Влияние тромбина на регенерацию периферических нервов и синапсов

Герасименко, Наталья Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние тромбина на регенерацию периферических нервов и синапсов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние тромбина на регенерацию периферических нервов и синапсов"

На правах рукописи

ГЕРАСИМЕНКО НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ТРОМБИНА НА РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕРВОВ И СИНАПСОВ

03 00 13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ177234

Москва 2007

003177234

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского Государственного Университета им.М В.Ломоносова, (заведующий - доктор биологических наук, профессор Андрей Александрович Каменский)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Ольга Петровна Балезина

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ-

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины Владимир Борисович Кошелев;

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ГУ «Научный центр здоровья детей РАМН» Татьяна Павловна Сторожевых

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский Университет Дружбы Народов

Защита состоится 17_декабря 2007года в 15ч ЗОмин на заседании

диссертационного ученого совета Д 501 ООО 93 при Московском государственном университете им М.В Ломоносова по адресу: 119991 Москва Ленинские горы, д 1 корп 12, биологический факультет, ауд.М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им.М.В Ломоносова

Автореферат разослан 17 ноября 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Б. А Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Исследования последних десятилетий показали, что тромбин - сериновая протеиназа, участвующая в тромбообразовании, обладает также свойствами сигнальной молекулы, то есть способен активировать специфические мембранные рецепторы к тромбину, т.н. PAR-рецепторы (от англ. Proteinase Activated Receptors) (Niclou et al, 1998; Turgeon et al, 2000) PAR-рецепторы - 7-доменные, G-белок сцепленные рецепторные белки, обнаружены на мембранах разных типов клеток, в том числе нейронов и их отростков. Активация PARs тромбином или синтетическими агонистами может способствовать, в зависимости от концентрации, либо гибели нейронов, либо (в низких концентрациях) устойчивости к действию повреждающих факторов (Xi et al, 1999, Striggow et al, 2000; Smirnova et al., 2001). Известно, что мотонейроны скелетных мышц мыши обладают PAR-рецепторами (Smirnova et al, 2001) Исследования в культуре и in vivo показали, что экзогенный тромбин при действии на PAR-рецепторы мотонейронов способен ускорять созревание моторных аксонов и моторной иннервации скелетных волокон в раннем онтогенезе путем ускорения процесса элиминации множественной иннервации и формирования одиночной концевой пластинки на мышечном волокне (Jia et al, 1999; Lanuza et al., 2001; Lanuza et al, 2003)

В ряде работ описано увеличение плотности PAR-рецепторов и содержания РНК протромбина в поврежденном седалищном нерве и денервированной скелетной мышце (Smirnova et al, 1996, Kim et al, 1998, Niclou et al, 1998, Friedman et al., 1999) В связи с этим весьма актуальным является вопрос о способности тромбина оказывать дозозависимые разнонаправленные влияния на поврежденный мотонейрон и его аксоны В последнее время особенно актуальным становится выявление возможного нейротрофического действия тромбина, поиск эффективных доз экзогенного тромбина и агонистов PAR для облегчения регенерации моторных и сенсорных аксонов после травмы периферического нерва и для восстановления нервно-мышечной передачи в мышцах в ходе их реиннервации

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследовать возможные нейротрофические эффекты экзогенного тромбина его способность облегчать функциональное восстановление передавленного периферического нерва и реиннервацию мышц, усиливать активность нововообразуемых нервно-мышечных контактов путем активации PAR

рецепторов и внутриклеточных каскадов в составе нерва и моторных синапсов

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие конкретные задачи;

1. Изучить изменения функциональных параметров регенерирующего нерва (п. fibularis) мыши при однократной аппликации на передавленный нерв тромбина, трипсина или пептидов-агонистов PARI и PAR2-рецепторов

2. Сопоставить характер спонтанной и вызванной синаптической активности у интактных и новообразуемых нервно-мышечных синапсов мышцы -длинного разгибателя пальцев (muEDL) - на фоне действия агониста PARI рецепторов

3. Исследовать эффект увеличения амплитуды ПКП под действием PAR1-агониста, обнаруженный у новообразованных синапсов, в условиях предварительного действия блокатора ПУрецепторов, ингибиторов протеинкиназы С и протеинкиназы А.

Научная новизна исследования.

В работе впервые обнаружена способность экзогенного тромбина при аппликации на поврежденный нерв в месте его пережатия ускорять восстановление функциональных параметров нерва в ходе его дальнейшей регенерации и прорастания на периферию Новыми являются и обнаруженные факты эффективного действия синтетических пептидов агонистов PARI и PAR2 рецепторов на регенерацию нерва, способность агонистов, в зависимости от дозы, ускорять, либо тормозить функциональное восстановление передавленного нерва. Впервые показано, что активация PAR-рецепторов стимулирует не только долговременные пластические перестройки мышечных волокон и синапсов, но и эффективно контролирует синаптическую передачу в моторных синапсах, модулируя состояние холинергической постсинаптической мембраны и секреции медиатора ацетилхолина.

Научное и практическое значение работы.

Полученные в работе факты, раскрывающие активную роль тромбина и его рецепторов в процессах регенерации поврежденного нерва, важны для понимания роли PAR-рецепторов в системе нерв-мышца, для оценки роли эндогенного тромбина и других эндогенных активаторов PARI и PAR2-рецепторов в процессах репарации нерва и выживания периферических нейронов после травм т vivo Способность синтетических агонистов тромбиновых рецепторов эффективно ускорять регенерацию передавленного

нерва может в дальнейшем иметь практический выход - для создания лекарственных препаратов, нацеленных на улучшение процессов восстановления поврежденных периферических нервов Очевидную научно-практическую ценность имеют и обнаруженные в работе факты острого облегчающего действия агонистов тромбиновых рецепторов на нервно-мышечную передачу в незрелых, новообразуемых нервно-мышечных синапсах скелетной мышцы в ходе ее реиннервации Это открывает возможность использования подобных препаратов для облегчения синаптической передачи и двигательной активности при патологиях, сопровождающихся развитием денервационно-реиннервационного синдрома у животных и человека Положения, выносимые на защиту

1 Тромбин и агонисты PAR-рецепторов оказывают облегчающее действие на процессы функционального восстановления периферического нерва в период его регенерации in vivo после механического передавливания

2 Активация PAR-рецепторов специфическим агонистом PARI-рецепторов может вызывать облегчение или подавление синаптической передачи в новообразованных нервно-мышечных синапсах скелетной мышцы Реализация и направленность эффекта PARl-агониста зависит от активности протеинкиназ А и С в составе синапсов

Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены на XIX Международном конгрессе по тромбозу и гемостазу (Бирмингем, Великобритания, 2003), международном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина», (Хургада, Египет, 2004), 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), XVII Международном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (Мельбурн, Австралия, 2004), школе по нейронаукам IBRO"Receptors, channels, messengers" (Ялта, Украина, 2004), всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагия, ДВС-синдром. Современные достижения» (Ярославль, 2005), школе международного физиологического общества "The study of nociception from periphery to brain stem" (Киев, Украина, 2006), XX съезде физиологического общества им. И П Павлова (Москва, 2007) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, объектов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка

цитируемой литературы. Работа изложена на 171 листе, содержит 78 рисунков Список литературы включает 156 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование проводили на беспородных лабораторных мышах весом 20-30 г. Всего использовали 403 животных. Объектом исследования служили смешанный общий мапоберцовый нерв п peroneus communis, сенсорная ветвь малоберцового нерва - п fibularis superficialis мыши мышца длинный разгибатель пальцев т extensor digitorum longus (EDL) мыши. В качестве объекта исследования спонтанной и вызванной секреторной активности синапсов были выбраны моторные синапсы, формирующиеся на мышечных волокнах т EDL

Пережатие нерва п peroneus communis Мышам под эфирным наркозом раздавливали малоберцовый нерв левой задней лапы в области коленного сустава, при помощи глазного пинцета с тонкими (1 мм) плоскими браншами, защищенными пластиковыми наконечниками. Протяженность раздавленного участка нерва составляла 1 мм

Регистрация суммарного потенциала действия нерва п fibularis superficialis Эффективность прорастания и регенерации аксонов тестировали электрофизиологически на 11-е сутки после пережатия нерва Для этого отпрепаровывали сенсорную ветвь малоберцового нерва п fibularis superficialis длиной около 15 мм. При помощи всасывающего электрода проводили монополярное отведение суммарного потенциала действия (СПДН) от дистального конца нерва в ответ на ретроградное супрамаксимальное электрическое раздражение его проксимального участка проволочными хлорсеребрянными электродами. Анализировали: латентный период (ЛП), время нарастания, длительность и амплитуду СПДН, а также способность нерва воспроизводить ритмичные залпы СПДН с частотой 50Гц.

Однократная локальная аппликация веществ на нерв в составе плюронического геля Исследуемые в работе растворы ферментов или пептидов смешивали с 33% плюроническим гелем и локально апплицировали 70 мкл на малоберцовый нерв мыши в месте его раздавливания непосредственно после раздавливания. В контроле вместо вещества в шпоронический гель добавляли равный объем физиологического раствора и также апплицировали на нерв.

Метод внутриклеточной регистрации спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки Для изучения активности новообразованных синапсов на 12-е сутки после пережатия нерва животных декапитировали и выделяли

мышцу длинный разгибатель пальцев - т extensor digitorum longus (т EDL) -и малоберцовый нерв. Полученный нервно-мышечный препарат помещали в камеру, заполненную нормальным раствором Лайли, содержащим 135 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 4 мМ KCl, 0,9 мМ NaH2P04, 2 мМ СаС12, 11 мМ глюкозы, 16 мМ ЫаНСОз, раствор был аэрирован карбогеном (96% Ог, 4% СОг) и имел pH 7,2-7,4 Модифицированный раствор Лайли с повышенным содержанием наружного калия состоял из 7,8 мМ NaCl, 1 мМ MgCh, 20 мМ KCl, 0,9 мМ NaH2P04, 2 мМ СаСЬ, 11 мМ глюкозы, 16 мМ ЫаНСОз, 61,7 мМ сахарозы, 55,6 мМ ЫагБОд, раствор также аэрировали карбогеном. Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП, не менее 100 в каждом синапсе) и потенциалы концевой пластинки (ПКП, не менее 50) регистрировали внутриклеточно при помощи стеклянных микроэлектродов (сопротивление 5-10 МОм), заполненных 2,5 М раствором KCl. Мышечное сокращение блокировали добавлением в раствор d-тубокурарина в концентрации 0,4-1,2 мкМ Для регистрации одиночных ПКП производили стимуляцию нерва импульсами длительностью 0,1-0,25 мс и силой 1-9 В с частотой 0,3 Гц. Для регистрации залповой активности синапсов т EDL использовали режим ритмической стимуляции малоберцового нерва (50 надпороговых стимулов) частотой 50 Гц Для одиночных ПКП анализировали среднюю амплитуду, квантовый состав (рассчитывали методом с использованием коэффициента вариаций), время нарастания и время полуспада ПКП При анализе ритмических залпов оценивали амплитуду «плато» залпа ПКП по 20-ти последним ПКП в залпе в процентах от первого ПКП

Используемые в работе вещества Пептид - агонист PARI (PARI-АР) (РКНПК МЗ РФ, Москва), трипсин (Sigma), a-тромбин (РКНПК МЗ РФ, Москва), плюронический гель F-127 (Sigma), пептид-агониста PAR2 (PAR2-АР) (Biosyntan), бисиндолилмалейимид (BIM) (Calbiochem), 2-аминоэтоксидифенилборат (2АРВ) (Tocris), Н-89 (Calbiochem), хелеретрин (Sigma).

Обработка результатов Полученные записи анализировали в программе Mini-Analysis (автор Justin Lee, США) Сравнение выборок производили по непараметрическим критериям Манна-Уитни (для независимых выборок) и Уилкоксона (для связанных выборок) в программе статистика Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего, п - объем выборки

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ параметров СИДИ после передавливания нерва в контроле и при аппликации веществ - агонистов РАН рецепторов.

Известно, что к 11 суткам после раздавливания нерва происходит его прорастание на периферию и реинкервация первоначальных мишеней (мышц, кожи и т.п.) (Балезина и др., 2000). Проведенный нами анализ электрической активности регенерирующего нерва на 11-е сутки после его передавливания показал, что латентный период СПДН (ЛП СПДН) и амплитуда СПДН существенно отличаются от аналогичных параметров интактного сенсорного нерва. В норме ЛП СПДН составляет 0,24±0,03 мс (п=6), а на 11-е сутки после пережатия нерва ЛП СПДН достоверно увеличивается до 0,96±0,10 мс (р<0,01; п=6). Амплитуда СПДН в норме в среднем равна 1,10±0,33 мВ, а на 11-е сутки достоверно (р<0,05) снижена в среднем до 0,21 ±0,04 мВ. Время нарастания и общая длительность на 11-е сутки после пережатия нерва также достоверно увеличены по сравнению с нормой. В норме время нарастания равно 0,34±0,03 мс, на 11 -е сутки оно возрастает до 0,91±0,06 мс (р<0,01). Общая длительность также существенно увеличивается по сравнению с нормой: от 1,37±0,11 мс в интактном нерве до 4,07±0,22 мс на 11 сутки после пережатия (р<0,001). 1.1. Влияние однократной аппликации иммобилизованного тромбина на регенерацию n.ßbularis мыши. На i 1 сутки после операции по раздавливанию нерва и

аппликации тромбина тестировали показатели СПДН в четырех опытных группах животных, получавших тромбин (в виде однократной аппликации на передавленный нерв) в

концентрациях соответственно ЗнМ, ШнМ, ЗОнМ и 1,3 мкМ. Кроме того, исследовали СПДН у оперированных животных, не получавших тромбина, а также у животных с интактным нервом.

Рисунок1. Электронейро грамма нерва п. fibularis superficialis : одиночные СПДН в норме, на 11 сутки после пережатия нерва в контроле и при аппликации тромбина (усреднение по 20 оригинальным записям).

т р

о M Б И H

1,6

со

s 1.4

я 1,2

с 1

ci 0,8

ь 0,6

Ч 0,4

2. < 0,2

Норма

п=7

0.4 0.8 1.2

Латентный период СПДН, мс

Контроль

п=7

1,ЗмкМ

п=8

Т Р О M Б И H

30 нМ 10 нМ

п=6 п—11

Р и с у н о к 2. Латентный период (А) и амплитуда (Б) СПДН в норме, на 11-е сутки после пережатия нерва в контроле и при аппликации тромбина в разных концентрациях, lut) I 90 ■

Рисунок 3. Изменение амплитуды СПДН в ходе высокочастотной (50 Гц) ритмической стимуляции нерва в норме, на 11 сутки после пережатия нерва в контроле и при аппликации тромбина.

5 10 •Норма п=7

■ 1,3 мкМ п=8

•10 нМ п=11

15 20 25 30

Контроль п=7 Время, с

•30 нМп=6 3 нМ п=7

По мере снижения концентрации тромбина до 30 нМ и ниже наблюдается тенденция к укорочению ЛП СПДН и увеличению амплитуды СПДН (рис 1, 2). При хронической аппликации на нерв тромбина в концентрации 10 нМ ЛП СПДН достоверно уменьшился на 38% (п=11, р<0,01), а амплитуда возросла на 137% по сравнению с контролем (р<0,01) (рис 1, 2).

Аналогичные (по направленности) эффекты тромбина выявлены при анализе изменений амплитуды СПДН в условиях ритмической стимуляции нерва с частотой 50Гц Введение тромбина в низкой дозе (10 нМ) приводило к явному облегчению способности нерва удерживать постоянную амплитуду СПДН Причем этот сдвиг является достоверным уже начиная со 2-й секунды стимуляции (р<0,01) (рис 3).

Полученные свидетельства эффективности аппликации на нерв низких доз тромбина для ускорения функционального восстановления аксонов позволяют предполагать рецепторное действие тромбина в области поврежденного нерва Для проверки этого предположения в следующей серии экспериментов мы исследовали воздействие на нерв пептида-агониста PARI (так называемого PARI-АР), лишенного протеолитической активности тромбина, но способного эффективно активировать PARI рецепторы, которые активируются и тромбином

1.2. Действие однократной аппликации PAR1-AP в составе плюронического геля на процесс регенерации нерва.

При аппликации PARI-АР на поврежденный нерв в низких концентрациях мы обнаружили тенденцию к укорочению ЛП СПДН Нанесение PARI-АР в концентрации 10 мкМ приводило (спустя 11 суток) к достоверному укорочению ЛП СПДН на 49% (п=8, р<0,001) Аппликация PARI-АР в более низкой концентрации 5 мкМ менее эффективно ускоряла процесс регенерации нервных волокон. ЛП укорачивается всего на 32% (п=6, р<0,05). В отличие от тромбина, аппликация PAR1-AP в концентрации 5-10 мкМ не вызывала достоверных изменений амплитуды одиночного СПДН и степени депрессии амплитуды СПДН в ходе ритмической стимуляции

Таким образом, нами впервые продемонстрирована способность экзогенного тромбина и пептида-агониста PARI облегчать процесс регенерации периферического нерва мыши после его передавливания. Показано, что лишь в низких концентрациях оба исследуемых препарата ускоряют восстановление функциональной активности регенерирующих аксонов. Такой характер действия тромбина согласуется с данными литературы о его способности лишь в низких, наномолярных концентрациях облегчать выживание нейронов,

поврежденных гипоксией in vivo (Stnggow et al, 2000, Striggow et al, 2001) и in vitro (Donovan et al., 1998, Xi et al, 2003), и вызывать противовоспалительные реакции в нервной ткани (Coughhn et al, 2000, Gingrichet al, 2000) Эффективность низких (наномолярных) концентраций тромбина, а также сходный характер действия тромбина и пептида-агониста PARI, известного как избирательный активатор PARI типа рецепторов, позволяет предполагать наличие в составе регенерирующего малоберцового нерва мыши специфических рецепторов тромбина, через посредство которых, по-видимому, и осуществляют свое нейротрофическое действие оба препарата тромбин и пептид-агонист рецепторов тромбина PARI-АР Далее мы проверяли возможность участия PAR2 рецепторов в процессах регенерации Известно, что в отличие от тромбина, действующего на PARI и PAR2 рецепторы, трипсин преимущественно активирует PAR2. Поэтому для выявления роли PAR2 рецепторов мы проводили аппликацию трипсина 1.3. Влияние однократной аппликации иммобилизованного трипсина на процесс регенерации периферического нерва n.fibularis мыши. На 11 сутки после операции по раздавливанию нерва тестировали показатели СПДН у группы контрольных животных не получавших трипсина и у четырех опытных групп животных, получавших трипсин в концентрациях соответственно 0,05 нМ, 0,5 нМ, 5 нМ и 50 нМ (в виде однократной аппликации на нерв сразу после его передавливания) Кроме того, исследовали СПДН у животных с интактным (неоперированным) нервом Анализ эффектов трипсина показал, что трипсин является эффективным, но неоднозначным модулятором процесса регенерации нерва, вызывая противоположно направленные изменения параметров СПДН в зависимости от концентрации. Мы установили, что однократная аппликация трипсина на нерв в дозе 50 нМ тормозит регенерацию нерва ЛП СПДН увеличивается на 48% (п=10, р<0,01), а амплитуда уменьшается на 51% по сравнению с контролем (п=10, р<0,01) (рис. 4) Однако в низких концентрациях (порядка 0,5 нМ) трипсин оказал достоверное облегчающее, положительное воздействие на восстановление такого показателя как ЛП, на его фоне ЛП СПДН укорачивается на 35% (п=15, р<0,001) Что касается амплитуды СПДН, то она остается без изменений (рис 4)

Трипсин при хронической аппликации на нерв в высоких дозах (50 и 5 нМ) не оказывал достоверных влияний на последующее восстановление способности нерва воспроизводить высокочастотное раздражение. При аппликации трипсина в малой концентрации (0,5 нМ) наблюдаются положительные

сдвиги, то есть удерживание амплитуды СПДН на более высоком уровне, чем в контроле, по всему ходу залпа (р<0,05).

1,6

33 ! 4

2 !'4

И *>2 ^ ]

CJ 0,8

d 0,6

£ 0,4

С 0,2 2 о J

-л* 0 -

-I-!-—Г

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Латентный период СПДН, мс

Норма Контроль

п=7 п=П

ТРИПСИН

50 нМ 5 нМ 0,5 нМ 0,05

п=10 п=б п=15

нМ

п=6

Рисунок 4. Латентный период (А) и амплитуда (Б) СПДН в норме, на 11 сутки после пережатия нерва в контроле и при аппликации трипсина. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** -р<0,001.

1.4. Изучение влияния на регенерацию периферического нерва мыши однократной аппликации пептида-агониста PAR2 (PAR2-AP).

Пептид-агонист PAR2 оказался способным эффективно ускорять процесс регенерации периферического нерва мыши. При аппликации в концентрации

100 мкМ он вызывает достоверное уменьшение ЛП СПДН на 39% (п=13, р<0,001) и увеличение амплитуды СПДН на 121% (п=13, р<0,05). Меньшая концентрация пептида (10 мкМ) менее эффективно ускоряет процесс регенерации нерва. ЛП достоверно не изменяется, а амплитуда СПДН увеличивается на 198% по сравнению с контролем (п=10, р<0,01) Аппликация PAR2-AP положительно влияла и на восстановление способности нерва удерживать постоянную амплитуду СПДН при высокочастотной (50 Гц) ритмической стимуляции. При аппликации PAR2-AP амплитуда СПДН по ходу залпа достоверно выше на 10-20%

Проведенные эксперименты показали, что трипсин при экзогенной аппликации на нерв способен - в зависимости от дозы - разнонаправлено влиять на процесс последующего восстановления функциональных параметров аксонов (на протяжении 11 суток). В низких концентрациях трипсин ускорял восстановление функциональных параметров регенерирующего нерва, а в высоких - тормозил восстановление активности аксонов Проведенное далее тестирование эффектов агониста PAR2 рецепторов показало, что облегчающие эффекты пептида-агониста PAR2 в концентрациях 10 и 100 мкМ (в отношении восстановления функциональных параметров аксонов) оказались сходными с эффектами низких концентраций трипсина

Известно, что синтетический пептид PAR2-AP не обладает протеолитической активностью трипсина, но способен высокоизбирательно связываться только с рецепторами PAR2-nma, вызывая их активацию (Ossovskaya et al, 2004) Сходство эффектов от аппликации на нерв трипсина (в низких концентрациях - 0,5 нМ) и пептида-агониста PAR2 позволяет предполагать, что трипсин в данном случае осуществляет свое облегчающее регенерацию действие через рецепторы РАЯ2-типа нервных волокон

Что касается обнаруженного нами факта торможения процесса регенерации нерва при действии трипсина в высокой концентрации (50 нМ), то это согласуется с данными литературы о токсичном действии высоких концентраций агонистов PAR2 (Smith-Swmtosky et al, 1997, Wang et al, 2002) Регенерация нерва имеет целью реиннервацию мишени, в том числе скелетной мышцы и восстановление нервно-мышечных контактов, на которых обнаружены PARI рецепторы (Lanuza et al, 2001; Lanuza et al., 2003). Поэтому в следующей серии опытов мы исследовали воздействие агонистов PAR-рецепторов на параметры синаптической передачи в новообразуемых нервно-мышечных синапсах.

2. Анализ изменений параметров спонтанной активности нервно-мышечных синапсов мыши под действием PAR1-AP на 12-е сутки после передавливания нерва.

В данной части работы объектом нашего исследования были нервно-мышечные синапсы, образуемые на m EDL аксонами мотонейронов, входящих в состав регенерирующего малоберцового нерва. В остром опыте мы исследовали спонтанную активность нервно-мышечных синапсов -регистрировали спонтанные миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП), оценивали их частоту и амплитуду и анализировали отличия параметров МПКП нормальной интактной мышцы и мышцы после реиннервации

В интактных моторных синапсах m EDL мыши средняя частота МПКП была равна 1,04±0,07 Гц, средняя амплитуда - 0,75±0,03 мВ (43 синапса, 9 мышц). Распределение амплитуд МПКП близко к нормальному (Гауссову) распределению Средняя амплитуда МПКП равнялась 0,75±0,03 мВ Среднее значение регистрируемого мембранного потенциала было -69±2мВ На 12-е сутки после передавливания нерва средняя частота МПКП у реиннервируемой mEDL составляла 0,29±0,02Гц (20 синапсов, 5 мышц), то есть в 3 раза ниже, чем в интактном контроле Причиной этого является маленький размер терминали в этот период и снижение в ней числа активных зон (Astrow et al, 1996; Wang et al, 2004). Средняя амплитуда МПКП на 12-е сутки после пережатия нерва составляла 0,72±0,09 мВ. Амплитудное распределение МПКП на данном сроке реиннервации ассимметрично, так как имеется «хвост» из высокоамплитудных значений Среднее значение регистрируемого мембранного потенциала было -71±4 мВ Далее мы анализировали изменения параметров МПКП в ответ на добавление PARI-АР в концентрации ЮмкМ на 12-е сутки после передавливания нерва Эффекты PARI-АР анализировали на фоне деполяризации терминали путем увеличения концентрации наружного калия до 20мМ, что приводило к приросту частоты МПКП до 1,93±0,32Гц (5 мышц, 25 синапсов) и облегчало их анализ. На фоне такого увеличения частоты PARI-АР в концентрации 10 мкМ оказал подавляющее действие: добавление пептида привело к падению частоты МПКП до 1,13±0,09Гц (5 мышц, 69 синапсов, р<0,01). Амплитуда МПКП при этом увеличивалась от 0,39±0,02мВ в контроле до 0,46±0,01 мВ в опыте, то есть на 17,5% (р<0,05) Амплитудное распределение незначительно сдвигается вправо, в сторону больших значений Мембранный потенциал при этом не изменялся, составляя в контроле -51±1 мВ, а в опыте -48±1 мВ.

£ 30-1

g 15

5 20

И 0

В"

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Амплитуда МПКП, мВ

Рисувок 5. Гистограмма амплитудного распределения МПКП на 12-е сутки после пережатия нерва до (5 мышцы, 25 синапсов) и после аппликации PARI-АР в концентрации IOmkM (5 мышц, 69 синапсов) при увеличении концентрации наружного калия до 20 мМ

Таким образом, при действии PARI-АР мы наблюдали прирост средней амплитуды МПКП. Этот прирост амплитуды, вероятнее всего, имеет постсинаптическую природу. Увеличение амплитуды МПКП может быть результатом увеличения плотности ацетилхолиновых рецепторов или возрастания чувствительности ацетилхолиновых рецепторов к ацетилхолину (Lanuza et al, 2003; Nelson et al., 2003).

Наряду с изменениями амплитуды нами были обнаружены изменения частоты МПКП под действием PARI-АР. Снижение частоты МПКП практически в 2 раза связано с пресинаптическим действием PAR1-AP. До сих пор возможность пресинаптических эффектов PARI не была описана. Известна лишь способность тромбина и PARI-АР стимулировать процесс элиминации синапсов (Lanuza et al., 2003; Nelson et al., 2003).

Наши данные позволяют предположить, что PARI-АР оказывает двоякое действие на реиннервированный синапс- положительное постсинаптическое (выражающееся в приросте средней амплитуды МПКП) и угнетающее спонтанную секрецию медиатора пресинаптическое (проявляющееся только на фоне калиевой деполяризации).

3. Анализ параметров вызванной активности нервно-мышечных синапсов m.EDL мыши в норме, на 12-е сутки после пережатия нерва в контроле и на фоне аппликации PARI-АР.

В данной части работы мы регистрировали вызванную активность нервно-мышечного синапса - потенциалы концевой пластинки (ПКП) - в ответ на

раздражение нерва одиночными стимулами (частота стимуляции 0,3Гц) и ритмичными залпами стимулов с частотой 50Гц.

3.1. Сравнительный анализ параметров одиночных ПКП в норме и на 12-е сутки после пережатия нерва.

В интактных моторных синапсах полученное в экспериментах среднее значение амплитуды одиночных ПКП составило 3,49±0,26мВ (8 мышц, 33 синапса), а значение квантового состава ПКП, рассчитанное методом с использованием коэффициента вариаций амплитуды ПКП, было равным 64±7. В норме временные характеристики ПКП - время нарастания и полуспада -составили 1,34±0,05 мс и 1,76±0,06 мс соответственно

При исследовании новообразованных нервно-мышечных синапсов т EDL на 12-е сутки пережатия нерва среднее значение амплитуды одиночного ПКП составило 1,67±0,14 мВ (6 мышц, 28 синапсов), то есть примерно в 2 раза ниже, чем в норме (р<0,001). Квантовый состав также был ниже и составил 25±3 (р<0,001). Временные характеристики ПКП у синапсов на 12-е сутки после пережатия нерва также отличались от таковых у интактных синапсов Имели место увеличенные времена нарастания и полуспада ПКП: 2,01±0,11 мс (р<0,001) и 2,71±0,16 мс (рс0,001) соответственно.

Таким образом, сравнительный анализ показал, что новообразованные синапсы существенно отличаются по ряду характеристик ПКП от нормальных зрелых синапсов. Регенерирующая терминаль не только является меньшей по своему объему и занимаемой площади, но и является существенно более «слабой» функционально, судя по сниженному квантовому составу и замедленному временному ходу ПКП.

3.2. Изучение влияния пептида-агониста PARI (PAR1-AP) на параметры одиночных ПКП на 12-е сутки после пережатия нерва.

При аппликации PAR1-AP в концентрации 10 мкМ средняя амплитуда ПКП возрастала от 1,46±0,11 мВ (5 мышц, 23 синапса) в контроле до 1,90±0,13 мВ (5 мышц, S3 синапса) после добавления пептида, то есть на 30% (р<0,05) (рис.6). Эффект от добавления PARI-АР развивался сравнительно медленно: в течение первого часа аппликации пептида средняя амплитуда составляла 1,70±0,14 мВ, а в течение второго часа она возрастала до 2,09±0,20 мВ. Таким образом, мы впервые обнаружили острое облегчающее действие PAR1-АР на работу синапса. Поэтому далее нам было важно понять, во-первых, является ли этот эффект специфическим для активации PARI, во-вторых, является он пре- или постсиналтическим, и в-третьих, проявляется ли он при

залповой активности синапса, естественном паттерне активности мотонейрона.

Время, тс

Рисунок 6. Примеры записей ПКП в норме и после реиннервации мышцы на 12-е сутки после пережатия иерва в контроле и при аппликации PARI-АР (10 мкМ). Каждый пример -усреднение 50 ПКП, зарегистрированных в одном синапсе.

Для ответа на эти вопросы мы сопоставили изменения амплитуды ПКП при концентрации PARI-АР 1 и 10 мкМ и сравнили их с действием контрольного пептида, имеющего последовательность аминокислот, аналогичную последовательности аминокислот PARI-АР, но лишенного первой аминокислоты и не способного активировать PARI. Мы показали, что PAR1-АР в концентрации 1 мкМ не вызывал изменения параметров одиночного ПКП новообразованного синапса (5 мышц). В концентрации 10 мкМ облегчающий эффект оказывал только PARI-АР, а не контрольный пептид (4 мышцы). Для анализа вопроса о пре- или постсинаптическом действии PARI-АР в синапсе мы сравнили изменения амплитуды ПКП и МПКП и квантовый состав ПКП до и на фоне действия PARI-АР. Мы установили, что наряду с приростом средней амплитуды ПКП, наблюдается и прирост средней амплитуды МПКП (рис.5). Квантовый состав ПКП, показатель пресинаптической активности, при аппликации PARI-АР достоверно не менялся, составляя в контроле 25±4, а в опыте 28±2. Это означает, что облегчающее действие PARI-АР реализуется на постсинаптическом уровне, в виде увеличения чувствительности постсинаптической мембраны к действию медиатора.

В следующей серии экспериментов мы анализировали влияние PAR1-AP на ритмическую вызванную активность новообразованных нервно-мышечных синапсов при стимуляции нерва с частотой 50 Гц. При добавлении PARI-АР в концентрации 10 мкМ рисунок залпа достоверно изменяется. На фоне действия пептида наблюдался более крутой прирост амплитуд, который приводил к увеличению «плато». Если в контроле уровень «плато» составляет примерно 120% от первого ПКП (5 мышц, 21 синапс), то в течение первого часа аппликации пептида он увеличивается до 139,4% (5 мышц, 21 синапс, р<0,001), а в течение второго - до 172,6% (5 мышц, 16 синапсов, р<0,001) (рис.7).

, 200

S5.160

® 140

С 120

Контроль 14мышц/59синапсов ■"0»0-60мин 5мышц/21синапс

•60-120мин 5мышц/16синапсов

Порядковый номер ПКП в залпе

Рисунок 7. Рисунок залповой активности (50Гц) новообразованных синапсов в контроле и под действием PARI-АР в концентрации ЮмкМ в течение первого и второго часа эксперимента с пептидом.

Таким образом, нами впервые выявлено, что PARI-АР в концентрации ЮмкМ оказывает выраженное облегчающее воздействие на нервно-мышечную передачу в новообразованном синапсе мыши. Можно предположить, что этот эффект опосредуется активацией PARI рецепторов тромбина, так как "контрольный" пептид не обладает таким облегчающим действием. Известно, что тромбин может запускать ряд каскадов - например активацию Gq белка, стимулирующего фосфолипазу С с образованием инозитол-1,4,5-трисфосфата

(1Рз) и диацилглицерола (DAG). IP3, действуя на рецепторы внутриклеточных депо, вызывает высвобождение кальция, a DAG участвует вместе с ионами кальция в активации протеинкиназы С (РКС) Кроме того, нельзя исключить и возможность активации аденилатциклазы с последующей активацией ПКА (Saito et al, 2005)

4. Влияние блокаторов 1Рз-рецепторов, РКС и РКА на развитие облегчающих эффектов PAR1-AP.

4.1. Влияние блокатора 1Рз-рецепторов на параметры ПК новообразованных синапсов.

Ингибитор ГРз-рецепторов 2АРВ (30 мкМ) вызывал значительное уменьшение средней амплитуда ПКП на 29,7% по сравнению с контролем (4 мышцы, 21 синапс, р<0,01) Квантовый состав ПКП также снижался от 25±3 в контроле до 19±2 при аппликации 2АРВ (р<0,05) Временные параметры ПКП (время нарастания и время полуспада) под действием 2АРВ не изменялись. Нанесение на фоне 2АРВ PARI-АР приводило к достоверному увеличению амплитуды ПКП, аналогичному ее приросту при аппликации только PARI-АР амплитуда одиночного ПКП новообразованного синапса увеличивалась на 26,3% (3 мышцы, 20 синапсов, р<0,05). Квантовый состав при этом также возрастал, но в меньшей степени, составляя в контроле 20±2, а в опыте - 24±3 Временные параметры ПКП в данной серии экспериментов также не изменялись.

Таким образом, блокада ГР3- рецепторов не препятствует развитию облегчающих эффектов активации PARI рецепторов тромбина Это позволяет предположить, что в механизме облегчения секреции медиатора под действием PARI-АР не принимает участия процесс активации ПУрецепторов внутриклеточных депо

4.2. Влияние ингибирования протеинкиназы С на параметры ПКП новообразованных синапсов.

В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние ингибирования протеинкиназы С (РКС) бисиндолилмалейимидом (BIM) и хелеретрином на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах мыши и то, как это ингибирование скажется на эффектах PARI-АР.

Ранее было показано, что блокирование РКС в интактных нервно-мышечных синапсах крысы вызывает значительное снижение вызванной секреции медиатора и квантового состава ПКП (Santafe et al., 2005) Однако мы наблюдали противоположный результат В новообразованном синапсе мыши аппликация блокаторов РКС вызывала быстрое (в течение 10-15 минут)

увеличение средней амплитуды и квантового состава одиночного ПКП на 3040% по сравнению с контролем (рис. 8). Временные параметры ПКП при этом не изменялись. Наши результаты согласуются с последними данными, полученными Сантафе и коллегами на нервно-мышечных синапсах новорожденных животных (БаШаГе е! а1., 2007). В данной работе также показано, что блокирование протеинкиназы С потенцирует нервно-мышечную передачу в развивающихся множественных нервно-мышечных контактах на мышечном волокне.

05 3,5

I -

6 25

га л и

s 1,5 ч

с 1

< 0,5

О i

## -fe

с 35

Ьй

К 30

га i- 25 -

w 20 -

3 я 15

н 33 10 -

а ьг 5

Контроль Хелеретрии Хелеретрии 4мкМ 4мкМ + PARI АР 10m кМ

Контроль Хелеретрив Хелеретрии 4мкМ 4мкМ+ PARI-АР lOmkM

Рисунок 8. Изменение амплитуды (А) и квантового состава (Б) ПКП на 12-е сутки после пережатия нерва под действием PARI-АР в концентрации ЮмкМ на фоне ингибирования РКС хелеретрином в концентрации 4мкМ (3 мышцы). * - р<0,05; ** - р<0,01 - по сравнению с контролем; # - р<0,05 и ## - р<0,01 по сравнению с эффектами хелеретрина.

На фоне ингибирования РКС добавление PARI-АР (10 мкМ) приводило к снижению амплитуды и квантового состава ПКП до значений, близких к первоначальным контрольным значениям этих параметров (рис.7). Таким образом, способность PARI-АР модулировать нервно-мышечную передачу сохранилась на фоне ингибирования РКС, но изменила направление действия. Теперь PARI-АР подавлял прирост не только амплитуды, но и квантового состава ПКП. Таким образом, в условиях предварительного ингибирования РКС PARI-АР оказывает не потенцирующее постсинаптическое, а тормозное пресинаптическое действие на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах. По-видимому, существует сложное взаимодействие между внутриклеточными каскадами, запускаемыми с

помощью PARI рецепторов на пре- и постсинаптическом уровне в период формирования моторной иннервации скелетной мышцы. 4.3. Влияние ингибирования протеинкиназы А на параметры ПКП новообразованных синапсов.

Ингибитор протеинкиназы А Н89 в концентрации 1 мкМ оказывал тормозное воздействие на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах: амплитуда ПКП снижалась на 44% по сравнению с контролем (3 мышцы, 16 синапсов, р<0,05) (рис. 9). Этот эффект развивался очень медленно и начинал проявляться спустя 60 минут после нанесения вещества. Квантовый состав при этом изменялся незначительно. Временные параметры ПКП при этом не изменялись. Фактически развивался эффект, противоположный действию PARI-АР. На этом фоне введение PARI-АР не вызывало эффекта, наблюдавшегося в контроле - прирост амплитуды ПКП оказался заблокированным (рис. 9).

Таким образом, в условиях ингибирования протеинкиназы A PARI-АР не оказывал облегчающего постсинаптического действия на амплитуду ПКП. Это позволяет предположить, что облегчающие эффекты PARI-АР в области регенерирующего нервно-мышечного синапса реализуются с участием протеинкиназы А мышечного волокна. Это согласуется с имеющимися в литературе данными о влиянии протеинкиназы А на реактивность постсинаптической мышечной мембраны (Li et al., 2001, 2001; Lanuza et al., 2006).

Проведенные исследования показали, что кратковременная аппликация сериновых протеиназ тромбина и трипсина, а также пептидов-агонистов PARI и PAR2 рецепторов на передавленный нерв in vivo ускоряет последующую

Контроль PAR1-AP Н89 lmkM Н89 ImkM

lOmkM

+ PARI-АР lOmkM

Рисунок 9. Изменение амплитуды (А) и квантового состава (Б) ПКП в процентах от контрольных значений на 12-е сутки после пережатия нерва под действием РАЮ-АР в концентрации ЮмкМ на фоне ингибирования

протеинкиназы А Н89 в концентрации 1мкМ (3 мышцы). * - р<0,05; ** -р<0,01 по сравнению с контролем.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

регенерацию периферического нерва и реиннервацию скелетной мышцы мыши. Нами впервые установлено, что лишь в низких концентрациях (порядка ЮнМ для тромбина, ЮмкМ для PARI-АР, 0,5нМ для трипсина и ЮОмкм для PAR2-aroraicTa) исследуемые препараты ускоряют восстановление функциональной активности регенерирующих аксонов: скорости проведения нервных импульсов, амплитуды сигналов, лабильности нерва и др. Полученные нами факты созвучны литературным данным о способности тромбина лишь в низких, наномолярных концентрациях облегчать выживание нейронов при гипоксии (Stnggow et al, 2000, Smiraova et aL, 2001) и вызывать противовоспалительные реакции в нервной ткани (Xi et al., 1999). Эффективность низких (наномолярных) концентраций тромбина, а также сходный характер действия тромбина и пептидов агонистов PARI и PAR2-рецепторов позволяет предполагать наличие в составе регенерирующего малоберцового нерва мыши специфических рецепторов тромбина, через посредство которых, по-видимому, и осуществляет свое нейротрофическое действие экзогенный тромбин, ускоряя регенерацию периферических аксонов Наряду с обнаруженной нейротрофической активностью тромбина, реализуемой через активацию PAR-рецепторов в составе регенерирующих аксонов, в нашей работе впервые выявлена способность PAR-агониста и тромбиновых рецепторов (PAR-рецепторов) участвовать в регуляции нервно-мышечной передачи в интактных и новообразованных синаптических контактов скелетной мышцы. Мы обнаружили, что пептид-агонист PAR1-рецепторов тромбина при действии на изолированный нервно-мышечный препарат т EDL вызывает увеличение амплитуды МПКП, ПКП, а также облегчение ритмической синаптической передачи в моторных синапсах. В новообразованных синапсах эти облегчающие эффекты предотвращаются блокадой протеинкиназы А с помощью Н 89 и нечувствительны к действию блокатора 1Рз-рецепторов Оказалось также, что в зависимости от условий облегчающие эффекты агониста PARI-рецепторов могут обращаться. На фоне блокады протеинкиназы С имело место увеличение амплитуды ПКП, а последующая аппликация PARI-АР подавляла этот прирост амплитуды и квантового состава ПКП до контрольного уровня Эти факты свидетельствуют о вовлечении по крайней мере двух каскадов (с участием протеинкиназ А и С) в реализацию регуляторного действия PARI-АР на активность синапсов, сосуществующих на мышце в период ее реиннервации Данные литературы позволяют предполагать, что разнонаправленные (в зависимости от активности протеинкиназ А и С) эффекты PARI-АР могут отражать

вовлеченность пре- и постсинаптическнх PAR-рецепторов в противоположно направленные процессы в элиминацию одних синапсов и стабилизацию других, что характерно для раннего периода реиннервации мышцы (Lanuza et al, 2001, Lanuza et al, 2003) Окончательный ответ об особенностях участия PAR-рецепторов в регуляции активности новообразуемых моторных синапсов предстоит получить в дальнейших экспериментах.

ВЫВОДЫ

1 При аппликации на передавленный нерв иммобилизованного тромбина (ЗнМ - 1,ЗмкМ) спустя И суток у регенерирующего нерва выявляется ускорение восстановления активности нерва: укорочение латентного периода и увеличение амплитуды суммарных ПД нерва (СПДН) по сравнению с контролем В дозе 10 нМ тромбин оказывал максимальный эффект, укорачивая ЛП на 39%, увеличивая амплитуду одиночных СПДН в 2,4 раза и ритмических СПДН - в 1,7 раза.

2 Аппликация пептида-агониста тромбиновых рецепторов PARI-АР (10 мкМ) на нерв вызывала качественно сходные с тромбином (10 нМ) облегчающие воздействия на восстановление активности регенерирующего нерва в виде укорочения ЛП на 49% , фазы нарастания СПДН на 26%, прироста амплитуды одиночных СПДН на 50%

3 Иммобилизованный трипсин при аппликации на поврежденный нерв вызывал в зависимости от концентрации противоположные эффекты: в больших дозах (50 нМ) замедлял регенерацию нерва, а в низких (0,5 нМ) ускорял ее, что выражалось в укорочении ЛП СПДН на 35%, повышении амплитуды СПДН при ритмической стимуляции на 10%, но лишь на последних 5-ти секундах залпа (50 Гц, 30 секунд).

4 Пептид-агонист рецепторов трипсина PAR2-AP (100 мкМ) при аппликации на нерв оказал качественно сходное с низкой концентрацией трипсина (0,5 нМ) облегчающее воздействие на восстановление активности регенерирующего периферического нерва, что выражалось в укорочении ЛП СПДН на 39% и увеличении амплитуды СПДН на 121%.

5 При аппликации на изолированный нервно-мышечный препарат PAR1-AP (10 мкМ) облегчал нервно-мышечную передачу в моторных синапсах, новообразованных в ходе реиннервации т EDL, вызывая увеличение амплитуды МПКП на 18%, прирост средней амплитуды одиночного ПКП на 30% и увеличение амплитуды «плато» высокочастотного залпа ПКП (50 Гц) на 50%

6 Блокатор 1Р3-рецепторов 2АРВ (30 мкМ) вызывает подавление амплитуды и квантового состава ГОШ, но не препятствует развитию потенциирующего действия PARI-АР на амплитуду ПКП в регенерирующих синапсах

7 Ингибиторы РКС В IM (1 мкМ) и хелеретрин (4 мкМ) вызывают увеличение амплитуды и квантового состава ПКП в новообразованных синапсах, на фоне которого PARI-АР (10 мкМ) приводит к снижению амплитуды и квантового состава ПКП до исходных контрольных значений

8 Ингибитор протеин киназы А Н89 (1 мкМ) вызывает снижение амплитуды ПКП на 44% и предотвращает прирост амплитуды ПКП под действием PARI-АР (10 мкМ). Это позволяет предполагать участие протеинкиназы А в реализации облегчающего действия PARI-АР на активность регенерирующих нервно-мышечных синапсов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Герасименко Н.Ю. Влияние сериновой протеиназы тромбина на процесс регенерации периферического нерва. Материалы X Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2003», Москва, 2003 г., С 15-16

2 Balezina О P., Gerasimenko N.Yu., Dugina T.N., Strukova S.M. Thrombin accelerates regeneration of mouse peripheral nerve in vivo Abstracts from XlXth International Congress on Thrombosis and Haemostasis, Birmingham, UK, July 1218, 2003. J Throm. And Haemost., V 1, Suppl 1, CD008

3 Балезина О.П, Герасименко Н.Ю, Дугина Т.Н, Струкова С М Особенности нейротропного действия тромбина - Успехи физиологических наук. - 2004 - Т 35, №3. - С.37-49

4 Балезина О.П, Герасименко Н.Ю., Струкова С.М. Сравнительное исследование тромбина и трипсина как сериновых протеиназ нейротрофического действия. Материалы международного семинара «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина», Хургада, Египет, 14-24 февраля 2004 г, С.29-32

5. Герасименко Н.Ю. Сравнительный анализ нейротрофических эффектов тромбина и трипсина Тезисы 8-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 мая 2004 г., С.105

6 Balezina О Р, Gerasimenko N.Y., Dugina T.N., Strukova S M., Similar effects of PARlAg and thrombin on regeneration of mouse axons Abstracts of XVIIth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, Melbourne, Australia, March 21-25, 2004, P 99.

7. Balezina O.P., Gerasimenko N.Yu., Dugma T .N., Strukova S.M Protemase-activated receptors of neurons and glial cells and their role in neuronal regeneration Abstracts from IBRO Advanced School of Neuroscience "Receptors, channels, messengers", Yalta, Ukraine, Septemberl6-28, 2004, poster 9.

8. Герасименко Н.Ю , Струкова С.М, Дугина Т Н, Балезина О П. Сравнение нейрорегенеративных эффектов тромбина и трипсина. Тезисы XIX съезда физиологического общества им. И П.Павлова, Екатеринбург, 2004г, С 203-204

9. Балезина О.П, Герасименко Н.Ю., Дугина Т.Н., Струкова С.М Исследование нейротрофической активности тромбина на модели регенерирующего нерва мыши - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2005 -Т.139, №1. - С 8-10.

10. Балезина О.П., Герасименко Н.Ю., Струкова С М. Участие протеиназ системы свертывания крови в регенерации периферических нервов мыши Материалы всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагия, ДВС-синдром Современные достижения», Ярославль, 12-14 октября 2005 г, С 15-

11. Gerasimenko N. Acute effect of TRAP6 m reinnervated mice motor synapses Abstracts from the physiological society international workshop "The study of nociception from periphery to brain stem", Kiev, Ukraine, June 4-7, 2006,

12. Герасименко Н.Ю , Струкова С.М , Балезина О.П. Действие TRAP6 на вызванную активность нервно-мышечного синапса мыши на ранней стадии реиннервации. Тезисы XX съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 4-8 июня 2007 г, С 191

13. Балезина О.П, Герасименко Н.Ю., Струкова С.М. Сериновая протеиназа трипсин как модулятор регенерации периферического нерва мыши - Нейрохимия - 2005. - Т.22, 4, - С.299-304.

16.

Р.86.

Заказ № 343. Объем 1 н.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Пезроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, з ел. 250-92-06 \vww.postator ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Герасименко, Наталья Юрьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая характеристика денервационно-реинервационного синдрома.

2. Элиминация синапсов.

3. Сериновые протеиназы и их рецепторы в регуляции функций клеток центральной нервной системы.

3.1. Общая характеристика тромбина и его рецепторов.

3.2. Роль тромбина и его рецепторов в регуляции функций клеток ЦНС in vitro и in vivo.

3.3. Трипсин как активатор PAR2 рецепторов и его роль в активности нейронов ЦНС.

4. Содержание сериновых протеиназ трипсина и тромбина - как активаторов

PAR рецепторов - в составе периферических смешанных нервов.

4.1. Трипсин и рецепторы PAR2 в регуляции функций периферической нервной системы.

4.2. Содержание тромбина, его рецепторов и ингибитора протеазного нексинав периферическом нерве после повреждения.

4.3. Влияние тромбина на формирование моторных синапсов млекопитающих.

4.3.1. Опыты в культуре клеток.

4.3.2. Эксперименты in vivo.

4.3.3. Экспрессия тромбина, рецептора тромбина PARI и ингибитора тромбина - протеазного нексина-1 - мышечными клетками.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Пережатие нерва п. peroneus communis.

2. Регистрация суммарного потенциала действия нерва п. fibularis superficialis.

3. Регистрация суммарного потенциала действия мышцы EDL.

4. Приготовление изолированного нервно-мышечного препарата n.peroneus communis -т. EDL мыши.

5. Метод внутриклеточной регистрации спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки.

6. Регистрация спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП).

7. Регистрация вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП).

8. Однократное локальное введение веществ.

9. Определение динамики десорбции тромбина из плюронического геля.

10. Метод определения агрегации тромбоцитов.

11. Используемые в работе вещества.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изменение параметров суммарного потенциала действия нерва после его передавливания в контроле и при аппликации веществ - агонистов PAR рецепторов.

1.1 Характер СПДН n.fibularis в норме, на 11 и 14 сутки после пережатия нерва.

1.2. Влияние сериновой протеиназы тромбина на процесс регенерации периферического нерва мыши.

1.2.1 Определение скорости высвобождения тромбина из плюронического геля.

1.2.2. Влияние однократной аппликации иммобилизованного тромбина на регенерацию п. fibularis мыши.

1.3 Изучение влияния пептида-агониста PARI (PARI-АР) на процесс регенерации периферического нерва мыши.

1.3.1. Динамика десорбции пептида-агониста тромбиновых рецепторов (PARI-АР) из плюронического геля.

1.3.2. Эффекты однократной аппликации PARI-АР в составе плюронического геля на процесс регенерации нерва.

1.4. Влияние однократной аппликации иммобилизованного трипсина на процесс регенерации периферического нерва n.fibularis мыши.

1.5. Изучение влияния на регенерацию периферического нерва мыши однократной аппликации пептида-агониста PAR2 (PAR2-AP).

2. Изменение параметров суммарного потенциала действия мышцы после передавливания нерва и последующей реиннервации в контроле и при аппликации веществ - агонистов PARI рецепторов.

2.1. Анализ суммарного потенциала действия мышцы EDL в норме и на 11 сутки после передавливания малоберцового нерва.

2.2. Изучение влияния тромбина на регенерацию моторной ветви малоберцового нерва и реиннервацию мышцы.

2.3. Изучение влияния пептида-агониста PARI (PARI-АР) на регенерацию моторной ветви малоберцового нерва и реиннервацию мышцы.

3. Анализ изменений параметров спонтанной активности нервно-мышечных синапсов мыши под действием пептида-агониста PARI в норме и на 12-е сутки после передавливания нерва.

3.1. Сравнение параметров МПКП в норме и на 12-е сутки после передавливания нерва.

3.2. Влияние пептида-агониста PARI (PAR1-AP) на спонтанную активность зрелых нервно-мышечных синапсов мыши.

3.3. Влияние пептида-агониста PARI (PARI-АР) на спонтанную активность новообразованных нервно-мышечных синапсов мыши на 12-е сутки после пережатия нерва.

4. Анализ параметров вызванной активности нервно-мышечных синапсов m.EDL мыши в норме, на 12-е сутки после пережатия нерва в контроле и на фоне аппликации пептида-агониста PARI-АР.

4.1. Сравнительный анализ параметров одиночных ПКП в норме и на 12-е сутки после пережатия нерва.

4.2. Сравнительный анализ ритмической вызванной активности нервно-мышечных синапсов в норме и на 12-е сутки после пережатия нерва.

4.3. Изучение влияния пептида-агониста PARI (PAR1-AP) на параметры одиночных ПКП на 12-е сутки после пережатия нерва.

4.4. Анализ влияния пептида-агониста PARI (PARI-АР) на ритмическую вызванную активность нервно-мышечного синапса мыши на 12-е сутки после пережатия нерва.

4.5. Влияние блокаторов 1Рз-рецепторов, РКС и РКА на развитие облегчающих эффектов PARI-АР.

4.5.1. Влияние блокады 1Рз-рецепторов на облегчающее действие пептида-агониста PARI (PARI-АР) на вызванную активность новообразованного нервно-мышечного синапса мыши на 12-е сутки после передавливания нерва.

4.5.2. Влияние ингибирования протеинкиназы С бисиндолилмалейимидом (BIM) на облегчающее действие пептида-агониста PARI (PARI-АР) на нервно-мышечную передачу в новообразованном синапсе мыши на 12-е сутки после пережатия нерва.

4.5.3. Влияние ингибирования протеинкиназы С бисиндолилмалейимидом (BIM) на нервно-мышечную передачу в нормальном интактном синапсе мыши.

4.5.4. Влияние ингибирования протеинкиназы С хелеретрином на развитие эффектов пептида-агониста PARI (PARI-АР) на нервно-мышечную передачу в новообразованном синапсе мыши на 12-е сутки после пережатия нерва.

4.5.5. Влияние ингибирования протеинкиназы А Н89 на облегчающее действие пептида-агониста PARI (PARI-АР) на нервно-мышечную передачу в новообразованном синапсе мыши на 12-е сутки после пережатия нерва.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние тромбина на регенерацию периферических нервов и синапсов"

Актуальность работы. Исследования последних десятилетий показали, что тромбин - сериновая протеиназа, участвующая в тромбообразовании, обладает также свойствами сигнальной молекулы, то есть способен активировать специфические мембранные рецепторы к тромбину, т.н. PAR-рецепторы (от англ. Proteinase Activated Receptors) (Niclou et al., 1998; Turgeon et al., 2000). PAR-рецепторы - 7-доменные, G-белок сцепленные рецепторные белки, обнаружены на мембранах разных типов клеток, в том числе нейронов и их отростков. Активация PARs тромбином или синтетическими агонистами может способствовать, в зависимости от концентрации, либо гибели нейронов, либо (в низких концентрациях) устойчивости к действию повреждающих факторов (Xi et al, 1999; Striggow et al, 2000; Smirnova et al., 2001).

Известно, что мотонейроны скелетных мышц мыши обладают PAR-рецепторами (Smirnova et al., 2001). Исследования в культуре и in vivo показали, что экзогенный тромбин при действии на PAR-рецепторы мотонейронов способен ускорять созревание моторных аксонов и моторной иннервации скелетных волокон в раннем онтогенезе путем ускорения процесса элиминации множественной иннервации и формирования одиночной концевой пластинки на мышечном волокне (Jia et al., 1999; Lanuza et al., 2001; Lanuza et al., 2003).

В ряде работ описано увеличение плотности PAR-рецепторов и содержания РНК протромбина в поврежденном седалищном нерве и денервированной скелетной мышце (Smirnova et al., 1996; Kim et al., 1998; Niclou et al., 1998; Friedman et al., 1999). В связи с этим весьма актуальным является вопрос о способности тромбина оказывать дозозависимые разнонаправленные влияния на поврежденный мотонейрон и его аксоны. В последнее время особенно актуальным становится выявление возможного нейротрофического действия тромбина, поиск эффективных доз экзогенного тромбина и агонистов PAR для облегчения регенерации моторных и сенсорных аксонов после травмы периферического нерва и для восстановления нервно-мышечной передачи в мышцах в ходе их реиннервации.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследовать возможные нейротрофические эффекты экзогенного тромбина: его способность облегчать функциональное восстановление передавленного периферического нерва и реиннервацию мышц, усиливать активность нововообразуемых нервно-мышечных контактов путем активации PAR рецепторов и внутриклеточных каскадов в составе нерва и моторных синапсов.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие конкретные задачи:

2. Сопоставить характер спонтанной и вызванной синаптической активности у интактных и новообразуемых нервно-мышечных синапсов мышцы - длинного разгибателя пальцев (m.EDL) - на фоне действия агониста PARI рецепторов.

3. Исследовать эффект увеличения амплитуды ПКП под действием PAR1-агониста, обнаруженный у новообразованных синапсов, в условиях предварительного действия блокатора ГРз-рецепторов, ингибиторов протеинкиназы С и протеинкиназы А.

Положения, выносимые на защиту

1. Тромбин и агонисты PAR-рецепторов оказывают облегчающее действие на процессы функционального восстановления периферического нерва в период его регенерации in vivo после механического передавливания.

2. Активация PAR-рецепторов специфическим агонистом PARI-рецепторов может вызывать облегчение или подавление синаптической передачи в новообразованных нервно-мышечных синапсах скелетной мышцы. Реализация и направленность эффекта PARI-агониста зависит от активности протеинкиназ А и С в составе синапсов.

Научная новизна исследования.

В работе впервые обнаружена способность экзогенного тромбина при аппликации на поврежденный нерв в месте его пережатия ускорять восстановление функциональных параметров нерва в ходе его дальнейшей регенерации и прорастания на периферию. Новыми являются и обнаруженные факты эффективного действия синтетических пептидов агонистов PARI и PAR2 рецепторов на регенерацию нерва, способность агонистов, в зависимости от дозы, ускорять, либо тормозить функциональное восстановление передавленного нерва. Впервые показано, что активация PAR-рецепторов стимулирует не только долговременные пластические перестройки мышечных волокон и синапсов, но и эффективно контролирует синаптическую передачу в моторных синапсах, модулируя состояние холинергической постсинаптической мембраны и секреции медиатора ацетилхолина.

Научное и практическое значение работы. Полученные в работе факты, раскрывающие активную роль тромбина и его рецепторов в процессах регенерации поврежденного нерва, важны для понимания роли PAR-рецепторов в системе нерв-мышца, для оценки роли эндогенного тромбина и других эндогенных активаторов PARI и 7

РА112-рецепторов в процессах репарации нерва и выживания периферических нейронов после травм in vivo. Способность синтетических агонистов тромбиновых рецепторов эффективно ускорять регенерацию передавленного нерва может в дальнейшем иметь практический выход - для создания лекарственных препаратов, нацеленных на улучшение процессов восстановления поврежденных периферических нервов. Очевидную научно-практическую ценность имеют и обнаруженные в работе факты острого облегчающего действия агонистов тромбиновых рецепторов на нервно-мышечную передачу в незрелых, новообразуемых нервно-мышечных синапсах скелетной мышцы в ходе ее реиннервации. Это открывает возможность использования подобных препаратов для облегчения синаптической передачи и двигательной активности при патологиях, сопровождающихся развитием денервационно-реиннервационного синдрома у животных и человека.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Герасименко, Наталья Юрьевна

156 ВЫВОДЫ

1. При аппликации на передавленный нерв иммобилизованного тромбина (ЗнМ -1,ЗмкМ) спустя 11 суток у регенерирующего нерва выявляется ускорение восстановления активности нерва: укорочение латентного периода и увеличение амплитуды суммарных ПД нерва (СПДН) по сравнению с контролем. В дозе 10 нМ тромбин оказывал максимальный эффект, укорачивая ЛП на 39%, увеличивая амплитуду одиночных СПДН в 2,4 раза и ритмических СПДН - в 1,7 раза.

2. Аппликация пептида-агониста тромбиновых рецепторов PARI-АР (10 мкМ) на нерв вызывала качественно сходные с тромбином (10 нМ) облегчающие воздействия на восстановление активности регенерирующего нерва в виде укорочения ЛП на 49% , фазы нарастания СПДН на 26%, прироста амплитуды одиночных СПДН на 50%.

3. Иммобилизованный трипсин при аппликации на поврежденный нерв вызывал в зависимости от концентрации противоположные эффекты: в больших дозах (50 нМ) замедлял регенерацию нерва, а в низких (0,5 нМ) ускорял ее, что выражалось в укорочении ЛП СПДН на 35%, повышении амплитуды СПДН при ритмической стимуляции на 10%, но лишь на последних 5-ти секундах залпа (50 Гц, 30 секунд).

4. Пептид-агонист рецепторов трипсина PAR2-AP (100 мкМ) при аппликации на нерв оказал качественно сходное с низкой концентрацией трипсина (0,5 нМ) облегчающее воздействие на восстановление активности регенерирующего периферического нерва, что выражалось в укорочении ЛП СПДН на 39% и увеличении амплитуды СПДН на 121%.

5. При аппликации на изолированный нервно-мышечный препарат PARI-АР (10 мкМ) облегчал нервно-мышечную передачу в моторных синапсах, новообразованных в ходе реиннервации m.EDL, вызывая увеличение амплитуды МПКП на 18%, прирост средней амплитуды одиночного ПКП на 30% и увеличение амплитуды «плато» высокочастотного залпа ПКП (50 Гц) на 50%.

6. Блокатор ГРз-рецепторов 2АРВ (30 мкМ) вызывает подавление амплитуды и квантового состава ПКП, но не препятствует развитию потенциирующего действия PAR1-АР на амплитуду ПКП в регенерирующих синапсах.

7. Ингибиторы РКС BIM (1 мкМ) и хелеретрин (4 мкМ) вызывают увеличение амплитуды и квантового состава ПКП в новообразованных синапсах, на фоне которого PARI-АР (10 мкМ) приводит к снижению амплитуды и квантового состава ПКП до исходных контрольных значений.

8. Ингибитор протеинкиназы А Н89 (1 мкМ) вызывает снижение амплитуды ПКП на 44% и предотвращает прирост амплитуды ПКП под действием PARI-АР (10 мкМ). Это позволяет предполагать участие протеинкиназы А в реализации облегчающего действия PARI-АР на активность регенерирующих нервно-мышечных синапсов.

157

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наша работа преследовала несколько целей. Во-первых, изучить действие хронической аппликации сериновых протеиназ - тромбина и трипсина - на регенерацию периферического нерва и реиннервацию мышцы мыши, а также пептидов-агонистов PARI и PAR2 рецепторов. Во-вторых, изучить влияние активации PARI на синаптическую передачу в новообразованных после реиннервации мышцы синапсах.

Нами впервые продемонстрирована способность экзогенного тромбина и пептида-агониста PARI облегчать процесс регенерации периферического нерва мыши после его передавливания. Показано, что лишь в низких концентрациях - порядка ЮнМ для тромбина и ЮмкМ для PARI-АР - оба исследуемых препарата ускоряют восстановление функциональной активности регенерирующих аксонов - скорости их проведения, лабильности и т.п. При этом облегчающие эффекты тромбина более выражены, чем действие PARI-АР, и отражаются на всех исследованных показателях нерва. Такой характер действия тромбина согласуется с данными литературы о его способности лишь в низких, наномолярных концентрациях облегчать выживание нейронов, поврежденных гипоксией in vivo (Striggow et al., 2000, Striggow et al., 2001) и in vitro (Donovan et al., 1998, Xi et al., 2003), и вызывать противовоспалительные реакции в нервной ткани (Coughlin et al., 2000; Gingrichet al., 2000). Эффективность низких (наномолярных) концентраций тромбина, а также сходный характер действия тромбина и пептида-агониста PARI, известного как избирательный активатор PARI типа рецепторов, позволяет предполагать наличие в составе регенерирующего малоберцового нерва мыши специфических рецепторов тромбина, через посредство которых, по-видимому, и осуществляют свое нейротрофическое действие оба препарата - тромбин и пептид-агонист рецепторов тромбина PARI-АР. Можно предположить, что PARI рецепторы тромбина в составе нерва могут активироваться не только экзогенными, но и эндогенными агонистами, такими как тромбин и активированный протеин С (Turgeon et al., 2000; Steinhoff et al., 2005; Saito et al., 2005). В пользу этого свидетельствует тот факт, что в периферическом нерве после его травмы возрастает содержание тромбина и экспрессия PARI (Smirnova et al., 1996; Niclou et al., 1998; Friedman et al., 1999). Таким образом, полученные нами факты и данные литературы позволяют предполагать, что в периферическом нерве после травмы существует система сериновых протеиназ (тромбина) и PARI рецепторов, работа которой способствует регенерации поврежденного нерва.

Известно, что действие тромбина может быть опосредовано разными типами PAR рецепторов, в связи с этим наряду с агонистами PARI рецептора в нашей работе были изучены эффекты хронической аппликации на травмированный нерв мыши агонистов

PAR2 - трипсина и пептида-агониста PAR2. Исследуемый нами нерв - п. fibularis superficialis - относится к смешанным нервам, но преимущественно содержит чувствительные волокна. Показано, что именно чувствительные волокна в составе смешанного нерва экспрессируют PAR2. Поэтому нам было интересно изучить влияние агонистов PAR2 на процесс регенерации сенсорной ветви малоберцового нерва после травмы.

Проведенные эксперименты показали, что трипсин при экзогенной аппликации на нерв способен - в зависимости от дозы - разнонаправлено влиять на процесс регенерации аксонов, прорастающих от места передавливания нерва на периферию, и динамику восстановления их функциональных параметров. В низких концентрациях трипсин ускоряет процесс регенерации периферического нерва мыши после травмы, а в высоких -тормозит. Облегчающие эффекты пептида-агониста PAR2 в концентрациях 10 и 100 мкМ (в отношении восстановления функциональных параметров аксонов) оказались сходными с эффектами низких концентраций трипсина.

Известно, что синтетический пептид PAR2-AP не обладает протеолитической активностью трипсина, но способен высокоизбирательно связываться только с рецепторами РАИ2-типа, вызывая их активацию (Ossovskaya et al., 2004). Сходство эффектов от аппликации на нерв трипсина (в низких концентрациях - 0,5 нМ) и пептида-агониста PAR2 позволяет предполагать, что трипсин в данном случае осуществляет свое облегчающее регенерацию действие через рецепторы РАЛ2-типа нервных волокон. Причем это касается, по-видимому, в первую очередь миелинизированных волокон большого диаметра, поскольку регистрируемый в наших экспериментах СПДН отражает, в основном, активность именно этого пула аксонов в составе периферического нерва (Fugleholm et al., 2000). До сих пор возможность существования PAR2 именно у этой группы крупных сенсорных аксонов в период их посттравматической регенерации была неизвестна. PAR2 в составе периферических нервов были описаны только на сенсорных аксонах небольшого диаметра и только у интактного нерва. (Steinhoff et al., 2000). Следует отметить, что по данным литературы, агонисты PAR2 способны стимулировать пролиферацию глиальных клеток in vitro (Wang et al., 2002). Поэтому нельзя исключить, что в нашей работе действие и трипсина, и пептида агониста PAR2 может быть адресовано не только PAR2 собственно аксонов, но и шванновских клеток регенерирующего нерва. В любом случае полученные данные является первым, хотя и косвенным свидетельством в пользу существования в составе регенерирующего сенсорного периферического нерва мыши рецепторов РАЕ2-типа, активация которых способствует регенерации аксонов.

Мы установили, что в высокой концентрации (50 нМ) трипсин вызывает торможение процесса регенерации нерва. Это согласуется с данными литературы о токсичном действии высоких концентраций агонистов PAR2. Показано, что в высокой концентрации пептид-агонист PAR2 вызывает существенное и длительное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и гибель гиппокампальных нейронов в культуре (Smith-Swintosky et al., 1997). Однако эффекты высоких концентраций трипсина могут реализовываться и через менее аффинные PAR4 рецепторы, активация которых также может приводить к гибели клеток. Показано, что пептид-агонист PAR4 вызывает гибель примерно 30% астроцитов в культуре (Wang et al., 2002).

Таким образом, в данном исследовании выявлены разнонаправленные - в зависимости от концентрации - эффекты трипсина в отношении регенерации периферического сенсорного нерва мыши. Сходство эффектов трипсина, облегчающих регенерацию нерва в низких концентрациях, и синтетического пептида - избирательного агониста рецепторов PAR2-Tnna - позволяет предполагать наличие в составе регенерирующего малоберцового нерва мыши мембранных рецепторов PAR2-rana, через посредство которых, по-видимому, и реализуется нейротрофическая активность обоих исследуемых препаратов.

Наряду с анализом влияния тромбина и пептида-агониста PARI на регенерацию сенсорных аксонов в составе п. fibularis superficialis, проводили исследование влияния тромбина и пептида-агониста PARI на процесс регенерации моторных аксонов и реиннервации m.EDL. С этой целью мы анализировали параметры суммарного потенциала действия мышцы (СПДМ) на 11-е сутки после пережатия нерва. Нами впервые показано, что аппликация на смешанный нерв тромбина в концентрации ЮнМ или PARI-АР в концентрации ЮмкМ приводит к облегчению процесса регенерации моторных аксонов и реиннервации мышцы, что выражается в увеличении скорости проведения сигнала от нерва к мышце, судя по укорочению ЛП СПДМ. В нашей лаборатории ранее показано, что компонентом, лимитирующим скорость проведения сигнала от нерва к мышце, выступают конечные тонкие немиелинизированные внутримышечные разветвления аксонов (Вардья, 2002). Следовательно, можно предположить, что работа именно этого участка проведения потенциала действия улучшается под влиянием тромбина и PARI-АР. Вероятно, под действием тромбина ускоряется созревание этих тонких разветвлений, например, за счет более быстрого увеличения их диаметра. Тот факт, что тромбин и PARI-АР оказывают облегчающее воздействие на процесс регенерации моторного нерва и реиннервации мышцы, позволяет предпологать, что действие этих веществ реализуется через PARI рецепторы тромбина, входящие в состав моторного нерва. Вопрос о том, какие именно клетки в составе моторного нерва являются мишенью действия веществ - агонистов PARI остается открытым. На аксонах культивируемых мотонейронов обнаружены PARI, которые могут активироваться под действием тромбина и PARI-АР (Smirnova et al., 2001). Нельзя исключить возможность присутствия PARI на мембране Шванновских клеток и других клеток микроокружения аксонов. Несомненным является то, что в составе двигательного нерва присутствует система PARI рецепторов, активация которой способствует процессу реиннервации мышцы.

Наряду с ролью PAR в составе нерва нас заинтересовала роль PARI в нервно-мышечных синапсах мыши. Показано, что PARI присутствуют на постсинаптической мембране концевой пластинки крысы и их расположение сходно с локализацией ацетилхолиновых рецепторов (Lanuza et al., 2003). В период элиминации синапсов в раннем постнатальном онтогенезе PARI рецепторы постсинаптической мембраны распределены по мышечному волокну более диффузно, а со временем, по мере роста животного, их расположение становится более компактным и уже четко совпадает с локализацией постсинаптических ацетилхолиновых рецепторов (Lanuza et al., 2003). Наличие PARI на мембране терминали в настоящее время не показано, однако их присутствие на мембране аксонального холмика и аксона мотонейрона (Smirnova et al., 2001) позволяет предполагать их возможную локализацию и на мембране терминали. Кроме того, показано, что скелетные мышечные волокна экспрессируют как мРНК PARI, так и мРНК протромбина (Kim et al., 1998). Таким образом, данные литературы о наличии PARI рецепторов в моторных синапсах скелетных мышц в раннем онтогенезе и в зрелом состоянии выглядят достаточно убедительными. Однако функциональная роль PARI в моторных синапсах млекопитающих в настоящее время не изучена. Поэтому целью данной работы было изучить влияние PARI-АР на активность нервно-мышечных контактов в норме и в процессе реиннервации мышцы.

Мы впервые показали, что PARI-АР в низкой концентрации (10 мкМ) вызывает увеличение средней амплитуды МПКП в зрелом синапсе на 30,6% и существенный сдвиг гистограммы распределения амплитуд МПКП вправо, в сторону больших значений. Такой прирост амплитуды способен значительно усиливать работу синапса. Мы предполагаем, что увеличение средней амплитуды МПКП под действием PARI-АР происходит посредством постсинаптического механизма, например путем увеличения плотности постсинаптических ацетилхолиновых рецепторов. По данным литературы в составе нервно-мышечных синапсов обнаружен пул быстро рециклизируемых никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (Bruneau et al., 2005).

Далее мы исследовали активность PAR рецепторов в незрелых новообразованных нервно-мышечных синапсах. По данным литературы тромбин и пептид-агонист PARI ускоряют морфологическое созревание нервно-мышечных синапсов новорожденных крысят (Lanuza et al., 2001; Lanuza et al., 2003). При введении животным тромбина и пептида-агониста PARI наблюдалось ускорение процесса элиминации избыточного числа терминалей в полинейрональных синапсах. Влияние тромбина и пептида-агониста на процесс функционального созревания новообразованного нервно-мышечного синапса оставалось не изученно. В связи с этим одной из целей нашей работы было изучить влияние PARI -АР на процесс секреции медиатора на примере новообразованных нервно-мышечных синапсов m.EDL, формирующихся после передавливания малоберцового нерва и последующей реиннервации мышцы. Наши исследования показали, что PARI-АР в концентрации 10 мкМ вызывает увеличение средней амплитуды МПКП на 18%, прирост средней амплитуды одиночного ПКП на 30% и увеличение амплитуды «плато» высокочастотного залпа ПКП (50Гц) примерно на 50%. Следовательно, под действием PARI-АР значительно облегчается нервно-мышечная передача в новообразованных синапсах мыши. Тот факт, что PARI-АР оказывает положительное воздействие прежде всего на амплитуду МПКП, а не на частоту, позволяет предположить, что облегчающие эффекты PARI-АР имеют постсинаптическую природу. Таким образом, в нашей работе впервые показано, что PARI-АР не только ускоряет морфологическое созревание нервно-мышечного синапса млекопитающих, но и усиливает нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах мыши, то есть способствует восстановлению функции синапса.

Наряду с облегчающими эффектами аппликации PARI-АР мы наблюдали и тормозное воздействие активации PARI на нервно-мышечную передачу. В условиях значительной деполяризации терминали путем повышения концентрации внеклеточных ионов калия до 20мМ мы наблюдали снижение частоты МПКП под действием PARI-АР на 41,5%. Данный эффект PARI-АР имеет пресинаптическую природу. Следует отметить, что регистрируемые значения частоты МПКП на 12-е сутки после пережатия нерва имеют интегральную природу - отражают суммарную секрецию квантов медиатора несколькими терминалами в области концевой пластинки. В этот период происходит процесс элиминации избыточных терминалей. По данным литературы подвергаемые элиминации более «слабые» терминали демонстрируют подавление активности, предшествующее их ретракции. Поскольку известно, что тромбин ускоряет элиминацию (Lanuza et al., 2001), можно предположить, что обнаруженное нами его тормозное действие отражает один из механизмов его влияния на ретракцию терминали. Мы предположили возможность разнонаправленного влияния PARI-АР на соседние терминали в составе полинейронального нервно-мышечного синапса. На наш взгляд нельзя исключить, что значительная деполяризация приводит к активации функционально более «слабых» или «молчащих» терминалей. В этих условиях добавление PARI-АР привело к подавлению активности именно «слабых» расторможеных терминалей и снижению частоты МПКП.

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют предположить, что эффекты PARI-АР опосредуются PARI рецепторами тромбина, входящими в состав нервно-мышечного синапса. PARI рецепторы - это G-белок сцепленные семидоменные рецепторы, активация которых может приводить к запуску целого ряда внутриклеточных каскадов проведения сигнала. Поэтому следующей целью нашей работы было установить, какие именно внутриклеточные посредники участвуют в реализации облегчающих эффектов PAR1-AP на синаптическую передачу. С этой целью использованны блокаторы различных внутриклеточных эффекторных молекул.

По данным литературы известно, что PARI может быть сопряжен в нейронах с Gq-белком, активация которого приводит к активации фосфолипазы С и образованию инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Рз) и диацилглицерола (DAG). IP3, действуя на рецепторы внутриклеточных депо, вызывает высвобождение кальция, a DAG участвует вместе с ионами кальция в активации протеинкиназы С (РКС) (Saito et al., 2005). Поэтому, для изучения возможной роли ГРз-рецепторов в эффектах PAR-агонистов в нервно-мышечных синапсах мы использовали блокатор ГРз-рецепторов 2АРВ.

При блокаде ГРз-рецепторов наблюдалось снижение амплитуды и квантового состава одиночного ПКП на 30 и 24% соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли ГРз-рецепторов в новообразованном нервно-мышечном синапсе. На фоне блокады ГРз-рецепторов PARI-АР продолжал оказывать облегчающее воздействие на параметры одиночного ПКП. Полученные данные позволяют предположить, что ГРз-рецепторы не участвуют в проведение внутриклеточного сигнала от PARI рецепторов тромбина в новообразованных синапсах мыши.

Далее мы исследовали возможное участие РКС в облегчающем действие PARI-АР в моторных синапсах, с этой целью использовали ингибиторы РКС В1М и хелеретрин. В новообразованных нервно-мышечных синапсах ингибирование РКС BIM и хелеретрином приводило к значительному приросту амплитуды и квантового состава ПКП. В зрелых интактных синапсах ингибирование РКС наоборот вызывало снижение средней амплитуды и квантового состава ПКП. Таким образом, в новообразованных синапсах ингибирование РКС оказывало противоположный по знаку эффект, чем в зрелых интактных нервно-мышечных контактах. Сходные результаты при действии ингибиторов на моторные синапсы были доложены в последней работе Сантафе и коллег (Santafe et al., 2007). Было показано, что ингибирование РКС в полинейрональных синапсах новорожденных животных вызывает облегчение синаптической передачи в функционально «слабых» нервных терминалях, а также вызывает растормаживание «молчащих» терминалей. При этом ингибиторы РКС практически не влияли на параметры ПКП функционально «сильных» терминалей. Можно предположить, что в нашем случае ингибиторы РКС оказывают сходное действие, облегчая передачу, прежде всего через более «слабые» контакты. Другими словами, ингибирование РКС приводит к растормаживанию «слабых» и «молчащих» терминалей и это вызывает прирост амплитуды суммарного ПКП. Как в этих условиях будет действовать на работу расторможенных синапсов агонист PARI рецепторов, который, по данным литературы, должен способствовать элиминации «слабых» терминалей?

Мы установили, что на фоне ингибирования РКС, сопровождающегося приростом амплитуды ПКП, PARI-АР оказывал тормозное воздействие, снижая амплитуду и квантовый состав ПКП до первоначальных контрольных значений. Таким образом, на фоне ингибирования РКС PAR1-AP оказывает тормозное пресинаптическое действие. Мы предполагаем, что на фоне ингибирования РКС мишенями PARI-АР в новообразованном синапсе становятся функционально «слабые» терминали, расторможенные под действием ингибиторов РКС.

Таким образом, можно предположить, что PARI-АР преимущественно действует на «слабые» нервные окончания в составе полинейронального синапса, оказывая на них тормозное воздействие (подавляет секрецию медиатора). Подавление секреции медиатора из более функционально «слабых» терминалей под действием PARI-АР может являться частью процесса элиминации синапсов, который, как известно, ускоряется под действием тромбина и пептида-агониста PARI.

Мы установили, что ингибитор РКА Н89 вызывал значительное - на 44% -снижение средней амплитуды ПКП, которое развивалось медленно и наблюдалось только через час после нанесения вещества. Квантовый состав ПКП при этом снижался незначительно. Полученные результаты свидетельствуют о значимой роли РКА в активности новообразованномго синапса. По-видимому, наблюдаемое снижение амплитуды ПКП связано прежде всего с постсинаптическим действием Н89. Мы установили, что на фоне Н89 полностью блокируется развитие облегчающих эффектов PARI-АР. Отсюда можно предположить, что в реализации облегчающих эффектов активации PARI участвует РКА, причем главная роль принадлежит РКА локализованной в постсинаптической клетке.

В настоящее время существует мало работ описывающих роль РКА в реализации эффектов агонистов PARI (Smirnova et al., 2001; Zieger et al., 2001). Однако полностью возможность участия РКА в проведении сигнала от PARI не исключается. В последнее время показана важная роль РКА в стабилизации мышечных ацетилхолиновых рецепторов (Lanuza et al., 2006). При этом значительные изменения плотности рецепторов под действием аналогов цАМФ наблюдаются уже через два часа после аппликации веществ. Ацетилхолиновые рецепторы, фрсфорилированные РКА, более стабильны в мембране. Можно предположить, что ингибирование протеинкиназы А Н89 приводит к дестабилизации ацетилхолиновых рецепторов и снижению амплитуды ПКП (Li et al., 2001; Li et al., 2002). Таким образом, в нашей работе показано, что PAR1-AP оказывает облегчающее воздействие на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах, и этот эффект может реализоваться через активацию постсинаптической мышечной РКА, которая способна усилить эффективность ответов холинорецепторной мембраны

Таким образом, в нашей работе впервые показано, что обе исследуемых протеиназы - тромбин и трипсин - в низких концентрациях, а также пептиды-агонисты PARI и PAR2 обладают выраженной нейротрофической активностью и способны облегчать процесс регенерации периферического нерва мыши после его передавливания. Тромбин и пептид-агонист PARI проявляют нейротрофическую активность не только в отношении сенсорных, но и в отношении моторных волокон.

Наряду с эффектами хронической аппликации тромбина и PARI-АР в нашей работе также изучались острые эффекты PARI-АР на секрецию медиатора в зрелых и новообразованных нервно-мышечных синапсах. Нами впервые продемонстрировано увеличение средней амплитуды МПКП под действием PARI-АР в зрелых и новообразованных синапсах. В новообразованных синапсах аппликация PARI-АР оказывает сложное разнонаправленное действие: облегчающее постсинаптическое и тормозное пресинаптическое. При этом мы предполагаем, что тормозное пресинаптическое действие, подавляющее секрецию медиатора, направлено только на «слабые», элиминируемые терминали и проявляется в случае их предварительной активации.

Мы предполагаем, что в полинейрональном новообразованном нервно-мышечном синапсе соседние терминали функционально разнородны («сильные» и «слабые») и в разной степени чувствительны к действию PARI-АР. В случае преимущественной активности «сильных» синапсов PARI-АР оказывает облегчающее действие на нервно-мышечную передачу на постсинаптическом уровне, усиливая активность

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Герасименко, Наталья Юрьевна, Москва

1. Балезина О.П. Патофизиология периферического нервно-мышечного аппарата // Элементы патологической физиологии и биохимии. Под ред. И.П.Ашмарина // М -1997-С. 182-200.

2. Балезина О.П. Роль внутриклеточных кальциевых каналов нервных терминалей в регуляции секреции медиатора // Усп. Физиол. Наук 2002 - Т.ЗЗ(З), С. 38-56.

3. Балезина О.П., Букия А.Н. Облегчение и депрессия нервно-мышечной передачи в условиях блокады рианодиновых рецепторов // Нейрофизиология 2003 - Т. 35 (2), С.83-89.

4. Валиуллин В.В., Гусева Д.С., Исламов P.P., Челышев Ю.А. Иммуногистохимическое изучение камбаловидной мышцы крысы при различных способах денервации // Бюллетень экспер. биол. и медицины 2001 - Т.131, №4, С.477-480.

5. Вардья И.В. Экспериментальная модель денервационно-реиннервационного синдрома: облегчающие эффекты Семакса и урокиназы. Автореферат диссертации на соискание степени кандидата биологических наук 2002.

6. Гехт Б.М. Теоретическая и клиническая электромиография. JL: Наука 1990.

7. Гехт Б.М., Никитин С.С. Механизмы компенсаторной реиннервации при повреждениях аксонов периферических нервов // Журнал невропатологии и психиатрии 1986 - Т.86, №2, С.294-300.

8. Каменская М.А. Современные представления о механизме квантового освобождения медиатора из моторных нервных окончаний скелетной мышцы // Успехи физиол. наук 1972 - Т.З, №3, С.22-63.

9. Касаткина Л.Ф. Плотность мышечных волокон в двигательных единицах мышц на разных стадиях развития денервационно-реиннервационного процесса у человека // Патологическая физиология и экспериментальная терапия 1985 - №1, С.42-47.

10. Киселева Е.В., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Глуза Е., Струкова С.М. Участие тромбина в активации нейронов гиппокампа // Бюллетень экспер. биол. и медицины 2004- Т. 137, №5, С.519-523.

11. П.Матюшкин Д.П. Основы электрофизиологии: Учебное пособие // JI.: Изд-во Ленинградского Университета 1984.

12. Николлс Дж. Г., Мартин А.Р., Валлас Б. Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу // М.: УРСС 2003.

13. Ноздрачев А.Д., Чумасов Е.И. Периферическая нервная система. Структура, развитие, трансплантация и регенерация // СПб.: Наука 1999.

14. Персон Р.С. Спинальные механизмы управления мышечным сокращением // М.: Наука 1985 - С. 15-110.

15. Пшедецкая А.Д., Савина М.Г. Постденервационные изменения мембранных потенциалов мышечных волокон адаптированных к холоду крыс // Физиол. журн. СССР им. И.М.Сеченова 1988 - №8, С. 1134-39.

16. Рагинов И.С., Челышев Ю.А. Чувствительные нейроны и шванновские клетки при фармокологической стимуляции регенерации нерва // Морфология 2000 - Т. 118, №6, С.36-40.

17. Рагинов И.С., Челышев Ю.А., Шагидуллин Т.Ф. Выживание в системе «чувствительный нейрон шванновская клетка» при стимуляции регенерации нерва ксимедоном // Бюллетень экспер. биол. и медицины - 2001 - Т. 131, №3, С.275-277.

18. Струкова С.М. Тромбин регулятор процессов воспаления и репарации тканей // Биохимия - 2001 - Т.66, С. 14-27.

19. Струкова С.М., Серейская А.А., Осадчук Т.В. Структурные основы специфичности тромбина // Усп. совр. биол. 1989 - Т.107, С.41-54.

20. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран // М.: Наука 1975.

21. Челышев Ю.А. Факторы поддержания регенерации периферических нервов // Успехи физиол. наук 1995 - Т.26, №3, С.57-69.

22. Челышев Ю.А., Сайткулов К. Шванновские клетки: развитие, фенотипическая характеристика//Успехи физиол. наук 2000 -Т.31, №3, С.61-68.

23. Челышев Ю.А.,Черепнев Г.В. Молекулярные и клинические аспекты стимуляции регенерации нерва // Экспер. и клинич. фармакология 2001 - Т.64, №3, С.67-71.

24. Acheson A., Barker P. A., Alderson R.F. et al. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF // Neuron 1991 - V.7, P.265-275.

25. Akaaboune M., Culican S.M., Turney S.G., Lichtman J.W. Rapid and reversible effects of activity on acetylcholine receptor density at the neuromuscular junction in vivo II Science 1999 - V.286, P.503-507.

26. Ann E.S., Mizoguchi A., Okajima S., Ide C. Motor axon terminal regeneration as studied by protein gene product 9.5 immunohistochemistry in the rat // Arch. Histol. Cytol. -1994- V.57(4), P.317-330.

27. Arenson M.S., Evans S.C. Activation of protein kinase С increases acetylcholine release from frog motor nerves by a direct action on L-type Ca2+ channels and apparently not by depolarization of the terminal // Neurosci. 2001 - V.104(4), P. 1157-1164.

28. Argentieri T.M., Aiken S.P., Laxminarayan S., McArdle J.J. Characteristics of synaptic transmission in reinnervating rat skeletal muscle // Pflugers Arch. 1992 - V.421(2-3), P.256-261.

29. Balice-Gordon R.J., Lichtman J.W. In vivo observations of pre- and postsynaptic changes during the transition from multiple to single innervation at developing neuromuscular junctions // J. Neurosci. 1993 - V.13(2), P.834-855.

30. Barry J.A., Ribchester R.R. Persistent polyneuronal innervation in partially denervated rat muscle after reinnervation and recovery from prolonged nerve conduction block // J. Neurosci. 1995 - V.15, P.6327-6339.

31. Bennett M.R., Florin Т., Woog R. The formation of synapses in regenerating mammalian striated muscle // J. Physiol. 1974 - V. 238, P.79-92.

32. Bennett M.R., McLachlan E.M., Taylor R.S. The formation of synapses in reinnervated mammalian striated muscle // J. Physiol. 1973 - V.233, P.481-500.

33. Bode W., Stubbs M.T. Spatial structure of thrombin as a guide to its multiple sites of interaction// Semin. Thromb. Hemost. 1993 - V.19(4), P.321-333.

34. Bozyczko D., Horwitz A.F. The participation of a putative cell surface receptor for laminin and fibronectin in peripheral neurite extension // J. Neurosci. 1986 - V.6(5), P.1241-1251.

35. Bruneau E., Sutter D., Hume R.I., Akaaboune M. Identification of nicotinic acetylcholine receptor recycling and its role in maintaining receptor density at the neuromuscular junction in vivo IIJ Neurosci 2005 - V.25(43), P.9949-9959.

36. Buffelli M., Busetto G., Bidoia C., Favero M., Cangiano A. Activity-dependent synaptic competition at mammalian neuromuscular junction // News Physiol. Sci. -2004 V.19, P.85-91.

37. Busetto G., Buffelli M., Tognana E., Bellico F., Cangiano A. Hebbian mechanisms revealed by electrical stimulation at developing rat neuromuscular junctions // J. Neurosci. 2000 - V.20, P.685-695.

38. Cajal S.R. 1928 цитирование по Питере Д. Ультраструктура нервной системы. М.: Изд-во «Мир» - 1972 - Р.275-416.

39. Camerer Е., Huang W., Coughlin S.R. Tissue factor- and factor X-dependent activation of protease-activated receptor 2 by factor Vila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 -V.97(10), P.5255-5260.

40. Card D.J. Denervation: sequence of neuromuscular degenerative changes in rats and the effect of stimulation // Exp. Neurol. 1977 - 54(2), P.251-265.

41. Caroni P., Rotzler S., Britt J.C., Brenner H.R. Calcium influx and protein phosphorylation mediate the metabolic stabilization of synaptic acetylcholine receptors in muscle // J. Neurosci. 1993 - V.13(3), P.1315-1325.

42. Cash S., Dan Y., Poo M., Zucker R. Postsynaptic elevation of calcium induces persistent depression of developing neuromuscular synapses // Neuron 1996 - V.16, P. 745-754.

43. Cavanaugh K.P., Gurwitz D., Cunningham D., Bradshaw R.A. Reciprocal modulation of astrocyte stellation by thrombin and protease nexin-1 // J. Neurochem. 1990 - V.54, P.1735-1743.

44. Chang Q., Pereda A., Pinter M.J., Balice-Gordon RJ. Nerve injury induces gap junctional coupling among axotomized adult motor neurons // J. Neurosci. 2000 -V.20(2), P.674-684.

45. Chin В., Scheiffele P. Is reelin the answer to synapse elimination at the neuromuscular junction? // Sci. STKE -2003 V.205, P.45.

46. Citron B.A., Smirnova I.V., Zoubine M.N., Festoff B.W. Quantative PCR analysis reveals novel expression of prothrombin mRNA and regulation of its levels in developing mouse muscle // Thrombosis Research -1997 V.87(3), P.303-313.

47. Colman H., Nabekura J., Lichtman J.W. Alterations in synaptic strength preceding axon withdrawal. // Science 1997 - V.275, P.356-361.

48. Corbalan-Garcia S., Gomes-Fernandez J.C. Protein kinase С regulatory domains: the art of decoding many different signals in membranes // Biochim. Biophys. Acta 2006 -V.1761, P.633-654.

49. Costanzo E.M., Barry J. A., Ribchester R.R. Co-regulation of synaptic efficacy at stable polyneuronally innervated neuromuscular junctions in reirmervated rat muscle // J. Physiol. 1999 - V.521(2), P.365-374.

50. Daniloff J.K., Levi G., Grumet M., Rieger F., Edelman G.M. Altered expression of neuronal cell adhesion molecules induced by nerve injury and repair // J. Cell Biol. -1986 V.103(3), P.929-945.

51. Dermis M.J., Miledi R. Characteristics of transmitter release at regenerating frog neuromuscular junctions // J. Physiol. 1974- V.239, P.571-594.

52. Dermis M.J., Miledi R. Non-transmitting neuromuscular junctions during an early stage of end-plate reinnervation // J. Physiol. 1974 - V.239, P.553-570.

53. Dery O., Corvera C.U., Steinhoff M., BunnettN.W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases // Am. J. Physiol. 1998 - V.274(43), P.1429-1452.

54. Donovan F.M., Cunningham D.D. Signaling pathways involved in thrombin-induced cell protection// J. Biol. Chemistry 1998 - V.273(21), P.12746-12752.

55. Donovan F.M., Pike C.J., Cotman C.W., Cunningham D.D. Thrombin induced apoptosis in cultured neurons and astrocytes via a pathway requiring tyrosine kinase and RhoA activities // J. Neuroscience 1997 - V.17(14), P.5316-5326.

56. Downes G.B., Granato M. Acetylcholinesterase function is dispensable for sensory neurite growth but is critical for neuromuscular synapse stability // Dev. Biol. 2004 -270(1), P.232-245.

57. Eusebio A., Oliveri F., Barzaghi P., Ruegg M.A. Expression of mouse agrin in normal, denervated and dystrophic muscle // Neuromuscul. Disord. 2003 - 13(5), P.408-415.

58. Fladby Т., Jansen J.K. Postnatal loss of synaptic terminals in the partially denervated mouse soleus muscle // Acta Physiol. Scandinav. 1987 - V. 129, P.239-246.

59. Friedman В., Screrer S.S., Rudge J.L. et al. Regulation of ciliary neurotrophic expression in myelin related Schwann cells in vivo // Neuron 1992 - V.9, P.295-305.

60. Friedmann I., Faber-Elman A., Yoles E., Schwartz M. Injury-induced gelatinase and thrombin-like activities in regenerating and nonregenerating nervous systems // FASEB J. 1999-V.13,P.533-543.

61. Fugleholm K., Schmalbruch H., Krarup C. Post reinnervation maturation of myelinated nerve fibers in the cat tibial nerv: chronic electrophysiological and morphometric studies // J. Peripher. Nerv. Syst. 2000 - V.5, P.82-95.

62. Gingrich M.B., Junge C.E., Lyuboslavsky P., Traynelis S.F. Potentiation of NMDA receptor function by the serine protease thrombin // J. Neurosci. 2000 - V.20 (1), P.4582-4595.

63. Gingrich M.B., Traynelis S.F. Serine proteases and brain damage is there a link? // Trends Neuroscience - 2000 - V.23, P.399-407.

64. Gordon Т., Sulaiman O., Boyd J.G. Experimental strategies to promote functional recovery after peripheral nerve injuries // J. Peripher. Nerv. Syst. 2003 - V.8(4), P.236-250.

65. Gundersen K. Early effects of denervation on isometric and isotonic contractile properties of rat skeletal muscles // Acta Physiol. Scand. 1985 - V.124(4), P.549-555.

66. Gundersen K., Leberer E., Lomo Т., Pette D., Staron R.S. Fibre types, calcium-sequestering proteins and metabolic enzymes in denervated and chronically stimulated muscles of the rat// J. Physiol. 1988 - V.398, P. 177-189.

67. Gurwitz D., Cunningham D. Thrombin modulates and reverses neuroblastoma neurite outgrowth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1988 - V.85, P.3440-3444.

68. He X.P., Yang F., Xie Z.P., Lu B. Intracellular Ca2+ and Ca2+/Calmodulin-dependent kinase II mediate acute potentiation of neuromuscular release by neurotrophin-3 // J. Cell Biol. 2000 - V. 149(4), P.783-791.

69. Herrera A. A., Zeng Y. Activity-dependent switch from synapse formation to synapse elimination during development of neuromuscular junctions // J. Neurocytol. 2003 - V. 32(5-8), P. 817- 833.

70. Heumann R., Korsching S., Bandtlow C. et al. Changes of NGF synthesis in non-neuronal cells in response to sciatic nerve transection. J. Cell Biol. - 1987 - ,V.104, P.1623-1631.

71. Hollenberg M.D., Saifeddine M., Zwiers H. Protease-activated receptors (PARs): activation of PARI and PAR2 by a proteolytic fragment of the neuronal growth associated protein B-50/GAP-43 // Can. J. Psysiol. Pharmacol. 2000 - V.78, P.81-85.

72. Hoogerwerf W.A., Zou L., Shenoy M., Sun D., Micci M.A., Lee-Hellmich H., Xiao S.Y., Winston J.H., Pasricha P J. The proteinase-activated receptor-2 is involved in nociception // J. Neuroscience 2001 - V.21(22), P.9036-9042.

73. Jia M., Li M., Dunlap V., Nelson F. The thrombin receptor mediates functional activity-dependent neuromuscular synapse reduction via protein kinase С activation in vitro II J Neurobiol- 1999 V.38, P.369-381.

74. Kang H., Tian L., Thompson W. Terminal Schwann cells guide the reinnervation of muscle after nerve injury // J. Neurocytol., 2003, 32(5-8), Р/ 975-985.

75. Kaplan D.R., Cooper E. PI-3 kinase and IP3: partners in NT3-induced synaptic transmission // Nature Neurosci 2001 - V.4(l), P.5-7.

76. Katz E., Ferro P.A., Weisz G., Uchitel O.D. Calcium channels involved in synaptic transmission at the mature and regenerating mouse neuromuscular junction // J. Physiol. 1996 V.497(3), P. 687-967.

77. Kawabata A., Kawao N., Tanaka A., Itoh H., Nishikawa H. Peripheral PAR-2 triggers thermal hyperalgesia and nociceptive responses in rats // Neuroreport 2001 - V.12(4), P.715-719.

78. Kim S., Buonanno A., Nelson P.G. Regulation of prothrombin, thrombin receptor, and protease nexin-1 expression during development and after denervation. // J. Neurosci. Res.- 1998 -V.53, P.304-311.

79. Kirkup A.J., Jiang W., Bunnett N.W., Grundy D. Stimulation of proteinase-activated receptor 2 excites jejunal afferent nerves in anaesthetized rats // J. Physiol. 2003 -V.552(2), P.589-601.

80. Kopp D.M., Perkel D.J., Balice-Gordon R.J. Disparity in neurotransmitter release probability among competing inputs during neuromuscular synapse elimination // J. Neurosci. 2000 - V.20(23), P.8771-8779.

81. Koshikawa N., Hasegawa S., Nagashima Y. et al. Expression of trypsin by epithelial cells of various tissues, leukocytes, and neurons in human and mouse // Am. J. Pathology -1998-V. 153, P.937-944.

82. Laskowski M. В., Colman H., Nelson C., Lichtman J.W. Synaptic competition during the reformation of a neuromuscular map // J.Neurosci. 1998 - V. 18(18), P.7328-7335.

83. Lehouelleur J., Noireaud J., Schmidt H. Acetylcholine-sensitivity and local regenerative activity in denervated frog slow muscle fibres // Pflugers Arch. 1984 - V.402(l), P.88-93.

84. Letourneau P.C., Shattuck T.A. Distribution and possible interaction of actin-associated proteins and cell adhesion molecules of nerve growth cones // Development 1989 -V.105, P.505-519.

85. Letourneau P.C., Shattuck T.A., Roche F.K. Nerve growth cone migration onto Schwann cells involves the calcium-dependent adhesion molecule, N-cadherin // Develop. Biol. -1990 V.138, P.430-442.

86. Li M.X., Jia M., Jiang H., Dunlap V., Nelson P.G. Opposing actions of protein kinase A and С mediate Hebbian synaptic plasticity // Nature Neurosci. 2001 - V.4(9), P.871-872.

87. Li M.X., Jia M., Yang L.X., Dunlap V., Nelson P.G. Pre- and postsynaptic mechanisms in Hebbian activity-dependent synapse modification // J. Neurobiol. 2002 - V.52, P.241-250.

88. Linden D.R., Manning B.P., Bunnett N.W., Mawe G.M. Agonists of proteinase-activated receptor-2 excite guinea-pig ileal myenteric neurons // Eur. J. Pharmacol. 2001 -V.431(3), P.311-314.

89. Liou J.C., Tsai F.Z., Ho S.Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture // J. Physiol. 2003 -V.553(3), P.719-728.

90. Liu Y., Fields R.D., Festoff B.W., Nelson P.G. Proteolytic action of thrombin is required for electrical activity-dependent synapse reduction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 - V.91, P.10300-10304.

91. Liu Y., Fields R.D., Fitzgerald S., Festoff B.W., Nelson P.G. Proteolytic activity, synapse elimination, and the Hebb synapse // J. Neurobiol. 1994 - V.25, P.325-334.

92. Liuzzi F.J., Tedeschi B. Peripheral nerve regeneration // Neurosurg. Clin. N. Am. 1991 - V.2(l), P.31-42.

93. Lomo T. What controls the position, number, size, and distribution of neuromuscular junctions on rat muscle fibers? Review // J. Neurocytol. 2003 - V.32(5-8), P.835-848.

94. Majewski H., Iannazzo L. Protein kinase C: a physiological mediator of enhanced transmitter output // Progress in Neurobiology 1998 - V.55, P.463-475.

95. Malinow R, Malenska R.C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity // Annu. Rev. Neurosci. 2002 - V.25, P.103-126.

96. Mbebi C., Rohn Т., Doyennette M.A., Chevessier F., Jandrot-Perrus M., Hantai D., Verdiere-Sahuque M. Thrombin receptor induction by injury-related factors in human skeletal muscle cells // Exp. Cell Res. 2001 - V.263, P.77-87.

97. McArdle J. J., Albuquerque E.X. A study of the reinnervation of fast and slow mammalian muscles // J. Gen. Physiol. 1973 - V.61(l), P. 1-23.

98. Miledi R. Properties of regenerating neuromuscular synapses in the frog // J. Physiol. 1960 - V.154, P.190-205.

99. Miller-Anderson M., Gattney P.J., Seghatchian M.J. Preparation and stability of a highly purified human thrombin standard // Throm. Res. 1980 - V.20, P. 109-122.

100. Moyer M., Van Lunteren E. Effect of phasic activation on endplate potential in rat diaphragm // J. Neurophysiol. 1999 - V.82(6), P.3030-3040.

101. Neary J.T., Rathbone Mitchel P., Cattabeni F., Abbracchio M.P., Burnstoch G. Trophic action of extracellular nucleotides and nucleosides on glial and neuronal cells // Trends Neurosci. 1996 - V.19, P.13-18.

102. Nelson P.G., Lanuza M.A., Jia M., Li M.X., Tomas J. Phosphorylation reactions in activity-dependent synapse modification at the neuromuscular junction during development // J. Neurocyt. 2003 - V.32, P.803-816.

103. Nguyen Q.T., Parsadanian A.S., Snider W.D., Lichtman J.W. Hyperinnervation of neuromuscular junctions caused by GDNF overexpression in muscle // Science 2003 -V.279, P. 1725-1729.

104. Ossovskaya V.S., Bunnett N.W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease // Physiol. Rev. 2004 - V.84(2), P.579-621.

105. Personius K.E., Balice-Gordon RJ. Loss of correlated motor neuron activity during synaptic competition at developing neuromuscular synapses // Neuron 2001 -V.31, P.395-408.

106. Pinter S., Mendler L. and Dux L. Neural impacts on the regeneration of skeletal muscles // Acta Biochim. Pol. 2003 - V.50(4), P.1229-1237.

107. Quattrocchi C.C., Huang C., Niu S., Sheldon M., Benhayon D., Cartwright J., Mosier D.R., Keller F., D'Arcangelo G. Reelin promotes peripheral synapse elimination and maturation // Science 2003 - V.301, P.649-653.

108. Rasband M.N., Trimmer J.S., Schwarz T.L., Levinson S.R., Ellisman M.H., Schachner M., Shrager P. Potassium channel distribution, clustering, and function in remyelinating rat axons // J. Neurosci. 1998 - V.18(l), P.36-47.

109. Redfern P.A. Neuromuscular transmission in new-born rats // J. Physiol. 1970 -V.209, P.701-709.

110. Ribchester R.R., Co-existence and elimination of convergent motor nerve terminals in reinnervated and paralysed adult rat skeletal muscle // J. Physiol. 1993 -V.466, P.421-441.

111. Rich M.M., Lichtman J.W. In vivo visualization of pre- and postsynaptic changes during synapse elimination in reinnervated mouse muscle // J. Neurosci. 1989 - V.9, P.1781-1805.

112. Rohatgi Т., Sedehizade F., Sabel B.A., Reiser G. Protease-activated receptor subtype expression in developing eye and adult retina of the rat after optic nerve crush // J. Neurosci. Res. 2003 - V.73, P.246-254.

113. Saito Т., Bunnett N.W. Protease-activated receptors: regulation of neuronal function // NeuroMolecular Medicine 2005 - V.7(l-2), P.79-99.

114. Santafe M.M., Garcia N., Lanuza M.A., Uchitel O.D., Tomas J. Calcium channels coupled to neurotransmitter release at dually innervated neuromuscular junctions in the newborn rat // Neuroscience 2001 - V.102(3), P.697-708

115. Santafe M.M., Lanuza M.A., Garcia N., Tomas J. Calcium inflow-dependent protein kinase С activity is involved in the modulation of transmitter release in the neuromuscular junction of the adult rat Synapse - 2005 - V.57, P.76-84.

116. Santafe M.M., Lanuza M.A., Garcia N., Tomas J. Muscarinic autoreceptors modulate transmitter release through protein kinase С and protein kinase A in the rat motor nerve terminal // Eur. J. Neurosci. 2006 - V.23, P.2048-2056.

117. Shyng S.L., Xu R., Salpeter M.M. Cyclic AMP stabilized the degradation of original junctional acetylcholine receptors in denervated muscle // Neuron 1991 - V.6, P.469-475.

118. Slawinska U., Navarrete R., Kasicki S., Vrbova G. Motor activity patterns in rat soleus muscle after neonatal partial denervation // Neuromuscul. Disord. 1995 - V.5(3), P.179-186.

119. Smirnova I.V., Ma J.Y., Citron B.A., Ratzlaff K.T., Gregory E.J., Akaaboune M., Festoff B.W. Neural thrombin and protease nexin I kinetics after murine peripheral nerve injury // J. Neurochem. 1996 - V.67, P.2188-2199.

120. Smirnova I.V., Zhang S.X., Citron B.A., Arnold P.M., Festoff B.W. Thrombin is an extracellular signal that activates intracellular death protease pathways inducing apoptosis in model motorneurons // J. Neurobiol. 1998 - V.36, P.64-80.

121. Steinhoff M., Vergnolle N., Young S.H. Agonists of proteinase-activated receptor-2 induce inflammation by a neurogenic mechanism // Nature Medicine 2000 -V.6, P.151-158.

122. Striggow F., Riek M., Breder J., Reiser G. The serine protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampal neuroprotection against ischemia at low concentrations but causes degeneration at high concentrations // PNAS 2000 - V.97(5), P.2264-2269.

123. Striggow F., Riek-Burchardt M., Reiser G. Four different types of protease-activated receptor are widely expressed in the brain and are up-regulated in hippocampus by severe ischemia // Eur. J. Neuroscience 2001 - V.14, P.595-608.

124. Sugiura Y., Ко Ch.-P. Novel modulatory effect of L-type calcium channels at newly formed neuromuscular junctions // J.Neurosci. 1997 - V.17, P.1101-1 111.

125. Tai C., Kuzmiski J.B., MacVicar B.A. Muscarinic enhancement of R-type calcium currents in hippocampal CA1 pyramidal neurons // J. Neurosci. 2006 -V.26(23), P.6249-6258.

126. Thompson W. Synapse elimination in neonatal rat muscle is sensitive to pattern of muscle use // Nature 1983 - V.302, P.614-616.

127. Tonge D.A. Physiological characteristics of re-innervation of skeletal muscle in the mouse // J. Physiol. 1974 - V.241, P.141-153.

128. Turgeon V.L., Salman N., Houenou L.J. Thrombin: A Neuronal Cell Modulator // Thrombosis Research 2000 - V.99, P.417-427.

129. Van Lunteren E., Moyer M. Electrophysiologic and inotropic effects of K+-channel blockade in aged diaphragm // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998 - V. 158(3), P.820-826.

130. Vergnolle N., Bunnett N.W., Sharkey K.A. et al. Proteinase-activated receptor-2 and hyperalgesia: a novel pain pathway // Nature Medicine 2001 - V.7(7), P.821-826.

131. Vergnolle N., Wallace J.L., Bunnett N.W., Hollenberg M.D. Protease-activated receptors in inflammation, neuronal signaling and pain // TRENDS in Pharmacol. Sciences 2001 - V.22(3), P.146-152.

132. Wang H., Ubl J.J., Reiser G. Four sybtypes of protease-activated receptor, co-expressed in rat astrocytes, evoke different psysiological signaling // Glia 2002 - V.37, P.53-63.

133. Wang H., Ubl J.J., Strieker R., Reiser G. Thrombin (PAR-l)-induced proliferation in astrocytes via МАРК involves multiple signaling pathways // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002 - V.283, P.1351-1364.

134. Wyatt R.M., Balice-Gordon R ,J. Activity-dependent elimination of neuromuscular synapses // J. Neurocyt. 2003 - V.32, P.777-794.

135. Xi G., Keep R.F., Hua Y., Xiang J., Hoff J.T. Attenuation of thrombin-induced brain edema by cerebral thrombin preconditioning // Stroke 1999 - V.30, P.1247-1255.

136. Xi G., Reiser G., Keep R.F. The role of thrombin and thrombin receptors in ischemic, hemorrhagic and traumatic brain injuri: deleterious or protective? // J. Neurochem. 2003 - V.84, P.3-9.

137. Yang F., He X.P., Feng L., Mizuno K., Russell J., Xiong W.C., Lu B. PI-3 kinase and ГРЗ are both necessary and sufficient to mediate NT3-induced synaptic potentiation // Nature Neurosci. 2001 - V.4(l), P.19-28.

138. Zengel J.E., Lee D.T., Sosa M.A., Mosier D.R. Effects of calcium channel blockers on stimulation-induced changes in transmitter release at the frog neuromuscular junction // Synapse 1993 - V.15(4), P.251-262.

139. Zieger M., Tausch S., Henklein P., Nowak G., Kaufmann R. A novel PAR-l-type thrombin receptor signaling pathway: cyclic AMP-independent activation of PICA in171

140. Список используемых сокращений.

141. СПДН суммарный потенциал действия нерва; СПДМ - суммарный потенциал действия мышцы; ПКП - потенциал концевой пластинки; МПКП - миниатюрный потенциал концевой пластинки; ЛП - латентный период;

142. ДРС денервационно-реиннервационный синдром;

143. PAR proteinase activated receptor;мРНК матричная рибонуклеиновая кислота;1. АДФ аденозиндифосфат;

144. ГЭБ гематоэнцефалический барьер;сАМР (цАМФ) циклический аденозинмонофосфат;

145. ГРз инозитол-1,4,5-трисфосфат;1. АС аденилатциклаза;

146. ТугК нерецепторная тирозинкиназа;1. GTF гуанозинтрифосфат1. GDF гуанозиндифосфат;1. PLC фосфолипаза С;

147. GAP-43 белок, связанный с ростом аксонов. РКС - протеинкиназа С; РКА - протеинкиназа А.

Информация о работе

Герасименко, Наталья Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние тромбина на регенерацию периферических нервов и синапсов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы