Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференцировка дофаминсинтезирующей системы медиобазального гипоталамуса и ее регуляция в пренатальном периоде развития крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мельникова, Виктория Ильинична, Москва

Г99-3/6ГЗ •

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова

На правах рукописи УДК 612.82. 577.175

МЕЛЬНИКОВА Виктория Ильинична

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ДОФАМИН-СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МЕДИОБАЗАЛЬНОГО ГИПОТАЛАМУСА И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ В ПРЕНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ КРЫС

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор М.В. Угрюмов, доктор наук, профессор А. Кал ас

Москва - 1997

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................6

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................12

1.1. Структурная и функциональная характеристика туберо-инфундибулярной дофаминергической системы у взрослых животных и в онтогенезе........................................................................................................................................................12

1.1.1. Дофаминергические нейроны аркуатного ядра взрослых животных......................................................................................................................................................................12

1.1.1.1. Топография и морфология. нейронов..................................................12

1.1.1.2. Функциональные характеристики нейронов................................17

1.1.1.3. Нейрогуморальная регуляция нейронов............................................18

1.1.1.4. Функциональное значение нейронов....................................................20

1.1.2. Дифференцировка дофаминергических нейронов аркуатного ядра....................................................................................................................................................................................22

1.1.2.1. Выход нейронов в дифференцировку................................................23

1.1.2.2. Морфологические характеристики развивающихся нейронов....................................................................................................................................................23

1.1.2.3. Функциональные характеристики развивающихся нейронов ....................................................................................................................................................26

1.1.2.4. Эфферентные связи нейронов ..................................................................27

1.1.2.5. Регуляция нейронов................................................................................................28

1.2. Регуляция секреции пролактина у взрослых животных и

ее становление в онтогенезе............................................................................................................29

1.2.1. Секреция пролактина и ее гипоталамическая регуляция у взрослых

животных....................................................................................................................................................................30

1.2.1.1. Пролактин-рилизинг факторы....................................................................30

1.2.1.2. Пролактин-ингибирующие факторы....................................................31

1.2.2. Секреция пролактина и ее регуляция дофамином в онтогенезе. 33

1.2.2.1. Секреция пролактина гипофизом в онтогенезе......................33

1.2.2.2. Секреция дофамина медиобазальным гипоталамусом в пренатальном периоде развития......................................................................................35

1.2.2.3. Чувствительность лактотрофов к дофамину в

онтогенезе..................................................................................................................................................35

1.2.2.3. Многообразие пролактино-подобных белков..........................37

1.3. Роль серотонина в дифференцировке нейронов мозга..............................38

1.3.1. Развитие серотонинергической системы мозга............................39

1.3.2. Роль серотонина в дифференцировке

катехоламинергических нейронов................................................................................40

1.3.3. Роль серотонина в дифференцировке пептидергических нейронов....................................................................................................................................................41

1.3.4. Механизмы морфогенетического действия

серотонина...........................................................................................42

ГЛАВА II. Материалы и методы исследования........................................................45

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................54

III. 1. Метаболизм и выделение дофамина нейронами

медиобазального гипоталамуса in vivo и в культуре......................................54

III. 1.1. Культура нейронов медиобазального гипоталамуса..........54

III. 1.2. Метаболизм и выделение дофамина in vivo................................54

III. 1.3. Метаболизм и выделение дофамина in vitro..............................55

III. 1.4. Обсуждение результатов....................................................................................59

111.2. Секреция пролактина гипофизом и ее гипоталамическая дофаминовая регуляция в пренатальном периоде развития........... 64

Ш.2.1. Становление секреции пролактина и ее гипоталамического

дофаминового контроля у плодов крыс........................................ 64

III.2.2. Обсуждение результатов.......................................... 65

111.3. Роль серотонинергических нейронов в развитии дофамин-синтезирующих нейронов аркуатного ядра.................................. 73

Ш.3.1. Экспрессия тирозингидроксилазы в ко-культуре нейронов

аркуатного ядра и ядра шва........................................................ 73

III.3.2. Обсуждение результатов.......................................... 76

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................... 79

ВЫВОДЫ.................................................................................. 82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................... 83

Список сокращений

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ДА - дофамин, дофаминергический

ДДК- ДОФА-декарбоксилаза

л-ДОФА - л-диоксифенилаланин

ДОФУК - диоксифенилуксусная кислота

МБГ - медиобазальный гипоталамус

5-ОТ - 5-окситриптамин(серотонин)-ергический

П - постнатальный день

ПРЛ - про л актин

ТГ - тирозингидроксилаза, тирозингидроксилаза-иммунопозитивный ФБ - фосфатный буфер Э - эмбриональный день

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Актуальность исследований развития нейроэндокринных регуляций в онтогенезе определяется их ключевой ролью в поддержании гомеостаза и интеграции развивающегося организма (Мицкевич 1978, Угрюмов 1989). Формирование отдельных структурно-функциональных элементов нейроэндокринной системы и становление специфических взаимодействий между ними не являются процессами, строго детерминированными генетически. Они характеризуются высокой функциональной лабильностью и специфической чувствительностью ко многим регуляторным факторам (Lauder 1993, Calas 1994), что открывает возможности для коррекции нарушений процесса развития.

Многообразие и сложность форм взаимоотношений нервной и эндокринной систем во взрослом организме существенно затрудняют познание фундаментальных принципов функционирования отдельных звеньев, и, в частности, нейросекреторной системы гипоталамуса. В этом отношении перспективным является онтогенетический подход, который дает возможность оценить функциональное значение отдельных элементов нейросекреторной системы до установления между ними сложных структурно-функциональных иерархических связей. Изучение основных закономерностей развития нейросекреторной системы гипоталамуса имеет и большое самостоятельное значение для нейроэндокринологии развития. В первую очередь это объясняется вовлечением гормонов, в том числе и нейрогормонов, в регуляцию морфогенетических процессов, которые у высших позвоночных реализуются в перинатальном периоде развития

(Мицкевич 1978, Buznikov et al. 1996). Сами нейрогормоны являются индукторами роста и дифференцировки мозга (Whitaker-Azmitia and Azmitia 1989, Lauder 1993). Морфогенетическое действие, получившее название "импринтинга", проявляется на строго определенных стадиях развития - в критические периоды - и носит необратимый характер. Отсутствие или недостаточная концентрация необходимого нейрогормона в критическом периоде приводит к серьезным органическим и функциональным нарушениям в отдельных звеньях нейроэндокринной регуляции. Такие нарушения в процессе дальнейшего развития и последующей жизни не корригируются (Мицкевич 1978, Ugrumov 1994).

Если на ранних этапах онтогенеза преобладает морфогенетическое действие нейрогормонов, то позднее проявляется и их активационный эффект. В этом случае обеспечивается контроль определенной функции организма, и само действие гормонов начинает носить обратимый характер (Мицкевич 1978, Kordon et al. 1980, Ugrumov 1991, Everitt et al. 1992). Таким образом, функционально разобщенные на начальных этапах развития гипоталамус, гипофиз и периферические эндокринные железы в перинатальном периоде превращаются в единую нейроэндокринную систему.

Наиболее важными физиологически активными веществами, вовлеченными в нейроэндокринную регуляцию на различных иерархических уровнях, являются катехоламины. Дофамин (ДА) медиобазального гипоталамуса (МБГ) обеспечивает регуляцию репродуктивной функции организма, контролируя выделение люлиберина в срединном возвышении и секрецию пролактина (ПРЛ) в передней доле гипофиза (Weiner et al. 1988, Collu 1989 Everitt et al. 1992).

В онтогенезе экспрессия ДА фенотипа нейронов МБГ осуществляется поэтапно. В пренатальном периоде развития в этой области присутствует лишь незначительное количество нейронов, содержащие оба фермента синтеза ДА и сам ДА (Borisova et al. 1991, Ugrumov et al. 1996). Однако, до сих пор отсутствуют данные об экспрессии специфических синтезов и функциональной активности этих нейронов в пренатальном периоде развития, а также о роли микроокружения в их дифференцировке. Имеющиеся литературные данные о становлении гипоталамического контроля секреции ПРЛ немногочисленны и противоречивы (Ojeda and McCann 1974, Reusens et al. 1979, Khorram et al. 1984, Hooghe-Peters et al. 1988).

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение формирования ДА-синтезирующей системы МБГ и роли внеклеточных сигнальных молекул в дифференцировке этих нейронов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить способность нейронов МБГ к синтезу ДА, а также к его выделению в ответ на деполяризацию мембран в пренатальном периоде развития in vivo и в культуре

2) изучить становление ДА ингибиторного контроля секреции ПРЛ гипофизом как показателя функциональной зрелости ДА-синтезирующих нейронов МБГ.

3) выявить характер влияния эмбриональных серотонинергических (5-ОТ) нейронов на экспрессию тирозингидроксилазы (ТГ) - первого фермента синтеза ДА - в эмбриональных нейронах МБГ.

Научная новизна. Предложен новый метод получения диссоциированной культуры клеток изолированных аркуатных областей гипоталамуса плодов, который выгодно отличается от культуры целого гипоталамуса, поскольку позволяет изучать дифференцировку отдельной популяции ДА-синтезирующих нейронов.

Показано, что в пренатальном периоде развития нейроны МБГ гипоталамуса способны синтезировать ДА и выделять его в ответ на деполяризацию мембран.

Доказано, что уже в пренатальном периоде секреция ПРЛ находится под гипоталамическим ДА контролем.

Продемонстрировано, что 5-ОТ нейроны стимулируют экспрессию скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА - ТГ - в нейронах МБГ плодов крыс.

Научная и практическая значимость работы. Полученные данные способствуют углублению существующих представлений о развитии гипоталамо-гипофизарного звена нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции. В работе впервые проведено комплексное исследование развития ДА-синтезирующих нейронов МБГ, включающее биохимические и физиологические показатели зрелости этих нейронов в конце пренатального периода. Согласно полученным данным становление ДА гипоталамической регуляции секреции ПРЛ происходит у крыс до рождения, т.е. в тот же период, что и формирование основных гипоталамо-гипофизарных звеньев нейроэндокринной регуляции. Выявленное стимулирующее влияние серотонина на развитие нейронов аркуатного ядра укладывается в представление о роли нейрогуморальных факторов

микроокружения в реализации генетической программы дифференцирующихся нейронов.

Результаты выполненной работы могут найти практическое применение в экспериментальной нейроэндокринологии и медицине при изучении патогенеза ряда нейроэндокринопатий, связанных с недостаточностью моноаминергической системы МБГ. Дегенерация ДА нейронов аркуатного ядра приводит к стойкой гиперпролактинемии, что влечет за собой аменорею, галакторею, импотенцию и гинекомастию (Марри и др. 1993). Представляется перспективной пересадка эмбриональных ДА нейронов при указанных патологиях. В настоящее время это направление находится на стадии разработки экспериментальных моделей гиперпролактинемии и коррекции ее путем трансплантации соответствующих нейросекреторных нейронов (Arrendash et al. 1986). В нашей лаборатории проведены исследования по изучению экспрессии ДА фенотипа нейронов аркуатного ядра, трансплантированных в третий желудочек мозга взрослого реципиента (Фетисов и др. 1994).

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ лаборатории гормональных регуляций Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН "Структурно-функциональные основы становления нейроэндокринных механизмов регуляции процессов онтогенеза" и в рамках программы проектов: INTAS-RFBR "Monoaminergic and peptidergic neurons: differentiation, plasticity and regulation of phenotype expression in intercellular signalling", РФФИ "Роль моноаминов в нейроэндокринной регуляции в

онтогенезе" и РФФИ "Дифференцировка нейронов и ее нейрогуморальная регуляция".

Публикация результатов исследования и апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены на коллоквиумах лаборатории гормональных регуляций ИБР им. Н. К. Кольцова; на международных симпозиумах: "11th Biennial Meeting of International Society for Developmenal Neurosciences" Tampere, Finland, 1996 г., "8th International Catecholamine Symposium" California, USA, 1996 г. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, три находятся в печати.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурная и функциональная характеристика туберо-инфун-дибулярной дофаминергической системы у взрослых животных и в онтогенезе.

Туберо-инфундибулярная система гипоталамуса включает нейроны аркуатного ядра, проецирующие аксоны в срединное возвышение. В аркуатном ядре содержатся нейроны, синтезирующие широкий спектр физиологически активных веществ, таких как ДА, адренокортикотропный гормон, (З-эндорфип, сомато либерин, меланоцитстимулирующий гормон, нейропептид У, энкефалины, динорфин, субстанция Р, галанин, нейротензин и гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) (рис. 1) (ЕуегШ; et а1. 1986, ЕуегШ: й а1. 1992). Одним из важнейших функциональных элементов туберо-инфундибулярной системы являются ДА нейроны.

1.1.1. Дофаминергические нейроны аркуатного ядра взрослых животных

Структурные и функциональные характеристики ДА нейронов аркуатного ядра наиболее полно изучены у взрослых животных. Повышенный интерес к ним определяется важной ролью ДА в регуляции репродуктивной функции организма.

1.1.1.1. Топография и морфология нейронов.

Первоначально для идентификации ДА нейронов использовался метод гистофлуоресценции Фалька-Хилларпа. Позднее были разработаны иммуногистохимические методы, направленные на выявление ТГ - первого фермента синтеза ДА, ДОФА-декарбоксилазы (ДДК)- второго фермента синтеза ДА и самого ДА. Такое обогащение арсенала методов позволило выявить в аркуатном ядре (Окатига & а1. 1988а, А§па1л е1 а1. 1988,Ю1аЬата

Рис. 1. Распределение нейромедиаторов и нейропептидов в нейронах аркуатного ядра. Справа представлены клетки, содержащие по одному физиологически активному веществу, слева - два и более.

GRF - соматолиберин, ТЫ - тирозин гидроксилаза, NT - нейротензин, NPY -нейропептид Y, GAB А - ГАМ К, GAL - галанин, ENK - энкефалины, SOM -соматостатин, РОМК - проопиомеланокортин, PVN - перивентрикулярное ядро, МЕ - срединное возвышение, 3V - третий желудочек мозга.

et al. 1990, Zoli et al. 1993), как и в других отделах мозга (Skagerberg et al. 1988, Meister et al. 1988a) не только ДА нейроны, но и нейроны, содержащие только один из ферментов синтеза ДА, и, следовательно, не являющиеся истинно дофаминергическими.

В нейронах, расположенных в дорзо-медиальной части аркуатного ядра иммуноцитохимически выявлены: ДА, ТГ и ДДК. В этой же области методом Фалька-Хилларпа обнаружены флуоресцирующие нейроны, проецирующие аксоны в срединное возвышение (Fuxe 1964, Daistrom and Fuxe 1966, Meister and Hokfelt 1988, Zoli et al. 1993). В ростро-каудальном направлении ДА-содержащие нейроны локализованы в средней части ядра (Okamura et al. 1988а, Agnati et al. 1988, Kitahama et al. 1990). ДА-содержащие нейроны овальной формы, содержат относительно крупное, асимметрично расположенное ядро, окруженное с трех сторон относительно тонким слоем цитоплазмы. Утолщенная цитоплазма с четвертой стороны содержит комплекс Гольджи и другие клеточные органеллы (Piotte et al. 1988). После внутрижелудочкового введения л-ДОФА или ДА в этих нейронах наблюдается увеличение содержания ДА, что свидетельствует об экспрессии в них ДДК (Fuxe and Ungerstedt 1968, Hokfelt and Fuxe 1972, Fuxe et al. 1974, Lidbrink et al. 1974).

ТГ-нейроны дорзо-медиальной области - среднего размера (10-13 мкм), в основном биполярные (Okamura et al. 1988). Сравнительный анализ ростро-каудального распределения ДА- и ТГ-содержащих нейронов в дорзо-медиальной области аркуатного ядра (Zoli et al. 1993) показал, что их расположение и абсолютное количество совпадает, причем число этих нейронов в равной степени уменьшается в каудальном направлении. Важно подчеркнуть,

что почти все ТГ нейроны этой области содержат одновременно и ДА (Zoli et al.1993).

Аксоны ДА- и ТГ-иммунопозитивных нейронов дорзо-медиальной области пр�