Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие эмбриональных нейротрансплантатов с высоким содержанием дофаминергических нейронов в мозге взрослого реципиента

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Развитие эмбриональных нейротрансплантатов с высоким содержанием дофаминергических нейронов в мозге взрослого реципиента"

РГБ ОД

г г 1 '.г '

_ (\Г,.....

1 л 4' • ! : РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591.461.1:612.82

ФЕТИСОВ Сергей Олегович

РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ НЕЙРОТРАНС1ШАНТАТОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В МОЗГЕ ВЗРОСЛОГО РЕЦИПИЕНТА

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

М.В. Угрюмой

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук

M.А. Александрова

доктор биологических наук C.B. Владимиров

Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия им. G.M. Кирова.

Зашита состоится " _1995 г. в часов на

заседании специализированного совета Д002.85.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 117808 Москва, ул. Вавилова, 26, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, 26).

мё,

Автореферат разослан " 'О 199j'г.

Ученый секретарь

специализированного совета: кандидат биологических наук

Е.М. Протопопова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность темы Одним иэ достижений нейробиологии в последние годы является широкое внедрение нового подхода в исследования развития нервной системы - нейротрансплантации. Разработка этого подхода оказалась важной не только для фундаментальных исследований, но также позволила внедрить его в практическую медицину (Bjorklund А.. 1991). Действительно, пересадка различных отделов развивающегося мозга в мозг взрослых реципиентов позволяет исследовать закономерности экспрессии фенотипа нейронов вне воздействия биологически активных веществ содержащихся в организме матери и эмбриона и вне привычного микроокружения (Das G-, et al., 1972, Lauder J., 1983, Daikoku S., et al-, 1988, Herman J., et al., 1Э88). Вместе с тем^ трансплантация эмбриональной нервной ткани открывает новые возможности для коррекции патологических состояний, связанных с поражением определенных отделов мозга, путем компенсации дефицита нейрогормонов или нейротрансмиттеров, стимуляции репаративных процессов, реконструкции нейрональных ансамблей и др.

Разработка экспериментальной модели паркинсонизма с последующим восстановлением поведения животных путем трансплантации дофамин (ДА)-ергических нейронов позволили применить трансплантацию меэенцефалона эмбрионов человека для лечения болезни Паркинсона ( Li rid val 1 О. , et al., 1989, Hitchcock E., et al., 1990к Не менее перспективной представляется пересадка эмбрионального гипоталамуса при нейроэндокринопатиях, обусловленных недостаточностью отдельных моноамин- или пептидергических систем гипоталамуса взрослого реципиента. В настоящее время это направление находится на стадии разработки экспериментальных моделей несахарного диабета, гиперпролактинемии, гипогонадиэма и их коррекции путем трансплантации сответствуюших нейросекреторных нейронов (Gash D-, et al., 1983, Arendash û.. et al., 193Ô, Charlton H.. 1987). Так, ДА, синтезируемый нейронами аркуатных ядер (АРКЯ), тормозит-секрецию пролактина лактотрофами аденогипофиза, ингибируя транскрипцию пролактинового гена и выделение самого гормона. Дегенерация ДА-ергических нейронов АРКЯ приводит к

гиперпролахтинемии, что влечет эа собой аменорею, галакторею, импотенцию и гинекомастию (Марри Р., и соавт., 1993).

В ранее проведенных исследованиях (Gash D., et al., 1983, Arendash G., et al. , 1936, Charlton H. , 1987. Rosenstein J., et al., 1978) показано, что оптимальным местом для трансплантации гипоталамуса является 3-й желудочек мозга, т.к. через ликвор осуществляется трофика трансплантата, что особенно важно на ранних этапах развития трансплантата, до его васкуляриэации. Анатомо-топографические особенности диэнцефальной области способствуют установлению специфических контактов между нейронами трансплантата и сосудами гипоталамо-гипофизарной портальной системы циркуляции. В области такого рода аксо-ваэальных контактов нейрогормоны поступают в портальную систему циркуляции и достигают клеток-мишеней аденогипофиза (Угрюмов М., 1989).

Несмотря на определенные успехи, достигнутые в экспериментальной нейротрансплантологии, до сих пор отсутствуют пересадки эмбрионального гипоталамуса в мозг больных при нейроэндокринопатиях. Это связано, прежде всего, с отсутствием адекватных моделей нейрозндокринной патологии и тщательного анализа развития и дифференцировки нейронов трансплантата эмбрионального гипоталамуса. Вместе с тем, трансплантация эмбриональной нервной ткани с высоким содержанием ДА-ергических нейронов в гипофизотропную область взрослых реципиентов, возможно, позволит решить проблему лечения, например, гиперпролактинемии при поражении ДА-ергических нейронов АРКЯ. Следовательно, одним из важнейших элементов разработки данной модели гипоталамической трансплантации является тщательный анализ развития и интеграции нервной ткани с высоким содержанием ДА-ергических нейронов в гипоталамусе взрослого реципиента.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось изучение характера дифференцировки ДА-ергических нейронов у крыс и человека в условиях нейротрансплантации.

Целью I раздела настоящей работы явилось исследование развития трансплантатов эмбриональных диэнцефалона и мезенцефалона, содержащих многочисленные ДА-ергические нейроны, в 3-м желудочке мозга взрослого реципиента. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить характер приживления трансплантатов эмбриональных диэнцефалона и мезенцефалона в 3-м желудочке мозга взрослого реципиента в условиях алло- (от крысы крысе) и ксено- (от человека крысе) трансплантации;

- изучить дифференцировку эмбриональных ДА-ергических нейронов АРКЯ крыс методами иммуноцитохимии (ИцХ), радиоавтографии и морфометрии.

Целью II раздела настоящей работы явились модификация и внедрение в клиническую практику нейротрансплантации при болезни Паркинсона методики приготовления суспензии нервных клеток с высоким содержанием ДА-ергических нейронов мезенцефалона эмбрионов человека с предварительным ИЦХ исследованием их локализации.

Научная новизна В настоящем комплексном исследовании особое внимание сосредоточено на развитии трансплантата эмбрионального медиоьазального гипоталамуса (МБГ) с высоким содержанием ДА-ергических нейронов в 3-м желудочке мозга взрослых крыс. При этом впервые:

- осуществлена ксенотрансплантация эмбрионального МБГ человека в 3-й желудочек мозга взрослой крысы в условиях

иммуно супре с сии;

- показано, что нейроны из внутрижелудочкового трансплантата МБГ мигрируют в ткань мозга хозяина;

- иммуноцитохимичеохи показана экспрессия обоих ферментов синтеза ДА, тирозннг-ндрокспля'зы (ТГ) и ДОФА-де карбоксил азы (ДДК), в нейронах трансплантата МБГ:

- ыорфометрически показано, что тела и аксоны ТГ-иммунопоэитивных нейронов в трансплантате ориентированы также, как и в МБГ хозяина: в направлении к срединному возвышению (СВ);

- морфометрически обнаружена синхронность и однонаправленность изменения размеров ТГ-иммунопоэитивных нейронов в трансплантате и в АРКЯ хозяина, что свидетельствует о синергизме в их функционировании.

Кроме этого, модифицирована и внедрена в клиническую практику нейротрансплантации при болезни Паркинсона методика приготовления суспензии нервных клеток с высоким содержанием ДА-ергических нейронов мезенцефалона эмбрионов человека, что

позволило получить новые научные факты об эффективности такой операции.

Научно-практическая ценность Полученные данные способствуют более глубокому пониманию механизмов дифференцировки ДА-ергических нейронов, включая их миграцию, экспрессию ферментов синтеза ДА, а также соотношения генетических и эпигенетических факторов, обеспечивающих регуляцию этого процесса.

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о высокой степени дифференцировкн ДА-ергпческих нейронов в трансплантате и их интеграции с гипоталамусом хозяина, что открывает возможность использования трансплантации МБГ для коррекции гиперпролактинемии, вызванной дегенерацией ДА-ергических нейронов реципиента.

В результате исследования локализаиГии ТГ-иммунопозитивных нейронов среднего мозга эмбрионов человека отработана методика получения эмбрионального мезенцефалона и приготовления из него суспензии нервных клеток с высоким содержанием ДА-ергических нейронов, проведены операции по трансплантации эмбрионального мезенцефалона человека больным паркинсонизмом.

Внедрение в практику Результаты исследования внедрены в клиническую практику НИИ нейрохирургии им. H.H. Бурденко РАМН у больных паркинсонизмом в рамках Государственной научно-технической программы "Здоровье населения России". По результатам этой работы, коллектив нейробиологов и клиницистов, включен в научную программу Европейского Экономического Сообщества по нейротрансплантеции - "NECTAR" (Network of European CNS Transplantation an Restoration) в 1992 году. Кроме того, полученные результаты включены в циклы лекций по нейроэндокринологии развития на медико-биологическом Факультете Российского государственного медицинского университета в Москве и в Университете Пьера и Мари Кюри в Париже.

Апробация работы Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на XI Всесоюзном Съезде Анатомов, Гистологов и Эмбриологов, (Смоленск, 1992); на Российской Молодежной Ассамблее "Молодежь и Здоровье", (Саратов, 1992); на Конференции молодых ученых ИБР РАН, (Москва, 1993); на V Международном Симпозиуме по Нейротрансплантации (Париж, 1994);

на семинаре Физиологических лабораторий ИБР РАН, (Москва, 1994).

Публикации По теме диссертации опубликовано 9, сдано в печать 2 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава II), изложения результатов и их обсуждения (главы III, IV), заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает в себя 2 графика, 5 схем, 2 гистограммы, 38 микрофотографий. Список литературы содержит 155 наименований.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение эмбрионального крысиного материала для экспериментальной нейротрансплантации Работа выполнена на 57 крысах линии Вистар, которые использовались в качестве доноров и реципиентов. Для трансплантации использовали материал 15-ти дневных эмбрионов крыс, т.к. этот возраст соответствует максимальному выходу ДА-ергических нейронов аркуатных ядер в дифференцировку (Borisova N., et al., 1993). Таким образом, у крыс на 15-й день беременности под наркозом (нембутал 40 мг/кг) извлекали эмбрионы, у которых под лупой выделяли вентральную область диэнцефалона или мезенцефалона. Одному взрослому животному трансплантировали кусочки мозга или клеточную суспензию, приготовленную по методике Bdorklund А., и соавт., (1983), от 4-5 эмбрионов.

Получение человеческого эмбрионального материала для клинической и экспериментальной нейротрансплантации Эмбрионы человека (6-9 недель) получали во время проведения плановых абортов в гинекологических отделениях больниц г. Москвы. Неповрежденные головки удавалось получить под контролем ультразвукового сканирования с помощью вакуум-аспирации, применяя специальную пластиковую трубку-кюретку. Полученные головки отмывали от крови в растворе Хенкса и, в случае клинической нейротрансплантации, в стерильных условиях доставляли в НИИ нейрохирургии им. H.H. Бурденко РАМН. В операционной головной мозг эмбрионов освобождали от оболочек, выделяли вентральный мезенцефалон (ВМ) и приготавливали

клеточную суспензию для трансплантации. Для трансплантации одному больному использовали суспензию от 3-5 эмбрионов.

Кроме клинической трансплантации, ыеэенцефалон и диэнцефалон 6-9-ти недельных эмбрионов человека в виде кусочков использовали для ксенотрансплантации крысам.

Техника стереотаксической трансплантации в 3-й желудочек мозга взрослой крысы Крысу-реципиента под наркозом (нембутал 40 мг/кг) фиксировали в стереотаксическом аппарате, делали фрезевое отверстие в черепе и с помощью инъекционной иглы с мандреном вводили приготовленную эмбриональную нервную ткань в 3-й желудочек мозга (координаты введения: 3,3 мм - каудально от брегмы по сагитальному шву, 9,3 мм - вентрально от внутренней пластинки черепа). После гемостаза зашивали рану.

Техника иымуносупрессии при экспериментальной ксенотрансплантации В случае экспериментальной трансплантатации эмбриональной мозговой ткани человека для предотвращения отторжения трансплантата крысе-реципиенту ежедневно внутрибрюшинно вводили иммуносупрессор циклоспорин (ЗапсИшшип) в дозировке 10 мг/кг вместе с антибиотиком юксациллин 20 мг/кг). Кроме того, для подбора оптимальных курсовых доз иммуносупрессора, введение циклоспорина осуществляли в течение первых 2 недель после трансплантации ежедневно или в течение всего эксперимента через день.

Техника световой микроскопии: рутинной и иювуноцитохимии Мозг крыс-реципиентов исследовали через 2-6 месяцев после трансплантации. Крыс под наркозом (нембутал 40 мг/кг) перфузировали через левый желудочек сердца физиологическим раствором, а затем 4% параформальдегидом. Выделенный после этого гипоталамус дофиксировали иммерсией в том же фиксаторе и в течение ночи пропитывали в криопротекторе - 15%-ом растворе сахарозы на иэотоничном физиологическом фосфатном буфере. Далее блок замораживали в изопентане при -45°С и приготавливали срезы мозга толщиной 20 мкм на криостате. Срезы окрашивали крезилвиолетом, метиленовым синим или проводили ИЦХ-реакцию на стеклах. Часть материала после постфиксации использовали для приготовления вибратомных срезов толщиной 50 мкм и последующего ИЦХ выявления антигена на плавающих срезах.

Иммуноцитохимическая реакция выполнялась пероксидаза-антипероксидазным (ПАП)-методом. Для подавления эндогенной

пероксидазы срезы инкубировали с 0,3% перекисью водорода. Для подавления неспецифического связывания первых антител с тканью

- с 2% нормальной сывороткой овцы. Для улучшения проницаемости клеточных мембран специфическими антителами - с детергентом — 0.2% тритоном. Далее следовали инкубации с первыми антителами (кроличьи против ТГ и ДДК1 в разведении 1:1000, - со вторыми антителами против гамма-глобулинов кролика в разведении 1:100,

- с ПАП-комплексом (в разведении 1:200) и, наконец, с 0,03% перекисью водорода и 0,05% раствором

диаминобензидинтетрагидрохлорида, обеспечивающим образование темнокоричневого нерастворимого осадка в местах локализации пероксидазы (Угрюмов М., 1991).

Иммуноиитохймически в мезенцефалоне эмбрионов человека идентифицировали ТГ-иммунопозитивные нейроны на криостатных срезах.

Техника радиошгтографми с 3Н-тимидином Перед трансплантацией, кусочки гипоталамуса 15-ти дневных эмбрионов крыс инкубировали с 3Н-тимидином (20 мкКи/мл) в течение 20 и 80 мин. Через 2 месяца после трансплантации проводили радиоавтографию на криостатных срезах. Срезы покрывали фотоэмульсией типа "М" (НИИ химфото) и через 7 недель экспозиции проявляли в амидоловом проявителе. После Фиксирования и высушивания срезы окрашивали толуидиновым синим и исследовали распределение меченых клеток в трансплантате и мозге хозяина.

Техника морфометричоскот анализа?- Морфометрию ТГ-иммунопозитивных нейронов трансплантата и хозяина в области аркуатных ядер осуществляли на установке MOP-videoplan (Япония). При этом оценивались: площадь нейрона на срезе, угол наклона большего диаметра исследуемого нейрона по отношению к горизонтальной плоскости, тангенциальной к срединному возвышению гипоталамуса. По результатам исследования был проведен статистический анализ и построены гистограммы (Рис. 3, 4).

Техника приготовления клеточной суспензии или клинической нейротранспл&нтации Для приготовления суспензии нервных клеток нами модифицирована оригинальная шведская методика (Рис. 1)

1Автор выражает благодарность проф. Ж.Тибо, Колледж де Франс, Париж, за предоставленные антитела.

2Лвтор благодарен к.м.н. Урановой H.A., БНЦПЗ эа оказанную

помощь в данном исследовании.

эмбрион 6-9 недель

к реципиенту

измельчение

вентральная часть среднего мозга

67-81 % Выживаемость клеток

бактериологический анализ

?

Рис. Подготовка человеческого эмбрионального материала для

трансплантации больным паркинсонизмом.

приготовления суспензии для трансплантации больным паркинсонизмом (ВгапсЛп Р., 1992).

Измельченные кусочки мозга от эмбрионов старше 8 недель трипсинизировали, отмывали в растворе Хенкса и суспендировали вместе с нетрипсиниэированными кусочками мозга от эмбрионов моложе В недель, далее кусочки суспендировали прокачиванием через стеклянные капилляры с последовательно уменьшающимся внутренним диаметром от 1,0 до 0,5 мм. Для уменьшения вязкости суспензии, вызываемой вышедшей из поврежденных клеток ДНК, в трипсин и в промывочную среду добавляли 0,05% ДНКазу. Контроль жизнеспособности клеток в суспензии проводили путем их прижизненной окраски 0,4% трипановым синим или акридин оранжевым с этидий бромидом с последующей микроскопией в гемоцитометре, соответственно, под световым и флуоресцентным микроскопом.' На конечном этапе приготовления суспензии осуществлялся ее бактериологический анализ. При выживаемости клеток в суспензии более 70%, она использовалась для трансплантации больному паркинсонизмом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Морфологический анализ приживляемости эмбриональной нервной

ткани с высоким содержанием дофаминергических нейронов в 3-м желудочке мозга взрослого реципиента в условиях алло- и ксено-

трансплантации

Для сравнительного анализа приживляемости эмбриональных трансплантатов нервной ткани головного мозга с высоким содержанием ДА-ергических нейронов в 3-м желудочке мозга взрослых крыс использовали гипоталамус и ВМ 6-9-ти недельных эмбрионов человека и 15-ти дневных эмбрионов крысы. Аллотрансплантация у крыс сопровождалась 100%-й приживляемостью трансплантатов и не требовала иммуносупрессии. Попытки получить жизнеспоспособный трансплантат эмбриональной мозговой ткани человека в условиях ограниченной иммуносупрессии или при полном ее отсутствии не увенчались успехом. Это связано, очевидно, с повреждением гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) и свободнымдоступом иммунокомпетентных клеток к трансплантату.

Иммуносупрессии циклоспорином ежедневно (10 мг/кг) после пересадки мозговой ткани эмбрионов человека крысам позволила

нам получить приживление трансплантата. Так, через 40 дней после операции, даже при иммуносупрессии в течение первых 2-х недель ежедневно или лри введении препарата через день в течение всех 40 дней, наблюдались признаки отторжения трансплантата на фоне его лимфоцитарной инфильтрации, что соответствует данным Еозепз1е1п Л. (1991). В отторгающемся трансплантате и в окружающей его нервной ткани хозяина нами обнаружены кровеносные сосуды большего диаметра и в большем количестве, чем в прижившихся трансплантатах. Это, очевидно, является показателем реактивного ангиогенеза, о котором также упоминает Оизаг^ I. с соавт. (1989). Только ежедневное, в течение всей последующей жизни животного после операции введение иммуносупрессора приводило к нормальной приживляемости и интеграции ксенотрансплантата с мозгом реципиента. Наши данные по применению иммуносупрессии согласуются с данными, полученными при трансплантации человеческой эмбриональной черной субстанции в стриатум взрослых крыс (ВгипсПп Р., еЪ а1., 1988, ВШзгоп 0., et а1. , 1988, БЪгошЬег^ I., еЬ а!., 1986).

Ксенотрансплантаты МБГ и ВМ занимали практически все пространство 3-го желудочка и по своей макроструктуре не отличался от аллотрансплантата. Однако, в отличие от аллотрансплантата, где по границе нервной ткани донора с мозгом реципиента часто наблюдалась зона интеграции, был обнаружен глиальный рубец. Структура ксенотрансплантата МБГ характеризовалась неоднородностью и хаотической ориентацией нейропиля. Трансплантат содержал мелкие нейроны и большое количество глиальных элементов. В ксенотрансплантате ВМ, с помощью ИЦХ-реакции с использованием антител против ТГ, была обнаружена интеграция трансплантата с мозгом реципиента в области миелинизированных нервных волокон с прорастанием в них ТГ-иммунопоэитивных аксонов нейронов трансплантата.

Таким образом, постоянная после операции иммуносупрессия циклоспорином позволяет получить приживление ксенотрансплантатов МБГ и ВМ в 3-м желудочке крысы с экспрессией фенотипа пересаженных ДА-нейронов.

2. Морфологический анализ оллотрансггпантата и его взаимоотношений о моагом хозяина

Через два месяца после трансплантации мелкие кусочки гипоталамуса донора интегрируются в единый конгломерат, заполняющий просвет 3-го желудочка мозга почти на всем его протяжении в роетрик.чудальном направлении (Рис. 2). Попытки трансплантировать суспеэию клеток в 3-й желудочек не привели к формированию аггрегирчэванного трансплантата, что, очевидно, объясняется миграцией пересаженных клеток по всей поверхности желудочков мозга (СазЬ О., еЪ а1., 1983).

По данным литературы, желудочковый трансплантат полностью васкуляриэируется к 8-му дню после операции (РгоасЬ«е11 К., еЪ а1. , 1991). Нами также было обнаружено большое количество сосудов, переходящих из трансплантата в мозг моэямна или наоборот. С помощью наливок кровеносных сосудов пероксидчзой хрена выявлена густая сосудистая сеть, соединяющая трансплантат с мозгом хозяина (Угрюмой М., и еоавт., 1994).

Тесный механический контакт трансплантата со стенками желудочка прослеживается почти на всем его протяжении, за исключением дорзальной поверхности, омываемой ликвором. В переднем гипоталамусе интеграция трансплантата с мозгом хозяина происходит по всей вентральной и вентролатеральной поверхности 3-го желудочка, что особенно отчетливо выражено на уровне перекреста зрительных нервов и зрительных трактов. Эта область характеризуется исчезновением пограднчной эпендимы и взаимным проникновением нейронов и глии между тканями трансплантата и хозяина. Подобная интеграция наблюдается также в области передней и задней комнссур мозга и комиесуры гиппокампа.

Полученные нами данные позволяют предположить, что в областях прохождения мощных трактов миелинизированных нервных волокон выделяются Факторы, стимулирующие интеграцию нервной ткани донора и реципиента.

В трансплантате обнаружены ядерноподобные скопления дифференцированных нейросекреторных иейроноп. Эти нейроны обладают длинными аксонами, нередко ориентированными в сторону ткани хозяина и заканчивающимися вблизи кровеносных сосудов. Ультраструктура нейронов в трансплантате свидетельствует о нормальном развитии комплекса Голъджи, гранулярной

45 ми

Рис 2. Схема развития трансплантата эмбрионального медиобаэального гипоталамуса в 3-м желудочке мозга взрослой крысы. АГ-гипофиз, АРК-аркуатное ядро, ГТ-гипоталамус реципиента, ЗИ-зона инсерта, к-капилляры гипоталамо-1'ипофиэарной портальной системы циркуляции, н-нейрон, ПЗН-перекрест зрительных нервов, СБ-срединное возвышение, Т-трансплантат, э-эпендима, Ш-'третий желудочек. 1-ядерноподо-бное скопление нейронов, 2-кровеносный сосуд, 3-клетки астроци-тарной глии, 4, 5-интеграция трансплантата с мозгом хозяина на уровне оптической хиазмы (4) и боковой стенки желудочка (5), 6-мигрировавший нейрон, 7-прорастание аксонов нейронов трансплантата к СВ, 8-прорастание аксона нейрона трансплантата в мозг хозяина и локализация нейрона в эпендиме желудочка.

зндоплазмитической сети и формировании секреторных гранул. Характерной особеностью трансплантата, отличающей его от окружающего гипоталамуса хозяина, является изобилие в его нейропиле различных типов синапсов (Угрюмов М., и соавт., 1994).

Наличие контактов аксонов нейронов трансплантата с капиллярами позволяет предположить возможность выделения нейрогормона в гнпоталамо-гипофиэарную портальную систему циркуляции и, следовательно, включения их в механизм нейроэндокринной регуляции в организме реципиента (Scott D., et al., 1984, Silverman A., et al., 1986).

Помимо нейронов и кровеносных сосудов в состав трансплантата входит глия. С помощью ИЦХ, по маркерному глиальному Фибриллярному кислому белку было показано, что трансплантат характеризуется интенсивным развитием астроцитарной глии, особенно, на уровне перекреста зрительных нервов и срединного возвышения реципиента (Угрюмов М., и соавт., 1994). Однако, глиальные элементы не образуют в этих областях выраженного глиального барьера и их скопление может быть вызвано стимулирующим пролиферацию действием трофических Факторов, сетретируемыми миелинизированными волокнами.

3. Миграция нейронов из трансплантата в мозг- хозяина

Миграция нейрсноз внутрижелудочкового трансплантата через эпендиму желудочковой системы мозга является интересным Фактом в экспериментальной нейробиологии, так как в норме эпендима представляет собой естественный ликворо-энцефалический барьер, практически не проницаемый для клеточных элементов и даже для высокомолекулярных соединений (Угрюмов М. 1988, Rosensteln J-, et al., 1989 и др.).

Исследование миграции дифференцирующихся нейронов проведено путем их мечения 3Н-тимидином перед трансплантацией. Через два месяца после операции радиоавтограФически в трансплантате обнаружено большое количество меченых нервных и глиальных клеток (индекс мечения до 38%). Отдельные меченые нейроны наблюдались между эпендимными клетками 3-го желудочка и в ткани мозга хозяина, на значительном удалении от 3-го желудочка (до 1000 мкм). Также обнаружена миграция меченых

глиальных клеток, как правило, вдоль кровеносных сосудов, связующих трансплантат с мозгом реципиента. Эти наблюдения хорошо согласуются с результатами исследования миграции глин при внутрикорковой трансплантации (Александрова М-, и еоавт., 1993).

Эпендима желудочка на уровне мигрировавших клеток, как правило, была сохранена. Возможно, такое изменение свойств проницаемости эпендимы для клеточных элементов объясняется ее контактом с трансплантатом. Однако, наиболее вероятна миграция нейронов в области истинной интеграции между трансплантатом и мозгом хозяина. Нельзя исключить также и возможность миграции нейронов через эпендиму, механически поврежденную в момент стереотаксического введения иглы.

4. Дифференцировка дофаминергичоских нейронов в трансплантате

Экспрессия ферментов синтеза дофамина

В качестве основных показателей дифференцировки ДА-ергических нейронов исследовали экспрессию ферментов синтеза ДА: ТГ и ДДК. Высокая плотность и распространенность ТГ не только в телах, но и в отростках нейронов позволяет оценивать также структурные характеристики ТГ-иммунопозитивных нейронов.

По данным ИЦХ исследования, трансплантат содержит большое количество ТГ-иммунопозитивных нейронов. Это, как правило, 6и-и униполярные округлые, мелкие и средние по размеру клетки с короткими неразветвленными отростками. Вместе с тем встречаются единичные мультиполярные нейроны. На зеркальных криостатных срезах показано, что в трансплантате МБГ большая часть иммунопоэитивных нейронов содержит только ТГ. Меньшее число нейронов содержат оба Фермента синтеза ДА, а отдельные нейроны содержат только ДДК. Это означает, что только часть ТГ-иммунопозитивных нейронов в трансплантате МБГ являются истинно ДА-ергическими, т.е. способными синтезировать ДА из Ь-тироэина - аминокислоты предшественника. Часть нейронов, очевидно, содержит Ь-ДОФА, как конечный продукт синтеза. Эти данные полностью соответствуют результатам исследований дифференцировки ДА-ергических нейронов 1п э^ Ьи. В нормальном онтогенезе аркуатные ядра также содержат в основном 6и- и униполярные нейроны мелкого и среднего размера (Чвгитоу М.,

1992). а у взрослых животных обнаружены две популяции нейронов: в дорзомедиальном отделе истинно ДА-ергнческие, в вентролатеральном отделе - нейроны, содержащие Ь-ДОФА. как конечный продукт синтеза (Окатига Н., еЬ а!.. 198В).

Анализ клеток трансплантата МБГ показал, что иммунопозитивные нейроны морфологически не отличаются от нейронов в гомологичных отделах гипоталамуса хозяина -архуатных ядрах. Как и в процессе нормального развития большая часть иммунопоэитивных нейронов образуют ядерно-подобные скопления, располагающиеся чаще всего в вентральной области трансплантата. Аксоны ДА-ергических нейронов трансплантата проецируются на его периферию и нередко проникают через эпендиму 3-го желудочка б мозг хозяина. Наиболее ярко это выражено на уровне перекреста зрительных нервов и трактов, где аксоны ДЛ-ергичеокпх нейронов проникают в нервную ткань хо&яина между перекрестом зрительных нервов и дном 3-го желудочка, образуя густую сеть. ДА-ергнческие нейроны обнаружены не только в трансплантате, но и в эпендиме 3-го желудочка, что возможно является проявлением их миграции из трансплантата в мозг реципиента. Миграция ТГ-иммунопоэитивных нейронов трансплантата БМ человека из бокового желудочка в мозг взрослой крысы была продемонстрирована ранее (31;готЬегЕ I., а]., 1991).

Б разлитых отделах трансплантата обнаружены ДА-ергические нейроны, аксоны которых контактируют с кровеносными сосудами. По ультраструктурной организации ДА-ергические нейроны трансплантата МБГ практически не отличались от таковых в аркуатном ядре хозяина. Отмечалось развитие в трансплантате симметричных, и крайне редко, ассиметричных синапсов ТГ-иммунопозитивных нейронов, что является прямым доказательством иннервации, а следовательно, и нервной регуляции. Кроме того, было показано, что •"'■Н-дофамин, введенный в желудочки мозга хозяина, специфически захватывается нервными волокнами на периферии трансплантата. Эти данные свидетельствуют о формировании мембранного механизма обратного захвата катехоламинов в отростках ДА-ергических нейронов трансплантата. Мечение только периферических волокон, очевидно, объясняется ограниченной диффузией 3Н-дофамина вглубь трансплантата (Угрюмов М., и соавт., 1994).

Помимо трансплантации аркуатнмх ядер, была проведена пересадка и других отделов мозга, богатых ДА-ергпческими нейронами - ВМ (область закладки черной субстанции) и зоны инсерта гипоталамуса. Несмотря на трансплантацию этих отделов эмбрионального мозга в одно и тоже место - в 3-й желудочек, были выявлены некоторые особенности и различия в их развитии.

После пересадки ВМ в трансплантате обнаруживаются скопления ТГ- и ДДК-иммунопозитивных нейронов. Однако, даже через 6 месяцев после операции их размер остается меньше размера ДА-ергических нейронов черной субстанции In situ у реципиента и у интактных взрослых крыс (Olson L. , et al., 1972).

При пересадке зоны инсерта трансплантат содержал небольшое количество ТГ- и ДДК-иммунопоэитивных нейронов, преимущественно уни- и биполярных с хорошо выраженными отростками. Эта картина отличается от наблюдаемой у интактных взрослых крыс, у которых зона инсерта включает многочисленые крупные мультиполярные ДА-ергические нейроны (Chan-Palay V., et al., 1984). Возможно, это объясняется тем, что ДА-ергические нейроны зоны инсерта были взяты для пересадки спустя несколько дней после периода их максимального выхода в дифференцировку (Ugrumov М., 1992).

Таким образом, совокупность полученных данных указывает на несомненное сходство ДА-ергических нейронов трансплантата «ркуатных ядер с таковыми хозяина и интактных взрослых крыс. Это означает, что основные этапы диФФеренЦировки и экспрессия специфического фенотипа ДА-ергических нейронов аркуатных ядер гипоталамуса в значительной степени детерминированы генетически.

Сравнительный морфоыетрический анализ тироэютщроксжлаэа-иммунопозитивных нейронов трансплантата и хозяина

По данным морфометрического анализа ТГ-иммунопозитивные нейроны трансплантата МБГ практически не отличаются по размерам от нейронов гомологичных областей хозяина, однако через два месяца после операции размер тех и других нейронов превышает размер нейронов этой популяции у интактных взрослых животных (Chan-Palay V., et al., 1964). Через шесть месяцев после

2 иес 6 мес

Рис.3. Площадь нейронов (ордината) тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов трансплантата (заштрихованные столбики) и реципиента (светлые столбики) через два (1, 2) и шесть (3, 4) месяцев (абсцисса) после трансплантации; 1, 3 - уни-, 2, 4 - биполярные нейроны.

градусы

юо -но 1Ч> -ю 20 -о -

Рис. А Угол наклона большего диаметра овальных тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов трансплантата (заштрихованные столбики) и реципиента (светлые столбики) по отношению к плоскости, тангенциальной к вентральной поверхности срединного возвышения через два (1, 2) и шесть (3, 4) месяцев после трансплантации. 1, 3 -уни-, 2, 4 - биполярные нейроны.

12 3 4

2 мес л мес

операции размер нейронов и в трансплантате, и у хозяина снижается в равной степени (. Рис. 3). Эти факты свидетельствуют о возникновении функционального синергизма между популяциями нейронов трансплантата и хозяина. Анализ проекции оси ТГ-иммунопозитивных нейронов трансплантата показал, что большинство нейронов имеют дорэовентральную ориентацию (Рис. 4), т.е. их аксоны растут по направлению к срединному возвышению мозга хозяина и, следовательно, к капиллярам гипоталамо-гипофизарной портальной системы циркуляции, что возможно способствует поступлению ДА в кровоток. На уровне таких аксовазальных контактов может осуществляться регуляция функциональной активности нейронов трансплантата со стороны мозга хозяина путем установления механизма обратной связи.

6. Внедрение методики приготовления суспензии нервных клеток эмбрионов человека для клинической трансплантации при паркинсонизме

Основным патогенетическим механизмом болезни Паркинсона является локальный дефицит ДА в нигростриальной системе.

Нейрогрансплантология предлагает идеологически новый подход к компенсации дефицита ДА при паркинсонизме за счет пролонгированного выделения ДА в моэге реципиента из подсаженных дифференцирующихся ДА-ергических нейронов ВМ Ембрионов человека.

Выделение ВМ, предположительно содержащего дифференцирующиеся ДА-ергические нейроны проводили на основе предварительного картирования ТГ-иммунопозитивных нейронов в моэге эмбрионов человека в возрасте 6-7-и недель. Наши данные соответствовали результатам, полученным другими исследователями (Pickel et al., 1980). ТГ-иммунопозитивные нейроны, представленные мелкими клетками без выраженных отростков, располагаются в ВМ эмбрионов.

Для приготовления суспензии нервных клеток эмбрионов человека нами использована собственная модификация метода разработанного шведскими исследователями (Brunin Р., 1992). Подробное описание методики приготовления суспезии представлено в разделе: "Материалы и методы" (Рис. 1). Модификация метода заключалась в том, что эмбриональный материал разделяли на две

группы: 1 ) старше 8 недель, 2) моложе 8 недель. Нервную ткань эмбрионов первой группы трипснннэировали 20 мин. при 37°С, отмывали и суспендировали вместе с нетрнпоинпзнрованными кусочками мозга от эмбрионов второй группы. Наша методика является более щадящей для эмбриональной нервной ткани и удобной для введения такой суспезии в отереотаксическую канюлю. Это обусловлено тем, что трипсин, разрушая мемраны клеток, приводит к выходу из ни.ч нуклеиновых кислот, которые вызывают высокую тягучесть суспензии, что мешает ее дискретному введению в мозг пациента. Данная методика позволила получать суспензию состоящую из отдельных клеток и клеточных конгломератов с высоким процентом живых клеток (70-81%) в момент операции, т.е. через 4 часа после аборта.

Представленная методика приготовления суспензии эмбрионального мезенцефалона эмбрионов человека была использована в семи операциях по транс-плантации данной суспензии больным паркинсонизмом. Операции проводились в НИИ нейрохирургии им. H.H. Бурденко, были получены положительные послеоперационные результаты (Шабалов В., и соавт.. 1994; Угрюмов М., и соавт., 1994а).

ВЫВОДЫ

1. Аллотрансплантация эмбриональных диэнцефалона и вентрального мезенцефалона в 3-м желудочке мозга взрослых крыс сопровождается 100%~м приживлением без иммуносупрессии. Напротив, приживление ксенотрансплантатов диэнцефалона и вентрального мезенцефалона 6-9-и недельных эмбрионов человека возможно только в условиях постоянной иммуносупрессии.

2. Трансплантированные нейроны медиобаэального гипоталамуса проходят дифференцировку, как in situ, так и мигрируя в мозг хозяина.

3. В трансплантате медиобаэального гипоталамуса обнаружены нейроны которые содержат тироэингидроксилаэу, ДОФА-декарбоксилаэу или оба фермента одновременно, то есть по экспрессии фенотипа сходны с нормальным развитием у интактных животных.

4. Синхронность и однонаправленность изменений размеров тирозингидроксилаэа иммунопоэитивных нейронов в трансплантате и аркуатных ядрах хозяина, может свидетельствовать о функциональном синергизме между ними.

5. Иммуноцитохимичеокое исследование 6-7-и недельных эмбрионов человека показало наличие тирозингидроксилаэа иммунопозитивных нейронов в вентральной части среднего мозга. На этом основании внедрена методика получения эмбрионального мезенцефалона человека, а также методика приготовления суспензии эмбриональных нервных клеток в клиническую нейротрансплантацию.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ И ПОДГОТОВЛЕННЫХ К ПУБЛИКАЦИИ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зиновскал Н.Г., Угрюмов N.B. , Попов А.П., Ефуни Е.С.,

Фетисов С. О. Трансплантация эмбрионального гипоталамуса - модель возможной компенсации дефицита катехоламииов в мозге взрослых крыс. Сборник научных трудов. Всесоюзный симпозиум. Нейробиологические аспекты современной эндокринологии. Москва. 1991. С. 25-26.

2. Fetisov S.O., Ugriunov M.V., Popov А.P. and Thibault J.

Differentiation of dopaminergic neurona in the mediobasal hypothalamus. Immunohistochemical and radioautographic studyes. The Histochemical Journal. A Journal of Cell and Tissue Biochemistry. 1992. V. 24. N. 8. P. 583.

3. Ugrumov M.V., Popov A.F.. Fetisov S.O., Proshlyakova E.V.,

Saproiiova А. Га., Boriaova N. A. and-Thibault J. Development of dopaminergic tubero-infundibular system in vivo and in the graft. VII Intern. Catecholamine Symp. Amsterdam. 1992. Abstracts. P. 321.

4. Фетисов С. О., Попов А. П., Ефуни Е.С., Ж. Тибо, М. Крнгер.

Угрюмов М.В. Экспрессия фенотипа дофаминергических нейронов аркуатного ядра гипоталамуса в трансплантате. Доклады РАН. 1994. Т. 334. N 5. С. 124-126.

5. Фетисов С. О. Экспрессия тирозингидроксилазы и

ДОФА-декарбоксилазы в нейронах трансплантата медиобазального гипоталамуса. Онтогенез. 1994. Т. 25. N 3. С. 21-25.

6. Угрюмов N.B., Фетисов С. О., Попов А. П., Ефуни Е.С.,

Титова Н.Г., X. Тибо, М. Кригер. Развитие трансплантата эмбрионального медиобазального гипоталамуса в 3-м желудочке мозга взрослой крысы. Известия РАН. Серия Биологическая. 1994. 3:320-326.

7. Шабалов В.А., Угрюмов М.В. . Федорова Н.В., Шток В.И.,

Попов А.П., Меликян А. Г. , Фетисов С.О., Макаренко И.Г.. Архнпова H.A., СаФронов В.А. Результаты применения нейротранеплантяции у больных паркшюониэмом. Митериалп Конференции посьяше-нной Н.П. Бехтеревой. С. Петербург. 1994.

в. М.В. Угрюмов, В.А. Шаьалов, И.В. Федорова, А.П. Попов.

В.Н. Шток. С.О. Фетисов, А. Г. Мелнкян. И. Г. Макаренко. E.H. Сотникова. Т.А. Ратина, Г.П. Луцепко, Г.В. Кузин, H.A. Аркипова, В. А. Сафронов, С. Б. Б у клина, А.Н. Коновалов Нейригрансплантацня в лечении паркинсонизма. Вестник РАМН. 1994а. Подготовлена к печати.

9. Ugi'umov M.V. . Fetisov S.O., Popov А. P., Et'uni E.S., Thibault

J. and Krleger M. Differentiating dopaminergic neurons of the arcuate nucleus in the graft. Neurosci. Lett., 1994. Submitted.

10. Ugrumov M.V.. FetiBov S.O.. Popov A.P. . Thibault J.,

Kvieger M. Dopaminergic phenotype expression by embryonic neurons of the arcuati- nucleui grafted into the 3rd ventiele of adult rat. 5th Intern. Symp. on Neural Transplantation. Chatenay-Malabry, France, 1994.

11. Shabalov V.A., Ugt-umov M.V. . Fedorova N.V.. SJitock V.H.,

Popov A.P. , Melikjan A.G., Fetisov S.O.. Makarenko I.G., Lutsenko G.I., Kuzin I.I., Archipova N.A., Safronov V.A. Russian experience on neuroti'ansplantation in patienta with Parkinson's disease. 5th Intern. Symp. on Neural Transplantation. Chatenay-Malabry, France, 1994.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ

ВМ

ГЗБ

ДА

ДДК

ДОФА

ИЦХ

МБГ

ПАП

ТГ

вентральный меэенцефалон; гемато-энцефалический барьер; дофамин ;

ДОФА-декярбокеилаза; 3,4-дигидроксиФенилаланин; иммуноцитохимия; медиобаэальный гипоталамус; пероксидаза-антипероксидазный комплекс ; тпроэингидроксилаза.