Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Возрастные особенности гормональной и нейрохимической регуляции репродуктивной функции самцов крыс с различным темпом старения

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Возрастные особенности гормональной и нейрохимической регуляции репродуктивной функции самцов крыс с различным темпом старения"

На правах рукописи

БЕЛОУСОВА ИРИНА ИГОРЕВНА

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ГОРМОНАЛЬНОЙ И НЕЙРОХИМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ САМЦОВ КРЫС С РАЗЛИЧНЫМ ТЕМПОМ СТАРЕНИЯ

Физиология - 03.03.01

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

005047303

005047303

Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Амстиславская Т.Г.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Калинина Т.С.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Дубровина Н.И. НИИ физиологии СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится 20 l(L г. на утреннем

заседании диссертационного совета Д. 001.14.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ФГБУ «НИИ физиологии» СО РАМН в конференц-зале Института по адресу:

630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 4, т. (383)335-98-55, факс (383) 335-97-54, e-mail: dissovet@physiol.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ физиологии» СО РАМН.

Автореферат разослан « 3 » 'рб^Л&Л^Р 20 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

. Бузуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Выявление генетических и физиологических механизмов старения представляет собой одну из актуальных проблем физиологической генетики, геронтологии и медицины. Репродуктивная функция является одной из основных биологически высоко значимых функций организма, а ее снижение одним из проявлений естественного старения человека и животных (Wu, Gore, 2010). Кроме функционирования органов, необходимых для размножения, репродуктивная функция включает в себя и половое поведение, без которого невозможна реализация всего процесса размножения. Регуляция репродуктивной функции осуществляется единой функциональной нейроэндокринной системой, которая включает в себя как центральное - интегрирующее звено (Hull et al., 2007), так и периферические (эффекторные, исполнительные) органы (Dixson, Anderson, 2004). Эти звенья взаимодействуют между собой по принципу прямой и обратной отрицательной и положительной связи, определяемой характером сигналов, поступающих с периферии (Pau, Spies, 1997).

Поведение, связанное с репродукцией, включает в себя ухаживание, ведущее к образованию пары, собственно копуляторное поведение, обеспечивающее оплодотворение, и родительское поведение (Мак-Фарленд, 1988). Для реализации копуляторного поведения животные должны обладать собственной сексуальной рецептивностью, а также различать внешние стимулы с целью обнаружения потенциального полового партнера, активно достигать его, уметь различать феромональный сигнал или поведенческий паттерн партнера от того, кто не является сексуально значимым, а также быть способными осуществить половой процесс (Тинберген, 1993; Clark, 1993; Pfaus, 2001).

Мужское половое поведение включает в себя аппетентную (мотивационную) и консуматорную (завершающую) фазу, а также рефрактерный период (Pfaus et al., 2003). Большинство исследований полового поведения самцов связано с изучением завершающей фазы, тогда как работ по изучению начальной, мотивационной фазы, запускающей весь процесс полового поведения, остается по-прежнему мало (Agmo, 1999; Amstislavkaya, 2004).

Учитывая глобальное постарение населения, важной задачей современной науки является продление активного периода жизни и сохранение репродуктивного здоровья мужчин (Bitzer et al., 2008). Кроме того, в настоящее время в развитых странах наблюдается рост процента мужчин репродуктивного возраста со сниженной половой мотивацией (Svendsen, Schultz, 2008; Rowland et al., 2010). В результате исследование механизмов, лежащих в основе возрастных изменений как полового поведения, так и всей репродуктивной системы в целом приобрело особую актуальность. Решение этой проблемы невозможно без проведения экспериментальных исследований с использованием адекватных биологических моделей.

В настоящее время в мире существует ограниченное число моделей животных с признаками преждевременного старения. Так, наиболее изученной является созданная японскими учеными линия мышей SAM (senescence accelerated mouse), представленная 12 сублиниями, различающимися по

характеру проявления признаков старения (Такес1а й а1., 1998; 2009). Тем не менее, проводимые в последнее десятилетие в Институте цитологии и генетики СО РАН исследования свидетельствуют, что полноценной моделью преждевременного старения может служить и созданная в 70-е гг. прошлого века в ИЦИГ СО РАН линия крыс ОХУ8 (Соловьева и др., 1975). Этих животных отличает раннее развитие заболеваний, свойственных стареющим людям и животным, сниженная моторно-исследовательская активность и способность к обучению, а также повышенная тревожность (Колосова и др., 2002, 2003; Лоскутова, Колосова, 2000). Существование такого рода ранних возрастных изменений позволило предположить и раннее снижение функциональной активности репродуктивной системы у крыс ОХУ8, исследование которой до этого не проводилось.

Преимущество использования в работе животных двух генотипов с различным темпом старения заключается в возможности обнаружения как общих для самцов обеих линий возрастных изменений, так и выявления особенностей в функционировании репродуктивной системы преждевременно стареющих самцов крыс линии ОХУв.

Целью данной работы было исследование возрастных особенностей гормональной и нейрохимической регуляции репродуктивной функции самцов крыс Вистар и ОХУй, характеризующихся разным темпом старения.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнительное исследование половой мотивации крыс линий Вистар и ОХУБ разного возраста;

2) Исследовать уровень тестостерона в условиях покоя и половой активации в крови и семенниках и лютеинизирующего гормона в крови у 6-, 12-и 26-месячных самцов Вистар и ОХУБ;

3) Оценить возрастные изменения гравиметрических и сперматогенных параметров репродуктивной функции самцов крыс линий Вистар и ОХУ8;

4) Исследовать возрастные особенности метаболизма норадреналина, дофамина и серотонина в мозге 6-, 12- и 26-месячных самцов Вистар и ОХУБ;

5) Провести исследование влияния социально и сексуально значимого партнера на метаболизм норадреналина, дофамина и серотонина в гипоталамусе 12- и 26-месячных самцов Вистар и ОХУЭ.

Научная новизна

• Возрастные нарушения полового мотивационного поведения у самцов линии ОХУБ появляются в 12 мес, в то время как у крыс Вистар подобные нарушения отмечены только к 18 мес.

• Выявлено возрастное снижение эндокринного ответа семенников (по уровшо тестостерона) в условиях половой активации у крыс ОХУЯ: в 26 мес он был ниже, чем у 12-месячных самцов ОХУБ и не отличался от крыс Вистар.

• Выявлено более выраженное по сравнению с Вистар возрастное снижение потенциальной способности семенников к нормальному мейозу у самцов ОХУв. Установлена предрасположенность самцов крыс линии ОХУЭ к

' развитию спонтанных лейдигом.

• Выявлены более ранние по сравнению с Вистар возрастные изменения метаболизма моноаминов в мозге у крыс ОХУБ: у 12-месячных самцов снижен уровень серотонина и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты в среднем мозге, дофамина и норадреналина в гипоталамусе.

• У 26-месячных самцов Вистар и ОХУБ показано снижение содержания дофамина и серотонина, а также усиление катаболизма дофамина в гипоталамусе.

• Установлено, что основные изменения в метаболизме катехоламинергической и серотонергической систем в условиях половой активации у самцов происходят в гипоталамусе.

• У крыс ОХУБ выявлены особенности метаболизма медиаторов в ответ на предъявление полового стимула, заключающиеся в снижении процесса катаболизма дофамина в гипоталамусе в возрасте 12 и 26 мес и повышенном содержании 5-гидроксииндолуксусной кислоты у 26-месячных животных.

Научно-практическая ценность

Результаты данной работы расширяют современные фундаментальные [редставления о возрастных нарушениях половой мотивации, сопряженных с [ейрогормональными и нейрохимическими изменениями в мозге и на [ериферии. Полученные в работе результаты подтверждают предположение о [реждевременном старении репродуктивной функции самцов крыс линии ОХУБ [ могут быть использованы при поиске подходов к коррекции возрастных ирушений организма.

Положения, выносимые на защиту

• Самцы крыс линии ОХУв характеризуются более ранним (12 мес) снижением полового мотивационного поведения по сравнению с крысами Вистар (18 мес). Наличие сексуального опыта не влияет на выраженность возрастного снижения полового мотивационного поведения у самцов крыс Вистар и ОХУБ.

• Для самцов линии Вистар и ОХУБ характерно возрастное снижение эндокринного ответа семенников (по уровню тестостерона) в условиях половой активации.

• Показано возрастное снижение массы семенников, эпидидимисов и препуциальных желез крыс обеих линий. Снижение массы семенников у крыс ОХУБ наблюдалось с 6 мес, тогда как у Вистар - с 12 мес.

• 12-месячные самцы линии ОХУБ характеризуются сниженным по сравнению с крысами Вистар содержанием норадреналина и дофамина в

гипоталамусе, серотонина и 5-гидроксииндолуксусной кислоты в среднем мозге, что свидетельствует о более ранних возрастных изменениях их центрального звена регуляции.

• В условиях половой активации крысы OXYS по сравнению с Вистар характеризуются сниженным катаболизмом дофамина в гипоталамусе в 12 и 26 месяцев, а также повышенным уровнем 5-гидроксииндолуксусной кислоты в 26 месяцев.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчетных сессиях аспирантов ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2010, 2011), отчетной Сессии Института цитологии и генетики в 2010, на XLVI и XLVIII международных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008, 2010), на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на II конференции Российской ассоциации психонейроэндокринологии (Москва, 2010), на XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), на конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010).

Публикации

Материал диссертации представлен в 13 публикациях, в том числе в 4 статьях в отечественных (3) и зарубежных (1) рецензируемых журналах.

Структура и объём работы

Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список использованной литературы (266 источников). Общий объем составляет 122 машинописных листа. Представлено 23 рисунка и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные. Работа выполнена на половозрелых самцах Вистар и OXYS 3-,6-,12-,18- и 26-месячного возраста в центре коллективного пользования "Генофонды лабораторных животных" Института цитологии и генетики СО РАН.

Исследование поведения самцов крыс. Применялось два экспериментальных подхода к исследованию начального (мотивационного) этапа полового поведения - тест «перегородка» и тест с непосредственным взаимодействием партнеров:

• Тест «перегородка» проводился с 19:00 до 21:00 вечера при красном свете в стандартной пластиковой клетке (52x33x20), разделенной на два отсека прозрачной перфорированной перегородкой, через которую могут происходить обонятельные и визуальные контакты между животными. За 3 суток до теста самца помещали в экспериментальную клетку для снятия группового эффекта содержания. После 5-минутной адаптации к условиям

тестирования в течение 10 мин оценивали спонтанную активность самца около перегородки. Затем в соседний отсек помещали рецептивную самку, и в течение 10 мин регистрировали время активного исследования самцом перегородки (основной показатель) и количество подходов к ней (дополнительный показатель, отражающий двигательную активность).

• Непосредственное взаимодействие партнеров проводилось в тех же условиях, но без перегородки. После 5-минутной адаптации к самцу помещали рецептивную самку, и в течение 10 мин наблюдателем регистрировались показатели полового поведения самца: суммарное время контакта с партнером (ано-генитальное обнюхивание, касание носом, туловищем или передними лапами) и количество подходов к нему, латентный период первой садки и число садок.

Исследование социального поведения самцов проводилось в тесте с перегородкой и при непосредственном взаимодействии, но при предъявлении социально значимого партнера (овариэктомированной самки). Все показатели сравнивались с поведением по отношению к сексуально значимому партнеру (рецептивной самке).

Кастрацию самок проводили в трехмесячном возрасте согласно общепринятой методике Я.Д. Киршенблата (1969), под общим наркозом (ауегпп, 2.5 % р-р.). В эксперимент самки допускались не ранее, чем через 3 недели после операции при отсутствии возобновления циклических изменений в матке, что подтверждалось исследованием вагинального мазка.

Эструс у овариэктомированных самок вызывали последовательным подкожным введением за 48 часов до тестирования масляного раствора эстрадиола (100 мкг/животное) и за 4 часа до тестирования - прогестерона (750 мкг/животное) (А1ЬопеШ, РагаЬоШш, 1993). Самок проверяли на выраженность лордозной реакции, эструс подтверждали по содержанию вагинального мазка.

Сексуальный опыт приобретался самцами в возрасте 10 мес. В опыт брали самцов с опытом 2-3 эффективных покрытий.

Содержание гормонов в крови и семенниках определяли с помощью иммуноферментного метода с использованием наборов «Хема-Медика» (Москва). Определение активационного уровня тестостерона (Т) и лютеинизирующего гормона (ЛГ) проводили в образцах крови, взятой из хвоста, обрезая 3-4 мм его кончика, под лёгким (1 мин) эфирным наркозом через 20 мин после предъявления в соседний отсек клетки рецептивной самки (т.е. после 35-минутной суммарной экспозиции при красном свете). Определение исходного уровня гормонов проводили в образцах, взятых через 35 мин после пребывания самца в условиях красного света. Концентрацию Т в семенниках определяли в навеске семенника массой 200 мг, которую гомогенизировали в 0,5 мл 0,01М фосфатного буфера (рН 7,3-7,5). Концентрацию Т выражали в нг/мл, а ЛГ в Лед/л.

Гравиметрические показатели. После поведенческих экспериментов животных взвешивали, декапитировали и извлекали семенники, эпидидимисы и препуциальные железы, которые взвешивали с точностью до 0,5 мг.

Гистологические исследования проведены совместно с А.И. Железовой (лаб. рекомбинационного и сегрегационного анализа ИЦиГ СО РАН). Срезы левого семенника обрабатывались йодной кислотой в ШИК-реакции и исследовались при помощи световой микроскопии. В семенных канальцах проанализировано отношение количества сперматоцитов 1 порядка к количеству круглых сперматид, рассчитанное на 100 клеток Сертоли, что считается показателем потенциальной возможности семенников к нормальному мейозу (Borodin et al„ 2006). Это соотношение в конце мейоза должно составлять 1:4, однако допустимым является и соотношение 1:3.

Содержание моноаминов в мозге определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. Проанализировано содержание норадреналина (НА), серотонина (5-НТ), 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК), дофамина (ДА), диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и показатели катаболизма серотонина (5-ГИУК/5-НТ) и дофамина (ДОФУК/ДА) в экстрактах обонятельных луковиц, фронтальной коры, гипоталамуса, гиппокампа, среднего мозга, продолговатого мозга (структурах, участвующих в регуляции полового мотивационного поведения и местах сосредоточения тел нейронов исследуемых медиаторных систем). Образец ткани взвешивали и гомогенизировали в буфере, содержащем 0,4М НС104, 0,27 шМ EDTA и 100 нг/мл 3.4-дигидроксибензиламина в качестве внутреннего стандарта, после чего гомогенат центрифугировали 5 мин при 4°С и 15000 об/мин, и супернатант в объеме 40 мкл наносили на колонку Nucleosil С8 (размер 100x4,6 мм) хроматографа, используя электрохимический детектор (500 mV, Coulochem III, ESA, США) и проточную ячейку (BASInc, США). Подвижная фаза содержала 0,1 mM Na2EDTA, 1,4 mM 1-октансульфоната натрия и метанол (4 %), рН=4.5. Высота пиков определялась с помощью хроматографического программного обеспечения «Мультихром 1.5» (ЗАО «Амперсенд», Россия). Содержание моноаминов и их метаболитов выражали в пг/мг образца ткани.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью однофакторного, двухфакторного и трехфакторного дисперсионного анализа с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 6.0) с post hoc сравнением выборочных средних («Newman-Keuls test»). Различия считали достоверными при Р<0.05. Значения всех поведенческих, гравиметрических, гормональных и медиаторных параметров представлены как средняя арифметическая и ее ошибка (M±SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Половое поведение самцов Вистар и OXYS в разном возрасте.

Половое поведение самцов представляет собой последовательность из мотивационной (начальной) и коисуматорной (завершающей) фазы. Согласно литературным данным первые возрастные изменения копуляторного поведения

(консуматорная стадия) самцов могут наблюдаться уже в 11 мес, что выражается в увеличении латентного периода возникновения садок, интромиссий и эякуляций (Chen et al., 2007). Экспериментальные данные о возрастном изменении половой мотивации самцов практически отсутствуют.

I I Пустой отсек

Рис.1. Время нахождения у перегородки и число подходов к ней крыс Вистар и 0ЙТ5 в разном возрасте (3, 6, 12, 18, 26 мес).

* - р<0,05; **-р<0,01;***-р<0,001 по сравнению с пустым отсеком;

# - р<0,05; ### - р<0,001 по сравнению с 3 мес;

& - р<0,05 по сравнению с Вистар.

Предъявление самки в условиях отсутствия непосредственного контакта, увеличивало время нахождения самцов Вистар и ОХУЭ у перегородки (Р1,186=495,04; р<0,001) (рис.1). При этом исследование уровня Т в крови показало его увеличение при предъявлении самки (Б 1,90=33,94, р<0,001) (рис.3). Такие изменения поведения и гормонального ответа свидетельствуют о наличии у самцов половой мотивации и находятся в хорошем соответствии с полученными ранее данными (Амстиславская, Осипов, 2003; Булыгина и др., 2005; Агшйзкувкауа Т.О., Ророуа КК., 2004).

С возрастом происходит уменьшение выраженности полового мотивационного поведения (Б4,186=39,05; р<0,001) (рис.1). У крыс ОХУ8 снижение начинается в более раннем возрасте (в 12 мес) по сравнению с Вистар (18 мес). С возрастом понижается и число подходов к перегородке, что свидетельствует о снижении у животных двигательной и исследовательской активности (Б4,186=13,8; р<0,001). У крыс линии Вистар это снижение более выражено, поскольку крысы ОХУ8 уже в 3 мес характеризуются более низкой двигательной активностью (Колосова, 2003).

Для оценки специфичности возрастного изменения половой мотивации было проведено исследование поведения по отношению к социально значимому партнеру (овариэктомированной самке) у 6-, 12- и 26-месячных самцов. Время, проводимое молодыми (6-месячными) самцами у перегородки, за которой находилась рецептивная самка, значительно превышало время нахождения у перегородки с овариэктомированной самкой (Р2,249=726,29; р<0,001) (рис.2). С возрастом происходило снижение времени, проводимого самцами у перегородки (Р2,249=326,51; р<0,001). У 12-месячных самцов ОХУ8 это снижение происходило исключительно за счет снижения половой мотивации, не затрагивая выраженность социальной компоненты их поведения у перегородки. У 26-месячных самцов обеих линий интерес как к овариэктомированной, так и к

рецептивной самке значительно падал и не отличался от реакции на пустой отсек. Число подходов х социально значимому партнеру, но не к рецептивной самке, снижалось у 12-месячных Вистар по сравнению с молодыми самцами, а у ОХУЗ и вовсе не менялось с возрастом.

Следует отметить, что сексуальный опыт не влиял на выраженность проявления половой мотивации самцов крыс обеих линий (Р 1,180=0,1; р=0,75).

Г I пустой огсек

овервястоиироаакад с Е.39Н рецептивная самка

Рис.2. Время нахождения у перегородки с социально и сексуально значимым партнером и число подходов к ней самцов крыс Вистар и ОХТ5' в б, 12 и 26 .чес. *"-р<0,01; ***-р<0,001 по сравнению с овариэктомированной сал4кой; ### - р<0,001 по сравнению с 6 мес; &&& -р<0,001 по сравнению с 12 мес; --р<0,001 по сравнению с Вистар.

6 12 26 Возраст ОХУЭ

Таким образом, самцов крыс линии ОХУ8 характеризует более раннее снижение половой мотивации: в возрасте 12 мес она снижена как по сравнению с крысами Вистар того же возраста, так и с более молодыми животными. Более раннее снижение половой мотивации у самцов ОХУЗ можно рассматривать как генетически детерминированное нарушение их начальной стадии, полового поведения, свидетельствующее об ускоренном старении репродуктивной системы этих крыс.

Возрастные особенности гормонального ответа семенников.

Важным признаком половой активации самцов крыс является повышенный уровень тестостерона (Т) в крови в условиях сексуального взаимодействия (КовеШ е1 а1., 2003). Такое повышение отмечено даже в условиях, когда отсутствует непосредственный, т.е. связанный со спариванием, контакт с самкой (Амстиславская, Осипов, 2003).

Рис.3. Содержание тестостерона в крови самцов крыс Вистар и ОХТ5 при половой активации в 6, 12 и 26 мес. ** р<0,01; *** р<0,001 по сравнению с пустым отсеком;

# р<0,05; #Н# р<0,001 по сравнению с 6-месячными самцами; & р<0,05 по сравнению с Вистар.

12 26 Вистар

12 26 Возраст ОХУ5 Пиния

Нами показано отсутствие возрастных изменений в исходном уровне Т у самцов, но отмечено его снижение в условиях присутствия рецептивной самки за перегородкой (F2,90=12,67, р<0,001) (рис.3). Активирующий эффект самки на гормональную составляющую половой активации в 12 мес сохранялся у самцов обеих линий. Исследование показало, что у старых 26-месячных самцов активационный уровень Т резко падал и в крови, и в семенниках (F2,96=11,45, р<0,001), что свидетельствует о снижении активности эндокринной функции с возрастом. Согласно литературным источникам, возрастное снижение уровня Т (Zirkin, Chen, 2000), по-видимому, связано не со снижением количества тестостерон-продуцирующих клеток Лейдига в семенниках (Chen et al., 1994), а с продукцией активных форм кислорода в процессе стероидогенеза и повреждением ими ключевых компонентов, необходимых для стероидогенеза (Quinn, Payne, 1985; Chen, Zirkin, 1999).

Как известно, повышению содержания тестостерона в условиях половой активации предшествует подъем уровня ЛГ в крови (Nyby, 2007). Возрастные изменения эндокринного статуса самцов выражаются не только в снижении уровня Т, но и ЛГ (Zirkin, Chen, 2000). Наше исследование содержания ЛГ в крови 6-, 12- и 26-месячных самцов Вистар и OXYS в условиях половой активации и без нее показало отсутствие возрастных (F2,96=2,34, р=0,11) и межлинейных (F 1,96=2,94, р=0,09) различий.

Обращает нз себя внимание то, что у самцов OXYS активирующий эффект самки на уровень тестостерона в 26 мес был, а у Вистар - отсутствовал, что было подтверждено и в исследовании содержания гормона в семенниках. Это обстоятельство может быть связано с тем, что рремя максимального уровня тестостерона у самцов Вистар и OXYS различно. Ранее в таких же модельных условиях при отсутствии непосредственного контакта между самцом и самкой было показано, что эндокринный ответ семеннихов самцов мышей на сексуальный стимул зависит от генотипа особи (Осадчук, Науменко, 1981; Амстиславская, Храпова, 2002).

Гравиметрические и сиерматогснные показатели у самцов Вистар и OXYS при старении.

Дополнительное исследование гравиметрических показателей репродуктивных органов крыс Вистар и OXYS показало возрастное снижение относительной массы семенников (F3,78=89,43; р<0,001), эпидидимисов (F3,78=180,25; р<0,001) и препуциальных желез (F3,78=44,62; р<0,001). Все эти органа являются андроген-зависимыми и могут отражать функциональную активность репродуктивной системы самцов (Свечников и др., 1996). Обнаружено более раннее снижение массы семенников у OXYS (с 6 мес) по сравнению с Вистар (с 12 мес), а также более выраженное снижение массы препуциальных желез у самцов OXYS, начиная с 12 мес, что свидетельствует об ускоренной инволюции органов репродуктивной системы у самцов OXYS.

Показатели потенциальной способности к сперматогенезу у годовалых самцов Вистар (1/2,95) и OXYS (1/2,85) близки к норме. Исследование показало возрастное снижение и данного показателя: у 26-месячных самцов Вистар он составил 1/2,5, и выявило полную стерильность трех из пяти исследованных

самцов OXYS. Дополнительное гистологическое исследование, проведенное под руководством Манских В.Н. в лаборатории гистологии и патоморфологии НИИ Митоинженерии МГУ, показало наличие многочисленных мультифокальных аденом из клеток Лейдига у практически всех самцов OXYS. Известно, что некоторые линии и сублинии крыс весьма подвержены развитию этих спонтанных опухолей (Teerds et.al., 1991).

Таким образом, первые возрастные изменения у самцов линии OXYS появляются в возрасте 12 мес и выражаются в нарушениях начального этапа полового поведения, которое у крыс Вистар отмечено только к 18 мес. Однако эндокринная активность семенников крыс OXYS в этом возрасте по-прежнему остается на уровне, свойственном молодым животным, а ее снижение происходит гораздо позднее.

Возрастные особенности метаболизма серотонина, дофамина, норадреналина в мозге 6, 12 и 26-месячных самцов Вистар и OXYS

Для оценки вклада нарушений на уровне центрального звена регуляции в возрастное снижение репродуктивной функции мы исследовали метаболизм моноаминов в мозге 6-, 12- и 26-месячных самцов Вистар и OXYS.

Полученные данные свидетельствуют о вовлечении норадренергической системы мозга в процесс старения. Показано возрастное изменение содержания НА в гипоталамусе крыс Вистар: повышение содержания в 12 мес по сравнению с 6 мес (р<0,05) и снижение в 26 мес по сравнению с 12 мес (р<0,01) (рис.4). Эти данные полностью согласуются с имеющимися в литературе сведениями о возрастном изменении уровня НА в гипоталамусе (Rodriguez-Gomez et.al., 1995). Как известно, гипоталамус является важнейшим звеном в регуляции как мужского полового поведения в целом, так и половой мотивации (McGinnis et al., 2002; Paredes, 2003). У крыс OXYS отсутствовали характерные для Вистар изменения, что может свидетельствовать об ускоренном темпе возрастного

Рис.4. Содержание норадреналина (пг/мг) в мозге самцов Вистар и OXYS. *р<0,05 по сравнению с б мес;

по сравнению с 12 мес.

снижения у них функции НА системы.

Исследование содержания ДА в мозге показало его возрастное изменение в гипоталамусе (Р2,58=14,28; р<0,001): снижение у 26-месячных самцов Вистар по сравнению с 6-(р<0,05) и 12-месячными (р<0,01) самцами и у ОХУв в 26 мес по сравнению с 6 мес (р<0,05) (рис.5).

Рис. 5. Содержание дофамина (пг/мг) и коэффициент катаболизма дофамина (ДОФУКУДА) в мозге б, 12 и 26-месячных самцов крыс Вистар и OXYS. *- р<0,05 по сравнению с б мес; # - р<0,05; ## - р<0,01 по сравнению с 12 мес; ~ - р<0,05 по сравнению с Вистар.

Такие изменения уровня ДА привели к возрастному повышению показателя катаболизма ДОФУК/ДА в гипоталамусе (F2,58=8,89; р<0,001): он увеличивался у 26-месячных самцов обеих линий по сравнению с 6-месячными (р<0,05), что свидетельствует о возрастном усилении распада ДА (рис.5). Это согласуется с литературными данными о возрастном снижении катехоламинергической активности в гипоталамусе (Venero et.al., 1993; Miguez et.al., 1999; Collier, 2011). У 12-месячных самцов OXYS обнаружено сниженное содержание ДА по сравнению с Вистар, что может указывать на более раннее снижение функциональной активности дофаминергической системы по сравнению с Вистар.

При исследовании содержания 5-НТ обнаружены возрастные (F2,20=7,79; р<0,01) и межлинейные различия (F1,20=7,24; р<0,05) в среднем мозге, где сосредоточены тела серотонергических нейронов (рис.6). Показано увеличение содержания 5-НТ в 12 мес (р<0,01 по сравнению с 6 мес) с последующим его снижением в 26 мес (р<0,05 по сравнению с 12 мес), а также повышение содержания его основного метаболита 5-ГИУК в 12 мес (р<0,05) у самцов Вистар и отсутствие достоверных изменений у OXYS (рис.6). У годовалых самцов OXYS в среднем мозге содержание 5-НТ снижено по сравнению с Вистар (р<0,05).

Исследование содержания 5-НТ в гипоталамусе выявило его возрастное снижение: у 26-месячных самцов обеих линий по сравнению с 12-месячными (F2,58 =7,45; р<0,01), при этом содержание 5-НТ у годовалых OXYS было снижено по сравнению с Вистар (р<0,05). Отмечено увеличение коэффициента

катаболизма (5-ГИУК/5-НТ) с возрастом в продолговатом мозге (F2,23=15,91; р<0,001) у самцов Вистар и OXYS.

Рис.6. Содержание серотонина (5-НТ) и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК)(пг/мг) в мозге 6, 12 и 26 месячных самцов крыс Вистар и OXYS. *- р<0,05; **-р<0,01 по сравнению с бмес; #-р<0,05; ##-р<0,01 по сравнению с 12 мес; ~ - р<0,05 по сравнению с Вистар.

Таким образом, показаны возрастные изменения в функционировании серотонинергической системы крыс. Изменения метаболизма 5-НТ в среднем мозге характерны только для самцов Вистар и отсутствуют у OXYS, что также может вносить вклад в раннее снижение полового мотивационного поведения у OXYS, поскольку известно о важной роли 5-НТ в его регуляции (Mas et al., 1995; Hull et al., 2004). В литературе имеются противоположные сведения о метаболизме 5-НТ при старении. С одной стороны, возрастное снижение содержания и метаболизма серотонина было обнаружено в стриатуме (Venero et.ai., 1993) и других лимбических областях мозга крыс (Rodriguez-Gomez et.al., 1995; Esteban et al., 2010). С другой стороны, имеются данные об усилении метаболизма 5-НТ и отсутствии каких-либо изменений в гипоталамусе, гиппокампе и фронтальной коре (Venero et.al., 1993; Miguez et.al., 1999). Выявленные в работе межлинейные различия в содержании медиаторов в разных структурах головного мозга еще не могут свидетельствовать об их ключевой роли в обнаруженном нами более раннем нарушении полового мотивационного поведения крыс OXYS. Поэтому особое значение могли иметь данные об особенностях метаболизма нейромедиаторов в условиях половой активации.

Влияние предъявления социально и сексуально значимого партнера на метаболизм моноаминов.

Поскольку наиболее важную роль в регуляции полового поведения самцов играет гипоталамус, в котором, к тому же, происходит трансформация медиато;рных сигналов в гормональные, то для исследования метаболизма медиаторов при половой активации была выбрана именно эта структура. Исследование изменения содержания медиаторов и их метаболитов у 12- и 26-

месячных самцов в гипоталамусе в ответ на предъявление социально и сексуально значимого партнера позволило выявить специфический ответ со стороны серотонинергической системы на предъявление рецептивной самки.

Рис. 7. Содержание 5-НТ и 5-ГИУК в гипоталамусе 12- и 26-месячных самцов Вистар (W) и OXYS (ОХ). * - по сравнению с пустым отсеком;# - р<0,05 - по сравнению с ювенильным самцом; & - р<0,05; && - р<0,01 - по сравнению с 12 мес; @-р<0,05; @@ - р<0,01 - по сравнению с Вистар.

В 12-месячном возрасте, когда у самцов OXYS отмечено снижение половой мотивации, предъявление самки не вызывало у них снижения содержания 5-НТ и 5-ГИУК (р>0,05), характерного для крыс Вистар (р<0,05) (рис.7). Кроме этого у 26-месячных самцов OXYS не происходило усиления катаболизма серотонина в гипоталамусе в ответ на предъявление самки (р>0,05), которое демонстрировали крысы линии Вистар (р<0,05).

Таким образом, проведенное в настоящей работе исследование репродуктивной функции самцов крыс линии OXYS позволило выявить более раннее снижение выраженности их половой мотивации и особенности обмена серотонина в гипоталамусе при половой активации. Обращает на себя внимание тот факт, что только в возрасте 12 месяцев имеются межлинейные различия по основному показателю полового мотивационного поведения - времени, проведенному самцом у перегородки. Более раннее снижение половой мотивации у самцов OXYS можно рассматривать как генетически детерминированное нарушение их начальной стадии полового поведения. Исследование возрастных изменений в содержании нейромедиаторов и их метаболитов в мозге позволило выявить у OXYS целый ряд особенностей функционирования норадренергической, дофаминергической и серотонинергической систем. Так, обнаружены межлинейные различия в содержании дофамина и серотонина в гипоталамусе 12-месячных крыс, кроме того у OXYS в этой структуре отсутствует и характерное для Вистар повышение содержания норадреналина. Содержание дофамина и серотонина у 12-месячных крыс OXYS в гипоталамусе оказалось снижено, а содержание дофамина в продолговатом мозге 26-месячных самцов повышено по сравнению с контрольными крысами Вистар. Кроме этого у 26-месячных самцов OXYS не происходило усиления катаболизма серотонина в гипоталамусе в ответ на

предъявление самки, которое демонстрировали крысы линии Вистар. В результате можно заключить, что ускоренное возрастное снижение половой мотивации у самцов OXYS напрямую связано с изменением метаболизма серотонина в гипоталамусе и сопровождается нарушенным метаболизмом норадреналина и дофамина в этой структуре.

ВЫВОДЫ

1. С возрастом происходит снижение полового мотивационного и копуляторного поведения самцов крыс с обычным (Вистар) и ускоренным (OXYS) темпом старения. У самцов крыс OXYS выявлено более раннее нарушение половой мотивации: в возрасте 12 мес она снижена как по сравнению с крысами Вистар того же возраста, так и с более молодыми животными обеих линий. Возрастное снижение полового мотивационного поведения у самцов крыс Вистар и OXYS не зависит от сексуального опыта.

2. Не выявлено влияния возраста и генотипа на исходный уровень лютеинизирующего гормона и тестостерона в крови самцов крыс, но показано угнетающее влияние возраста на эндокринный ответ семенников крыс обеих линий в условиях половой активации.

3. Относительная масса андроген-зависимых репродуктивных органов (семенников, эпидидимисов и препуциальных желез) у самцов с возрастом снижается. Уменьшение массы семенников у крыс OXYS происходит с 6 мес, тогда как у Вистар - с 12 мес. Отмечено возрастное снижение потенциальной способности семенников к нормальному мейозу, которое более выражено у самцов с ускоренным старением.

4. С возрастом происходит снижение содержания ДА и 5-НТ и усиление катаболизма ДА в гипоталамусе самцов обеих линий. У крыс OXYS отсутствуют характерные для Вистар возрастные изменения уровня НА в гипоталамусе, 5-НТ и 5-ГИУК в среднем мозге.

5. Выявлены межлинейные различия в содержании ДА и 5-НТ в гипоталамусе 12-месячных крыс и ДА' в продолговатом мозге у старых животных. Содержание ДА и 5-НТ в 12 месяцев у крыс OXYS снижено, а ДА в 26 месяцев повышено по сравнению с Вистар.

В условиях половой активации у крыс OXYS 12-ти и 26-ти месяцев в гипоталамусе снижен катаболизм ДА. У старых животных повышен уровень 5-ГИУК. В возрасте 12 мес у OXYS отсутствует снижение содержания 5-НТ и 5-ГИУК в этой структуре мозга, характерное для Вистар. У 26-месячных крыс OXYS, в отличие от Вистар, предъявление рецептивной самки не приводит к усилению катаболизма 5-НТ в гипоталамусе.

7. Снижение половой мотивации у 12-месячных самцов OXYS сопровождается нарушением метаболизма норадреналина, дофамина и серотонина в гипоталамусе.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Амстиславская Т.Г., Гладких Д.В., Белоусова И.И., Маслова JI.H., Попова Н.К. Влияние сексуального опыта на половое мотивационное и

копуляторное поведение самцов крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 2009, Т.93, №12, С.1362-1373.

2. Белоусова И.И., Гладких Д.В., Железова А.И., Стефанова H.A., Колосова Н.Г., Амстиславская Т.Г. Возрастные аспекты репродуктивной функции самцов крыс с обычным и ускоренным темпом старения // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 2009, Т.95, №11, С.1258-1267.

3. Амстиславская Т.Г., Гладких Д.В., Белоусова И.И., Маслова JI.H., Колосова Н.Г. Возрастные аспекты сексуального поведения самцов крыс с различным темпом старения // ЖВНД, 2010, Т.60, №5, С.554-561.

4. Amstislavskaya T.G., Maslova L.N., Gladkikh D.V., Belousova I.I., Stefanova N.A., Kolosova N.G. Effects of the mitochondria-targeted antioxidant SkQl on sexually motivated behavior in male rats // Pharmacol. Biochem. Behav., 2010, Aug, 96(2): 211-216.

5. Белоусова И.И. Влияние митохондриально направленного антиоксиданта SkQl на репродуктивную функцию самцов крыс. Материалы XLVI международной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2008, С.73.

6. Белоусова И.И., Гладких Д.В., Амстиславская Т.Г., Колосова Н.Г. Особенности репродуктивной функции самцов крыс OXYS, характеризующихся ускоренным темпом старения. Тезисы ВОГИС. Москва,

2009. Ч.2С.107.

7. Гладких Д. В., Белоусова И.И., Колосова Н.Г., Амстиславская Т.Г. Возрастные аспекты социального и сексуального поведения самцов крыс Вистар и OXYS. Тезисы ВОГИС. Москва, 2009. 4.2, С.112.

8. Чубарева Е.А., Белоусова И.И. Влияние антиоксидантных препаратов на репродуктивную функцию стареющих самцов крыс. Материалы XLVIII международной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2010, С.58.

9. Амстиславская Т.Г., Белоусова И.И., Колосова Н.Г. Индивидуальные особенности организма в эффектах митохондриально направленного антиоксиданта SkQl на половое поведение самцов. Материалы 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2010, С. 19.

10. Белоусова И.И., Гладких Д.В., Амстиславская Т.Г. Роль сексуального опыта в половом поведении самцов крыс с разным темпом старения. Тезисы докладов XXI Съезда физиологического общества им. И.П.Павлова. Калуга,

2010, с. 60.

11. Амстиславская Т.Г., Гладких Д.В., Белоусова И.И., Колосова Н.Г. Сравнительный анализ сексуального и коммуникативного поведения самцов крыс, характеризующихся разным темпом старения. Тезисы докладов XXI Съезда физиологического общества им. И.П.Павлова. Калуга, 2010, с. 25.

12. Белоусова И.И., Амстиславская Т.Г. Влияние сексуального опыта на половое мотивационное и копуляторное поведение крыс Вистар и OXYS. Тезисы докладов конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии». Томск, 2010, с. 30.

13. Белоусова И.И., Амстиславская Т.Г. Влияние сексуального опыта на половое мотивационное и копуляторное поведение крыс Вистар и ОХУБ // Труды Томского Государственного Университета. - Т. 275. - Сер. биологическая: Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии. Материалы Первой Всероссийской молодежной научной конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете. - Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2010, с. 100-103.

Подписано к печати 16.01.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ № 1

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоусова, Ирина Игоревна, Новосибирск

61 12-3/1166

Российская Академия Наук Сибирское отделение Учреждение РАН Институт цитологии и генетики

на правах рукописи

Белоусова Ирина Игоревна

Возрастные особенности гормональной и нейрохимической регуляции репродуктивной функции самцов крыс с различным темпом старения.

(03.03.01 - физиология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. Т.Г. Амстиславская

Новосибирск 2011

Введение...............................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы. Современные представления о половом мотивационном поведении самцов и механизмах, лежащих в основе его возрастного снижения....................................................................................................10

1.1. Структура полового поведения самцов....................................................10

1.2. Механизмы возникновения полового мотивационного поведения................13

1.2.1. Андрогены и половое мотивационное поведение..............................13

1.2.2. Структуры головного мозга участвующие в реализации полового мотивационного поведения.................................................................15

1.2.3. Нейромедиаторы и половое поведение самцов...................................19

1.3. Регистрация половой мотивации в эксперименте.......................................22

1.4. Старение и репродуктивная функция самцов............................................24

1.4.1. Половое поведение при старении....................................................24

1.4.2. Возрастные нейрохимические и эндокринные изменения...................26

1.4.3. Окислительный стресс и модели старения.......................................30

1.4.4. Окислительный стресс и репродуктивные нарушения........................33

1.5. Заключение......................................................................................34

Глава 2. Материалы и методы.................................................................35

2.1. Животные.......................................................................................35

2.2. Исследование полового поведения самцов крыс.......................................35

2.3. Исследование социального поведения самцов крыс..................................36

2.4. Иммуноферментный метод определения концентрации тестостерона и лютеинизирующего гормона....................................................................37

2.5. Гравиметрические и гистологические исследования..................................37

2.6. Определение содержания медиаторов в мозге с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.....................................................................38

2.7. Статистическая обработка данных.......................................................39

Глава 3. Результаты исследования...........................................................41

3.1. Исследование полового поведения самцов крыс линий Вистар и ОХУ8

разного возраста....................................................................................41

3.1.1. Изучение полового мотивационного поведения.....................................41

3.1.2. Изменение поведения при взаимодействии с социально и сексуально значимым партнером...............................................................................44

3.1.3. Влияние сексуального опыта на половое мотивационное поведение самцов...............................................................................................50

3.2. Изменение уровня тестостерона и лютеинизирующего гормона

с возрастом.........................................................................................52

3.3. Возрастные изменения гравиметрических (в 6,12, 26-месячном возрасте) и сперматогенных (в 12 и 26-месячном возрасте) параметров репродуктивной функции самцов......................................................................................55

3.4. Метаболизм серотонина, дофамина и норадреналина в мозге 6, 12 и 26-месячных самцов....................................................................................58

3.5. Влияние социально и сексуально значимого партнера на метаболизм моноаминов в гипоталамусе 12- и 26-месячных самцов.............................................69

4. Обсуждение...............................................................................................................76

5. Заключение..................................................................................................................94

Выводы....................................................................................................................97

Список цитируемой литературы....................................................100

Список сокращений:

5-НТ - серотонин

5-ГИУК - 5-гидроксииндолуксусная кислота

АСБ - андроген-связывающий белок

АФК - активные формы кислорода

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГСПГ - глобулин связывающий половые гормоны

ГГСК - гипоталамо-гипофизарно-семенниковый комплекс

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг гормон

ДА - дофамин

ДОФА - диоксифенилаланин

ДОФУК - диоксифенолуксусная кислота

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МПО - медиальная преоптическая область

НА - норадреналин

Т - тестостерон

Введение.

Выявление генетических и физиологических механизмов старения представляет собой одну из актуальных проблем физиологической генетики, геронтологии и медицины. Репродуктивная функция является одной из основных биологически высоко значимых функций организма, а ее снижение одним из проявлений естественного старения человека и животных (Wu, Gore, 2010). Кроме функционирования органов, необходимых для размножения, репродуктивная функция включает в себя и поведение, без которого невозможна нормальная реализация всего процесса размножения. Регуляция репродуктивной функции осуществляется единой функциональной нейроэндокринной системой, которая включает в себя как центральное - интегрирующее звено (Hull et al., 2007), так и периферические (эффекторные, исполнительные) органы (Dixson, Anderson, 2004). Эти звенья взаимодействуют между собой по принципу прямой и обратной отрицательной и положительной связи, определяемой характером сигналов, поступающих с периферии (Pau, Spies, 1997).

Поведение, связанное с репродукцией, включает в себя ухаживание, ведущее к образованию пары, собственно копуляторное поведение, обеспечивающее оплодотворение, и родительское поведение (Мак-Фарленд, 1988). Для реализации копуляторного поведения животные должны обладать собственной сексуальной рецептивностью, а также различать внешние стимулы с целью обнаружения потенциального полового партнера, активно достигать его, уметь различать феромональный сигнал или поведенческий паттерн партнера от того, кто не является сексуально значимым, а также быть способными осуществить половой процесс (Тинберген, 1993; Clark, 1993; Pfaus, 2001).

Мужское половое поведение включает в себя аппетентную (мотивационную) и консуматорную (завершающую) фазу, а также рефрактерный период (Pfaus et al., 2003). Большинство исследований мужского полового поведения связано с изучением завершающей фазы, тогда как работ по изучению начальной, мотивационной фазы, необходимой для нормальной реализации всего полового поведения, остается по-прежнему мало (Agmo, 1999; Amstislavkaya, 2004).

Учитывая глобальное постарение населения, важной задачей современной науки является продление активного периода жизни и сохранение репродуктивного

здоровья (Bitzer et al., 2008). Кроме того, в настоящее время в развитых странах наблюдается рост процента мужчин репродуктивного возраста со сниженной половой мотивацией (Svendsen, Schultz, 2008; Rowland et al., 2010). В результате исследование механизмов, лежащих в основе возрастных нарушений как полового поведения, так и всей репродуктивной системы в целом приобрело особую актуальность. Решение этой проблемы невозможно без проведения экспериментальных исследований с использованием адекватных биологических моделей.

В настоящее время в мире существует ограниченное число моделей животных с признаками преждевременного старения. Так наиболее изученной является созданная японскими учеными линия мышей SAM (senescence accelerated mouse), представленная 12 сублиниями, различающимися по характеру проявления признаков старения (Takeda et al., 1998; 2009). Тем не менее, проводимые в последнее десятилетие в Институте цитологии и генетики СО РАН исследования свидетельствуют в пользу того, что полноценной моделью преждевременного старения может служить созданная в 70-е гг. в ИЦИГ СО РАН линия крыс OXYS (Соловьева и др., 1975). Этих животных отличает раннее развитие заболеваний, свойственных стареющим людям и животным, сниженная моторно-исследовательская активность, способность к обучению, а также повышенная тревожность (Колосова и др., 2002, 2003; Лоскутова, Колосова, 2000). Существование такого рода ранних возрастных изменений позволило предположить и раннее снижение функциональной активности репродуктивной системы у крыс OXYS, исследование которой до этого не проводилось.

Преимущество использования в работе животных двух генотипов, различающихся темпом старения, позволит выявить особенности функционирования репродуктивной системы на медиаторном и гормональном уровне преждевременно стареющих самцов крыс линии OXYS.

Целью данной работы было исследование возрастных особенностей гормональной и нейрохимической регуляции репродуктивной функции самцов крыс Вистар и OXYS, характеризующихся разным темпом старения.

Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование половой мотивации крыс линий Вистар и ОХУ8 разного возраста;

2. Исследовать уровень тестостерона в условиях покоя и половой активации в крови и семенниках и лютеинизирующего гормона в крови у 6-, 12- и 26-месячных самцов Вистар и ОХУ8;

3. Оценить возрастные изменения гравиметрических и сперматогенных параметров репродуктивной функции самцов крыс линий Вистар и ОХУ8;

4. Исследовать возрастные особенности метаболизма норадреналина, дофамина и серотонина в мозге 6, 12 и 26-месячных самцов Вистар и ОХУ8;

5. Провести исследование влияния социально и сексуально значимого партнера на метаболизм норадреналина, дофамина и серотонина в гипоталамусе 12 и 26-месячных самцов Вистар и ОХУ8.

Научная новизна работы

• Установлено, что первые возрастные нарушения полового мотивационного поведения у самцов линии ОХУ8 появляются в 12 мес, в то время как у крыс Вистар подобные нарушения отмечены только к 18 мес.

• Выявлено возрастное снижение эндокринного ответа семенников (по уровню тестостерона) в условиях половой активации у крыс ОХУ8: в 26 мес он был ниже, чем у 12-месячных самцов ОХУ8 и не отличался от крыс Вистар.

• Выявлено более выраженное по сравнению с Вистар возрастное снижение потенциальной способности семенников к нормальному мейозу у самцов ОХУ8. Установлена предрасположенность самцов крыс линии ОХУ8 к развитию спонтанных лейдигом.

• Впервые проведено исследование метаболизма моноаминов в структурах мозга, вовлеченных в регуляцию полового поведения и структурах, где сосредоточены тела серотонергических, дофаминергических и норадренергических нейронов у самцов ОХУ8 разного возраста.

• Выявлены более ранние по сравнению с Вистар возрастные изменения метаболизма моноаминов в мозге у крыс ОХУЭ: у 12-месячных самцов снижен уровень серотонина и его метаболита 5-ГИУК в среднем мозге, дофамина и норадреналина в гипоталамусе.

• У 26-месячных самцов Вистар и ОХУБ выявлено снижение содержания дофамина и серотонина, а также усиление катаболизма дофамина в гипоталамусе.

• Установлено, что основные изменения в метаболизме катехоламинергической и серотонергической систем в условиях половой активации у самцов происходят в гипоталамусе.

• У крыс ОХУ8 выявлены особенности метаболизма медиаторов в ответ на предъявление полового стимула, заключающиеся в снижении катаболизма дофамина в гипоталамусе в возрасте 12 и 26 мес и повышенном содержании 5-ГИУК у 26-месячных животных.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы

Данная работа расширяет современные фундаментальные представления о возрастных нарушениях полового мотивационного поведения, сопряженных с определенными нейрогормональными и нейрохимическими изменениями в мозге и на периферии. Практическая ценность работы заключается не только в выявленной избирательности вклада гормонов и моноаминов в процесс снижения полового мотивационного поведения при старении, но и в перспективе дальнейших исследований по поиску подходов к коррекции приспособления организма к возрастным нарушениям.

Положения, выносимые на защиту

1. Самцы крыс линии ОХУ8 характеризуются более ранним (12 мес) снижением полового мотивационного поведения по сравнению с крысами Вистар (18 мес). Наличие сексуального опыта не влияет на выраженность возрастного снижения полового мотивационного поведения у самцов крыс Вистар и ОХУ8.

2. Для самцов линии Вистар и ОХУ8 характерно возрастное снижение эндокринного ответа семенников (по уровню тестостерона) в условиях половой активации.

3. Показано возрастное снижение массы семенников, эпидидимисов и препуциальных желез. Снижение массы семенников у крыс ОХУБ наблюдалось с 6 мес, тогда как у Вистар - с 12 мес.

4. 12-месячные самцы линии OXYS характеризуются сниженным содержанием норадреналина и дофамина в гипоталамусе, серотонина и 5-гидроксииндолуксусной кислоты в среднем мозге, что свидетельствует об ускоренных возрастных изменениях в центральном звене регуляции репродуктивной функции у них.

5. В условиях половой активации крысы OXYS по сравнению с Вистар характеризуются сниженным катаболизмом дофамина в гипоталамусе в 12 и 26 месяцев, а также повышенным уровнем 5-гидроксииндолуксусной кислоты в 26 месяцев.

Апробация работы

Полученные данные были представлены и обсуждены на отчетных сессиях аспирантов ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 2010, 2011), отчетной Сессии Института цитологии и генетики в 2010, на XLVI и XLVIII международных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008, 2010), на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на II конференции Российской ассоциации психонейроэндокринологии (Москва, 2010), на XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), на конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 4 статьи (1 в зарубежном издании и 3 в отечественных рецензируемых журналах).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (240 наименований). Работа изложена на 113 страницах, содержит 23 рисунка и 3 таблицы.

Глава 1 Обзор литературы

Современные представления о половом мотивационном поведении самцов и механизмах, лежащих в основе его возрастного снижения

1.1. Структура полового поведения самцов

Половое поведение является важнейшей составной частью процесса размножения и относится к числу биологически высоко значимых форм поведения. Его реализация обеспечивается сочетанным действием нейромедиаторов и нейропептидов, половых стероидов и их метаболитов.

У всех животных половое поведение организовано как последовательность или «каскад» поведенческих событий, который можно схематически представить перекрыванием так называемых диаграмм Вена, в которых изменение поведения последовательно происходит слева направо (см. рис. 1). За начальной (аппетентной или мотивационной) следует завершающая (или консуматорная) стадия, после которой следует рефрактерный период (или период покоя) (Clark, 1993). Половое мотивационное поведение грызунов запускается феромонами рецептивной самки и связано с поиском сексуально значимого объекта, а консуматорное поведение имеет место уже при контакте со стимулом и осуществляется при тактильной стимуляции с половым объектом. Разделение между этими фазами не строго фиксировано, и некоторые компоненты могут присутствовать в обеих фазах (Pfaus et al., 2001, 2003; Hull at al., 2002). В отличие от консуматорного поведения, которое стереотипно и видозависимо, аппетентное поведение более вариабельно: выживание часто зависит от способности животного обучаться различным стратегиям для достижения целей или желаемого (Blackburn et al., 1992).

Необучаемые аппетентные процессы представлены существующими инстинктами, например, безусловным аногенитальным исследованием. Известно, что аппетентные реакции в поведенческом проявлении идентичны как для самцов, так и для самок крыс, несмотря на существование полозависимых различий в нейрональном и эндокринном контроле этих реакций. У самцов консуматорным ответом служат садки, интромиссии и эякуляции (Pfaus et al, 2001).

Рис 1. Последовательность осуществления полового поведения у крыс (по Pfaus, 2001 в модификации).

Различие между начальным и завершающим этапами является ключевым фактором в современной теории действия стимула, которая приложима к таким разным формам поведения как пищевое, агрессивное (Berridge, 2004), а также и половое (Everitt, 1990,1995; Pfaus, 1995, 1999; Pfaus et al., 1999).

Некоторые авторы выделяют в половом поведении кроме аппетентной и консуматорной фаз ещё подготовительную и предвосхищающую стадию (Pfaus, 1996). В эксперименте подготовительная стадия имеет место в тех случаях, когда используются инструментальные ответы, такие как бег в лабиринте, пересечение электрической решетки, предпочтение обусловленного места, предпочтение в выборе партнёра.

В 1956 году Франк Бич впервые выдвинул положение о том, что сочетание внутренних и внешних факторов активирует половое поведение, поскольку сам