Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Принципы формирования синаптических связей при регенерации крылоногого моллюска

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Зеленин, Павел Владимирович, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи

ЗЕЛЕНИН Павел Владимирович

ПРИНЦИПЫ ФОРМИРОВАНИЯ СИНАПТИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ КРЫЛОНОГОГО МОЛЛЮСКА

Специальность: 03.00.02 - биофизика

диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ:

Введение......................................................................................................3

Глава 1. Основные экспериментальные методы, использованные в работе ....17

Глава 2. Норма и "Стандартная" регенерация..............................................23

Глава 3. Регенерация "Без Выбора" и "С Ограниченным Выбором".............49

Глава 4. Регенерация в случае недоступности нормальной мишени...............71

Глава 5. Обсуждение физиологических экспериментов и общие положения

математических моделей..............................................................................86

Глава 6. Модель регенерации без влияния нейритов и модель с влиянием

нейритов на распределение материала..........................................................98

Глава 7. Модель регенерации с влиянием нейритов друг на друга.................108

Выводы.......................................................................................................125

Список литературы...................................................................................... 127

ВВЕДЕНИЕ

В.1. Постановка задачи.

Одной из самых важных научных проблем является работа нервной системы. В данный момент интенсивно развиваются самые разнообразные подходы к этому вопросу. Один из них - изучение функционального строения нервной системы. В частности, это изучение образования и изменения специфических связей между элементами нервной системы, нервными клетками. Образование новых связей можно вызвать искусственно, нарушив старые связи. При исследовании подобной вызванной повреждением регенерации весьма вероятно обнаружить существенные принципы и механизмы формирования мозга. Такой подход применяется уже давно, но, в основном, к позвоночным животным, так как их нервная система считается наиболее близкой к нервной системе человека. Однако, в последние годы накопилось довольно много данных о сходстве, если не идентичности, механизмов развития у всех животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. Исследование же мозга беспозвоночных имеет ряд существенных преимуществ. Во-первых, их нервная система состоит из меньшего числа нейронов, многие, если не все, из которых идентифицируемы, т.е. консервативны и легко узнаваемы у животных данного вида; связи между этими нейронами также весьма консервативны. Кроме того, количество клеток в нейронной сети беспозвоночных, ответственной за данную функцию, часто оказывается небольшим (десяток типов и сотни штук нейронов). Таким образом, нейронные сети беспозвоночных — системы с небольшим количеством элементов и связей между этими элементами. Во-вторых, некоторые беспозвоночные удобны для генетических исследований. Это позволяет связать функцию на уровне отдельных нейронов с генетикой на уровне отдельных генов. Наконец, что часто важно, с беспозвоночными легко работать, их несложно содержать, и они относительно дёшевы. Все эти причины заставили обратить внимание на моллюска СНопе Итаста (морского ангела). В данной работе изучалась регенерация аксонов локомоторных мотонейронов и нервномышечных связей у морского ангела.

При изучении регенерации, то есть восстановления нарушенных

связей между нервными клетками и их мишенями, мы должны ответить на несколько групп вопросов и a priori на каждый из вопросов существует несколько возможных и теоретически равноценных ответов. Какой из ответов правилен? Это может сказать только эксперимент. Причем для разных животных ответы могут оказаться различными. Но даже если они различны, их интересно получить, поскольку это позволит рассмотреть влияние различных механизмов. И, возможно, механизм, работающий в одной системе, затем обнаружится и в другой. Перечислим вопросы, стоящие при изучении регенерации.

Что направляет рост новых нейритов нейронов? Если нейриты доросли до области, где располагается их нормальная мишень, как нейрон выбирает данную мишень среди многих ему доступных? Каковы необходимые и достаточные условия установления новых связей нейронов на их мишенях? Если новые связи, сделанные нейроном, неправильны или избыточны (что, кстати, часто наблюдается на опыте), то появляется проблема убирания подобных связей. При этом они могут убираться, а могут становиться постоянными. Если убирание происходит, то каковы его причины и механизмы? Каковы необходимые и достаточные условия убирания?

В данной работе я попытаюсь ответить на эти и некоторые другие вопросы.

Работы как по регенерации мотонейронов у позвоночных, так и по регенерации у беспозвоночных уже проводились ранее. Новизна данной работы в том, что образование новых аксонов мотонейронов и восстановление нервномышечных связей изучались на уровне отдельных идентифицированных клеток. Основной итог данной работы — доказательство функциональной значимости конкуренции между разными нейритами внутри отдельной нервной клетки, построение математической модели взаимодействия между различными элементами нейрона, оценка приложимости различных моделей к ситуации в реальном организме и возможных следствий из них.

В.2. Регенерация у беспозвоночных и позвоночных: факты и модели.

Регенерация или восстановление нервных связей описана во многих работах [1, 2, 3, 4]. Данная тема подразделяется на несколько тем меньшего, но все же довольно значительного, размера.

Во-первых, это, конечно, запуск роста новых нейритов после того, как старые нервные связи разрушены. Многочисленные исследования посвящены тому, как нейрон регирует на нанесенное повреждение и устраняет его.

Другой темой регенерации являются механизмы запуска роста новых нейритов. В боыиинстве случаев для запуска необходимо удаление старых аксонов или нарушение нормальной синаптической передачи, однако оказалось, что даже неповрежденные нейроны могут выпускать новые нейриты [5, 6, 7, 8]. Изучалось также, как зависит интенсивность образования новых нейритов от места повреждения старого аксона. Основной качественный итог этих исследований: чем ближе к соме нейрона был отрезан старый нейрит, тем многочисленнее образующиеся новые нейриты [8].

Следующей темой исследований является сама возможность роста новых нейритов. Известно, что восстановление нарушенных связей внутри центральной нервной системы позвоночных, если и происходит, то с трудом. Это объясняется большими трудностями роста нейритов через шрам, образующийся на месте повреждния [9]. Поэтому интенсивно ищутся способы преодолеть эту проблему. (Отметим, что в отличие от позвоночных, для беспозвоночных данная проблема не стоит: новые нейриты нейронов практически всегда могут расти внутри ЦНС.)

Если рост возможен, то встает вопрос о его направлении. В этой области наибольшие успехи достигнуты не при изучении регенерации, а при исследовании роста аксонов в эмбриогенезе [10]. Анализ на уровне одиночных идентифицированных нейронов насекомых показал, что нейроны растут стереотипным образом. В эмбрионах насекомых были выявлены ранние "пионерские" конусы роста, которые создают простую сетку аксонных путей [11], которые используются для роста более поздних аксонов. Подобные "пионерские" нейроны были также обнаружены в развивающейся ЦНС рыб [12] и в мозге млекопитающих [13,14]. Конусы

роста могут направляться по специфическим путям дифференциальной адгезией [15], притягивающими [16, 17, 18] и отталкивающими [19] хемотропными сигналами и другими способами.

Сохраняются ли механизмы направления роста нейритов во взрослом организме? Известно, что рост новых нейритов при регенерации может быть специфическим [20]. В частности растущие нейриты могут устанавливать контакт с выживающими [21] или дегенерирующими [22] отрезанными частями старых аксонов и расти вдоль них. Существуют также предпочтения для роста в нервы, где в норме нет аксонов исследуемых нейронов [8, 23]. Некоторые данные указывают на возможные специфические запреты роста нейритов в определенные места [24]. Все эти предпочтения, по-видимому, являются индивидуальными характеристиками данного нейрона. При регенерации растущие нейриты могут также притягиваться к мишеням диффундирующими факторами [25]. К сожалению, животные удобные для изучения эмбриогенеза не удобны для рассмотрения регенерации и наоборот, поэтому не всегда ясно, используются ли одни и те же механизмы определения специфичности в эмбриогенезе и при регенерации. Хотя, например, было показано, что при развитии и при регенерации важную роль в направленном росте играет немышечная мезодерма [26].

После того, как нейриты достигли какой-то области, они устанавливают синапсы. Специфичен ли этот синаптогенез? Часто это так [27, 28, 29, 30]. Во многих других случаях - нет. Нейрон может устанавливать связи со всеми клетками чувствительными к выбрасываемому им нейромедиатору. Так, хотя в эмбриогенезе мотонейроны позвоночных растут по специфическим нервным путям к своим мышцам-мишеням и иннервируют только их, можно имплантировать моторный нерв в какую-либо другую мышцу, и она будет им проиннервирована. Аналогично, если во время эмбриогенеза дрозофилы убить нормальную для данного мотонейрона мышцу, он, не найдя свою мишень на обычном месте, прорастет дальше и установит связи с неправильной мишенью [31]. Нейрон ЯРесЩ1 лимнеи при регенерации, по-видимому, иннервирует все доступные ему мишени, отвечающие на его нейромедиатор [32]. Однако позже образовавшиеся синапсы могут убираться [33, 34, 35].

В начале XX века в работах Вейса [36] было обнаружено, что трансплантированные конечности амфибий иннервируются нейронами реципиента и осуществляют координированные движения. С этого времени позвоночные часто являлись объектами изучения регенерации [37, 38]. К сожалению, лишь в редких случаях удается изучать регенерацию идентифицированных нейронов позвоночных [39, 40, 41], обычно же приходится работать не с отдельными нейронами, а с нервами.

Наиболее экспериментально доступными и, соответственно, очень популярными объектами являются нервномышечные синапсы. Образование новых нервномышечных синапсов у позвоночных может быть вызвано как полной, так и частичной денервацией мышцы [42, 43]. При регенерации любой моторный нерв может иннервировать любую мышцу [44, 45]. При реиннервации мышца оказывается множественно иннервированной, то есть на одиночном мышечном волокне распологаются синапсы нескольких мотонейронов, тогда как в норме на данном мышечном волокне оканчивается только один мотонейрон. Мотонейроны конкурируют между собой за мышечные мишени, в итоге деля мышцу на "зоны влияния" [46, 47, 48]. Если в опыте мышца иннервирована двумя нервами: ранее иннервировавшим данную мышцу и чужим, то свой будет иметь преимущество в конкуренции, и неправильные синапсы будут убираться [49]. Показано, что в таком убирании синапсов при регенерации очень важную роль играет активность нейронов [50].

Конкуренция между нейронами за мышечные клетки приводит также к возникновению топографических проекций. Так существует ростро-каудальная топография проекций мотонейронов в повторяющиеся мышцы, такие как передний серратус и мышцы диафрагмы [51]. Было показано влияние и активность-зависимых, и активность-независимых механизмов [52]: сравнительно хорошая топографическая проекция моторных нейронов на мышцы устанавливается ещё до рождения [53], что указывает на существование рострокаудальных меток в эмбриональных мышцах, однако, синаптические перестройки после рождения уточняют и улучшают эту топографическую карту.

Наиболее изученным случаем убирания нервномышечных связей

является все же не убирание во время регенерации, а перинатальное убирание множественной иннервации у млекопитающих [54, 55, 56, 57]. Оказалось, что имеющееся во взрослом организме разделение волокон скелетных мышц по моторным единицам возникает только в период сразу до и после рождения, а до этого периода каждая мышечная клетка иннервирована более, чем одним мотонейроном. В результате многочисленных исследований стали раскрываться механизмы убирания нервномышечных синапсов [58]. В частности, было показано, что убирание происходит по активность-зависимому механизму [59]. В данном процессе участвуют многие внутриклеточные структуры и внеклеточный матрикс, предполагается участие многочисленных вне- и внутриклеточных сигналов [54]. Для лучшего понимания происходящих процеессов молекулярная структура нервномышечных синапсов была в последние годы детально изучена [60].

На основе имеющихся экспериментальных данных были построены разнообразные модели убирания нервномышечных связей у млекопитающих [61, 62, 63, 64]. Базовая схема данных моделей довольно проста. Окончание нерва производит некоторый сигнал, который вызывает изменения в концевой пластинке. Концевая пластинка производит другой сигнал, который воспринимается пресинаптическим окончанием и влияет на производства нейронального сигнала и/или на рост синапса. Между синапсами различных нейронов, оканчивающихся на одной и той же концевой пластинке происходит конкуренция за какой-либо лимитирующий фактор: это может быть место или трофическое вещество, производимое мышцей. На тенденцию синапсов расти могут влиять также их размеры. Может предполагаться некоторая присущая мотонейрону тенденция расти или убираться. Разнообразные комбинации условий моделей позволяют получить убирание множественной инннервациии мышц. Однако выбрать из множества имеющихся моделей одну оказывается довольно сложным. Частично это объясняется, по-видимому, сложностью системы. Другой причиной является сложная проверяемость предсказаний моделей из-за того, что экспериментаторы работают с большими группами нейронов с достаточно разнообразными и обычно неконтролируемыми свойствами.

Поэтому было бы очень интересно попытаться уменьшить число "игроков" и исследовать систему на уровне одиночных идентифицируемых клеток.

В.З. Крылоногий моллюск СИопе Итаста как выбранный объект исследования регенерации.

Нейронная сеть, обеспечивающая локомоцию у морского ангела.

Морской ангел - это крылоногий моллюск, который постоянно плавает в толще морской воды за счёт ритмических сокращений двух крыльев с частотой 1-5 Гц (Рис. В.1). Тела нейронов ангела объединены в пять пар ганглиев, которые составляют окологлоточное нервное кольцо (Рис. В.2). (Окологлоточное кольцо ниже будет называться центральной нервной системой или, для краткости, ЦНС ангела.) Эти тела оказались очень крупными и легко различимыми (Рис. В.З), что позволило произвести полное электрофизиологическое описание нейронной сети, осуществляющей ритмическое махание [66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73]. Эта сеть состоит из девяти типов нейронов, различающихся по характеру электрической активности и по фазе активности в цикле локомоции (Рис. В.4) [68]. Типы делятся на две группы: типы нейронов, активных во время движения крыла в дорзальную сторону (этим типам даны нечётные номера 1, 3, 7, такие нейроны будут называться дорзальными, а соответствующая фаза локомоторного цикла далее в тексте будет называться дорзальной или Б-фазой), и типы нейронов, активных во время движения крыла в вентральную сторону (этим типам даны чётные номера 2, 4, 6, 8, 10, 12, такие нейроны будут называться вентральными, а соответствующая фаза локомоторного цикла далее будет называться вентральной или V-фазой). Тела всех нейронов локомоторного генератора, за исключением нейронов типа 12, лежат в педальных ганглиях ЦНС, а тела нейронов типа 12 находятся в плевральных ганглиях [73]. Генерация плавательного ритма делается исключительно нейронами, находящихся внутри ЦНС, без какого-либо участия сигналов от периферических сенсорных клеток. Генерирующая нейронная сеть состоит из трёх групп интернейронов (интернейроны типов 7, 8 и 12) [69,72]. Нейроны внутри каждой из групп 7 и 8 сильно электрически связаны друг с другом и работают синхронно, поэтому каждая

морского ангела с вентральной стороны. Справа изображены фазы движения крыльев при махании (вид с головы, дорзальная сторона тела сверху, вентральная сторона тела снизу). 1.Фаза максимального сгибания крыльев в вентральную сторону. 2.Фаза движения крыльев в дорзальную сторону. З.Фаза максимального сгибания крыла в дорзальную сторону. 4. Фаза движения крыльев в вентральную сторону.

Рис. В.2. Центральная нервная система Clione limacina - окологлоточное кольцо ганглиев - и отходящие от неё периферические нервы (вид с вентральной стороны). Вис - буккальные ганглии; Сег - церебральные ганглии; Р1 - плевральные ганглии; Ped - педальные ганглии; Par -абдоминальные (пар