Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференцировка катехоламинергических нейронов гипоталамуса крыс и ее половые особенности

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Дифференцировка катехоламинергических нейронов гипоталамуса крыс и ее половые особенности"

\ ц и»

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 591.481/1

БАЛАН Ирина Сергеевна

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА КРЫС И ЕЕ ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ

03.00.11 - Эмбриология, гистология, цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН и в лаборатории цитологии Института Нейронаук Университета им. П. и М. Кюри (Париж)

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор М. В. Угрюмов, профессор А. Калас

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Д. А. Сахаров доктор биологических наук, профессор В. Н. Бабичев

Ведущая организация:

Институт морфологии человека РАМН.

Защита состоится "Л" 1997 г. в/У часов на заседании

Диссертационного совета Д002.85.01 при Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (117334 Москва, ул. Вавилова, 26, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБР РАН Автореферат разослан ¿^¡Г"__ь^Ь-Л-Л^ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета:

кандидат биологических наук Е. В. Волина

Зак. 81 Тираж 100 Отпечатано ПП "Патент" Бережковская наб., 24, стр. 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Катехоламинергическая система гипоталамуса является одним из важнейших звеньев нейроэндокринной регуляции. Катехоламины (КА), синтезируемые гипоталамическими нейронами, с одной стороны, выступают в роли нейромедиаторов или нейромодуляторов, регулируя функциональную активность нейросекреторных нейронов - синтез и выделение пептидов (Weiner at al., 1988; Calas, 1994), а с другой, в качестве нейрогормонов, через портальный кровоток, действуют на железистые клетки аденогипофиза (Neill, 1989). Особое значение имеет тубероинфундибулярная дофаминергическая система, которая гуморальным путем оказывает ингибирующее влияние на секрецию пролактина (Weiner and Ganong, 1978; Ben-Jonathan, 1985).

Чтобы в полной мере оценить роль катехоламинергической (КА-ергической) системы в механизмах нейроэндокринной регуляции у взрослых животных весьма перспективным является онтогенетический подход в ее изучении (Мицкевич, 1978; Угрюмов, 1989). Знание основных закономерностей дифференцировки КА-ергической системы гипоталамуса может пролить свет и на участие КА в регуляции морфогенетических процессов, реализующихся, в основном, в перинатальном периоде развития (Lauder, 1993). Появившиеся в последние годы данные о влиянии КА на экспрессию генов пептидергических нейронов-мишеней в критические периоды развития (Ugrumov, 1994) привлекают особое внимание к изучению ранних этапов дифференцировки КА-ергической системы.

ДиффсрСМЦ'.'рСВКЗ HS^PCHC?, КЗ1^ !1"эЕ°СТип ияимняетга г. мпмрнтя ИХ

"рождения", т.е. прекращения пролиферации матричных клеток-предшественников (Грачева, 1968; Altman а. Bayer, 1986). Определение времени выхода нейронов в дифференцировку имеет не только важное научно-теоретическое значение, но также необходимо для решения задач медицинской практики, в частности, при заместительной нейротрансплантации в поврежденные участки мозга.

Важным фактором дифференцировки КА-ергических нейронов является экспрессия ферментов синтеза КА и самих КА, которые и оказывают морфогенетическое действие на формирование специфических черт фенотипа клеток-мишеней (Максимова, 1985).

Наряду с типичными КА-ергическими нейронами в гипоталамусе обнаружены нейроны, содержащие только один из ферментов синтеза КА

(Jaeger et a!., 1983, 1984; Skagerberg et al., 1988), функциональное значение которых до сих пор остается невыясненным.

В последние годы в литературе особое внимание уделяется половым различиям в КА-ергических системах мозга, которые, как оказалось, определяются не только половыми гормонами, но и детерминированы генетически.

Таким образом, актуальность изучения дифференцировки КА-ергической системы гипоталамуса определяется ее ключевой ролью в морфогенетических процессах и в формировании нейроэндокринной регуляции в развивающемся организме.

Цель и задачи исследования. Основная цель проведенных исследований состояла в изучении формирования КА-ергической системы гипоталамуса в перинатальный период развития и выяснении роли половых гормонов в этом процессе.

Для решения сформулированной проблемы необходимо было:

1) определить время выхода в дифференцировку КА-ергических нейронов трех областей гипоталамуса - аркуатной, перивентрикулярной и зоны инсерта у самцов и самок крыс, используя двойное мечение (иммуногистохимическое выявление тирозингидроксилазы (ТГ) и "тимидиновая" авторадиография);

2) оценить экспрессию первого и второго ферментов синтеза дофамина - ТГ и ДОФА-декарбоксилазы (ДДК) в дифференцирующихся нейронах медиобазального гипоталамуса (МБГ) у самцов и самок;

3) выяснить роль мужских половых гормонов в развитии дофамин-продуцирующих нейронов МБГ.

Научная новизна работы. Впервые определены периоды выхода в дифференцировку КА-ергических нейронов в трех областях гипоталамуса -аркуатной, перивентрикулярной и зоне инсерта. При этом впервые обнаружен половой диморфизм в образовании КА-ергических нейронов всех трех исследуемых областей гипоталамуса, который обусловлен не влиянием мужских половых гормонов, а детерминирован генетически.

Анализ экспрессии ТГ и ДДК, позволил выявить в развивающемся МБГ 4 популяции нейронов, отличающихся по времени начала синтеза ферментов и их внутриклеточному содержанию, а также по локализации нейронов, экспрессирующих эти ферменты. Впервые было показано, что в МБГ в перинатальный период практически отсутствуют истинно дофаминергические нейроны, зато обнаружены большие популяции нейронов, экспрессирующих

либо ТГ, либо ДДК, которые, возможно, взаимодействуют, обеспечивая синтез дофамина.

Нейроны, вырабатывающие ТГ или ДДК, в процессе дифференцировки характеризуются половым диморфизмом, который проявляется в количестве этих нейронов, размере тел и в содержании ферментов. Кастрация новорожденных самцов нивелировала эти различия, что свидетельствует о влиянии мужских половых гормонов на дифференцировку дофамин-продуцирующих нейронов.

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ лаборатории гормональных регуляций ИБР им. Н. К. Кольцова "Структурно-функциональные основы становления нейрозндокринных механизмов регуляции процессов онтогенеза" в рамках программы проектов: РФФИ "Роль моноаминов в нейроэндокринной регуляции в онтогенезе", "Дифференцировка нейронов и ее нейрогуморальная регуляция"; ISF (SOROS) по теме: "Development ot the hypothalamic peptidergic and monoaminergic systems in ontogenesis"; INTAS-RFBR по теме: "Monoaminergic and peptidergic neurons: differentiation, plasticity, and regulation of phenotype expression in intracellular signalling" Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Нейробиологические аспекты современной эндокринологии" (Москва, 1991), на Конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 1993), на Международной конференции "Mechanisms of Development: Ontogenetic and Phylogenetic Aspects" (Москва, 1994), на Всероссийской конференции "Нейроэндокринология - 95" (С-Петербург, 1995),

1,1 ............... '4ft-, Dior^m,^! МппКпгч л* »Ил C^ninb/

■■^'■•rtj • ^«^..W . 'Y^I-VI .^..r.....WW............. . ..W. IW. WVV.WIJ

for Developmental Neuroscience" (Tampere, Finland, 1996); Международном симпозиуме "8th International Catecholamine Symposium" (California, USA, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9, сдано в печать 2 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и включает в себя 9 графиков, 6 схем, 9 микрофотографий, 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные, фиксация. В работе использованы крысы Wistar: самки с 11 по 17 дни беременности, самцы и самки на 18, 20, 22 дни эмбрионального (ДЭ) развития, на 1 и 9 дни постнатального развития (ДП) и 2-4 недельные. Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках. Животных под нембуталовым наркозом (40 мкг/кг) перфузировали через сердце сначала 0.9% раствором NaCI при 37°С в течение 2-5 мин до полного вымывания крови из сосудов, а затем фиксатором -4% параформальдегидом на 0.1 M фосфатном буфере (рН 7.3) в течение 15 мин при 4°С. После фиксации перфузией животных декапитировали, выделяли у них гипоталамус. Гипоталамус плодов дофиксировали в 4% параформальдегиде при 4°С в течение 2 ч, а 9 дневных и 2-4 недельных крыс - в течение 4 ч.

Двойное мечение - иммуногистохимия с использованием антител к тирозингидроксилазе и 3Н-тимидиновая авторадиография. Метод двойного мечения основан на иммуногистохимическом выявлении ТГ и регистрации последнего митотического деления клеток-предшественников нейронов 3Н-тимидиновой авторадиографией. Беременным крысам однократно внутрибрюшинно вводили 3Н-тимидин (уд. акт. 12 Ки/мМ; Изотоп, Россия) в дозе 5 мкКи/г на 11, 12, 13, 14, 15, 16 и 17 дни беременности в определенное время суток (17 ч). Полученное потомство содержали в нормальных лабораторных условиях до 2-4 недельного возраста.

Фиксированный гипоталамус 2-4 недельных крысят (3-6 самцов и 3-6 самок минимум от двух матерей) отмывали в 0.02 M фосфатном буфере с 0.9% NaCI (ФБС, рН 7.2-7.4) в течение 12 часов при 4°С. Серийные срезы толщиной 50 мкм, приготовленные на вибратоме (Oxford Instruments) последовательно инкубировали: 1) в 0.3% Н2О2 полчаса при комнатной температуре, 2) в 0.1% тритоне Х100, приготовленном на ФБС, с добавлением 3% нормальной сыворотки овцы 1 час при комнатной температуре, 3) с первыми кроличьими антителами против ТГ (1:1000) в течение одной ночи при 4°С, 4) с антителами козы против иммуноглобулинов кролика (Miles Laboratory) (1:200) в течение 2 часов, 5) с пероксидазо-антипероксидазным комплексом (Dakopatt) в разведении 1:200 в течение одного часа при комнатной температуре, 6) с 0.01% Н2О2 в 0.01% растворе

3,3-диаминобензидин-тетрагидрохлорида на 0.05 М Tris-HCI-буфере (рН 7.6; SIGMA), обеспечивающем образование темнокоричневого нерастворимого осадка в местах локализации пероксидазы (Угрюмов, 1991). После каждой вышеописанной инкубации с антисывороткой срезы промывали в ФБС с добавлением 1% нормальной сыворотки овцы. Для контроля специфичности реакции исключали инкубацию с первой антисывороткой. Вибратомные срезы отмывали в 0.02 М фосфатном буфере, обезвоживали в ацетонах возрастающей концентрации, заливали в смесь эпона с аральдитом и проводили полимеризацию блоков при 58°С в течение 48 часов. Из срезов выделяли аркуатное ядро, перивентрикулярную область и зону инсерта.

На ультратоме LKB-III готовили полутонкие (2мкм) серийные фронтальные срезы из залитых в смолу вибратомных срезов, покрывали их эмульсией типа М (ГОСНИИ Химфотопроект, Москва) в разведении 1:2, экспонировали 3 месяца и проявляли в амидоловом проявителе в течение 5 мин при 19°С.

Для количественного анализа использовали каждый третий полутонкий срез, чтобы исключить повторный подсчет одного и того же меченого ядра нейрона. Нейроны с двойным мечением классифицировали как радиоактивно слабо-, средне- и высокомеченные в зависимости от количества зерен восстановленного серебра над ядром. Радиоактивно мечеными считали ТГ-ИП нейроны с более чем 10 зернами восстановленного серебра на ядро. Время выхода в дифференцировку ТГ-ИП нейронов определяли по индексу меченых ядер как отношение количества нейронов с двойной меткой к общему количеству ТГ-ИП-нейронов. Индекс мечения на один вибоатомный срез (MMR) вычисляли по следующей формуле:

N1HM+ N3flM+... Ытдм

ИМВ=-

N1Tr+ N V... NmTr

где Ыдм - количество клеток с двойной меткой на один полутонкий срез; Ытг - общее количество ТГ-ИП-нейронов (радиоактивно меченных и немеченных) на один полутонкий срез, и m - количество анализируемых полутонких срезов, полученных из одного вибратомного среза. Количество ТГ-ИП нейронов, просчитанных в каждой исследуемой гипоталамической области на каждый период введения 3Н-тимидина у каждого животного было не менее 280.

Согласно непараметрическому тесту Вилкоксона (Wilcoxon), переменные ИМв, подсчитанные у каждого исследуемого животного внутри каждой группы, получавшей 3Н-тимидин в один и тот же день, будь то самцы или самки, статистически не отличались между собой. Это позволило сравнивать ИМВ а) внутри каждой исследуемой гипоталамической области между предыдущим и последующим днями введения 3Н-тимидина отдельно у самцов и самок, б) между различными гипоталамическими областями на каждый день введения 3Н-тимидина (например, сравнивались переменные ИМВ аркуатного ядра на 12 ДЭ введения 3Н-тимидина с переменными ИМв зоны инсерта также на 12 ДЭ введения 3Н-тимидина и т.д.) отдельно у самцов и самок; в) между самцами и самками внутри одной и той же гипоталамической области на каждый день введения 3Н-тимидина.

Иммуногистохимия_с_использованием_антител_к

тирозингидроксилазе и ДОФА-декарбоксилазе на криостатных срезах.

После фиксации мозг на 18, 20 и 22 ДЭ и на 9 ДП инкубировали в криопротекторе (15% растворе сахарозы на ФБС) в течение ночи при 4°С, замораживали в изопентане при -45°С.

Для изучения колокализации ТГ и ДДК в одних и тех же нейронах были использованы "зеркальные" срезы. В этом случае криостатные серийные срезы (Юмкм) монтировали на два предметных стекла (первый срез на одно стекло, второй- на другое и т.д.), причем каждый второй срез клали перевернутым. И, таким образом, в рассеченных ножом криотома нейронах, в одной их половине выявляли ТГ, а во второй - ДДК с помощью авидин-биотин-пероксидазного метода.

Этот метод состоял из тех же этапов инкубации, которые описаны выше для пероксидазо-антипероксидазного метода, но с небольшими модификациями: разведение первых антител против ТГ было 1:3000, и против ДДК - 1:1500; для выявления вторых антител использовали авидин-биотин-пероксидазный комплекс (ABC-kit, BIOSYS) (1:200). Срезы, обезвоженные в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле, заключали в пермаунт.

Компьютерная трехмерная реконструкция. Установка для построения трехмерной реконструкции распределения ТГ-иммунопозитивных (ИП) и ДДК-ИП нейронов МБГ включала 1) световой микроскоп (объектив Х25) с автоматически движущимся объектным столиком, 2) черно-белую видеокамеру

(CCD), 3) компьютер (IBM PC pentium 60). Информацию с каждого среза ввиде изображения МБГ проецировали на экран монитора и обрабатывали с применением программы IMSTAR. Тела ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов с хорошо выраженным ядром маркировали, обводя их курсором. Обводили также границы третьего желудочка и вентральной поверхности гипоталамуса, которые служили макроориентирами при совмещении срезов. С помощью графической программы Silicon Graphics SGI lndigo2 (IMOD, Boulder Laboratory for 3-Dimensional Fine Structure, University of Colorado), последовательно накладывая один зеркальный срез с ТГ-ИП нейронами на другой срез с ДДК-ИП нейронами, получали трехмерную реконструкцию распределения ТГ-ИП и/или ДДК-ИП нейронов.

Морфо- и денситометрия тирозингидроксилаза- и ДОФА-декарбоксилаза-иммунопозитивных нейронов. С помощью программы IMSTAR проведен количественный анализ ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов аркуатного ядра самцов и самок крыс: на 18 ДЭ, 20 ДЭ и на 9 ДП (не менее 4 животных на каждый срок), а также 9 дневных самцов, кастрированных на 1 ДП и 9 дневных самок, ложнооперированных на 1 ДП (по 4 животных). С этой целью использовали серийные срезы (10 мкм), на которых выявляли ТГ и ДДК (см. выше). На каждое предметное стекло монтировали по 4 среза МБГ интактного самца и по 4 среза МБГ интактной самки. Также на одно и то же предметное стекло клали по 4 среза МБГ кастрированного самца и по 4 среза МБГ ложнооперированной самки.

Интактные самцы и самки, а также кастрированные самцы и ложнооперированные самки сравнивались по следующим показателям: 1) количество ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов на срез; 2) площади тел ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов; 3) оптические плотности тел ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов.

Изображение со срезов (объектив микроскопа Х25) проецировали на экран монитора, и тела ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов маркировали для дальнейшего количественного анализа.

Для определения оптической плотности использовали усредненный по выделенной площади показатель - "уровень серого" (УС), корреллирующий с интенсивностью иммуноокрашивания каждого исследуемого тела клетки ("образца") - чем темнее "образец", тем ниже УС. Кроме этого курсором выделяли область на срезе, где не присутствовали иммунопозитивные

элементы, и которую обозначали как "фон". Оптическую плотность (ОП) тел ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов вычисляли по следующей формуле:

ОПобразца-ОПфона= 1д(УСфонА> - ^(УСобразца)

Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического теста Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение времени выхода в дифференцировку тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов.

В гипоталамусе нейроны, синтезирующие КА, по своей природе являются дофаминергическими ( В]огк!ипс! а. №Ып, 1973; Вргк1ипс1 а. Ыпс1уа11, 1984). В основном, они локализованы в трех областях: аркуатном ядре, в зоне инсерта и в перивентрикулярном ядре.

Дифференцировка нейронов, как известно, начинается с момента прекращения пролиферации матричных клеток-предшественников (Грачева, 1968).

1.1 Аркуатное ядро. ТГ-ИП нейроны аркуатного ядра выходят в дифференцировку с 12 ДЭ, причем этот процесс продолжается до 16 ДЭ с пиками на 12 и 15 ДЭ у самцов и на 14 ДЭ у самок. (рис.1а). Сравнение полученных данных с более ранними иммуногистохимическими наблюдениями (Оа1коки е! а1., 1986; идгитоу е1 а1., 1989) приводит к предположению, что ТГ-ИП нейроны аркуатного ядра выходят в дифференцировку намного раньше, чем в них удается обнаружить ТГ (Оа1коки е1 а1., 1986; идгитоу е1 а1., 1989), и, что существенно отличает эти нейроны от дофаминергических нейронов других областей мозга. Эта задержка в экспрессии ТГ после выхода нейронов аркуатного ядра в дифференцировку обусловлена либо тем, что уровень ТГ в клетках ниже разрешающей способности иммуногистохимического метода, либо тем, что миграция ТГ-ИП нейронов из мест их образования в аркуатное ядро является длительным процессом.

Обнаруженные в настоящей работе два пика выхода в дифференцировку ТГ-ИП нейронов у самцов, по-видимому, свидетельствуют о существовании в аркуатном ядре двух популяций ТГ-ИП нейронов, которые прекращают делиться в разные сроки. Одной из таких популяций у взрослых животных, вероятно, является скопление дофаминергических нейронов в

дорсомедиальной области аркуатного ядра (Okamura et al., 1988; Zoli et al., 1993). Помимо дофамина в ТГ-ИП нейронах аркуатного ядра обнаружены вещества другой химической природы, например, пептиды (Okamura et al., 1985; Everitt et al., 1986; Melander et al., 1986; Tinner et al., 1989). Вероятно, обнаруженный нами довольно высокий процент радиоактивно меченых ТГ-ИП клеток в аркуатном ядре на 12 ДЭ связан с более ранним выходом в дифференцировку нейронов, продуцирующих не дофамин, а какие-либо другие физиологически активные вещества.

1.2. Зона инсерта. Выход в дифференцировку ТГ-ИП нейронов зоны инсерта у самцов происходит в течение короткого периода, в основном, на 12 и 13 ДЭ, что, по-видимому, свидетельствует о синхронной пролиферации их клеток-предшественников. Период образования ТГ-ИП нейронов у самок более длительный - с 12 по 16 ДЭ, с пиком на 12 и 13 ДЭ (рис. 16). В эмбриональной закладке зоны инсерта ТГ-, ДДК-ИП нейроны и КА-флюоресцентное свечение в нейронах обнаруживают рано в онтогенезе - на 13-15 ДЭ (Schlumpf et al., 1980; Jaeger, 1986; Ugrumov et al., 1989), что указывает на наличие небольшого латентного периода между последним митотическим делением клеток-предшественников и началом синтеза ТГ, характерного для дофаминергических нейронов других отделов мозга (Lauder and Bloom, 1974).

1.4 Перивентрикулярное ядро. Максимальный выход в дифференцировку ТГ-ИП нейронов перивентрикулярного ядра у самцов и самок приходится на 12 и 13 ДЭ. Причем, процент радиоактивно меченых ТГ-ИП нейронов к 16 ДЭ постепенно снижается (рис. 1в). Показано, что ТГ-, дофамин-ИП нейроны и КА-флюоресцентное свечение в нейронах перивентрикулярного ядра впервые обнаруживают на 18-19 ДЭ (Ugrumov et al., 1989; Borisova et al., 1991; Kalsbeek et al., 1992). Это свидетельствует о том, что основное количество нейронов перивентрикулярного ядра начинает экспрессировать ТГ лишь через 4-6 дней после последнего митотического деления их клеток-предшественников.

Таким образом, ТГ-ИП нейроны гипоталамуса выходят в дифференцировку в соответствие с дорсовентральным градиентом: первыми образуются нейроны дорсальной области - зоны инсерта, затем - средней области - перивентрикулярного ядра, и последними - нейроны вентральной области - аркуатного ядра. Это, вероятно, свидетельствует о том, что каждая популяция ТГ-ИП нейронов образуется из определенного участка нейроэпителия.

1.5 Половой диморфизм. Во всех трех исследованных областях гипоталамуса обнаружены половые различия в выходе в дифференцировку ТГ-ИП нейронов. Половой диморфизм проявляется как в количестве радиоактивно меченых ТГ-ИП нейронов, так и в динамике их образования. Наиболее дорсальная популяция ТГ-ИП нейронов гипоталамуса, относящаяся к зоне инсерта, выходит в дифференцировку раньше у самцов, чем у самок (рис. 16). Средняя в дорсовентральном направлении популяция ТГ-ИП нейронов гипоталамуса, образующая перивентрикулярное ядро, выходит в дифференцировку приблизительно в одно и то же время у самцов и самок, однако суммарный процент нейронов с двойной меткой выше у самок, чем у самцов (рис. 1в). ,

Популяция ТГ-ИП нейронов вентрального отдела гипоталамуса выходит в дифференцировку раньше у самок, чем у самцов. Кроме того, у самок основное количество ТГ-ИП нейронов во всех трех областях гипоталамуса выходит в дифференцировку в течение более короткого периода (13-14 ДЭ), чем у самцов (12-15 ДЭ).

Половая дифференцировка мозга (ПДМ) осуществляется под влиянием мужских половых гормонов в определенный, так называемый критический период онтогенеза, который у крыс приходится на последние дни пренатального развития и первую неделю постнатальной жизни (Резников, 1982; Gorski, 1988). Хотя основным продуктом секреции семенников является тестостерон, ПДМ у крыс осуществляется под влиянием продукта его ароматизации - эстрогенов, образующихся в самом мозге (Naftolin et al., 1971; Weizs and Gibbs, 1974). Однако, в последние годы появились данные in vitro о половых различиях в дифференцирующихся дофамин-ергических нейронах промежуточного мозга в отсутствии половых стероидов (Reisert et al., 1989; 1994; Kolbinger et al., 1991), т.е. за счет генетической детерминированности.

Данные по выходу в дифференцировку ТГ-ИП нейронов, полученные в настоящей работе, являются первым доказательством in vivo того, что половой диморфизм нейронов не во всех случаях определяется влиянием тестостерона, а может быть детерминирован генетически. Действительно, обнаруженные половые различия во времени выхода ТГ-ИП нейронов в дифференцировку проявляются до начала секреции тестостерона (Weisz and Ward, 1980).

2. Экспрессия ферментов ТГ и ДДК нейронами МБГ в перинатальный период развития.

Полученные нами данные позволяют выделить четыре популяции нейронов, экспрессирующих ТГ и/или ДДК, в МБГ в течение перинатального периода развития. К первой популяции относится наиболее обширное скопление ТГ-ИП нейронов в вентролатеральной области аркуатного ядра, которое впервые обнаружено на 18 ДЭ (рис. 2). Эти нейроны были описаны ранее (Оа1коки е1 а1., 1986; идгитоу е1 а1., 1989а) и отнесены к дифференцирующимся дофаминергическим нейронам. Однако, их нельзя считать истинно дофаминергическими, т.к. в этой части аркуатного ядра ни на одном из исследуемых нами сроков развития, также как и у взрослых животных (Ме^ег е{ а1., 1988; Окатига е! а1., 1988с), не были обнаружены нейроны, экспрессирующие ДДК.

Выявление в нейронах вентролатеральной области аркуатного ядра только одного из ферментов синтеза дофамина - ТГ, ставит вопрос о природе и функциональном значении этих нейронов. У взрослых животных гомологичные нейроны коэкспрессируют нейропептиды (Окатига е( а1., 1985; Еуел'й е1 а)., 1986) и, по-видимому, имеют немоноаминергическую природу.

Возможно, что диоксифенилаланин, синтезирующийся из тирозина в дифференцирующихся ТГ-ИП нейронах вентролатеральной области аркуатного ядра, выполняет роль нейромедиатора, как это происходит в стриатуме и гипоталамусе у взрослых животных (СоБЫта е! а1., 1988, 1991; Ыакатига е! а1., 1992). Не исключено также, что диоксифенилаланин диффундирует из этих нейронов и захватывается близлежащими ДДК-ИП нейронами и в них декарбоксилируется с образованием дофамина фоН е1 а(., 1993).

Нейроны МБГ, относящиеся ко второй популяции, экспрессируют только второй фермент синтеза дофамина- ДДК. Эти нейроны впервые обнаружены на 20 ДЭ (рис. 26). В течение пренатальной жизни и на 9 ДП, также как и у взрослых животных (Окатига е1 а1., 1988), ДДК-ИП нейроны расположены в дорсомедиальной области аркуатного ядра. В отличие от вентролатеральной популяции ТГ-ИП нейронов, количество и размеры нейронов этой популяции увеличиваются в несколько раз в течение не только пренатального, но и постнатального периода (рисЗ,4), что свидетельствует о более ранней дифференцировке ТГ-ИП нейронов.

Популяция ДДК-ИП нейронов, возможно, также вовлечена в синтез дофамина, но не из тирозина, а из диоксифенилаланина, образующегося в ТГ-

ИП нейронах. Подобная способность нейронов, содержащих ДДК, но не экспрессирующих ТГ, захватывать (Lidbrink et al., 1974; Tison et al., 1991) и декарбоксилировать диоксифенилаланин (Tison et al., 1991) обнаружена в промежуточном мозге у взрослых животных.

ДЦК-позитивные/ТГ-негативные нейроны были обнаружены ранее не только в гипоталамусе, но и в других отделах мозга (Jaeger et al., 1983, 1984). Не исключено, что в этих нейронах декарбоксилируется не только диоксифенилаланин, но и другие аминокислоты с образованием фенилэтиламина, тирамина или триптамина (Jaeger, 1986; Vincent and Hope, 1990).

Компьютерная реконструкция позволила обнаружить в аркуатном ядре третью, самую малочисленную популяцию нейронов, экспрессирующих одновременно ТГ и ДДК. Колокализация этих ферментов свидетельствует о том, что эти нейроны способны синтезировать дофамин, т. е. они являются истинно дофаминергическими. Нейроны, содержащие оба фермента, и в пренатальном и постнатальном периоде развития локализованы в дорсомедиальной области аркуатного ядра. Количество этих нейронов увеличивается незначительно в процессе развития - от 1% на 20 ДЭ до 2% на 9 ДП от общего числа ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов.

Несмотря на то, что в настоящее время нет биохимических данных о метаболизме дофамина в развивающемся МБГ, о возможном синтезе дофамина в этой области можно судить по наличию ингибиторного контроля дофамином секреции пролактина аденогипофизом, который обнаруживают уже на 4 ДП (Ojeda and McCann, 1974). По-видимому, обнаруженного в настоящей работе количества истинно дофаминергических нейронов недостаточно, чтобы контролировать секрецию пролактина. Это еще раз позволяет предположить, что нейроны, которые экспрессируют либо ТГ, либо ДДК, могут взаимодействовать, обеспечивая синтез дофамина.

Согласно нашим данным на 20 ДЭ в дорсомедиальной области аркуатного ядра локализованы единичные ТГ-ИП нейроны (рис. 26). В раннем постнатальном периоде (9 ДП), картина распределения ТГ-ИП нейронов меняется - большое количество этих нейронов локализовано не только в вентролатеральной, но и в дорсомедиальной области аркуатного ядра (рис. 2в), также, как и на 15 ДП (Piott et al., 1988) и у взрослых животных (Chan-Palay et al., 1984). Таким образом, в отличие от 20 ДЭ на 9 ДП количество ТГ-ИП нейронов дорсомедиальной области аркуатного ядра значительно превышает количество

нейронов, экспрессирующих одновременно ТГ и ДДК. Возможно, что в процессе развития ТГ-ИП нейроны из вентролатеральной области ядра мигрировали в дорсомедиальную. Однако, можно также предположить, что эти нейроны принадлежат к четвертой популяции, отличной от трех вышеперечисленных. В пользу этого предположения свидетельствуют данные, показывающие, что и у самцов и у самок оптические плотности ТГ-ИП нейронов в дорсомедиальной области выше (рис. 5), а размеры тел этих нейронов больше, чем в вентролатеральной (рис. 4). Более того, нами было показано, что у самцов в аркуатном ядре существует 2 пика выхода ТГ-ИП нейронов в дифференцировку (рис. 1а), что также является косвенным подтверждением наличия двух различных популяций ТГ-ИП нейронов в МБГ. Таким образом, на 9 ДП обнаружено два типа ТГ-ИП нейронов МБГ, отличающихся по уровню экспрессии в них ТГ и по размерам их тел. При этом одни нейроны расположены в дорсомедиальной, а другие - в вентролатеральной области аркуатного ядра.

В пренатальном периоде размеры ТГ-ИП нейронов вентролатеральной области аркуатного ядра у обоих полов увеличиваются, а постнатально (на 9 ДП) у самцов они практически не меняются, а у самок даже уменьшаются (рис. 4). Наличие более крупных размеров ТГ-ИП нейронов в пренатальный период связано либо с гиперфункцией нейронов на этом сроке развития, либо с тем, что уже в эмбриональном возрасте существует два типа ТГ-ИП нейронов, отличающихся по размерам их тел.

3. Половой диморфизм в развитии тирозингидроксилаза- и ДОФА-

декарбик(.-илаза-пм~мупОПйЗпТг!гнь:х :::Г:рс::с2 мод^обззз.ть него гипоталамуса.

Половые гормоны, вырабатывающиеся в перинатальном периоде развития, оказывают, по-видимому, не прямое, а опосредованное через КА-ергические системы мозга влияние на нейрогормональную регуляцию репродуктивной функции (Wilson et al., 1991). К настоящему моменту скопилось довольно много данных по половому диморфизму в распределении и количестве в различных отделах мозга КА-ергических нейронов и волокон, в уровнях и метаболизме КА, в активности ферментов их синтеза и т.д. (Demarest et al., 1981; Simerly et al, 1985; Simerly, 1989). Особое внимание в изучении морфо-функциональных половых различий отводится тубероинфундибулярной дофаминергической системе МБГ, участвующей в регуляции секреции пролактина, а также оказывающей влияние на выделение лю-либерина.

В настоящей работе обнаружен половой диморфизм в количестве ТГ- и ДДК-ИП нейронов МБГ, размере тел этих нейронов и их оптической плотности на всех исследуемых стадиях перинатального развития.

Начиная с 20 ДЭ отмечены достоверные половые различия в количестве ТГ-ИП нейронов МБГ - у самцов их больше, чем у самок (рис. 3), что, возможно, обусловлено индуцирующим действием половых гормонов на выживаемость нейронов или синтез в них ТГ. Важно подчеркнуть, что на 9 ДП половой диморфизм в количестве ТГ-ИП нейронов обнаружен нами только в вентролатеральной области аркуатного ядра (первая популяция), и не обнаружен в дорсомедиальной (четвертая популяция) (рис. 3). По-видимому, воздействие половых гормонов на количество ТГ-ИП нейронов является регионально-специфическим, что подтверждается данными, полученными ранее на взрослых животных (Yuri and Kawata, 1994). Более того, это является еще одним аргументом в пользу существования четвертой популяции нейронов МБГ, экспрессирующих ТГ, отличной от первой популяции.

В отличие от количества ТГ-ИП нейронов размеры тел этих нейронов и их оптические плотности выше у самок, чем у самцов (рис.4, 5). Эти половые различия на 18 ДЭ и 20 ДЭ присущи всем ТГ-ИП нейронам МБГ, а на 9 ДП -только нейронам дорсомедиальной области аркуатного ядра (четвертая популяция). Наши данные согласуются с более ранними наблюдениями на взрослых животных, показыващих, что интенсивность окрашивания ТГ-ИП нейронов и уровень мРНК ТГ в МБГ (Arbogast and Voogt, 1990) выше у самок, чем у самцов. По-видимому, ббльший размер дифференцирующихся ТГ-ИП нейронов МБГ у самок, чем у самцов объясняется более быстрой дифференцировкой этих нейронов у самок, что согласуется с нашими данными по выходу в дифференцировку ТГ-ИП нейронов аркуатного ядра, и результатами in vitro других авторов (Reisert et al., 1989) по морфогенезу развивающихся ТГ-ИП нейронов в культуре диэнцефалона.

Аналогичная тенденция - более быстрая дифференцировка нейронов у самок, чем у самцов, - проявляется и в отношении ДДК-ИП нейронов, что выражается в большем их количестве, в более крупных размерах их тел и более высокой оптической плотности этих нейронов у самок по сравнению с самцами (рис. 3, 4, 5).

Для оценки роли мужских половых гормонов в развитии ТГ-ИП и ДДК-ИП нейронов МБГ проведены опыты с кастрацией новорожденных самцов.

При этом обнаружено, что выключение действия мужских половых гормонов в период ПДМ нивелирует половые различия, обнаруженные в норме в нейронах МБГ, экспрессирующих ферменты синтеза дофамина.

Таким образом, обнаруженый нами половой диморфизм в интенсивности эспрессии ферментов синтеза дофамина, в количестве и размере тел ТГ- и ДДК-ИП нейронов в критический период ПДМ определяется мужскими половыми гормонами.

ВЫВОДЫ

1. Тирозингидроксилаза-иммунопозитивные нейроны зоны инсерта, перивентрикулярного и аркуатного ядер образуются с 12 по 16 дни пренатального развития у самцов и самок крыс. Динамика этого процесса характеризуется дорсовентральным градиентом.

2. Обнаружены половые различия в динамике выхода тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов в дифференцировку: в зоне инсерта нейроны образуются раньше у самцов, чем у самок, а в аркуатном ядре, наоборот, раньше у самок, чем у самцов.

3. В аркуатном ядре в перинатальном периоде обнаружены четыре популяции нейронов: две популяции, экспрессирующие тирозингидроксилазу, локализованы одна в вентролатеральной области ядра, другая - в дорсомедиальной; популяция, синтезирующая ДОФА-декарбоксилазу, а также истинно дофаминергическая популяция, экспрессирующая тирозингидроксилазу и ДОФА-декарбоксилазу, расположены дорсомедиальмо.

4. Нейроны медиобазального гипоталамуса, экспрессирующие тирозингидроксилазу и ДОФА-декарбоксилазу, в процессе дифференцировки характеризуются половым диморфизмом, который проявляется в количестве этих нейронов, размере тел и в содержании ферментов.

5. Половые различия дифференцирующихся тирозингидроксилаза- и ДОФА-декарбоксилаза-иммунопозитивных нейронов определяются мужскими половыми гормонами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ И ПОДГОТОВЛЕННЫХ К ПЕЧАТИ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балан И. С., Борисова Н. А., Угрюмов М. В. Изучение сроков выхода катехоламинергических нейронов гипоталамуса в дифференцировку.

Сборник научных трудов. Нейробиологические аспекты современной эндокринологии. Москва. 1991. с.10.

2. Borisova N. A., Ugrumov М. V., Balan I. S. and Thibault J. Development of the tuberoinfundibular system in rats: bithdates of the tyrosine hydroxylase-¡mmunopositive neurons. Developmental Brain Research, 1993, V. 73, P. 173176.

3. Balan I., Borisova N. A., Proshlyakova E. V., Sapronova A. Y., Halasz В., Thibault J., Ugrumov M.V. Development of the dopamine tuberoinfundibular system in rats during ontogenesis. Intern, conference "Mechanisms of development: ontogenetic and phylogenetic aspects". Онтогенез, 1994, т. 25, N 4, с. 53.

4. Балан И. С., Борисова Н. А., Угрюмов М. В. Определение времени выхода в дифференцировку тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов аркуатного ядра у крыс-самцов. Доклады Академии Наук, 1995, т. 341, N 1, стр. 115-117.

5. Балан И. С., Борисова Н. А., Угрюмов М. В. Распределение тирозингидроксилаза и ДОФА-декарбоксилаза-иммунопозитивных нейронов в аркуатном ядре у крыс. Всероссийская конференция "Нейроэндокринология - 95". С-Петербург, 1995, стр. 19.

6. Борисова Н. А., Балан И. С., Угрюмов М. В. Формирование катехоламинергической системы гипоталамуса у самок и самцов крыс в онтогенезе. Всероссийская конференция "Нейроэндокринология - 95". С-Петербург, 1995, стр. 24.

7. Balan I., Ugrumov М., Borisova N., Calas A., Pilgrim Ch., Reisert I. and Thibault J. Schedule of the origin of the hypothalamic dopaminergic neurons in male and female rats, p. 169, 11th Biennial meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, July 30- August 3,1996, Tampere, Finland.

8. Balan I. S., Ugrumov M. V., Borisova N. A, Calas A., Pilgrim C., Reisert I., and Thibault J. Birthdates of tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons in the hypothalamus of male and female rats. Neuroendocrinology, 1996, V.64, P. 405411.

9. Ugrumov M. V., Calas A., Balan I. S., Melnikova V., Orosco M., Mailly P., Delhaye-Bouchaud N., Thibault J., Krieger M., Nikolaidis S. Non-monoaminergic differentiating neurons co-operate in dopamine synthesis. 8th International Catecholamine Symposium. California, USA, 13-18 October, 1996.

10. Balan I. S., Ugrumov M. V., Calas A., Mailly Ph., Krieger M., Thibault J. Tyrosine hydroxylase- and/or aromatic L-amino acid decarboxylase-expressing neurons in

the mediobasal hypothalamus of perinatal rats: differentiation and sexual dimorphism. J. of Comparative Neurology. Submitted. 11. Балан И. С., Угрюмов М. В., Борисова Н. А, Калас А., Пилгрим К., Райзерт И. Выход в дифференцировку тирозин гидроксилаза-иммунопозитивных нейронов гипоталамуса самцов и самок крыс. Подготовлена к печати.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ДДК - ДОФА-декарбоксилаза; ДЭ - день эмбрионального развития; КА - катехоламины;

ДП - день постнатального развития ИП - иммунопозитивный МБГ -медиобазальный гипоталамус

ПДМ - половая дифференцировка мозга; ТГ - тирозингидроксилаза

40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 -

а 0 -

Самцы Самки

Д1

Ц,

й

11 12 13 14 15 16 17

11 12 13 14 15 16 17

т Т

ф т v

I

_ т v

т

П г-

11 12 13 14 15 16 17

Рис. 1. Выход в дифференцировку ТГ-ИП нейронов самцов и самок крыс а) аркуатного ядра, б) зоны инсерта, в) перивентрикулярного ядра. *Р<0.05 - между последующими днями введения 3Н-тимидина у самцов;

^Р<0.05 - между последующими днями введения 3Н-тимидина у самок. Ось абсцисс - дни эмбрионального развития; ось ординат - % нейронов с двойной меткой

ЛЯ

АЯ ДМ

<t> св

. тг * ддк о тг+ддк

** о

АЯ ***

Мк

*

о* ** .***

дд J " Щ ■» я

■к

шДЩ.*

АЯ

т л **

Чр*"

.ш ■

"¿SP"-" св

-й-

■

Рис. 2. Распределение тирозингидроксилаза (ТГ), ДОФА-декарбоксилаза (ДДК)-иммунопозитивных нейронов, а также нейронов, содержащих оба фермента синтеза дофамина - ТГ и ДДК в медиобазальном гипоталамусе крыс а) на 18 день эмбрионального развития (ДЭ), б) на 20 ДЭ и в) на 9 день постнатального развития (ДП); АЯ - аркуатное ядро, ВЛ- вентролатеральная область АЯ, ДМ-дорсомедиальная область АЯ, СВ - срединное возвышение, III -третий желудочек мозга

|100

| 80 -

1 60 С

= 40

¥ 20-I

I I Самцы I I Самки

Д,

МБГ МБГ МБГ ВЛ 18ДЭ 20ДЭ ЭДП ЭДП

ДМ ЭДП

о

МБГ МБГ 20ДЭ ЭДП

Рис. 3. Количество ТГ- и ДДК-иммунопозитивных нейронов (ИП) в медиобазальном^оталамусе (МБГ) у самцов и самок крыс на 18 день эмбрионального развития (ДЭ), 20 ДЭ и 9 день постнатального развития (ДП). ВЛ - вентролатеральная область аркуатного ядра; ДМ - дорсомедиальная область аркуатного ядра. *Р<0.01

МБГ 20ДЭ

Рис. 4. Размеры тел ТГ- и ДДК-иммунопозитивных нейронов (ИП) в медиобазальном'-Гюталамусе (МБГ) у самцов и самок крыс на 18 день эмбрионального развития (ДЭ), 20 ДЭ и 9 день постнатального развития (ДП). ВЛ - вентролатеральная область аркуатного ядра; ДМ - дорсомедиальная область аркуатного ядра. *Р<0.01, **Р<0.001

МБГ 20ДЭ

Рис. 5. Оптическая плотность ТГ- и ДДК-иммунопозитивных нейронов (ИП) в медиобазальном'тюталамусе (МБГ) у самцов и самок крыс на 18 день эмбрионального развития (ДЭ), 20 ДЭ и 9 день постнатального развития (ДП). ВЛ - вентролатеральная область аркуатного ядра; ДМ - дорсомедиальная область аркуатного ядра; *Р<0.01

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балан, Ирина Сергеевна, Москва

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 591.481/1

БАЛАН Ирина Сергеевна

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА КРЫС И ЕЕ ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ

03.00.11 - Эмбриология, гистология, цитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор М. В. Угрюмов, профессор А. Калас

Москва 1997

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................11

1.1. КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ГИПОТАЛАМУСА У ВЗРОСЛЫХ КРЫС..................................................................................................................................11

1.1.1 Распределение катехоламинергических нейронов в гипоталамусе.......11

1.1.2 Катехоламинергические волокна гипоталамуса.........................................12

1.1.3 Фенотипическая специфичность катехоламинергических нейронов

гипоталамуса..............................................................................................................15

1.1.4 Тубероинфундибулярная дофаминергическая система..............................20

1.2. НЕЙРОГЕНЕЗ ГИПОТАЛАМУСА. ФОРМИРОВАНИЕ

КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ................................22

1.2.1 Развитие гипоталамуса и формирование его нейросекреторных ядер. ... 22

1.2.2 Формирование катехоламинергической системы гипоталамуса в онтогенезе........................................................................................................................24

1.2.2.1 Нейроны................................................................................................................24

1.2.2.2 Волокна.................................................................................................................27

1.2.2 Формирование дофаминергической тубероинфундибулярной системы

гипоталамуса в онтогенезе.........................................................................................29

2.2.4 Морфо-функциональные характеристики катехоламинергических нейронов гипоталамуса...............................................................................................30

1.3. ПОЛОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА МОЗГА. ПОЛОВОЙ ДИМОРФИЗМ КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ..............................................................34

1.3.1 Критический период половой дифференцировки мозга. .............................34

1.3.2. Ароматизация андрогенов..................................................................................35

1.3.3 Формирование рецепторных систем к половым гормонам........................38

1.3.4 Эпигенетическое влияние половых гормонов на половой диморфизм

катехоламинергической системы.............................................................................40

1.3.5 Генетический контроль полового диморфизма катехоламинергической системы.............................................................................................................................44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................46

2.1. Животные, фиксация..............................................................................................46

2.2. Двойное мечение - иммуногистохимия с использованием антител к

тирозингидроксилазе и 3Н-тимидиновая авторадиография...............................46

2.3. иммуногистохимия с использованием антител к тирозингидроксилазе и ДОФА-декарбоксилазе на криостатных срезах......................................................51

2.4. Компьютерная трехмерная реконструкция......................................................51

2.5. Морфо- и денситометрия тирозингидроксилаза- и ДОФА-декарбоксилаза-иммунопозитивных нейронов...........................................................................................52

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................................54

3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ВЫХОДА В ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗА-ИММУНОПОЗИТИВНЫХ НЕЙРОНОВ....................54

3.1.1. Аркуатное ядро.......................................................................................................54

3.1.1.1. Самцы..................................................................................................................54

3.1.1.2. Самки...................................................................................................................55

3.1.1.3. половые различия..............................................................................................55

3.1.2. Зона инсерта..........................................................................................................56

3.1.2.1 Самцы..................................................................................................................56

3.1.2.2. Самки...................................................................................................................57

3.1.2.3 Половые различия................................................................................................57

3.1.3. Перивентрикулярное ядро..................................................................................58

3.1.3.1 Самцы...................................................................................................................58

3.1.3.2. Самки..................................................................................................................59

3.1.3.3 Половые различия.................................................................................................59

3.2. Распределение тирозингидроксилаза- и/или ДОФА-декарбоксилаза-

иммунопозитивных нейронов в медиобазальном гипоталамусе.....................65

3.2.1.18-й день пренатального развития....................................................................65

3.2.2. 20 и 22 дни пренатального развития.................................................................65

3.2.3. 9 день постнатального развития......................................................................66

3.3. морфо- и денситометрический анализ половых различий тирозингидроксилаза- и ДОФА-декарбоксилаза-иммунопозитивных нейронов медиобазального гипоталамуса.............................................................71

3.3.1. 18-й день пренатального развития....................................................................71

3.3.2. 20-й день пренатального развития....................................................................72

3.3.3. 9-й день постнатального развития...................................................................73

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................82

4.1. Выход в дифференцировку тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов гипоталамуса...............................................................................................82

4.1.1. Аркуатное ядро......................................................................................................83

4.1.2. Зона инсерта..........................................................................................................85

4.1.3. Перивентрикулярное ядро......................................................................................85

4.1.4. Половой диморфизм............................................................................................86

4.3. Половой диморфизм в развитии тирозингидроксилаза- и ДОФА-

декарбоксилаза-иммунопозитивных нейронов медиобазального гипоталамуса..................................................................................................................92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................95

ВЫВОДЫ............................................................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ДДК - ДОФА-декарбоксилаза

ДОФА - диоксифенилаланин,

ДП - день постнатального развития,

ДЭ - день эмбрионального развития,

ИМв - индекс мечения на один вибратомный срез,

ИП - иммунопозитивный,

КА - катехоламины,

МБГ -медиобазальный гипоталамус,

ПДМ - половая дифференцировка мозга,

ТГ - тирозингидроксилаза,

ФБС - фосфатный буфер солевой

УС - уровень серого

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Катехоламинергическая система гипоталамуса является одним из важнейших звеньев нейроэндокринной регуляции. Катехоламины (КА), синтезируемые гипоталамическими нейронами, с одной стороны, выступают в роли нейромедиаторов или нейромодуляторов, регулируя функциональную активность нейросекреторных нейронов - синтез и выделение пептидов (Weiner at al., 1988; Calas, 1994), а с другой, в качестве нейрогормонов, через портальный кровоток, действуют на железистые клетки аденогипофиза (Neill, 1980). Особое значение имеет тубероинфундибулярная дофаминергическая система, которая гуморальным путем оказывает ингибирующее влияние на секрецию пролактина (Weiner and Ganong, 1978; Ben-Jonathan, 1985).

Чтобы в полной мере оценить роль катехоламинергической (КА-ергической) системы в механизмах нейроэндокринной регуляции у взрослых животных весьма перспективным является онтогенетический подход в ее изучении (Мицкевич, 1978; Угрюмов, 1989). Знание основных закономерностей дифференцировки КА-ергической системы гипоталамуса может пролить свет и на участие КА в регуляции морфогенетических процессов, реализующихся, в основном, в перинатальном периоде развития (Lauder, 1983). Появившиеся в последние годы данные о влиянии КА на экспрессию генов пептидергических нейронов-мишеней в критические периоды развития (Ugrumov, 1994) привлекают особое внимание к изучению ранних этапов дифференцировки КА-ергической системы.

Дифференцировка нейронов, как известно, начинается с момента их "рождения", т.е. прекращения пролиферации матричных клеток-

предшественников (Грачева, 1968; Altman and Bayer, 1986). Определение времени выхода нейронов в дифференцировку имеет не только важное научно-теоретическое значение, но также необходимо для решения задач медицинской практики, в частности, при заместительной нейротрансплантации в поврежденные участки мозга.

Важным фактором дифференцировки КА-ергических нейронов является экспрессия ферментов синтеза KA и самих KA, которые и оказывают морфогенетическое действие на формирование специфических черт фенотипа клеток-мишеней (Максимова, 1985).

Наряду с типичными KA-ергическими нейронами в гипоталамусе обнаружены нейроны, содержащие только один из ферментов синтеза KA (Jaeger et al., 1983, 1984; Skagerberg et al., 1988), функциональное значение которых до сих пор остается невыясненным.

В последние годы в литературе особое внимание уделяется половым различиям в КА-ергических системах мозга, которые, как оказалось, определяются не только половыми гормонами, но и детерминированы генетически.

Таким образом, актуальность изучения дифференцировки КА-ергической системы гипоталамуса определяется ее ключевой ролью в морфогенетических процессах и в формировании нейроэндокринной регуляции в развивающемся организме.

Цель и задачи исследования.

Основная цель проведенных исследований состояла в изучении формирования КА-ергической системы гипоталамуса в перинатальный период развития и выяснении роли половых гормонов в этом процессе.

Для решения сформулированной проблемы необходимо было:

1) определить время выхода в дифференцировку КА-ергических нейронов трех областей гипоталамуса - аркуатной, перивентрикулярной и зоны инсерта у самцов и самок крыс, используя двойное мечение (иммуногистохимическое выявление тирозингидроксилазы (ТГ) и "тимидиновая" авторадиография);

2) оценить экспрессию первого и второго ферментов синтеза дофамина - ТГ и ДОФА-декарбоксилазы (ДДК) в дифференцирующихся нейронах медиобазального гипоталамуса (МБГ) у самцов и самок;

3) выяснить роль мужских половых гормонов в развитии дофамин-продуцирующих нейронов МБГ.

Научная новизна работы.

Впервые определены периоды выхода в дифференцировку КА-ергических нейронов в трех областях гипоталамуса - аркуатной, перивентрикулярной и зоне инсерта. При этом впервые обнаружен половой диморфизм в образовании КА-ергических нейронов всех трех исследуемых областей гипоталамуса, который обусловлен не влиянием мужских половых гормонов, а детерминирован генетически.

Анализ экспрессии ТГ и ДДК, позволил выявить в развивающемся МБГ 4 популяции нейронов, отличающихся по времени начала синтеза ферментов и их

внутриклеточному содержанию, а также по локализации нейронов, экспрессирующих эти ферменты. Впервые было показано, что в МБГ в перинатальный период практически отсутствуют истинно дофаминергические нейроны, зато обнаружены большие популяции нейронов, экспрессирующих либо ТГ, либо ДДК, которые, возможно, взаимодействуют, обеспечивая синтез дофамина.

Нейроны, вырабатывающие ТГ или ДДК, в процессе дифференцировки характеризуются половым диморфизмом, который проявляется в количестве этих нейронов, размере тел и в содержании ферментов. Кастрация новорожденных самцов нивелировала эти различия, что свидетельствует о влиянии мужских половых гормонов на дифференцировку дофамин-продуцирующих нейронов.

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ лаборатории гормональных регуляций ИБР им. И. К. Кольцова "Структурно-функциональные основы становления нейроэндокринных механизмов регуляции процессов онтогенеза" в рамках программы проектов: РФФИ "Роль моноаминов в нейроэндокринной регуляции в онтогенезе", "Дифференцировка нейронов и ее нейрогуморальная регуляция"; ISF (SOROS) по теме: "Development ot the hypothalamic peptidergic and monoaminergic systems in ontogenesis"; INTAS-RFBR по теме: "Monoaminergic and peptidergic neurons: differentiation, plasticity, and regulation of phenotype expression in intracellular signalling".

Апробация работы.

Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Нейробиологические аспекты современной эндокринологии" (Москва, 1991), на Конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 1993), на Международной конференции "Mechanisms of Development: Ontogenetic and Phylogenetic Aspects" (Москва, 1994), на Всероссийской конференции "Нейроэндокринология - 95" (С-Петербург, 1995), на Международной конференции "1th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience" (Tampere, Finland, 1996); Международном симпозиуме "8th International Catecholamine Symposium" (California, USA, 1996).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9, сдано в печать 2 работы. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и включает в себя 9 графиков, 6 схем, 8 микрофотографий, 10 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ГИПОТАЛАМУСА У ВЗРОСЛЫХ КРЫС

1.1.1 Распределение катехоламинергических нейронов в гипоталамусе

КА-ергические нейроны в гипоталамусе крыс впервые были обнаружены с помощью гистофлюоресцентного метода Фалька-Хилларпа (Dahlstrom and Fuxe, 1964). Локализация этих нейронов была уточнена с помощью более чувствительной модификации гистофлюоресцентного метода, с использованием глиаксалевой кислоты (Bjorklund and Nobin, 1973). Позднее КА-ергические нейроны в гипоталамусе выявляли иммуногистохимически, используя антитела к ТГ, первому ферменту синтеза КА (Hokfelt Т. et al., 1976). Это позволило осуществить картирование ТГ-иммунопозитивных (ТГ-ИП) нейронов в гипоталамусе (Chan-Palay et al., 1984; Hokfelt et al., 1984; Van den Pol et al., 1984).

В гипоталамусе гистофлюоресцентным методом выделены 4 группы КА-ергических нейронов (рис. 1): а) передняя перивентрикулярная (А 14) занимает перивентрикулярную область, распространяясь в рострокаудальном направлении от передней комиссуры до срединного возвышения, б) туберальная (А12) состоит из нейронов аркуатного ядра и вентральной области перивентрикулярного ядра, в) дорсальная гипоталамическая (А 13) охватывает медиальную часть зоны инсерта, и г) задняя гипоталамическая (All) занимает каудо-дорсальную область гипоталамуса (Bjorklund et al., 1973, 1975; Lindvall and Bjorklund., 1978).

В инсертогипоталамической КА-ергической системе топографически различают несвязанные друг с другом каудальный и ростральный отделы. Каудальная область включает скопление КА-ергических нейронов заднего таламуса и гипоталамуса (All), в том числе и зону инсерта (А13). Нейроны каудальной области проецируют свои отростки в дорсомедиальное ядро, в дорсальную и переднюю области гипоталамуса (Bjorklund et al., 1975). Ростральная область включает А14-группу, аксоны нейронов которой достигают преоптической области и передних отделов гипоталамуса (Day et al., 1980).

Иммуногистохимические исследования не только подтвердили данные гистофлюоресцентного анализа (Ajika,1980), но и показали, что нейроны, содержащие ТГ, присутствуют и в других отделах гипоталамуса - в дорсальном, вентромедиальном, переднем гипоталамическом, паравентрикулярном, супрахиазматическом, супраоптическом ядрах, а также в ретрохиазматической и передней преоптической областях (Hokfelt et al., 1978, 1980; Chan-Palay et al., 1984).

Таким образом, самые крупные скопления КА-ергических нейронов обнаружены в аркуатном, перивентрикулярном ядрах, а также в зоне инсерта (Chan-Palay et al., 1984).

1.1.2 Катехоламинергические волокна гипоталамуса

В гипоталамусе обнаружены три типа КА-ергических волокон -адренергические, норадренергические и дофаминергические.

Рис. 1. Схема локализации катехоламинергических нейронов (треугольники) в гипоталамусе взрослых крыс (Бихе ег а1., 1985; Угрюмов, 1989). ВМ-вентромедиальное ядро, Г - гипофиз, ДМ - дорсомедиальное ядро.

Адренергические и норадренергические волокна берут начало в стволе мозга и поступают в гипоталамус в составе медиального пучка переднего мозга (Fuxe et al., 1985). Высокая концентрация адренергических нервных волокон обнаружена в дорсомедиальном и аркуатном ядрах, а также в крупноклеточной части паравентрикулярного ядра. Небольшое количество адренергических волокон отмечены в вентромедиальном, супраоптическом, супрахиазматическом, переднем гипоталамическом ядрах, в преоптической области и срединном возвышении (Hôkfelt et al., 1978).

Норадренергические волокна имеют сходную картину распределения в гипоталамусе с адренергическими. Многочисленные норадренергические волокна расположены во внутреннем слое срединного возвышения, аркуатном, дорсомедиальном, супраоптическом, паравентрикулярном ядрах, а также в преоптической области. В несколько меньшей концентрации норадренергические волокна обнаруживаются в наружной зоне срединного возвыш