Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экстрасинаптическая секреция нейротрансмиттеров: исследование с помощью изолированного нейрона как биологического сенсора

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экстрасинаптическая секреция нейротрансмиттеров: исследование с помощью изолированного нейрона как биологического сенсора"

На правах рукописи

005007747

Чистопольский Илья Александрович

ЭКСТРАСИНАПТИЧЕСКАЯ СЕКРЕЦИЯ НЕИРОТРАНСМИТТЕРОВ: ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ИЗОЛИРОВАННОГО НЕЙРОНА КАК БИОЛОГИЧЕСКОГО СЕНСОРА

03.03.01. - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯНВ 2012

Москва 2012

005007747

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Сахаров Дмитрий Антонович, ИБР РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Гомазков Олег Александрович, РАМН НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

кандидат медицинских наук Шевелкин Алексей Валерьевич, РАМН НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН

Ведущая организация: Московский государственный университет им.

М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра высшей нервной деятельности

Защита диссертации состоится « (Н » 02 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан «_

20 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ele0806@yandex.ru

Абрамова Е.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно логике классической синаптической парадигмы, для работы нервной системы не требуется нескольких, даже двух медиаторов. В реальной же нервной системе множество медиаторов работают совместно. В попытке логически разрешить «противоречие» между разнообразием эргичности нейронов и представлением о достаточности одного химического посредника для работы нервной системы, были высказаны соображения о том, каким образом это разнообразие участвует в работе нервной сети (Сахаров, 1985, 1990). Кодирование передающих сигналов в такой сети предполагается не посредством синаптических связей нейронов между собой, а наличием рецепторного поля к тому или иному химическому агенту, выделяемому нейроном-передатчиком. Такая передача не требует обязательной локализации всего процесса внутри синапса, т.к. адресация в ней производится не локализацией места передачи, а типом рецепторов к медиатору, расположенных на мембранах нейронов как вблизи, так и в удалении от зоны медиаторного выброса. Известные на сегодня описания элементов такой «несинаптической» передачи в нейрональных сетях конкретных животных пытаются объединить в одной группе феноменов. С другой стороны, синаптической доктрине противоречат феномены, которые относят к экстрасинаптической секреции («объемной передаче», volume transmission, VT) (Zoli,1999; Agnati,2010; Sykova, 2008). Вместе с тем, функции и механизмы экстрасинаптической секреции остаются в целом неясными, методы ее исследования разработаны недостаточно и требуют новых подходов. Необходимо изучение того, как экстрасинаптическая секреция проявляет себя в работе нервных систем реальных животных.

Цель и задачи исследования. Цель работы - выявление механизмов химических несинаптических взаимодействий в работе простой центральной нервной системы (ЦНС). В работе предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать методику с использованием биосенсора для регистрации нейроактивных веществ, выделяемых нейронами в нейропиль ганглиев ЦНС моллюска.

2. Выявить участие нейроактивных веществ, действующих по механизму безадресного межнейронального взаимодействия, в работе простой ЦНС моллюска Lymnaea stagnalis.

3. Оценить функциональную значимость и эффективность таких нейроактивных веществ в работе нейронов ЦНС, участвующих в реализации локомоторного поведения моллюска.

4. Выяснить, проявляют ли себя феномены экстрасинаптического межнейронального взаимодействия при генерации нейронами ЦНС моллюска программы фиктивного пищевого поведения.

Научная новизна н практическая значимость работы. Впервые системно и в разных модификациях зарегистрированы в режиме реального времени экстраклеточные химические процессы, которые относят к

несинаптическим взаимодействиям. С этой целью была применена собственная методическая разработка - биосенсор на основе изолированного нейрона.

Применение нового метода впервые дало возможность визуализировать регистрацию и позволило исследовать несинаптические взаимодействия в интактной, фиктивно работающей нервной системе. Метод позволяет тестировать химическую обстановку вблизи поверхности ганглиев моллюска и отслеживать ее изменения, наблюдать в режиме реального времени работу нейроактивных факторов, выделяемых в объем ганглия.

Разработанные методические приёмы, продлевающие на многие часы рабочее состояние изолированного нейрона, впервые позволили регистрировать химические изменения межнейронального пространства простой нервной системы, связанные со спонтанным переключением ее функциональных состояний. Результаты экспериментов говорят о важности феномена экстрасинаптической секреции в работе нервной системы исследованного объекта, моллюска Lymnaea stagnalis. Они позволяют выявить специфику объемной межнейрональной передачи, а также очертить круг функций, с которыми может быть связан феномен экстрасинаптической секреции.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи были решены с применением современных методов электрофизиологии. Кроме того, была отработана не применявшаяся ранее методика для многочасовой детекции нейроактивных веществ истекающих из нейропиля ЦНС. Выводы сформулированы четко и соответствуют заявленным целям и использованным методам. Написание и оформление диссертации осуществлено в соответствии с предъявляемыми требованиями. Научные положения и выводы, изложенные в работе, обоснованы и опираются на квалифицированный анализ собственных исследований и данных литературы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: Simpler nervous systems. VI East European conférence of the ISIN, September 22-24, Moscow-Pushchino, 2000.; VIII Всероссийская конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Х.С. Коштоянца, октябрь 25-27, 2000.; Simpler nervous systems. VII East European conférence of the ISIN, September 12-16, Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe, 2003.; Конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», 14-16 марта, Москва, 2005.; 35th annual meeting of the Society for Neuroscience, 13-16 November, Washington, USA, 2005.; Simpler nervous systems. VIII East European conférence of the ISIN, September 13-17, Kazan, Russia, 2006.; 1 lth Symposium on invertebrate neurobiology, August 25-29, Tihany, Hungary, 2007.; Конференция «Механизмы нервных и эндокринных регуляций, ноябрь 24-26, Москва, 2008.; Simpler nervous systems. IX East European conférence of the ISIN, September 9-13, S-Peterburg, Russia, 2009.; 9th International congress of neuroethology, August 2-7, Salamanka, Spain, 2010.; 40th annual meeting of the Society for Neuroscience, 13-17

November, San Diego, California, USA, 2010.; 9th Gagra Talks. International conference on fundamental questions of neuroscience, October 13-16, Tbilisi, Georgia, 2010.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 24 печатных работы, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 6, в других журналах и научных сборниках - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 15.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 75 страницах, содержит 18 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы, включающий 82 цитируемых источника.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были выбраны выращенные в аквариальной культуре взрослые особи большого прудовика Lymnaea stagnalis (Mollusca Gastropoda Pulmonata). Все эксперименты проводили с использованием препарата изолированной ЦНС улитки (рис. 1). Регистрацию электрической активности нейронов, а также их стимуляцию, осуществляли стандартными методами клеточной электрофизиологии. Отводились микроэлектродами как от нейронов, лежащих внутри ЦНС, так и от изолированных нейронов.

Биосенсор. С помощью изолированного нейрона-биосенсора тестировалось присутствие нейроактивных веществ в выбранной точке пространства рабочей камеры. Такой биосенсор, имея необходимую рецепцию, реагировал на окружающие его химические вещества изменением мембранного потенциала. Биосенсоры изолировали из педальных, церебральных, буккальных и плевральных ганглиев. Для изоляции биосенсора нервную систему прудовика обрабатывали проназой Е (Sigma), 4 мг/мл, 5-7 минут, с последующей отмывкой физиологическим раствором. Изоляцию осуществляли с помощью микроэлектрода (Т.Л. Дьяконова, 1985). В сому клетки вводили стеклянный микроэлектрод, который медленно сдвигали в сторону до полного отрыва ветвей нейрита от нейропиля. Этот же микроэлектрод использовали как для дальнейших перемещений биосенсора, так и для регистрации его электрической активности. В опытах с тестированием экстранейрональной среды биосенсор попеременно сближали с поверхностями одного или нескольких ганглиев. Его перемещали в течение 20-60 секунд из отдалённой точки, находящейся на расстоянии около 0,5 мм от тестируемых ганглиев, к выбранному участку поверхности. Через 60-120 секунд биосенсор возвращали в исходную отдалённую точку. При непрерывном мониторинге среды у поверхности ганглия использовали несколько биосенсоров.

«Полуизолированные» нейроны. В некоторых опытах использовали не до конца изолированные нейроны. Получены они были сходно с тем, как описано для биосенсора, т.е. микроэлектрод вводили в сому и затем

микроманипулятором отодвигали ее от ганглия, стараясь вытащить проксимальный и медиальный сегменты отростка из нейропиля. Тестируемые ганглии нервной системы улитки. Тестируемые ганглии обрабатывали проназой Е (Sigma), 4 мг/мл, 2-6 минут, с последующей отмывкой физиологическим раствором.

I7CGC

леве

ЛПедГ

ППедГ

ППлГ

ЛПлГ

ЛПарГ

ППарГ

Рис. 1. Схема ЦНС моллюска Ьушпаеа (предоставлена В.Цыгановым).

Дорсальная сторона ЦНС. Перерезана церебральная комиссура, церебральные ганглии развернуты вентральной стороной. Отмечены идентифицированные нейроны, используемые в экспериментах.

ЛБГ и ПБГ- левый и правый буккальные ганглии; ЛЦГ и ПЦГ- левый и правый церебральные ганглии; ЛПлГ и ППлГ- левый и правый плевральные ганглии; ЛПарГ и ППарГ- левый и правый париетальные ганглии; ЛПедГ и ПедГ- левый и правый педальные ганглии; ВГ - висцеральный ганглий; В4 - идентифицированные нейроны буккальных ганглиев; В4-кл - район кластера, состоящего из В4С1 нейронов; А-кл - район А-кластера; ПСвС и ЛСвС - гигантские нейроны правого и левого церебральных ганглиев.

Условия экспериментов. Основной физиологический раствор имел составив мМ): NaCl - 50; KCl - 1,6; СаС12 - 4; MgCl2 - 4; Tris - 10 (pH 7,5); с добавлением D-глюкозы 0,05%. Эмпирически подобранный состав раствора, оптимальный для регистрации биосенсорами ритмов в буккальных ганглиях, был изменен, концентрация MgCl2 составляла в нем 1 мМ. Препарат ЦНС помещали в проточную камеру объёмом 1,5 мл. В ней поддерживали проток скоростью 0,5-1 мл/мин на всём протяжении эксперимента. Используемые экзогенные химические вещества вносили в проток рабочей камеры или апплицировали в камеру микропипеткой. Использовали вещества: хинин (Calbiochem), серотонин (5 - гидро кс и- L-тр и птам и н, 5-НТ, Sigma), предшественник серотонина (5-гидрокси-Ь-триптофан, 5-НТР, Sigma). Для ингибирования триптофандекарбоксилазы, фермента, превращающего 5-НТР в 5-НТ, применяли м-гидроксибензилгидразин (мГБ, Sigma).

В части опытов нейрон подводили также к кончику капилляра с диаметром кончика несколько микрометров, который содержал 10"3 М 5-НТ. Мембранные потенциалы отводили от нейронов с помощью стеклянных микроэлектродов (KCl, ЗМ, R= 20 - 50 МОм), на усилители постоянного тока фирмы Микромед. Далее сигналы подавали на аналого-цифровой преобразователь (АЦП, интервал между двумя последовательными опросами по одному каналу составлял 0,2 миллисекунды), встроенный в персональный компьютер IBM PC. После дополнительной обработки данных и расчета средних значений параметров, достоверность полученных результатов оценивали по непараметрическому критерию Уилкоксона и критерию знака, в части случаев пользовались F-критерием.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1.Медиаторная обстановка вблизи серотонинергических нейронов А-кластера педальных ганглиев.

1.1. Предварительное исследование механизма действия 5-НТР на нейроны А-кластера педальных ганглиев. Зная, что у моллюска можно активизировать локомоторное поведение при помощи 5-НТР, данного экзогенно в его гемолимфу, на изолированной центральной нервной системе (ЦНС) моллюска было изучено, сводится ли действие 5-НТР к повышению синтеза 5-НТ в серотонинэргических нейронах. В них был заблокирован синтез 5-НТ из 5-НТР с помощью мГБ (см. методы) в концентрации 25 мкМ. В этих опытах электрическую активность отводили от «полуизолированного» нейрона А-кластера педальных ганглиев (см. методы). После начала поступления раствора с мГБ в рабочую камеру, регистрировали фоновую активность нейрона в течение 30 минут (пять или шесть записей, каждая длительностью 1 минута). Затем в проток мГБ на 6 минут добавляли 5-НТР в концентрации 100 мкМ и регистрировали сходным образом активность нейрона в интервале с 4-ой до 14-ой минуты от начала поступления 5-НТР в рабочую камеру. Разность двух средних частот по модулю, до и после воздействия 5-НТР, выражала его

влияние на клетку. Результаты опытов с мГБ (п=7) даны в Таблице 1. Результаты контрольных экспериментов (п=12) с действием 5-НТР без мГБ, даны в Таблице 2.

Таблица 1.

номер нейрона 1 2 3 4 5 6 7

исходная частота (спай к/мин) 14,5 16,0 16,0 11,5 24,5 21,5 51,2

частота после мГБ (спайк/мин) 14,6 14,0 18,5 9,3 28,3 17,6 53,4

частота после мГБ + 5-НТР (спайк/мин) 13,3 14,1 15,0 10,5 27,1 16,5 53,3

Таблица 2.

номер нейрона 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

исходная частота (спайк/мин) 10,8 5,8 9,3 33,2 9,2 8,6 8,4 6,8 4,4 9,4 10,2 17,0

частота после 5-НТР (спайк/мин) 20,3 15,8 27,0 36,6 15,3 14,5 15,4 13,9 9,1 13,2 11,1 19,1

Опыты показали, что мГБ достоверно снимает эффект 5-НТР (уровень значимости 0.01, критерий Уилкоксона), и что его возбуждающее действие становится возможным лишь после его превращения в 5-НТ. Т.к. все это наблюдалось в условиях «полуизоляции», можно было предполагать, что действие 5-НТР осуществляется на уровне одного нейрона. В дальнейшем это подтвердилось опытами на полностью изолированных нейронах. Т.е. после дачи предшественника вновь синтезированный 5-НТ нейрона действует на этот же нейрон, возбуждая его, и, тем самым, осуществляет положительную обратную связь на уровне одной клетки.

1.2. 5-НТ в межклеточном пространстве педальных ганглиев. В предположении, что 5-НТ действует в районе А-кластера при усилении локомоции моллюска по механизму экстрасинаптической секреции, была исследована химическая обстановка с помощью биосенсора, в качестве которого выступал нейрон А-кластера. В подавляющем большинстве случаев (36 из 42 клеток на 31 препарате ЦНС) частота спайков изолированного нейрона, придвинутого сомой к поверхности ганглия в зоне А-кластера, возрастала и составляла 112-1000% (в среднем 280%). Однако были исключения, когда частота значимо не менялась (3 случая) или даже уменьшалась (3 случая). Если биосенсор сближали с кончиком 5-НТ капилляра (см. методы), частота спайков возрастала. Исследование биосенсором всей поверхности педальных ганглиев позволило получить более детальную

информацию о химической обстановке внутри них (см. рис. 2). То, что наиболее сильное возбуждающее действие достигается в области А-кластера, уже более определенно указывает на эти нейроны, как на источник сильного медиаторного влияния.

.13 Т1

150мкм

Рис. 2. Изменения активности биосенсора в зависимости от его позиции относительно педального ганглия.

ЛПД - левый педальный ганглий; ГТПД - правый педальный ганглий; А - педальный А-кластер. На ЛПД дана карта активности биосенсора у разных участков дорзальной поверхности (среднее из 7 экспериментов, в процентах от измеренной частоты спайков у латерального края ганглия). На ППД показаны результаты эксперимента, в котором биосенсор перемещали вдоль протока. Для каждой точки указано число спайков за 2 мин регистрации. Стрелкой указано направление протока физиологического раствора.

Далее была проведена серия опытов с подведениями биосенсора к педальным ганглиям на фоне экзогенного 5-НТ. Периодическое сближение биосенсора с педальными ганглиями на фоне постепенно увеличивающейся концентрации 5-НТ в протоке (2 случая) показало, что после достижения экзогенным 5-НТ некоторого порогового значения частота спайков нейрона переставала увеличиваться и могла даже уменьшаться при подведениях к педальным ганглиям. Экзогенный 5-НТ, действуя сонаправленно с фактором, выделяющимся из ганглия, при 10"7М полностью маскировал действие этого эндогенного фактора на биосенсор. При 5*10"5М 5-НТ подведение биосенсора к А-кластеру во всех случаях не вызывало усиления электрической активности. Напротив, в этих условиях отмечалось уменьшение частоты спайков (в 6 случаях из 10). Все это указывало на 5-НТ, как на один наиболее значимых химических факторов, который выделяется в исследуемой области ганглиев и влияет на биосенсор.

В следующей схеме эксперимента использовали усиливающее действие 5-НТР. При поступлении с протоком в концентрации 1-2*10"4М (или при аппликации его в камеру) (рис. 3) (п=6), 5-НТР вызывал как усиление активности самого биосенсора, так и увеличение прироста частоты, вызванного его сближением с педальными ганглиями. Абсолютный прирост частоты, вызываемый сближением с педальными ганглиями, продолжал увеличиваться, в то время как фоновая частота спайков самого биосенсора уже прошла максимум увеличения, вызванного 5-НТР. Т.е. возбуждающее влияние педальных ганглиев на биосенсор усиливается в присутствии 5-НТР, который, не обладая прямым действием на нейроны А-кластера, действует на них только после превращения в 5-НТ.

Рис. 3. Реакция биоеенсора на подведение к А-кластеру усиливается на фоне 2*10"4М 5-НТР в протоке. Биосенсор подводили через каждые 5 минут, начиная с 0 минуты, время перемещения нейрона при подведении (отведении) - 0,5 минуты, время у поверхности ганглия после подведения до начала отведения - 1,5 минуты. Черный прямоугольник на горизонтальной оси - начало поступления в камеру 5-НТР. Светлый прямоугольник - начало отмывки.

1.3. Медиаторный «бульон» педальных ганглиев. Помимо ожидаемого 5-НТ, в системе педальных ганглиев предполагались и другие факторы, которые, подобно 5-НТ, действовали на биосенсор. На это указывали единичные случаи гиперполяризации биосенсоров в отсутствие внешних химических воздействий на педальные ганглии.

Применение хинина в концентрации 10 мкМ выявило отличный от 5-НТ деполяризующий фактор. На фоне хинина спайк биосенсора, подведенного к педальным ганглиям, сужается под влиянием деполяризующего фактора, который не является 5-НТ, т.к. последний всегда действует на биосенсоры (изолированные из А-кластера), расширяя их спайк (пример см. рис. 4).

Для обнаружения тормозящего фактора препарат подвергали действию 0,5 мкМ 5-НТ, что вызывало возбуждение нейронов А-кластера, в том числе биосенсора. Если на первых минутах действия 5-НТ сблизить биосенсор с А-кластером педальных ганглиев ЦНС, то в первые секунды сближения частота спайков уменьшается (рис. 5) (п=6).

Рис. 4. Изменения длительности спайков биосенсора на фоне 10 мкМ хинина в ходе тестирования эталонного источника медиатора, 5-НТ капилляра, и ганглиев ЦНС.

тонкая сплошная линия - в отсутствие воздействий; толстая сплошная линия - при сближении с 5-НТ капилляром; тонкая пунктирная линия - при сближении с А -кластером. Действие кончика 5-НТ капилляра было равносильно действию 10"8-1СГ7М 5-НТ.

Рис. 5. Изменение средней частоты спайков биосенсора при сближении его с А-кластером педальных ганглиев в отсутствие и на фоне 0,5 мкМ 5-НТ. Момент появления 5-НТ в растворе обозначен стрелкой. Толстые А-линии - нейрон находится вблизи А-кластера. Каждая точка графика - средняя частота спайков на интервале 30 секунд.

2. Медиаторная обстановка вблизи буккальных ганглиев.

Опыты показали, что медиаторный фон имеется у многих ганглиев моллюска (у педальных, церебральных, париетальных, буккальных и висцерального ганглиев). Мембранный потенциал биосенсора при подведении его к поверхности выбранного ганглия обратимо сдвигался до нескольких мВ. При повторных подведениях того же биосенсора к той же точке характер ответа не менялся. Знак ответа при тестировании примерно одной и той же области в разных опытах мог быть разным даже при использовании в качестве биосенсора одноименных нейронов. В большинстве экспериментов было видно, что у поверхности ЦНС присутствуют нейроактивные факторы в концентрации, способной оказать значимое влияние на мембранный потенциал изолированного нейрона. Для дальнейших исследований были выбраны буккальные ганглии, которые ответственны за формирование пищевого паттерна.

2.1. Работа генератора пищевого ритма. Основная задача нейронов этих ганглиев - задание ритмических движений мышц буккальной массы, организация циклических движений скребущего ротового аппарата. Стандартный моторный цикл, с периодом порядка 10 сек, состоящий из трех фаз, обеспечивается поочередной активностью нейронов центрального генератора. В ходе многочасовых экспериментов на препаратах изолированной ЦНС прудовика отслеживали изменения состава среды вблизи буккальных ганглиев, отражающие изменения в характере генерации фиктивного моторного ритма.

Использовали биосенсоры, представляющие собой изолированные буккальные нейроны В4 или В4С1 (это идентифицированные нейроны 4-го кластера буккальных ганглиев). Эти нейроны - моторные нейроны третьей фазы. В поведении моллюска эта фаза соответствует заглатыванию пищи.

Биосенсоры выделяли из ЦНС другого животного и располагали вблизи выбранного участка поверхности одного из буккальных ганглиев. Одновременно отслеживали работу буккального генератора, регистрируя in situ электрическую активность нейрона В4, входящего в состав тестируемого ганглия.

Примеры электрофизиологических данных, полученных в такой схеме, даны на рис. 6, 7, 8, 9. На рис. 6 видно, как запуск генерации внутри буккального ганглия, отслеживаемый по нейрону В4 in situ, приводит к изменению активности биосенсоров. В активности нейрона in situ, помимо собственно моторного ритма периодом около 7-10 сек, нами зарегистрированы медленные ритмы с периодами порядка 50 сек (см. рис. 7 и 9) и 500 сек (см. рис. 9). Эксперименты показали, что электрическая активность биосенсора коррелирует с активностью нейрона in situ на обоих медленных ритмах. Значимой корреляции с 10 секундным моторным ритмом обнаружить не удалось. Результаты, сходные с показанными на рис. 6, 7, 8 ,9 были получены на 13 биосенсорах в 8 опытах. Достоверность наблюдаемых корреляций

оценивали после обработки максимальных частотных или амплитудных значений активности биосенсоров, сравнивая полученные данные с усредненной ритмической активностью нейронов в ганглии (см. методы). Наличие корреляции оценивали отдельно в каждом опыте, используя для анализа Р-критерий.

В4 в ЦНС

61 и 62

меняются ВШ^

„ Ml

liiili

I I I I И

1MB

увеличения

Рис. 6. Электрическая активность биосенсоров, расположенных вблизи поверхности буккальных ганглиев ЦНС. 61 и 62 - биосенсоры, изолированные В4 нейроны, стрелка указывает перемену мест биосенсоров в пространстве (их механическое перемещение электродами); В4 в ЦНС - нейрон В4 in situ одного из буккальных ганглиев; Рамка увеличения - выделенный фрагмент, данный в развернутом виде на рис. 7.

■■11

В4 в ЦНС

1

1111! »ill

щи

62

ж

Рис. 7. Увеличенный фрагмент электрической активности нейронов, приведенной на рис. 6, обозначения см. там же.

61 и 62 меняются

61 mcvmmn ______

М в ЦНС

II..... »111

увеличения

Рис. 8. Электрическая активность биосенсоров, расположенных вблизи поверхности буквальных ганглиев ЦНС. 61 - биосенсор, изолированный В4С1 нейрон, 62 - биосенсор, изолированный В4 нейрон, стрелка указывает перемену мест биосенсоров в пространстве (их механическое перемещение электродами); В4 в ЦНС - нейрон В4 in situ одного из буккальных ганглиев;

Рамка увеличения - выделенный фрагмент, данный в развернутом виде на рис. 9.

61

| 5мВ

f in CNS

mum

Рис. 9. Увеличенный фрагмент электрической активности нейронов, приведенной на рис. 8, обозначения см. там же.

2.2. Активация церебральных гигантских клеток (CGC), управляющих генератором пищевого ритма. Генератор пищевого цикла, описанный выше, управляется несколькими нейронами. Эти нейроны, непосредственно влияющие на параметры пищевой генерации, группируются в церебральных ганглиях и дают проекции в церебро-буккальные коннективы. В частности, пара CGC управляет генератором, воздействуя на свойства как интернейронов, так и мотонейронов генератора. Эта пара нейронов имеет электрическую связь в комиссуре, которая соединяет буккальные ганглии.

Для исследования работы CGC с помощью биосенсоров использовали препарат с частично изолированными ганглиями. Оставили только пару церебральных и пару буккальных ганглиев, сохранили связывающие их коннективы (т.е. сохранили паттернобразующие нейроны и управление ими со стороны CGC). В качестве биосенсоров использовали изолированные нейроны А-кластера предварительно отрезанных педальных ганглиев той же ЦНС. В опытах, проведенных по этой схеме (п=6), меняли только количество и места расположения биосенсоров у поверхности буккальных ганглиев. Во всех опытах наблюдали сходные результаты, пример см. на рис. 10. В этом опыте CGC, изначально гиперполяризованные, деполяризовали до различного уровня как совместно, так и раздельно. Видно, что усиление степени деполяризации приводит к усилению активности биосенсоров, что отражает усиление выброса медиаторного агента из буккальных ганглиев.

inccc aï "'V^V ЛСБС ff nCGC н

Г ; -1.5 ЯА Г"" •+Г9 я jT -H). 9 н J (_ -0.9 вА J i -1.5 вА

L -0.9 HA

_n_f\

_m_m

|50мВ

Рис. 10. Электрическая активность биосенсоров, расположенных вблизи поверхности буккальных ганглиев ЦНС, при деполяризации управляющих пищевым ритмом нейронов (CGC).

JICGC и nCGC - мембранные потенциалы левой и правой CGC соответственно;

'леве и Incœ - токи, подаваемые в левую и правую CGC соответственно. Значения

подаваемых токов указаны над соответствующими пунктирными линиями;

61,62 и 63 - биосенсоры, расположенные у буккальных ганглиев.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Экстраклеточная секреция в педальных ганглиях моллюска. Как

известно из более ранних исследований, при усилении локомоторной активности, что моделируется инъекцией в полость тела моллюска 5-НТР, активируются серотонинергические нейроны А-кластера. Известно, что активируется вся цепь синтеза, что приводит к видимому многократному приросту содержания 5-НТ в телах нейронов А-кластера, а сами эти нейроны деполяризуются под действием 5-НТ. Основное действие этих нейронов -выделение медиатора в подошве ноги улитки, активация и модуляция эффекторов локомоции, в случаях, когда прудовик нуждается в более эффективном передвижении по субстрату.

Согласно результатам нашей работы, совместная секреция нейронов А-кластера поддерживает у его поверхности концентрацию 5-НТ на уровне 10"8-10"7М. Этого достаточно для вовлечения серотонинергических нейронов в процесс самоусиливающегося возбуждения и для эффективного серотонинергического контроля других нейронов, расположенных на этом участке клеточной коры педальных ганглиев, даже без учета того, что концентрация в межсоматическом пространстве ганглиев, безусловно, выше той, которая фиксировалась вблизи их поверхности.

Из анализа медиаторной обстановки вблизи медиальной области педальных ганглиев ЦНС улитки можно заключить, что там присутствуют несколько нейроактивных факторов, один из которых 5-НТ.

Расширение спайка экзогенно данным хинином помогло выявить присутствие нейроактивного агента с менее сильным, при сравнении с 5-НТ, эффектом воздействия на данный тип клеток. Можно полагать, что этот выявленный, сужающий спайки, агент выполняет, сходную с 5-НТ, функцию воздействия на группу нейронов одновременно. Вместе с тем, источник этого агента неизвестен, а действие его на нейроны А-кластера in situ маскируются 5-НТ-ом. Таким образом, в настоящее время сложно делать какие-либо заключения о его функции. То же самое можно сказать и о выявленном гиперполяризующем факторе, добавив, что на временные ограничения его действия в реализуемых им функциональных процессах указывает «привыкание» нейронов А-кластера к этому веществу.

2. Медиаторная обстановка в буккальных ганглиях моллюска. В

представленных опытах биосенсор регистрирует медиаторные изменения у буккальных ганглиев во время работы генератора пищевой моторики. Это указывает на возможное участие медиаторов, работающих по механизму экстраклеточной секреции, не только в медленном процессе стабилизации поведенческих программ, примером которого служит работа 5-НТ в педальных ганглиях.

Об эргичности нейронов, составляющих буккальный генератор Большого прудовика, известно немного. С уверенностью можно сказать только

о том, что в нем работают нейроны разной эргичности и что нейроны одной эргичности включены в состав одной и той же фазы (ацетилхолин - для первой фазы, глутамат - для второй). Это наводит на мысль, что одна и та же зргичность нейронов может быть не только признаком их принадлежности одной фазе, но и иметь функциональный смысл.

Вместе с тем, генерация в буккальных ганглиях имеет сложный характер и состоит из многих мод, которые на порядок отличны друг от друга по частоте. Биосенсоры в наших опытах регистрируют более медленные моды паттерна, которые по отношению к основному пищевому паттерну по характеристикам частоты являются модулирующими. Следовательно, наблюдаемые феномены нельзя просто привязать к фазам «стандартного» ритма. Наблюдаемая генерация, имеющая период около 50 сек, может представлять собой заторможенный «стандартный» пищевой паттерн, имеющий период у интактного животного около 10 сек. Такое увеличение периода может определяться состоянием генератора. Периодичный 500-секундный сигнал может являться составным, т.к. источник 50-секундного сигнала может выбрасывать медиатор и за краями своего периода. Кроме того, диффузионное рассеяние также будет вносить вклад в сглаживание колебаний концентраций медиатора, как в начале, так и в конце пачки. Несмотря на то, что наблюдаются периодические, значимые по амплитуде флуктуации нейроактивного вещества (или веществ) во всем объеме ганглия, функция этих процессов подлежит уточнению.

Гомологи нейронов, называемые CGC, присутствуют, практически во всех хорошо изученных ЦНС гастропод. У Большого прудовика известны как множество мишеней этих церебральных клеток в буккальных ганглиях, так и множественные эффекты 5-НТ на свойства мишеней. 5-НТ меняет систему в сторону большей генерации, облегчается межфазовое взаимодействие, клетки, связанные со «стандартным» пищевым паттерном, деполяризуются, становятся более активны.

Традиционно считается, что CGC управляет нейронным ансамблем буккальных ганглиев через синаптические связи с каждым нейроном. На сегодня известно множество нейронов буккального ганглия, которые имеют рецепцию к 5-НТ. В рамках традиционной схемы адресного действия и т.к. CGC является основным источником 5-НТ в буккальных ганглиях и именно через эти нейроны осуществляется основная модуляция буккальной генерации, предполагается, что все буккальные 5-НТ чувствительные нейроны являются мишенями CGC. Коммуникация же CGC с ее мишенями происходит в переплетениях нейропиля.

Для проверки адекватности изложенной схемы работы CGC, были поставлены эксперименты, в которых регистрировали фон медиатора у поверхности буккальных ганглиев при деполяризации CGC. В этих условиях был обнаружен выброс нейроактивного агента. Сам по себе этот факт говорит о том, что CGC может не только воздействовать на активность и свойства

определенных клеток, но и задавать состояние всей системы буккальных ганглиев, задавая некоторый средний фон медиатора в ганглиях. Именно на этом может быть основан механизм плавной регулировки паттерна, в случаях, когда 5-НТ-фон плавно меняет характеристики частоты основного генератора посредством воздействия на свойства мембран клеток (на пейсмекерные свойства, ребаунд и т.п.). Несколько опытов с биосенсорами, в качестве которых выступали изолированные В2 нейроны, показали, что ситуация неоднозначна. В2 нейроны отвечают на 5-НТ гиперполяризацией. В наших же экспериментах при стимуляции CGC такие биосенсоры деполяризовались, подобно нейронам-биосенсорам из А-кластера. Т.е. или медиатор, выбрасываемый у буккальных ганглиев при стимуляции CGC, не является 5-НТ-ом, или это смесь 5-НТ и др. агента (агентов), которые в смеси действуют на В2 так, что деполяризуют ее. Вопрос о природе этого (этих) отличного от 5-НТ агента остается открытым.

ВЫВОДЫ

1) Разработана методика с использованием биосенсора для регистрации нейроактивных веществ, вытекающих из ганглиев ЦНС моллюска. Это позволило наблюдать в реальном времени процессы экстрасинаптической секреции в фиктивно работающей ЦНС.

2) Зарегистрировано присутствие нескольких нейроактивных агентов, действующих по механизму безадресного межнейронального взаимодействия (по типу volume transmission), в работе простой ЦНС моллюска Lymnaea stagnalis. Обнаружено их непосредственное действие на нейроны в двух функционально различных нейронных ансамблях.

3) Описан механизм работы одного из идентифицированных нейроактивных агентов - серотонина, участвующего в экстрасинаптическом взаимодействии. Исследована роль этого медиатора в функциональной системе, обеспечивающей усиление локомоторной активности моллюска.

4) Выявлены нейроактивные вещества, участвующие в работе нейронной сети, которая генерирует программы пищевого поведения моллюска. Полученные результаты, касающиеся медиаторных изменений в межклеточном пространстве ганглиев, не укладываются в классические описания работы нейронных сетей в рамках синаптической парадигмы.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ:

96-04-49181-а, 99-04-48411-а, 02-04-48091-а, 05-04-49812-а, 08-04-00120-а, 11-04-00674-а.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Активация серотонинергических нейронов метаболическим предшественником серотонина: увеличение частоты и длительности потенциалов действия. // Доклады РАН. 1998. Т. 362(4). С.561-563.

2. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Активация серотонинергических нейронов метаболическим предшественником серотонина: эффект ингибитора триптофандекарбоксилазы. //Доклады РАН. 2000. Т. 372(1). С. 129-131.

3. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Несинаптическая интеграция клеточных тел нейронов в ЦНС улитки. П Росс, физиол. журн. 2001. Т. 87(11). С. 15401547.

4. Чистопольский И.А. Взаимодействия нейронов на уровне клеточных тел в ЦНС улитки: Гетерогенность нейроактивной среды. Росс, физиол. журн. 2004. Т. 90(3). С. 345-350.

5. Чистопольский И.А. Использование изолированного нейрона для мониторинга нейроактивных факторов среды, окружающей генератор моторного поведения. // Онтогенез. 2005. Т. 36(3). С. 240.

6. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Изолированный нейрон как биосенсор, реагирующий на высвобождение нейроактивных веществ. // Рос. физиол. журн.

2007. Т. 93(10). С. 1210-1213. Другие издания:

1. Chistopolsky I.A., Vorontsov D.D., Sakharov D.A. Monitoring of neuroactive factors released from a pattern-generating network. // Acta Biologica Hungarica.

2008. V. 59. P. 29-31.

8. Dyakonova V.E., Chistopolsky I.A., Dyakonova T.L., Vorontsov D.D., Sakharov D.A. Direct and decarboxylation-dependent effects of neurotransmitter precursors on firing of isolated monoaminergic neurons. // J. Сотр. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 2009. V. 195(6). P. 515-527.

9. Чистопольский И.А., Сахаров Д.А. Мониторинг volume transmission мультирецепторным биосенсором, в сб.: Актуальные вопросы нейробиологии, нейроинформатики и когнитивных исследований. 2010; М., НИЯУ МИФИ. С. 91-100.

Формат 60x90/16. Заказ 1499. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чистопольский, Илья Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Научная новизна.

1.4. Положения, выносимые на защиту.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭКСТРАСИНАПТИЧЕСКАЯ ПЕРЕДАЧА В ПРОСТЫХ НЕРВНЫХ СИСТЕМАХ.

2.1. Современные представления об экстрасинаптической передаче (УТ).

2.1.1. Модели.

2.1.2. Характеристика УТ и сравнение ее с \УТ.

2.2. Медиаторные системы простых нервных сетей.

2.2.1. Малые молекулы.

2.2.2. Макромолекулы (полипептиды).

2.2.3. Классические медиаторы.

2.3. Методы исследования экстрасинаптической секреции медиаторов в простых нервных системах.

2.3.1. Соматическая секреция.

2.3.2. Прямые способы обнаружения соматического выброса.

2.3.3. Регистрация соматического выброса.

2.4. Предваряющие исследование замечания.

3. МЕТОДЫ.

3.1. Биосенсор.

3.2. «Полуизолированные» нейроны А-кластера.

3.3. Тестируемые ганглии ЦНС.

3.4. Условия экспериментов, обработка полученных данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Медиаторная обстановка вблизи серотонинергических нейронов А-кластера педальных ганглиев.

4.1.1. Предварительное исследование механизма действия 5-НТР на нейроны А-кластера педальных ганглиев.

4.1.2. 5-НТ в межклеточном пространстве педальных ганглиев.

4.1.2.1. Изменение активности изолированного нейрона вблизи ЦНС и 5-НТ капилляра.

4.1.2.2. Косвенная идентификация медиаторных молекул педальных ганглиев.

4.1.3. Медиаторный «бульон» педальных ганглиев.

4.1.3.1. Неизвестной деполяризующий (сужающий) химический фактор.

4.1.3.2. Неизвестный гиперполяризующий тормозящий) химический фактор.

4.2. Медиаторная обстановка вблизи буккальных ганглиев.

4.2.1. Исследование медиаторной обстановки в буккальных ганглиях во время работы генератора пищевого ритма.

4.2.2. Исследование медиагорной обстановки в букальных ганглиях при активации CGC, нейронов, управляющих генератором пищевого ритма.

4.3. Итоги проделанных экспериментов.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Механизмы VT типа в педальных ганглиях моллюска.

5.1.1. Роль 5-НТ.

5.1.2. Медиаторы межклеточного пространства педального ганглия.

5.2. Медиаторная обстановка в буккальных ганглиях моллюска.

5.2.1. Функция медиаторных колебаний в буккальных ганглиях.

5.2.2. Амплитуда медиаторных колебаний в буккальных ганглиях.

5.2.3. CGC - классическая модель управления нейронным ансамблем?.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экстрасинаптическая секреция нейротрансмиттеров: исследование с помощью изолированного нейрона как биологического сенсора"

1.1. Актуальность проблемы.

В конце 19 столетия исследования клеточной структуры нервной ткани позволили ставить вопросы о природе механизмов нервных систем. Предположения об основных принципах организации нервной системы животных опирались уже в большей степени на опыт, чем на умозрительные доводы, как было до этого. Первоначальные разумные представления о том, что нервная ткань это непрерывная среда, которая приспособлена для передачи возбуждения по проводящим волокнам, постепенно замещались представлениями о том, что нервная сеть устроена по типу связанных между собой, но отдельных, относительно независимых элементов. Тон в исследованиях задавали методические подходы нейроанатомов. Методы окрашивания отдельных нейронов позволили выдвинуть несколько гипотез об их способах связи внутри нервной системы. Делались попытки обобщить принципы нервного возбуждения и торможения на работу всей нервной системы животного, при этом исследования проводились, в основном, на протяженных нервах, связывающих ЦНС (центральная нервная система) и мышцы-эффекторы.

Наиболее ранняя, обоснованная анатомическими данными трактовка передачи сигналов внутри ЦНС связана с именем К. Гольджи [22]. Его представление о передаче возбуждения от одного нейрона другому предполагало потерю индивидуальных свойств нейронов и ставило во главу угла пространство «диффузной сети». Гольджи разумно полагал, что любая адресная передача электрического сигнала с одной клетки на другую необходимо столкнется с шунтированием низкоомным внешним раствором. Его трактовка работы такой диффузной сети, приводила необходимо к выводу о том. что окончания нейронов, создающих такую сеть, не имеют упорядоченной структуры и образуют нечто сходное с тем, что мы теперь называем синцитием. Возбуждение распространяется в такой ткани безадресно, т.е. на все нейриты, расположенные вблизи источника таких сигналов. Из всего этого также следовало, что вклад одного нейрона в реализацию функции всей ЦНС будет ничтожным. Сеть нейронов представлялась Гольджи как состоящая из нескольких пластов, каждый из которых содержит или тела (сомы) нейронов или же их нейриты. Такая модель хорошо согласовывалась с его анатомическими представлениями о нервной системе.

С представлением о диффузной сети конкурировало представление о нервной системе как о цепочках связанных друг с другом нейронов. Сформулировал его испанский 4 исследователь начала 20 века Р. Кахаль [22],[23]. В его трактовке нейриты нейрона передают сигналы не всем прилегающим к ним нейритам других нейронов, а только тем из них, с которыми существует непосредственный контакт. Зоны непосредственных контактов между нейритами носят анатомически специфический характер, а передача возбуждения с нейрона на нейрон вне зон этих контактов невозможна. Эти зоны были названы синапсами. Такая модель организации нервной сети наделяла важной ролью каждый элемент нейронной цепи. Каждое звено нервной цепи необходимо вносило вклад в результирующую активность ее выхода, а выход из строя элементов цепи приводил к нарушению ее работы.

Развитие нейронаук в середине 20 столетия привело к открытию химической передачи между нейронами [1]. Участие медиаторов сняло кажущееся противоречие между электрической природой передачи нервных сигналов и неприспособленностью внеклеточной среды к их проведению. Это также привело к обновлению парадигм, господствующих в нейронауках. Главной стала модель, которая объединила принцип адресной передачи возбуждения с нейрона на нейрон через синапсы с принципом, постулирующим химическую природу такой передачи. Стала понятно, что роль нейрона не сводится просто к роли переносчика возбуждения в рефлекторной цепи и что нельзя пренебрегать свойствами отдельного нейрона при анализе активности цепи.

В 70-х годах роль диффузной химической передачи в работе всех нейронных цепей была признана бесспорной. В основном, ей отводилось место посредника, необходимого для замыкания цепи электрического сигнала в синаптической щели при переходе с одного нейрона на другой. Описанные выше элементы организации нейронной сети являются базой всех современных представлений о ее работе [2].

Сегодня известны два эффективных способа передачи электрического возбуждения от клетки к клетке, опосредованный и прямой:

- посредством выделения одной из них химического агента, медиатора, с улавливанием такого сигнала другой клеткой,

- посредством контакта между цитоплазмами клеток, годного для распространения электротонического сигнала.

Основным же механизмом взаимодействия нейронов в подавляющем большинстве известных на сегодня нервных систем является принцип химической передачи.

С середины 20 века копилась информация о природе химических агентов, участвующих в передаче, о рецепции этих агентов, об анатомических свойствах синапса, о структуре и различной организации отдельных нервных узлов у разных видов животных.

Наряду с этим, основные принципы работы передачи сигнала от одного нейрона к другому, сформулированные в середине 20 века, оставались без изменений. Наличие химического агента в зоне синаптического контакта, дополнялось очевидным принципом независимости работы каждого отдельно взятого синапса от работы соседних синапсов, а так же предположением того, что химический агент действует непосредственно в зоне синапса, и любой выход его из анатомической зоны этого синапса не имеет функционального значения.

Вместе с тем, вслед за первыми медиаторами (ацетилхолином и адреналином) обнаруживались все новые вещества, претендующие на роль химических агентов в передаче сигналов от нейрона к нейрону. Представления о филогении нервной системы животных позволили систематизировать ход развития нейронов той или иной эргичности. Обобщения, сделанные на этом материале, способствовали выдвижению обоснованной гипотезы о различном происхождении нейронов разной эргичности. Согласно Х.С.Коштоянцу, можно было говорить о появлении медиаторного многообразия нервной системы каждого животного как о наследуемом свойстве в процессе эволюции []].

Кроме того, сдвигу представлений о роли химических агентов в работе мозга способствовал кардинальный прорыв в методах лечения людей с психическим нарушениями [2],[9]. Для лечения использовали нейроактивные вещества, нейролептики, которые приводили к долговременным положительным изменениям при лечении психически больных людей. Этот прогресс в лечении вызвал появление различных гипотез о механизме действия этих веществ. Это, в свою очередь, стимулировано работы по исследованию фона нейроактивных веществ в тканях мозга и применение в данной области исследований таких методов, как жидкостная хромотография. для выявления нейроактивных агентов и продуктов их распада. Была выявлена зависимость работы нейронов мозга от средних уровней нейроактивных веществ в определенных структурах мозга, влияние этих уровней на психические расстройства. Так для шизофрении, оказалось критичным значение средней концентрации дофамина в некоторых отделах мозга. В настоящем, подавление синтеза этого медиатора посредством воздействия на рецепторы, активность моноаминооксидаз и систему обратного захвата является основной целью медикаментозного лечения.

Вместе с тем, само наличие медиаторного многообразия в нервной системе животного не предполагало непосредственной связи этого многообразия с теми принципами функционирования нервной системы, которые входили в господствующую парадигму. Другими словами, такое многообразие выглядело как некоторое случайное стечение обстоятельств в эволюционном процессе зарождения и развития нервной системы животных. Ведь полагая, что функция диффузной передачи сводится к переносу возбуждения с нейрона на нейрон в синаптической щели, мы необходимо приходим к выводу, что природа химического агента, участвующего в этой передаче не важна. Т.е. для работы нервной системы не требуется множественность трансмиттеров. В предельном случае, достаточно одного химического агента для того, чтобы нервная система «правильно» работала. Т.е., предполагая независимость работы синапсов и предполагая, что химический агент действует только в локальных зонах этих синапсов, мы приходим к выводу, что наличие хотя бы одного химического посредника, в принципе, достаточно для реализации всех функций такой нервной системы. Возвращаясь непосредственно к факту наличия в реальных нервных системах животных множества трансмиттеров, мы не можем заключить каких-либо прямых следствий о его важности для функций этих нервных систем. Вместе с тем, большой спектр различных медиаторов, практически, у каждого отдельного вида современных животных, наводил на мысль, что дифференцировка эргичности все же связана с собственно основами работы реальных нервных систем животных.

В попытке логически разрешить это «противоречие» между разнообразием эргичности нейронов и представлением о достаточности одного химического посредника для работы нервной системы, Д.А. Сахаровым были высказаны соображения о том. каким образом это разнообразие участвует в работе нервной сети [14],[15]. Эта гипотеза опиралась также на представление о филогенезе нейронов из клеток примитивных древних животных, функция которых была сходной с функцией железистых клеток современных животных. Т.е. предполагалось, что были «предшественники» нейронов, выделяющие вещества, еще не имеющие медиаторных функций в современном представлении. В дальнейшем, в ходе эволюции нервной системы, «предшественники» нейронов специализировались, и выбрасываемые ими вещества приобрели функции медиаторности.

Множественность химических посредников диффузной передачи в рассматриваемой гипотезе трактовалась как процесс, необходимый для функционирования нервной сети. Кодирование передающих сигналов в такой сети осуществляется не связями нейронов между собой, не «адресностью» синаптических соединений, а наличием рецепторного поля к тому или иному химическому агенту, выделяемому нейроном-передатчиком (т.е. пресинаптическим нейроном, в старой парадигме). Такое рецепторное поле позволяет отреагировать нейрону-приемнику (постсинаптическому нейрону, в старой парадигме) на выделившийся медиатор и замкнуть цепь переноса возбуждения с нейрона на нейрон. Вместе с тем, такая передача уже не требует обязательной локализации всего процесса внутри синапса, т.к. адресация передачи производится не локализацией места передачи, а чувствительностью к медиатору мембран нейронов, расположенных в зоне медиаторного выброса. В такой схеме действие нескольких химических агентов происходит независимо, и дифференцировка мишеней к выделившимся медиаторам в том или ином объеме гкани происходит за счет различия в типе химического агента, а не за счет локализации места действия этого агента. Кроме того, в случае реализации такой схемы взаимодействия нейронов, обозначение их как «пресинаптические» и «постсинаптические» имеет ограниченный смысл. Локальная синаптическая связь становится предельным случаем диффузной передачи, реализуемой тогда, когда объем химического действия медиатора ограничен синапсом, т.е. объемом ткани, имеющим размер порядка этой структуры. «Постсинаптическими» нейронами в случае не ограниченной объемом синапса диффузной передачи, будут все нейроны, имеющие рецепторы и расположенные в зоне действия выделившегося из «пресинаптического» нейрона медиатора.

Отметим, что, в общем случае, способы организации нервных систем рознятся у разных видов животных в силу исторических (филогенетических) причин, а так же зависят от сложности структуры конкретной нервной системы. Вместе с тем. объем накопленной информации о работе и структуре нервных сетей показывает, что, на уровне общих принципов, наблюдается сходство, как у близкородственных видов, так и у далеко отстоящих филогенетически. Более того, представители различных типов животного царства на уровне нейрона имеют сходство организации способов выброса и рецепции медиатора, сходство в организации распространения возбуждения по мембране, сходство организации передачи межнейрональных сигналов. Также наличествует сходство организации и на уровне нейрональных групп. Так, например, генерация моторного поведения в настоящее время изучена на многих филогенетически далеко отстоящих друг от друга видов. Нейроны генераторов проявляют огромное разнообразие свойств [3],[20],[41]. Кроме того, широк спектр способов организации элементарных генераторов. Сама же генерация, как принцип организации периодической активности, неизменно присутствует у животных, имеющих необходимость реализации моторных программ. Т.е. специализированные нейроны, выполняющие функции порождения моторных ритмов, представлены у всех видов животных, у которых можно говорить о сформировавшейся нервной системе. Разнообразие же генераторов, представленных у видов, принадлежащих одному типу животных, не меньше, чем разнообразие, видимое при сравнении генераторов представителей разных типов животных.

Таким образом, можно ожидать, что поиск принципов организации нейронной сети будет продуктивен при исследовании самых разных выбранных для этой цели животных. Критерии же выбора должны быть связаны более с удобством модели и её пригодностью для целей исследования, а не с попыткой найти какого-либо исключительного представителя животного царства, имеющего ярко выраженные эксклюзивные особенности работы нервной сети.

Описанные выше особенности работы нервных сетей в литературе были выделены относительно недавно, но уже имеют установившиеся обозначения [22],[23],[73],[82]. Так, представление, делающее упор на синаптическую адресацию (сходно с тем, как адресация осуществляется в телефонии), получило название wiring transmission (WT). Представление, акцентирующееся на адресации с помощью типа химического агента и на том, что медиатор выделяется в некоторый объем, где чувствительность, а не точность связи нейрона-приемника определяет адрес передачи, получило название экстрасинаптической секреции или, что аналогично, «объемной передачи», volume transmission (VT). Дифференцировка этих представлений при исследовании работы конкретных нервных систем требовала новых экспериментальных подходов.

С середины 20-го столетия стали активно вестись работы на некоторых видах моллюсков с аномально крупными сомами нейронов[14]. Это позволило накопить детальную информацию по нейрональной активности ЦНС этих моллюсков, позволило получить описание работы конкретных нейронов и их групп у простых нервных систем. В настоящее время ЦНС такого моллюска - один из самых удачных модельных объектов для исследования элементарных механизмов межнейронального взаимодействия. Этот модельный объект удобен и для подробного изучения того, как WT и VT реализуются на уровне малых нейрональных групп.

В рамках нашей работы мы сосредоточились на выявлении механизмов VT в простой нервной системе улитки. Первые серии опытов позволили найти наиболее удобные методы для решения поставленных задач, выявить особенности используемых экспериментальных схем. В дальнейшем, мы воспользовались полученными в этих первичных экспериментах навыками для выявления элементов работы VT в объектах нашего исследования.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Чистопольский, Илья Александрович

7. ВЫВОДЫ.

1) Разработана методика с использованием биосенсора для регистрации нейроактивных веществ, вытекающих из ганглиев ЦНС моллюска. Это позволило наблюдать в реальном времени процессы экстрасинаптической секреции в фиктивно работающей ЦНС.

2) Зарегистрировано присутствие нескольких нейроактивных агентов, действующих по механизму безадресного межнейронального взаимодействия (по типу volume transmission), в работе простой ЦНС моллюска Lymnaea stagnalis. Обнаружено их непосредственное действие на нейроны в двух функционально различных нейронных ансамблях.

3) Описан механизм работы одного из идентифицированных нейроактивных агентов -серотонина, участвующего в экстрасинаптическом взаимодействии. Исследована роль этого медиатора в функциональной системе, обеспечивающей усиление локомоторной активности моллюска.

4) Выявлены нейроактивные вещества, участвующие в работе нейронной сети, которая генерирует программы пищевого поведения моллюска. Полученные результаты, касающиеся медиаторных изменений в межклеточном пространстве ганглиев, не укладываются в классические описания работы нейронных сетей в рамках синаптической парадигмы.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проделанной работы была исследована работа некоторых экстросинаптических взаимодействий в ЦНС Большого прудовка. Исследовались, в основном, два функционально различных нейронных ансамбля Большого прудовка. Оригинальная методика позволила обнаружить в этих ансамблях элементы взаимодействий VT типа. Мы выявили участие во взаимодействиях VT типа как ожидаемого нейроактивного вещества (5-НТ), так и других веществ, имеющих не ясную природу и функции.

Мы выявили подробности участие 5-НТ в активации локомоторной системы улитки и обнаружили, что нейроны А-кластера педальных ганглиев используют экстрасинаптическое взаимодействие для организации положительной обратной связи на уровне сом группы клеток.

Работа строилась вокруг исследования веществ, которые не требовали специфических условий для их регистрации. Из этого можно заключить, что регистрируемые эффекты не требуют каких-либо специфических состояний системы. Возможно, в реальной работе простой ЦНС, механизмы, использующие возможности неадресного взаимодействия УТ типа, не являются редкостью. Это подкрепляют данные регистрации сильных медиаторных изменений в буккальной системе большого прудовика, полученные при генерации основного пищевого паттерна. Регистрация этих изменений в реальном времени позволила увидеть корреляцию химических изменений в межнейрональном пространстве ганглия и электрической активности нейронов этого ганглия.

Видимо, только ясное понимание функции выявленных нейроактивных веществ может помочь в оценке значимости зарегистрированных эффектов. Наши данные позволяют говорить о функциональной значимости УТ только для 5-НТ и только для модели А-кластера педальных ганглиев. Во всех остальных случаях, в настоящий момент можно говорить пока только о регистрации множества нейроактивных веществ, которые показывают свойства медиаторов УТ типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чистопольский, Илья Александрович, Москва

1. Артемов Н.М., Сахаров ДА. Хачатур Седракович Коштоянц. 1986. М. Наука. 224 с.

2. Ашмарин И.П., Стукалов П.В. Нейрохимия. 1996. М. Институт биомедицинской химии РАМН. 470 с.

3. Баев К.В. Нейробиология локомоции. 1991. М. Наука. 180 с.

4. Балабан П.М., Захаров И.С. Обучение и развитие (общая основа двух явлений). 1992. М. Наука. 38 с.

5. Боровягин B.JI., Сахаров Д.А. Ультраструктура гигантских нейронов тритонии. Атлас. 1968. М. Наука. 32 с.

6. Данилов А.Ф. Постсинаптические миорелаксанты 1994. С.-П. Наука. 160 с.

7. Дьяконова Т.Л. Два типа нейронов, различающиеся по пластическим свойствам: изучение ионных механизмов. //ЖВНД. 1985; т. 35(3). с. 552-560.

8. Каботянский Е.А., Сахаров Д.А. Нейрональные корреляты серотонин-зависимого поведения крылоногого моллюска клиона. // ЖВНД. 1990. Т. 40, № 4. с. 739-753.

9. Каркищенко H.H. Психоунитрапизм лекарственных средств. 1993. М. Медицина. 208 с.

10. Маломуж А.И., Никольский Е.Е. Неквантовое выделение ацетилхолина внервно мышечном синапсе млекопитающего: зависимость от внеклеточной концентрации ионов магния и кальция.// ДАН, 2010, т.430(2). с. 277-280.

11. Мюллер П., Нойман П., Шторм Р. Таблицы по математической статистике. ¡982. М. Финансы и статистика. 272 с.

12. Никколс Д.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Д. Фукс П.А. От нейрона к мозгу. 2003. М. УРСС. 672 с.

13. Ноздрачев А.Д., поляков Е.Л., Лапицкий В.П., Осипов Б.С., Фомичев Н.И. анатомия беспозвоночных. 1999. С.-П. Центр «Интеграция». 320 с.

14. Сахаров Д.А. Генеалогия нейронов. 1974. М. Наука. 184 с.

15. Сахаров Д.А. Множественность нейротрансмиттеров:функциональное значение. // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1990; т. 26(5). с. 733-740.

16. Сахаров Д.А., Каботянский Е.А. Интеграция поведения крылоногого моллюска дофамином и серотонином. //Журн. общ. биол. 1986; т.47(2). с. 234-245.

17. Сахаров Д.А., Цыганов В.В. Трансмиттерзависимое включение респираторного интернейрона в локомоторный ритм у легочного моллюска Lymnaea. // Росс, физиол. журн. 1998; т. 84(10). с. 1029-1037.

18. Семьянов А.В. ГАМК-эргическое торможение в ЦНС: типы ГАМК-рецепторов и механизмы тонического ГАМК-опосредованного тормозного действия. // Нейрофизиология, 2002; т. 34(1). с. 82-92.

19. Урбах В.Ю. Биометрические методы. 1964. М. Наука. 415 с.

20. Чернавский А.В. Нейронные сети управления движением, в сб.: Итоги науки и техники. Физические и математические модели нейронных сетей. М. ВИНИТИ. 1990. Т.2. с. 30-56.

21. Acosta-Urquidi J., Sahley C.L., Kleinhaus A.L. Serotonin differentially modulates two K+ currents in the Retzius cell of the leech. // J Exp Biol. 1989; v. 145. pp. 403-417.

22. Agnati L.F., Genedani S., Leo G., Rivera A., Guidolin D., Fuxe K. One century of progress in neuroscience founded on Golgi and Cajal's outstanding experimental and theoretical contributions. // Brain res. rev. 2010; v. 55. pp. 167-189.

23. Agnati L.F., Guidolin D., Guescini M., Genedani S., Fuxe K. Understanding wiring and volume transmission. // Brain res. rev. 2010; v. 64, pp. 137-159.

24. Alania M., Sakharov D. A., Elliott C. J. H. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusk Lymnaea stagnalis. // J. Comp. Physiol. A. 2004; v. 190. pp. 379-390.

25. Arshavsky Y.I., Deliagina T.G., Gelfand I.M., Orlovsky G.N., Panchin Y.V., Pavlova G.A., Popova L.B. Non-synaptic interaction between neurons in mollusks. // Comp. Biochem. Physiol. 1988; v. 91C. pp. 199-203.

26. Brown P., Dale N. Spike-independent release of ATP from Xenopus spinal neurons evoked by activation of glutamate receptors. // J. Physiol. 2002; v. 540(3). pp. 851-860.

27. Bruns D., Jahn R. Real-time measurement of transmitter release from single synaptic vesicles. // Nature, 1995; v. 377(7). pp. 62-65.

28. Bruns D., Riedel D., Klingauf J., Jahn R. Quantal release of serotonin. // Neuron, 2000; v. 28(1). pp. 205-220.

29. Bunin M.A., Wightman R.M. Paracrine neurotransmission in the CNS: involvement of 5-HT. // Trends Neurosci. 1999; v. 22(9). pp. 377-382.

30. Chen G., Gutman D.A., Zerby S.E., Ewing A.G. Electrochemical monitoring of bursting exocytotic events from the giant dopamine neuron of Planorbis corneus. // Brain Res. 1996; v. 733(1). pp. 119-124.

31. Crisp K.M., Mesce K.A. To swim or not to swim: regional effects of serotonin, octopamine and amine mixtures in the medicinal leech. // J. Comp. Physiol. A. 2003; v. 189, pp. 461-470.

32. Dawson T.M., Snyder S.H. Gases as biological messengers: nitric oxide and carbon monoxide in the brain. // J. Neurosci. 1994; 14(9). pp. 5147-5159.

33. De-Miguel F.F., Trueta C. Synaptic and extrasynaptic secretion of serotonin. // Cell. Mol. Neurobiol. 2005; v. 25(2). pp. 297-312.

34. Dickinson P.S. Interactions among neural networks for behavior. // Current Opinion in Neurobiology, 1995; v.5. pp. 792-198.

35. Elliott C.J.H., Susswein A.J. Comparative neuroethology of feeding control in mollusks. // J. Exp. Biol. 2002; v. 205. pp. 877-896.

36. Elliott C.J.H., Vehovszky A. Comparative pharmacology of feeding in mollusks. // Acta Biologica Hungarica 2000; v. 51(2-4). pp. 153-163.

37. Elmquist W.F., Sawchuk R.J. Application of microdialysis in pharmacokinetic studies. // Pharm. Res. 1997; v. 14(3). pp. 267-288.

38. Fickbohm D.J., Katz P.S. Paradoxical actions of the serotonin precursor 5-hydroxytryptophan on the activity of identified serotonergic neurons in a simple motor circuit. // J Neurosci. 2000; v. 20(4). pp. 1622-1634.

39. Fickbohm D.J., Spitzer N., Katz P.S. Pharmacological manipulation of serotonin levels in the nervous system of the opisthobranch mollusk Tritonia diomedeci. // Biol. Bull. 2005; v. 209. pp. 67-74.

40. Fingerman M., Nagabhushanam R. Control of the release of crustaccan hormones by neuroregulators. // Comp. Biochem. Physiol. 1992; v. 102C. pp. 343-352.

41. Getting P. Emerging principles governing the operation of neural networks. // Ann. Rec. Neurosci. 1989; v. 12. pp. 185-204.

42. Huang H.P. et al. Long latency of evoked quantal transmitter release from somata of locus coeruleus neurons in rat pontine slices. // PNAS. 2007; v. 104(4). pp. 1401-1406.

43. Huang Y.J., Maruyama Y., Lu K.S., Pereira E., Plonsky I., Baur J.E., Wu D., Roper S.D. Using biosensors to detect the release of serotonin from taste buds during taste stimulation. // Arch. Ital. Biol. 2005; v. 143(2). pp. 87-96.

44. Huang Y.J., Maruyama Y., Lu K.S., Pereira E., Plonsky I., Baur J.E., Wu D., Roper S.D. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter. // The Journal of Neuroscience, 2005; v. 25(4), pp. 843-847.

45. Jing J. et al. Reconfiguration of a feeding network by Aplysia neuropeptide Y. // J. Neurosci. 2007; v. 27(13). pp.3490-3502.

46. Kabotyanski E.A., Milosevic I., Sakharov D.A. Neuronal correlates of 5-hydroxytryptophan-induced sustained swimming in Aplysia fascialci. // Comp. Biochem and Physiol. 1990; v. 95C. pp. 39-44.

47. Laming P.R., et al. Neuronal-glial interactions and behavior. // Neurosci. Biobehav. Rev. 2000; v. 24(3). pp. 295-340.

48. Liu L., Wong TP., Pozza M.F., Lingenhoehl K., Wang Y., Sheng M., Auberson YP, Wang Y.T. Role of NMDA receptor subtypes in governing the direction of hippocampal synaptic plasticity. // Science, 2004; v. 304. pp. 1021-1024.

49. Locan-Mengido I.M., Libertun C., Becu-Villalobos D. Different serotonin receptor types participate in 5-hydroxytryptophan-induced gonadotropins and prolactin release in the female infantile rat. /'/ Neuroendocrinology, 1996; v. 63(5). pp. 415-421.

50. Mackey S., Carew T.J. Locomotion in Aplysia: triggering by serotonin and modulation by bag cell extract. // J. Neurosci. 1983; v. 3. pp.1469-1477.

51. McCrohan C.R., Kyriaides M.A., Tuerley M.D. Initiation and modification of rhythmic buccal motor output in the isolated CNC of Lymnaea stagnalis. // J. Moll. Stud. 1989; v. 55. pp. 183-192.

52. Moroz L.L., Bulloch A.G.M., Lukowiak K., Syed N.I. Putative NO-synthesizing neurons of Lymnaea in vivo and in vitro. // Netherlands J. of Zoology, 1994; 44(3-4). pp. 535-549.

53. Nàssel D.R. Neuropeptide signaling near and far: how localized and timed is the action of neuropeptides in brain circuits? // Invert. Neurosci. 2009; v. 9(2). pp. 57-75.

54. Nusbaum M.P., Blitz D.M. Swensen A.M., Wood D. Marder E. The roles of co-transmission in neural network modulation. // Trends Neurosci. 2001; v. 24(3). pp. 146-154.

55. Palovcik R.A., Basberg B.A., Ram J.L. Behavioral state changes induced in Pleurobranchaea and Aplysia by serotonin // Behav.Neural Biology. 1982; v.35. pp. 383-394.

56. Park J.H., Straub V.A., O'Shea M. Anterograde signaling by nitric oxide: characterization and in vitro reconstitution of an identified nitrergic synapse. // J. Neurosci. 1998; v. 18(14). pp. 5463-5476.

57. Philippides A., Husbands P., O'Shea M. Four-dimensional neuronal signaling by nitric oxide: a computational analysis. // J. Neurosci. 2000; v. 20(3). pp. 1199-1207.

58. Popova L.B., Katz P.S. Serotonin responses of acutely isolated identified neurons from the Tritonia swim CPG. // Soc. Neurosci. Abstr. 1998; v. 24. parti, pp. 358. Abstr. 142.3.

59. Rice M.E., Cragg S.J. Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. // Brain Res Rev. 2008; v. 58(2). pp. 303-313.

60. Rose R.M., Benjamin P.R. Interneuronal control of feeding in the pond snail Lymnaea stagnalis. II. The interneuronal mechanism generating feeding cycles. // J. Exp. Biol. 1981; v. 92. pp. 203-228.

61. Rusakov D.A., Kullmann D.M., Stewart M.G. Hippocampal synapses: do they talk to their neighbours? // Trends Neurosci. 1999; v. 22(9). pp. 382-388.

62. Sadamoto H., Hatakeyama D., Kojima S., Fujito Y., Ito E. Histochemical study on the relation between NO-generatiye neurons and central circuitry for feeding in the pond snail, Lymnaea stagnalis. // Neurosci. Res. 1998; v. 32. pp. 57-63.

63. Sakharov D.A., Milosevic I., Salimova N. Drug-induced locomotor stereotypies in Aplysia. // Comp. Biochem. and Physiol. 1989; v. 93C. pp. 161-166.

64. Schwartz-Bloom R.D., Sah R. Gamma-aminobutyric acid (A) neurotransmission and cerebral ischemia. // J. Neurochem. 2001; v. 77(2). pp. 353-371.

65. Skiebe P. Neuropeptides in the crayfish stomatogastric nervous system. // Microsc. Res Tech. 2003; v. 60(3). pp. 302-312.

66. Staras K., Kemenes V., Benjamin P.R. Pattern-generating role for motoneurons in a rhythmically active neuronal network. // J. Neurosci. 1998; v. 18(10). pp. 3669-3688.

67. Stein W. Modulation of stomatogastric rhythms. // J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 2009; v. 195(11). pp. 989-1009.

68. Straub V.A., Benjamin P.R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. //J. Neurosci. 2001; v. 21(5). pp. 1767-1778.

69. Syed N.I., Harrison D., Winlow W. Locomotion in Lymnaea role of serotonergic motoneurones controlling the pedal cilia. // Symp. Biol. Hung. 1988; v. 36. pp. 387-399.

70. Syed N.I., Winlow W Morphology and electrophysiology of neurons innervating the ciliated locomotor epithelium in Lymnaea stagnalis (L.).// Comp. Biochem. Physiol. 1989; v. 93A. pp. 633-644.

71. Sykovâ E., Nicholson C. Diffusion in Brain Extracellular Space. // Physiol. Rev. 2008; v. 88 pp. 1277-1340.

72. Szatkowski M., Barbour B., Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake. // Nature. 1990; v. 348(6300). pp. 443-446.

73. Takano T., Nedergaard M. The best supporting actors. Nature, 2001; v. 412, pp. 674-676.

74. Trueta C., Mendez B., De-Miguel F. F. Somatic exocytosis of serotonin mediated by L-type calcium channels in cultured leech neurones. // J. Physiol. 2003; v. 547. pp. 405-416.

75. Trueta C., Morales, M.A., Sanchez-Armass S., De-Miguel F.F. Calcium-induced calcium release contributes to somatic secretion of serotonin in leech retzius neurons. //J. Neurobiol. 2004; v. 61. pp. 309-316.

76. Weimann J.M., Skiebe P., Heinzel H.G., Soto C., Kopell N., Jorge-Rivera J.C., Marder E. Modulation of oscillator interactions in the crab stomatogastric ganglion by crustacean cardioactive peptide. //J. Neurosci. 1997; v. 17(5). pp. 1748-1760.

77. West A.R., Galloway M.P., Grace A.A. Regulation of striatal dopamine neurotransmission by nitric oxide: effector pathways and signaling mechanisms. // Synapse, 2002; v. 44(4). pp. 227245.

78. Zhou Z., Misler S. Action potential-induced quantal secretion of catecholamines from rat adrenal chromaffin cells. // J. Biol. Chem. 1995; v. 270(8). pp. 3498-3505.

79. Zoli M., Jansson A., Sykova E., Agnati L., Fuxe K. Volume transmission in the CNS and its relevance for neuropsychopharmacology. //Trends Pharmacol. Sci. 1999; v. 20. pp. 142-150.