Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Возможная роль катехоламинов в дифференцировки и миграции ГРГ-нейронов у плодов крыс и овец

ВАК РФ 03.00.00, Биологические науки

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Извольская-Чупова, Марина, Тур (Франция)

-m

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МКДИЦИПСКМХИЛУК

4s

62 11/82

Университет Франсуа Рабле

ДИССЕРТАЦИЯ

JJ_N I V Е RJ5^ I Т Е

HABAS NAHONAJX

на соискание степени доктора университета г. Тур

-TOURS-

Специальность : науки о жизни

Представлена и защищена 13 сентября 2004г

МАРИНОЙ ИЗВОЛЬСКОЙ-ЧУПОВОЙ

Возможная роль катехоламинов в дифференцировки и миграции ГРГ-нейронов у

плодов крыс и овец.

Научные руководители: Тийе Ив, Угрюмов Михаил

Жюри:

Проф. Андре Калас Проф. Анн Дуиттоз Директор научных исследований Ив Тийе Проф. Жерар Трамю Проф. Угрюмов Михаил Проф. Веселкин Николай

Список сокращений 7

I. Обзор литературы

1. Введение. 9

2. ГРГ система взрослых млекопитающих.

2.1 Синтез ГРГ и формы ГРГ.

2.1.1 Ген, транскрипция и процессинг РНК ГРГ. 12

2.1.2 Трансляция мРНК ГРГ и процессинг пре-проГРГ 13 и деградация зрелого декапептида.

2.2.3 Формы ГРГ у различных видов позвоночных. 16

2.2 Организация ГРГ системы у взрослых млекопитающих.

2.2.1 Расположение основных групп нейронов. 18

2.2.2 Расположение основных проекций ГРГ нейронов. 23

2.3 Иннервация ГРГ нейронов.

2.3.1. Связи ГРГ системы и катехоламинергических систем мозга. 2.3.1.1 Организация катехоламинергических систем мозга млекопитающих. 25 2.3.1.2 Иннервация ГРГ нейронов катехоламинергическими терминалями. 27 2.3.2 Иннервация ГРГ нейронов терминалями других

нейротрансмиттерных систем мозга. 29

2.4 Регуляция работы ГРГ системы.

2.4.1 Рецепторы различных нейротрансмиттеров, обнаруженные на ГРГ нейронах.

2.4.1.1 Рецепторы катехо л аминов, обнаруженные на ГРГ нейронах. 30

2.4.1.2 Рецепторы прочих нейротрансмиттеров и

стероидных гормонов, обнаруженные на ГРГ нейронах. 34

2.4.2 Регуляция синтеза ГРГ. 35

2.4.3 Регуляция выделения ГРГ.

36

2.5 Функциональное значение ГРГ системы у взрослых животных.

39

3. Онтогенез ГРГ системы млекопитающих.

3.1. Происхождение и миграция ГРГ нейронов.

3.1.1 Происхождение и деление клеток предшественников.

41

3.1.2 Факторы транскрипции, ответственные за экспрессию

специфического фенотипа, обнаруживаемые в ГРГ нейронах.

44

3.1.3 Миграционный путь ГРГ нейронов.

45

3.1.4 Популяции нейронов других типов, мигрирующие вместе

с ГР-нейронами. 47

3.2 Регуляция миграции ГРГ нейронов.

3.2.1 Молекулы клеточной адгезии, участвующие в миграции ГРГ нейронов. 48

3.2.2 Молекулы хемоаттрактанты / хемореппеленты на миграционнам

пути ГРГ нейронов. 48

3.2.3 Нейротрансмиттеры, регулирующие миграцию ГРГ нейронов. 49

3.3 Дифференцировка ГРГ нейронов и становление их функциональной активности.

3.3.1 Морфологические изменения мигрирующих ГРГ нейронов. 52

3.3.2 Функциональная дифференцировка.

3.3.2.1 Синтез ГРГ во время миграции. 53

3.3.2.2 Выделение ГРГ в пренатальный период. 54

3.3.2.3 Влияние нейротрансмиттеров на выделение и синтез ГРГ. 55

3.4 Развитие афферентных связей ГРГ системы. 56

3.5 Развитие эфферентных связей ГРГ системы. 57 4.Заключение 59

II. Материалы и методы.

1. Животные и схемы экспериментов.

1.1 Исследования, проведенные на плодах крыс. б 1

1.2 Исследования, проведенные на плодах овец. 62

2. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). 64

3. Радио-иммунологический анализ (РИА). 65 4. Иммуногистохимия.

4.1 Фиксация материала и приготовление срезов. 66

4.2 Одинарное иммуногистохимическое пероксидазное мечение на ГРГ и ТГ. 67

4.3 Двойное иммуногисто- и иммуноцитохимическое флюоресцентное мечение

на ГРГ, ТГ и ДАА. 68

5. Гибридизация in situ.

5.1 Гибридизация in situ на мРНК ГРГ с использованием РНК зонда. 72

5.1.1 Фиксация материала и приготовление срезов. 72

5.1.2 Мечение зонда. 72

5.1.3 Прегибридизация, гибридизация и авторадиография. 73 5.2 Гибридизация in situ на мРНК ТГ с использованием ДНК зонда.

5.2.1 Фиксация материала и приготовление срезов. 74

5.2.2 Мечение зонда. 74

5.2.3 Прегибридизация, гибридизация и авторадиография. 75

6. Анализ результатов.

6.1 Количественный и полуколичественный анализ ГРГ-ир нейронов, выявленных при помощи одинарного иммунопероксидазного мечения на фронтальных срезах голов плодов крыс. 76

6.2 Ординарная флюресдентная микроскопия.

6.3 Конфокальная флюресцентная микроскопия.

6.4 Статистическая обработка.

77

77

78

III. Результаты.

1. ГРГ нейроны и ТГ-ир структуры в областях их миграции - места взаимодействия.

1.1 Исследования, проведенные на плодах крыс.

1.1.1 Иммуногистохимическое определение ТГ и ГРГ нейронов и

волокон в назальной области головы и ростральном переднем мозге. 79

1.1.2 Иммуногистохимическое определение ДАА и в областях миграции ТГ-ир нейронов в назальной области головы и ростральном переднем мозге. 83

1.1.3 Иммуногистохимическое определение а2А-аренорецептора в мигрирующих ГРГ нейронах на Э20. 84

1.2 Исследования, проведенные на плодах овец.

1.2.1 Определение содержания катехоламинов в назальной области

головы и переднем мозге у плодов овец. 86

1.2.2 Выявление ГРГ- и ТГ- ир и содержащих сигнал гибридизации

in situ нейронов в назальной области головы и ростральном переднем мозге у плодов овец и в органотипической культуре обонятельных плакод. 87

1.2.3 Иммуногистохимическое определение ДАА и в областях миграции ТГ-ир нейронов в назальной области головы и ростральном переднем

мозге у плодов овец. 92

2. Модель снижения концентрации катехоламинов в пренатальном онтогенезе у плодов крыс.

2.1 Подтверждение адекватности и эффективности модели для исследования

миграции и дифференцировки ГРГ-нейронов у плодов крыс

при помощи ВЭЖХ. 94

2.2 Определение концентрации ГРГ в каудальных областях миграции ГРГ нейронов у плодов крыс в контроле и после введения аМПТ

при помощи РИА. 98

2.3 Определение количества и полуколичественное измерение оптической плотности ГРГ нейронов в областях их миграции у плодов крыс в контроле и после введения аМПТ

(одинарное пероксидазное иммуномечение). 99

IV. Обсуждение.

1. Миграция ГРГ и ТГ нейронов из обонятельных плакод.

1.1 Присутствие ТГ нейронов на миграционном пути ГРГ нейронов из обонятельных плакод - феномен, наблюдаемый у многих видов млекопитающих.

1.2 Функциональные возможности ТГ в назальной области головы у плодов крыс и овец.

1.3 Возможные причины экспрессии ТГ в нейронах, происходящих

из обонятельного эпителия 112

2. Катехоламины и мигрирующие ГРГ нейроны в онтогенезе - места взаимодействия.

2.1 Катехоламины представлены на миграционнм пути ГРГ нейронов. 114

2.2 Возможные места иннервации мигрирующих

ГРГ-нейронов катехоламинергическими терминалями. 116

2.3 Экспрессия а2А-адренергического рецептора в мигрирующих

ГРГ нейронах. 118

107

110

3. Влияние снижения концентрации катехоламинов в пренатальном периоде у плодов крыс на развитие ГРГ нейронов.

3.1 Оценка эффективности модели для исследований развития ГРГ нейронов. 119

3.2 Эффект снижения концентрации катехоламинов на миграцию ГРГ нейронов. 122

3.3 Эффект снижения концентрации катехоламинов на синтез/секрецию ГРГ. 125

V. Основные выводы. 128

VI. Список литературы. 129

5'АДМФ 5'-амино-2,4-дигидрокси-

альфаметилфениламин

6-ГДА 6-гидроксидофамин

ОС С рецепхорный белок нетринов

ЫСАМ белки клеточной адгезии нервной ткани

РБА-ЫСАМ полисиалированные формы белков клеточ:

адгезии нервной ткани

аМПТ альфа-метил-пара-тирозин

АП-2 активаторный протеин 2

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматографи

ГАМК Гамма-аминомаслянная кислота

ГАП Гонадотропин-релизинг гормон -ассоциирован!

пептид

ГРГ Гонадотропин-релизинг гормон

ДАБ 3,3'-Диаминобензидин

ДБГ дофамин-бетта-гидроксилаза

ДГБА дигидроксибензиламид гидробромид

ДГФА дигидроксифенилаланин

ДК День культивирования

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГХ иммуногистохимия

кРНК комплементарная рибонуклеиновая кислота

ЛГ Лютеинезирующий горион

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

ОП оптическая плотность

РИА Радиоиммуный анализ

СВ Срединное возвышение

СОТП Сосудистый орган терминальной пластинки

ТГ Тирозин гидроксилаза

ФБ Фосфатный буфер

ФНМТ Фенилэтаноламин-Н-метил-трансфераза

ФРГ Фактор роста гепатоцитов

ФСГ Фолликуло-стимулирующий гормон

ЦАМФ циклоаденозинмонофосфат

ЦСБ Цитратно-солевой буфер

Э День эмбрионального развития

ЭДС Этан-1,2-диметан сульфат

I. Обзор литературы.

1. Введение.

Репродуктивная функция является одной из важнейших функций для всех животных. Осуществление этой функции определяется точным взаимодействием большого числа нервных, эндокринных и поведенческих реакций организма. Динамика эндокринных процессов, связанных с репродукцией, контролируется уровнем секреции в гипоталамо-гипофизарную портальную систему циркуляции крови гонадотропин рилизинг-гормона (ГРГ). Этот декапептид синтезируется небольшой (800-2000) популяцией нейронов, расположенных у большинства млекопитающих диффузно в септо-преоптической области и переднем гипоталамусе (Silverman, 1988). Большая часть аксонов этих нейронов заканчивается в срединном возвышение, где выделение ГРГ в систему портальной циркуляции крови регулирует синтез и выделение лютеинезирующего и фолликулостимулируещего гормонов гонадотропоцитами. Кроме того, ГРГ играет нейромодуляторную роль в регуляции полового поведения и передачи ольфактивных сигналов (Dubois et al., 2002).

ГРГ система у взрослых животных, в свою очередь, находится под сложным нейро-эндокринным контролем. Одними из важнейших регуляторов функциональной активности ГРГ нейронов являются катехоламины (Kalra and Kalra, 1983, Kalra, 1985), в основном дофамин и норадреналин, поступающие по афферентным волокнам из перивентрикулярного ядра гипоталамуса и ствола мозга (Jennes et al., 1982, Jennes et al., 1983, Horvath et al., 1993). Действие катехоламинов опосредованно рецепторами, которые экспрессируются ГРГ нейронами (Lee et al., 1995, Hosny and Jennes, 1998).

У позвоночных большая часть ГРГ нейронов образуется в пренатальный период вне мозга из эпителия обонятельных плакод (Wray et al., 1989). Далее ГРГ нейроны мигрируют в пренаталном онтогенезе в передний мозг, что бы занять свое место в

гипоталамо-гипофизо-гонадной оси у взрослых животных. Миграция ГРГ нейронов в назальной части головы происходит в тесной связи с терминальными, вомероназальными и обонятельными нервами (Wray et al., 1989), после проникновения в мозг через решетчатую пластинку решетчатой кости ГРГ нейроны продолжают мигрировать к септальной области переднего мозга по траектории терминального нерва (Yoshida et al, 1995). Нарушение миграции ГРГ нейронов, связанное с отсутствием белка клеточной адгезии, приводит к недоразвитию гонад и отсутствию обоняния у людей, известное как синдром Кальмана (Schwanzel-Fulcuda et al., 1989).

Актуальной проблемой нейробиологии развития в целом является дифференцировка и миграция нейросекреторных клеток гипоталамуса в места их постоянной локализации. Удобной моделью для изучения процесса миграции могут служить ГРГ нейроны, так как только эти нейроны образуются далеко от места их постоянного расположения - в эпителии обонятельных плакод и затем по терминальному нерву мигрируют в мозг, в ростральный гипоталамус. Эта модель удобна по двум причинам: во-первых, ГРГ нейроны мигрируют на достаточно большое расстояние, и, во-вторых, эта миграция происходит в течение длительного периода: от нескольких дней у мышей до нескольких недель у овец (Wray et al., 1989, Caldani et al, 1995).

Изучение функциональной активности ГРГ нейронов, а также механизмов их миграции и дифференцировки крайне затруднено их небольшим количеством и диффузным расположением у взрослых животных и у плодов. Поэтому за последнее десятилетие были созданы несколько моделей изучения ГРГ нейронов in vitro и in vivo: (1) GT1-7, линия клонированных клеток мыши, происходящих из опухоли в гипоталамусе, экспрессирующих крысиныи ген ГРГ (Mellon et al., 1990), (2) GnlO (NLT) и Gnl 1, линии клонированных клеток мыши, происходящих из опухоли в обонятельных луковицах, экспрессирующих ген ГРГ человека (Radovick et al., 1991b), (3)

органотиптческие культуры обонятельных плакод различных млекопитающих (Terasawa et al., 1993, Wray et al., 1994, Duittoz et al., 1997), (4) линии мышей, у которых транскрипция с гена ГРГ связана с экспрессией ß-галактозидазы или флюресцентным маркером (Spergel et al., 1999, Skynner et al., 1999, Suter et al., 2000). Использование этих моделей значительно облегчает исследование ГРГ нейронов.

В последние десятилетие было предпринято много попыток определить те или иные фавкторы, влияющие на миграцию и дифференцировку ГРГ нейронов. В "донейротрансмиттерном" эмбриональном периоде развития мозга, катехоламины являются высокоэффективными морфогенетическим факторами, влияющими на дифференцировку и миграцию клеток-мишеней (Lauder, 1993, Pabatti et al., 1995). Это дает возможность предположить возможность их влияние на развитие своих будущих клеток-мишеней - ГРГ нейронов.

2. ГРГ система взрослых млекопитающих.

2.1 Синтез ГРГ и формы ГРГ.

2.1.1 Ген, транскрипция и процессинг РНК ГРГ.

Впервые существование ГРГ было предположено в 1950 году (Harris, 1950), однако его ничтожное малое количество в гипоталамусе затруднило его выделение и очистку, и ГРГ был впервые выделен и описан только двадцать лет спустя из гипоталамуса овец и свиней (Amoss et al., 1971, Matsuo et al., 1971). Еще через пятнадцать лет изолирование и клонирование гена проГРГ человека, крысы и мыши (Adelman et al., 1986, Mason et al., 1986) позволило исследовать экспрессию гена ГРГ млекопитающих в нормальных и экспериментальных условиях.

Первичный РНК транскрипт гена ГРГ содержит четыре экзона и три интрона. Первый экзон кодирует 5'-нетранслируемый участок РНК, второй экзон кодирует некоторые участки молекулы препрогормона ГРГ: он включает в себя сигнальную последовательность, сайты энзиматического амидирования и процессинга предшественника, последовательность самого декапептида и первые 11 аминокислот гонадотропин-ассоциированного пептида (ГАП). Третий экзон несет информацию о следующих 32 аминокислотах ГАП. Четвертый экзон кодирует последние 13 аминокислот ГАП, терминирующий трансляцию участок и З'-нетранслируемый участок (Seeburgetal., 1984, рис. 1).

У человека и мыши транскрипция с гена проГРГ начинается с промотера, расположенного в 5'фланкирующей области гена (Radovick et al., 1990, Yu et al., 1994). У крыс транскрипция может начинаться с одного основного и двух дополнительных промотерных участков (Bond et al., 1982). Более того, промотер у крыс может содержать не только активирующие, но и ингибирующие последовательности (Nelson et al., 1998). Промотер гена проГРГ содержит сайты связывания POU-домен факторов транскрипции

(Oct-1, SCIP/Oct-6/Tst-l) (Nelson et al., 1998). В отличие от человека, промотер гена проГРГ у крыс не содержит функциональных областей связывания эстрогенов (Radovick et al., 1991а, Nelson et al., 1998).

Первичный РНК транскрипт гена ГРГ подвергается процессингу в ядре нейрона. У крыс процессинг РНК осуществляется в строго определенном порядке: в начале осуществляется сплайсинг интрона В, сопровождаемый быстрой его деградацией, далее интроны А и С также подвергаются сплайсингу без соблюдения определенной последовательности (Jakubowski and Roberts, 1994, рис. 1). У мышей, а также в клетках линии GT1 определенной последовательности сплайсинга интронов обнаружено не было (Yeo et al, 1996, рис. 1). Получившаяся в итоге такого процессинга мРНК транспортируется в цитоплазму нейрона.

Уровень экспрессии ГРГ определяется уровнем транскрипции гена проГРГ, скоростью полиаденилирования и 5'-кэппинга синтезированной РНК, скоростью процессинга первичных транскриптов и сокростью транспотра синтезированной мРНК в цитоплазму.

Количество цитоплазматической мРНК зависит от обращения этой молекулы в цитоплазме, и в большей степени от скорости ее деградации (Goore and Roberts, 1997).

2.1.2 Трансляция мРНК ГРГ, процессинг пре-проГРГ и деградация зрелого декапептида.

Как для большинства биологических пептидов, белковая последовательность ГРГ синтезируется в процессе рибосомной трансляции специфической мРНК, которая кодирует пре-про-гормон ГРГ, состоящий из 92 аминокислот. Последовательность пре-про-ГРГ начинается с 23 преимущественно гидрофобных аминокислот сигнальной последовательности, необходимой для проникновения через мембрану шероховатого

эндоплазаматического ретикулюма. Сразу за этой последовательностью следует N-конец последовательности декапептида ГРГ, он представляет собой аминокислоту глютамин, которая при отделении сигнальной последовательности подвергается циклизации и становится дефинитивным N-концом декапептида ГРГ. За С-концом последовательности ГРГ находится последовательность из трех аминокислот, представляющая собой сайт энзиматического амидирования С-конца декапептида ГРГ и энзиматического разделения ГРГ и ГАП, и далее начинается последовательность из 56 аминокислот ГАП (Seeburg andAdelman, 1984, рис. 1).

В шероховатом эндоплазматическом ретикулюме отделение сигнальной последовательности приводит к образованию из пре-про-ГРГ про-ГРГ. Дальнейшее энзиматическое разделение приводит непосредственно к образованию ГРГ.

Зрелый ГРГ колокализован с ГАП и про-ГРГ в нейронах септо-преоптической области и медиобазальном гипоталамусе у крыс (Phillips et al., 1985). Все три молекулы обнаруживают в телах нейронов и проксимальных о�