем крови, проходящей через место повреждения, а тромбоциты, активируясь и агрегируя на поврежденной поверхности за счет высвобождаемых из поврежденного эндотелия веществ, образуют рыхлый сгусток, предотвращающий потерю клеток крови, но не плазмы. Характерное время срабатывания этих систем составляет 15-20 секунд при серьезной травме сосудистой стенки и 1-2 минуты при незначительной [1]. На фоне этих событий развивается плазменное свёртывание, активирующееся при контакте крови с клетками, лежащими под эндотелием. Работа плазменного звена приводит к образованию плотного фибринового сгустка, полностью предотвращающего потерю крови. С течением времени происходит дальнейшее уплотнение сгустка (ретракция) и лизис тромба. Все компоненты гемостаза тесно связаны между собой - сосудистая стенка и тромбоциты предоставляют свои поверхности для проведения реакций свёртывания и секретируют вещества, регулирующие тромбообразование, а ключевой фермент системы свёртывания - тромбин - является мощным активатором

тромбоцитов и регулятором фибринолиза [2,3]. Рассмотрим процессы тромбоцитарного, плазменного и сосудистого гемостаза подробнее.

1.1.1. Тромбоцитарное звено гемостаза

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки крови, присутствующие в ней в концентрации 150000-300000 в 1 мкл. Они являются первой, а иногда и единственной (при незначительных травмах) защитой организма при повреждении сосуда [4]. Активация тромбоцитов представляет собой сложный процесс, в котором участвуют многочисленные вещества. Контакт тромбоцитов с рядом физиологических веществ - АДФ, тромбином, коллагеном, тромбоксаном А2, вазопрессином, адреналином, а также их механическое повреждение, активация системы комплемента, воздействие кальциевым ионофором приводят к драматическим изменениям в клетке: тромбоциты, в норме имеющие блюдцевидную форму, начинают увеличиваться в размере, принимают неправильную форму с множеством расходящихся псевдоподий, приобретают способность к адгезии и агрегации; их сократительные белки мощно сокращаются, способствуя выделению про-и антикоагулянтных веществ из содержащихся в тромбоцитах гранул, тромбоциты изменяют также состав своей мембраны, позволяя факторам свёртывания связываться и реагировать на ней, и отщепляют микровезикулы, способные поддерживать реакции свёртывания [2].

Разнообразие активаторов тромбоцитов и их сложные взаимодействия не до конца понятны, однако существующие данные позволяют построить примерную картину событий при повреждении сосуда [5,6]. Основными первоначальными активаторами тромбоцитов являются АДФ и коллаген. Первый выделяется при разрушении клеток, а второй обнажается из-под поврежденного эндотелия. АДФ является сравнительно слабым активатором и даже не может вызвать все виды секреции тромбоцита. Тем не менее, АДФ обеспечивает активацию тромбоцитов в потоке, их адгезию к коллагену и агрегацию. Это приводит к формированию первичного тромбоцитарного

тромба. Коллаген, а затем и тромбин, который вырабатывается плазменной системой свертывания, полностью активируют тромбоциты. Те, в свою очередь, секретируют АДФ и тромбоксан А2, вовлекая в процесс активации новые тромбоциты. Кроме того, коллаген и тромбин вызывают изменения в клеточной мембране, приводящие к связыванию факторов и ускорению реакций свертывания. Прочие активаторы тромбоцитов, такие как адреналин, не присутствуют в организме в количествах, способных вызвать активацию. Скорее всего, их роль заключается в базовой регуляции чувствительности гемостаза путем изменения порога активации тромбоцитов сильными активаторами [7].

Участие тр�