Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование связей, обеспечивающих контроль генерации ритма в нейронной сети моллюска

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Садреев, Руслан Ильясович, Москва

/ • у

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 612.829

САДРЕЕВ Руслан Ильясович ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЕЙ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ КОНТРОЛЬ ГЕНЕРАЦИИ РИТМА В НЕЙРОННОЙ СЕТИ МОЛЛЮСКА

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Панчин Юрий Валентинович

Москва - 1999

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................б

ГЛАВА 1. Обзор литературы..........................................................9

1.1. Основные задачи исследования нейронных сетей центральных генераторов ритма......................................................9

1.2. Типы механизмов, обеспечивающих генерацию периодической активности в центральных генераторах ритма.........10

1.3. Механизмы генерации ритма в исследованных центральных генераторах у различных животных..............................................21

1.3.1. Реализация обратной связи, обеспечивающей поддержание периодических колебаний активности...........21

1.3.2. Механизмы, задающие частоту генерации и длительность различных фаз в одном цикле.....................24

1.3.3. Механизмы, обеспечивающие устойчивость ритма ....27

1.3.4. Контроль генерации с более высоких уровней управления...................................................................29

1.4. Плавательный генератор морского ангела........................30

ГЛАВА 2. Идентификация нейромедиаторов пейсмекерных нейронов локомоторного генератора: ответы изолированных нейронов различных типов на действие ацетилхолина, глютамата и их миметиков ...................................................................................34

2.1. Введение ......................................................................34

2.2. Методика.....................................................................36

2.3. Действие ацетилхолина и глютамата на изолированные нейроны локомоторной сети воспроизводит действие двух типов пейсмекерных интернейронов....................................................37

2.3.1. Результаты ..........................................................37

2.3.2. Обсуждение ................................................................43

2.4. Характеризация ацетилхолиновых и глютаматных рецепторов нейронов локомоторного генератора: действие миметиков ацетилхолина и глютамата на изолированные нейроны ..................46

2.4.1. Результаты .................................................................46

2.4.1.1. Действие миметиков ацетилхолина......................46

2.4.1.2. Действие миметиков глютамата............................48

2.4.2. Обсуждение................................................................54

ГЛАВА 3. мРНК белка-рецептора к глютамату экспрессируется в мотонейронах локомоторного генератора.......................................57

3.1. Введение.......................................................................57

3.2. Методика.......................................................................59

3.3. Результаты....................................................................61

3.4. Обсуждение...................................................................64

ГЛАВА 4. Действие блокады холинэргической передачи на связи в локомоторной системе..................................................................66

4.1. Введение.......................................................................66

4.2. Методика.......................................................................66

4.3. Результаты....................................................................68

4.3.1. Действие антагонистов ацетилхолина на нервно-мышечные синапсы........................................................68

4.3.2. Действие антагонистов ацетилхолина на нейронную сеть плавательного генератора.........................................73

4.4. Обсуждение..................................................................79

4.4.1. Холинэргические синапсы в локомоторной системе клиона и их свойства......................................................79

4.4.2. Генерация плавательного ритма после выключения тормозных связей полуцентра У-фазы с полуцентром Э-фазы............................................................................82

ГЛАВА 5. Действие блокады глютаматэргической передачи на связи в локомоторном генераторе..............................................................86

5.1. Введение.......................................................................86

5.2. Методика.......................................................................87

5.3. Результаты....................................................................87

5.4. Обсуждение...................................................................93

5.4.1. Глютаматэргнческие синапсы в локомоторной нейронной сети...............................................................94

5.4.2. Генерация плавательного ритма после выключения тормозных связей полуцентра О-фазы с полуцентром V-фазы.............................................................................95

ГЛАВА 6. Выключение обратной связи между противофазными полуцентрами изменяет стабильность и управляемость работы генератора....................................................................................98

6.1. Введение.......................................................................98

6.2. Методика.......................................................................99

6.3. Результаты....................................................................101

6.3.1. Степень периодичности работы схемы с односторонними связями в обычном режиме.....................101

6.3.2. Возможность режима апериодической генерации.....104

6.3.3. Ослабление ограничений на сбои последовательности фаз в цикле.................................................................107

6.3.4. Зависимость длительности фаз, периода и частоты генерации от базового потенциала нейронов двух полуцентров

в норме и при выключении обратной связи.....................108

6.4. Обсуждение.................................................................113

ВЫВОДЫ .................................................................................116

ЛИТЕРАТУРА............................................................................117

ВВЕДЕНИЕ

В исследовании принципов функционирования нервной системы одним из важнейших направлений является изучение нейронных механизмов управления движениями. Продуктивным подходом к пониманию этих механизмов оказывается исследование нейронных сетей в нервных системах животных с относительно простой организацией.

Человеческий мозг состоит из 1011 нейронов, которые подразделяются как минимум на 1000 типов; при этом размеры нервных клеток позвоночных животных часто не позволяют регистрировать внутриклеточно электрическую активность отдельного нейрона. Нейронные сети в относительно простых нервных системах некоторых беспозвоночных, с одной стороны, включают небольшое количество сравнительно крупных клеток; с другой стороны, многие такие сети контролируют разнообразные и часто сложные акты поведения, для которых, однако, возможна простая экспериментальная интерпретация. В этом смысле удобными для изучения моделями являются, например, некоторые виды моллюсков. Для таких моделей в последнее время, с ростом понимания внутриклеточных механизмов функционирования и развития нервных клеток, возникла реальная возможность объединить в одном объекте исследование трех уровней организации поведения: уровень поведенческих реакций целого организма, уровень отдельных нейронов, составляющих нейронную сеть, молекулярный уровень внутриклеточной и межклеточной коммуникации.

Объектом данной работы является нейронная сеть, контролирующая ритмические плавательные движения крылоногого моллюска морского ангела (СНопе Нтаста). Эта система нейронов является центральным генератором, т.е. она способна самостоятельно, без внешних ритмических воздействий, поддерживать периодическую активность. Эта активность управляет плавательными движениями

крыльев животного, обеспечивая ритмическую смену фазы подъема крыла (Б-фаза) и фазы опускания крыла (У-фаза). Частота плавательного ритма меняется в пределах 1-3 Гц в зависимости от поведенческих реакций моллюска. К настоящему времени были установлены все типы нейронов, составляющие локомоторный генератор, и схема связей между ними, которая способна обеспечить ритмическую генерацию в отсутствие самостоятельной пейсмекерной активности нейронов. В то же время, было показано, что в изолированном состоянии основные управляющие нейроны сети способны к периодической активности. Это предполагает избыточность системы, контролирующей плавание моллюска, участие в генерации ритма нескольких механизмов, дополняющих друг друга. Функциональное значение такой избыточности изучено не было. Детальное знание схемы нейронной сети и методы регистрирации электрической активности идентифицированных нейронов и их изоляции из нервной системы позволяют исследовать роль различных механизмов в генерации локомоторного ритма.

Основной целью работы являлось изучение вклада, который вносится в генерацию двумя типами механизмов: внутренней пейсмекерной активностью нейронов, управляющих двумя противоположными фазами локомоции, и взаимными тормозными связями между ними. Исходя из этого, были решены следующие задачи:

1. Определение типов нейромедиаторов, опосредующих связи между нейронами локомоторного генератора.

2. Специфическая блокада связей одной из двух групп пейсмекерных нейронов.

3. Изучение процессов периодической генерации в новой модифицированной схеме нейронной сети и их сравнение с работой исходной схемы локомоторного генератора.

В диссертации представлены следующие основные результаты работы:

1. Идентифицированы нейромедиаторы нейронов различных типов из состава локомоторного генератора морского ангела. Показано, что связи двух основных типов пейсмекерных интернейронов опосредованы двумя различными нейромедиаторами (ацетилхолином и глютаматом).

2. Из изолированных мотонейронов локомоторного генератора выделена мРНК белка-рецептора к глютамату и частично охарактеризована его первичная структура.

3. Обнаружено, что периодическая активность нейронной сети с нормальной последовательностью двух фаз локомоторного цикла может обеспечиваться схемой с односторонними связями между пейсмекерными нейронами.

4. Исследованы изменения в работе нейронной сети при блокировке обратной связи между противофазными пейсмекерными нейронами. Установлено, что в такой схеме понижается стабильность частоты генерации и ослабляется контроль переключения двух фаз активности.

5. В схемах с двусторонними и односторонними связями определена зависимость длительности двух фаз локомоторного цикла, его полного периода и частоты генерации от базового потенциала пейсмекерных интернейронов двух основных типов. Сравниваются возможности управления частотой генерации в двух схемах.

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Основные задачи исследования нейронных сетей центральных генераторов ритма.

Одной из основных функций нервной системы является управление движениями. Объектом отдельного интереса стали принципы построения нейронных сетей, управляющих ритмическими движениями (шаганием, плаванием, дыханием и т.д.) Первые исследования в этой области были проведены английским физиологом Шеррингтоном в начале века [1]. Он экспериментально установил несколько важных принципов генерации ритма и необходимой последовательности сокращений мышц конечностей при шагательных и чесательных движениях позвоночных животных. Было показано, что собственно генераторные механизмы этих движений находятся в спинном мозге; при этом высшие отделы нервной системы только подают команды включения генерации. Шеррингтон, а также Браун [2] установили, что конечность, не получающая афферентных стимулов, способна тем не менее совершать шагательные и чесательные движения. Таким образом, они показали, что ритмическая активность генераторных механизмов не зависела от сигналов обратной связи с периферических рецепторов. Это привело к появлению понятия "центрального генератора"- системы нейронов, способной производить на выходе периодические изменения электрической активности в отсутствие внешних влияний. Центральный генератор и "командный" уровень, с которого подаются непериодические сигналы его включения-выключения и подстройки [3-9], образуют многоуровневую управляющую систему, идея которой была проанализирована в работах Бернштейна [10].

Основная цель исследования центральных генераторов- выявить принципы построения ритмических движений, начиная с уровня отдельного нейрона и кончая целостной организацией поведения. Для этого необходимо ответить по крайней мере на следующие вопросы:

1. Каковы источники периодической активности в нейронной сети?

2. Какие механизмы определяют период выходного сигнала и продолжительность различных фаз отдельного цикла?

3. Какие механизмы формируют общее построение цикла, т.е. число фаз в цикле и переходы между ними?

В настоящее время ответы на все эти вопросы могут быть получены лишь для небольшой части известных у животных нейронных сетей с периодической активностью, в основном у беспозвоночных и низших позвоночных. В таких подробно исследованных системах идентифицированы все (или почти все) нейроны, составляющие генератор, и связи между ними, что позволяет объяснить работу сети в терминах взаимодействий между нейронами.

1.2. Типы механизмов, обеспечивающих генерацию периодической активности в центральных генераторах ритма

Среди механизмов, которые могут быть использованы в нейронной сети для генерации ритмической электрической активности, можно выделить несколько важнейших. А. Синаптическая передача

Классическая синаптическая передача- это, вообще говоря, один из многих известных типов передачи сигналов между нервными клетками. Существует несколько механизмов коммуникации между нейронами, по широте "адресации", времени задержки сигнала, времени действия и другим характеристикам. Кроме химической синаптической передачи,

они включают электрическую связь через щелевые контакты или цитоплазматические мостики, действие "неклассических" медиаторов типа N0 и СО [11], сигналы, с помощью которых модулируются характеристики мембраны нейрона (порог возбуждения, частота генерации потенциала действия (ПД) и др.) без изменеия мембранного потенциала [12], нейросекреция гормональных факторов, химические сигналы регуляции развития ( белки и протеогликаны, выделяемые пре-и постсинаптической клетками для взаимной координации в процессе образования синапса [13]). Процесс передачи сигнала через химический синапс включает несколько этапов [14] (см. рис.1):

(а) ПД распространяется по аксону в пресинаптическое окончание;

(б) Деполяризация нервного окончания открывает потенциал-зависимые кальциевые каналы в пресинаптической мембране, что ведет к локальному повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция, которое затем вызывает слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной и выделение нейромедиатора [15].

(в) Нейромедиатор влияет на нейрон-мишень, специфически связываясь с его мембранными рецепторными белками, которые способны изменять ионную проводимость постсинаптической мембраны за счет активации ионных каналов. Трансмембранные ионные токи (на рис.- натриевые) приводят к возникновению в постсинаптической клетке т.н. постсинаптического потенциала (ПСП)- возбуждающего (ВПСП) или тормозного (ТПСП). Для того, чтобы действие медиатора не было размыто во времени и в пространстве, существуют специальные механизмы быстрого удаления медиатора из синаптической щели сразу после его выделения. Несвязанный медиатор либо химически инактивируется специальным ферментом (например, ацетилхолин

Пресинаптический потенциал действия

+40 тУ

ОтУ

-55 тУ ■ -70 тУ

_ .¡.и 1 -____порог

Возбуждающий

постсинантическнй

потенциал

порог I

• ^: ;

_Л Т) Ш) О Т)_ Постсннаптическая

—I [РНш^и 1Р клетка

И.*

Потенциал действия Вхождение кальция распространяется в окончание аксона

вызывает слияние

Открываются ионные каналы, формируются

синаптическнх пузырьков новые пузырьки с мембраной

Рис. 1. Основные этапы химической синаптической передачи. А: Потенциал действия (показан сверху слева) распространяется по аксону к окончанию. Б: Деполяризация пресинаптической мембраны ведет к открыванию потенциал-зависимых Са2+ каналов и локальному повышению внутриклеточной концентрации Са2+, что приводит к выбросу медиатора из пресинаптических пузырьков. В: нейромедиатор активирует лиганд-зависимые ионные каналы постсинаптической мембраны и вызывает входной Ыа+ ток, деполяризующий постсинаптическую мембрану (ВПСП внизу слева).

гидролизуется холинэстеразой), либо поглощается пресинаптической клеткой путем эидоцитоза (механизм "обратного всасывания", uptake).

В 70-80-х годах были накоплены данные о том, что практически все нейромедиаторы, которые активируют лиганд-зависимые каналы и вызывают быстрый (1 мс) постсинаптический ответ, связываются также со вторым классом рецепторов, которые запускают постсинаптические потенциалы с характерным временем затухания порядка секунд. В результате одни и те же сигналы, передаваемые клеткой, могут иметь разные временные характеристики в зависимости от типов рецепторов у различных клеток-мишеней, кроме того, в одной клетке возможны сложные составные постсинаптические ответы на простой сигнал. Эти рецепторы не связаны с ионными каналами непосредственно, а активируют их через т.н. ГТФ-связывающие белки (G-белки), свободно диффундирующие в мембране [16]. G-белки в свою очередь активируют ферменты, катализирующие синтез молекул т.н. втори