Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференцировка дофамин-синтезирующей системы медиобазального гипоталамуса и ее регуляция в пренатальном периоде развития крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Дифференцировка дофамин-синтезирующей системы медиобазального гипоталамуса и ее регуляция в пренатальном периоде развития крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова

I

7 о ■'

г \ М\р

МЕЛЬНИКОВА Виктория Ильинична

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ДОФАМИН-СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МЕДИОБАЗАЛЬНОГО ГИПОТАЛАМУСА И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ В ПРЕНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ КРЫС

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

На правах рукописи УДК 612.82. 577.175

Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляции Института бнолоп развития им. Н. К. Кольцова РАН (Москва) и в лаборатории цнтолоп Института лейронаук Университета им. П. и М. Кюри (Париж).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор М. В. Угрюмое доктор наук, профессор А. Калас

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, члсн-коррсспондснт РАМН,

профессор К. С. Раевский доктор биологических наук, профессор Б. Н. Манухин

Ведущая организация:

Институт нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН

Защита диссертации состоится " сопрел-* 1997 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.85.01 при Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН. Адрес: 117808 Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБР РАН

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е. В. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Актуальность исследований развития нейроэндокриппых регуляций в онтогенезе определяется их ключевой ролью в поддержании гомеостаза л интеграции развивающегося организма (Мицкевич 1978, Угрюмов 1989). Формирование отдельных структурно-функциональных элементов нейроэндокршшой системы и становление специфических взаимодействий между ними не являются процессами, строго детерминированными генетически. Они характеризуются высокой функциональной лабильностью и специфической чувствительностью ко многим регуляториым факторам (Lauder 1993, Calas 1994), что открывает возможности для коррекции нарушений процесса развития.

Многообразие и сложность форм взаимоотношений нервной и эндокринной систем во взрослом организме существенно затрудняют познание фундаментальных принципов функционирования отдельных звеньев, и, в частности, неиросекреторной системы гипоталамуса. В этом отношении перспективным является онтогенетический подход, который дает возможность оценить функциональное ■ значение отдельных элементов нейросекреторной системы до установления между ними сложных структурно-функциональных иерархических связей. Изучение основных закономерностей развития нейросекреторной системы гипоталамуса имеет п большое самостоятельное значение для нейроэндокринологии развития. В первую очередь это объясняется вовлечением гормонов, в том числе и ненрогормонов, в регуляцию морфогенетпческих процессов, которые у высших позвоночных реализуются в перинатальном периоде развития (Мицкевич 1978, Buzníkov et al. 1996). Сами нейрогормоны являются индукторами роста и днфференцировки мозга (Whitaker-Azmitia and Azmitia 1989, Lauder 1993). Морфогенетическое действие, получившее название "нмпринтинга", проявляется па строго определенных стадиях развития - в критические периоды - и носит необратимый характер. Отсутствие или недостаточная концентрация необходимого ненрогормона в критическом периоде приводит к серьезным органическим и функциональным нарушениям в отдельных звеньях нейроэндокршшой регуляции. Такие нарушения в процессе дальнейшего

развития и последующей жизни не корригируются (Мицкевич 1978, Ugrumc 1994).

Если на ранних этапах онтогенеза преобладает морфогеиетнческс действие нейрогормоиов, то позднее проявляется и их актинашюнпын эффегс В этом случае обеспечивается контроль определенной функции организма, само действие гормонов начинает носить обратимый характер (Мицкевич 197Î Kordon et al. 1980, Ugrumov 1991, Everitt et al. 1992). Таким образо? функционально разобщенные па начальных этапах развития гппоталаму< гипофиз н периферические эндокринные железы в перинатальном период превращаются в единую нейроэндокрннную систему.

Наиболее важными физиологически активными петествам1 повлеченными в нейроэндокринную регуляцию на различных иерархически уровнях, являются катехоламшш. Дофамин (ДА) медиобазальног гипоталамуса (МБГ) обеспечивает регуляцию репродуктивной функнн организма, контролируя выделение люлибернна в срединном возвышении секрецию пролактина в передней доле гипофиза (Weiner et al. 1988, Collu 198 Everitt et al. 1992).

В онтогенезе экспрессия ДА-фенотппа нейронов МБГ осуществляете поэтапно. В пренаталыюм периоде развития в этой области присутствует лнш незначительное количество нейронов, содержащие оба фермента синтеза ДА сам ДА (Borisova et al. 1991, Ugrumov et al. 199S). Однако, до енх по отсутствуют данные об экспрессии специфических синтезов и функционально активности этих нейронов в пренаталыюм периоде развития, а также о рол микроокружения в их дифференцировке. Имеющиеся литературные данные становлении гипоталамического контроля секреции пролактин немногочисленны н противоречивы (Ojeda and McCann 1974, Reusens et al 1979, Khorram et al. 1984, Hooghe-Peters et al. 1988). Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение формирования ДА синтезирующей системы МБГ и роли внеклеточных сигнальных молекул дифференцировке этих нейронов. Для достижения этой цели были поставлеш следующие задачи:

1) изучить способность нейронов МБГ к синтезу ДА, а также к его выделению в отпет на деполяризацию мембран п прематальном периоде развития in vivo и в культуре

2) изучить становление дофаминового иигибиториого контроля секреции пролактипа гипофизом как показателя функциональной зрелости ДА-сшггезнрующнх нейронов МБГ.

3) выявить характер влияния эмбриональных серотошшергнческнх нейронов на экспрессию тирозннгидрокенлазы (ТГ) - первого фермента синтеза ДА - в эмбрпональих нейронах МБГ.

Научная новизна.

Предложен новый метод получения диссоциированной культуры клеток изолированных аркуатных областей гипоталамуса плодов, который выгодно отличается от культуры целого гипоталамуса, поскольку позволяет изучать дифференцировку отдельной популяции ДА-сннтезнрующих нейронов.

Показано, что в пренатальном периоде развития нейроны МБГ гипоталамуса способны синтезировать ДА п выделять его в ответ на деполяризацию мембран.

Доказано, что уже в пренатальном периоде секреция пролактипа находится под гипоталамнческнм дофаминовым контролем.

Продемонстрировано, что серотонннергическне нейроны стимулируют экспрессию скорость-ллмитирузощего фермента синтеза ДА - ТГ - в нейронах МБГ плодов крыс.

Научная и практическая значимость работы.

Полученные данные способствуют углублению существующих представлений о развитии гнпоталамо-гипофизарного звена неироэндокринной регуляции репродуктивной функции. В работе впервые проведено комплексное исследование развития ДА-снитезирующих нейронов МБГ, включающее биохимические и физиологические показатели зрелости этих нейронов в конце пренатального периода. Согласно полученным данным становление дофаминовой гнпоталамическон регуляции секреции пролактипа происходит у крыс до рождения, т.е. в тот же период, что и формирование основных гнпоталамо-гипофизарных звеньев ненроэндокринкоп регуляции. Выявленное стимулирующее влияние серотошша на развитие нейронов аркуатного ядра

укладывается в представление о роли нейрогуморальных факторов микроокружешш в реализации генетическом программы дифференцирующихся нейронов.

Результаты выполненной работы могут найти практическое применение в экспериментальной нейроэндокринологнн и медицине при изучении патогенеза ряда непроэндокрннонатш!, связанных с недостаточностью моноаминсргнческой системы МБГ. Дегенерация ДА-нейронов аркуатного ядра приводит к стойкой гиперпролактпнемин, что влечет за собой аменорею, галакторею, импотенцию и гинекомастию (Марри п др. 1993). Представляется перспективной пересадка эмбриональных ДА-neiiponoB при указанных патологиях. В настоящее время это направление находится на стадии разработки экспериментальных моделей гнперпролактинемин и коррекции ее путем трансплантации соответствующих нейросекреторных нейронов (Arrendash et al. 1986). В нашей лаборатории проведены исследования по изучению экспрессии ДА-фенотипа нейронов аркуатного ядра, трансплантированных в третий желудочек мозга взрослого реципиента (Фетисов и др. 1994).

Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ лаборатории гормональных регуляций Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН "Структурно-функциональные основы становления непроэндокринных механизмов регуляции процессов онтогенеза" н в рамках программы проектов: INTAS-RFBR "Monoamincrgic and peptidergic neurons: differentiation, plasticity and regulation of phenotype expression in intercellular signalling", РФФИ "Роль моноаминов в ненроэндокринной регуляции в онтогенезе" и РФФИ "Дпффсренцнровка нейронов нее нейрогуморальная регуляция". Публикация результатов исследования и апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены на коллоквиумах лаборатории гормональных регуляции ИБР им. Н. К. Кольцова; на международных симпозиумах: "11th Biennial Meeting of International Society for Developmenal Neurosciences" Tampere, Finland, 1996 г., "8th International Catecholamine Symposium" California, USA, 1996 г. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, три находятся в печати.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и

содержат /Г рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав изложения собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах были использованы крысы линии Вистар. Для получения самок с датированным сроком беременное™ использовали 3-4-х месячных крыс, к которым вечером подсаживали самцов, а утром брали влагалищные мазки. День обнаружения спермы в мазке считали первым днем беременности.

У части плодов проводили in utero декапитацию методом, разработанным А. Jost (Jost 1947) или энцефалэктомию методом, разработанным в лаборатории гормональных регуляций ИБР РАН (Мицкевич и др. 1970). Схемы экспериментов.

1) Метаболизм и выделение дофамина нейронами медиобазалъного гипоталамуса in vivo и в культуре.

In vivo. МБГ, включающий аркуатное ядро и срединное возвышение, выделяли у 19-ти и 21-дневных плодов крыс. Часть выделенных фрагментов использовали для определения ДА и его метаболита - диоксифеннлуксуснои кислоты (ДОФУК) в экстрактах ткани, а другую часть - для оценки спонтанного и стимулированного выделения ДА. К^-стнмулированное выделение эндогенного ДА из ткани МБГ определяли в перфузионных камерах в соответствии с методом, описанным Е. Gallardo и V. Ramirez (Gallardo and Ramirez 1977). С этой целью использовали буферы, различающиеся по содержанию ионов калия (в мМ): 1) NaCl - 136, KCl - 3, СаС12 - 2, NaH2P04 -0,5. HEPES - 20, глюкоза 10, аскорбиновая кислота 0,13; 2) KCl - 60, NaCl -79, остальные компоненты без изменений. Собирали 5-минутные фракции с буфером 1) и 2), замораживали и хранили до определения ДА и ДОФУК.

In vitro. Диссоциированную культуры нейронов получали из МБГ 17-дневных плодои, выделяемого из мозга по оригинальной методике. Для выделения мозга у 17-дневных плодов на уровне основания черепа проводили горизонтальный надрез, пересекая хиазму, ножку гипофиза и черепно-мозговые нервы. Мозг располагали вентральной поверхностью вверх п делали два фронтальных надреза: каудальпьж - сразу за ложкой гипофиза, и ростральный - па расстоянии двух третей протяженности от хиазмы до иожкн гипофиза. Из полученного таким образом фронтального среза вырезали МБГ, ориентируясь на вентральную область третьего желудочка. Выделенные фрагменты ткани освобождали от мозговых оболочек.

Культивирование нейронов проводили согласно протоколу A. Faivre-Bauman и A. Tixicr-Vidal (Tixier-Vidal and Faivre-Bauman, 1990) в бессывороточной культуральноп среде DMEM/F12 с дополнительными компонентами определенного химического состава. Плотность посадки составляла 1 млн клеток на чашку. Смену среды проводили на 4-й и 6-й дни. На 7-й день культивирования отбирали пробы среды для последующего определения ДА и его метаболитов, затем культуру останавливали и оценивали спонтанное а стимулированное выделение ДА н его содержание в экстрактах клеток. Оценку К+-етпмуллрованного выделения эндогенного ДА в культуре проводили в соответствии с методом, описанным J. Puymirat с соавторами (Puvmirat et al. 1987). Длительность инкубации в буферах "1" н "2" (см. выделение ДА in vico) составляла 15 минут. Пробы замораживали и хранили до определения ДА и ДОФУК.

2) Секреция пролактича гипофизом и ее дофаминовая гипоталамическая регуляция в пренаталыю.ч периоде развития. Для блокады рецепторов дофамина на лактотрофах самкам крыс на 18-й, 20-й и 22-й дни беременности однократно вводили внугрнбрюшпнно галонерндол в дозе 75 мг, кг. Контрольной группе животных вводили равный объем физиологического раствора. Через 1,5 часа после инъекции плоды извлекали. Содержание пролактина определяли в плазме крови и гипофизах. Часть плодов, декашггнрованных или энцефалэктомнрованных in utero на 18-ií день, использовали в эксперименте на 22-й день. 22-дневных плодов дифференцировали по полу.

3) Влияние ссрогпоиинергических нейронов па экспрессию пшрозингидрокыиазы в нейронах медиооазалъного гипоталамуса. Использовали модель совместного культивирования нейронов ядра шва п МБГ, взятых от 17-дпевных плодов крыс. Для ко-культнвнрования нейроны из указанных областей мозга помещали па изолированные покровные стекла, укрепленные на дне культуральных чашек (КО мм), что позволило предотвратить физический контакт между клетками. Культуру останавливали на 7-й день и иммуноцитохнмпчески выявляли серотошш в нейронах ядра шва и ТГ в нейронах аркуатной области. Относительные количества выявляемых веществ оценивали по оптической плотности.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Определение ДА и ДОФУК проводили на обращенпо-фазовой колонке (3x150 мм, Ct8, 5 мкм, МНПП "Элснко", Москва) в 0,1 M нитратно-фосфатном буфере, содержащем 0,25 мМ октаисульфоната натрия, 0,1 M ЭДТА и 8,5 % ацетоннтрила (рН=3,6), с последующей электрохимической детекцией на стеклоуглеродном электроде (+0,8 В).

И.ч.чуноцитохимическое выявление тирозингидроксилазы и серотонгша в клетках культуры. Использовали авидин-бнотпн-иммунопероксидазный метод (Hsu et al. 1981). Культуру фиксировали 4-%-ным параформальдегидом (30 мни). Инкубировали с антисывороткой к ТГ (1:3000) или серотоннну (1:1000) в течение 12-тн часов при 4°С. Дальнейшие процедуры проводили в соответствии с протоколом Vectastain, используя АВС-кнт (Vector Labs). Пероксидазную активность выявляли днаминобензндин тетрагпдрохлорндом (0,3 мг/мл на 0,02 M фосфатном буфере с 0,01% Н202) (Sigma). Денсптометрическип анализ проводили на компьютерной установке с использованием программы "Starwise".

Радиоиммунологическое определение пролаютта. Содержание пролактнна определяли в плазме крови и гипофизах плодов с помощью NIADDK - кита, любезно предоставленного др. Pariow A.F. (NIADDK кит PRL-RP-3), минимальная чувствительность - 0,5 иг/мл. Экстракцию пролактнна из ткани гипофизов проводили в соответствии с протоколом W. Shah и G. Hymer (Shah and Hvmer 1989).

Математический анализ результатов. Для статистической обработки данных использовали критерий Стьюдсита н непара,метрический критерий Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

/. Метаболизм дофамина и его К'-стимупирооашюе выделение нейронами медиобазалыю/о гипоталамуса плодов крыс.

Исследование in vivo. Способность к выделению ДА в ответ на деполяризацию мембраны выявлена на 19-й эмбриональный день (Э) только у самок (рис. 1). К Э21 стимулированное выделение ДА обнаружено и у самцов, причем оно в 5,6 раза превышает базальиый уровень, в то время как у самок - только в 1,8 раза (рис. 2). Зарегистрированные различия между иолами статистически достоверны. Кроме того, на Э21 обнаружена тенденция к более высокому содержанию ДА и ДОФУК в ткани МБГ у самцов по сравнению с самками (рис. 3). Отношение ДОФУК/ДА у самцов и самок составляло соответственно 0,896+0,12 и 1,07+0,21.

Повышенный уровень ДА и ДОФУК в конце пренатального периода развития в МБГ по сравнению с целым гипоталамусом и мозгом (Covle et al. 1973, Herregodts et al. 1990) может свидетельствовать о высоком уровне метаболизма ДА в нейронах этой области. Выделение ДА в ответ на деполяризацию мембран также является важной характеристикой функциональной зрелости нейронов. Полученные данные позволяют предположить, что функциональное созревание ДА-неиронов МБГ у самок начинается раньше, чем у самцов, но протекает медленнее. Таким образом, к концу пренатального периода развития ДА-нейроны МБГ у самцов являются более зрелыми, чем у самок.

Исследование in vitro. Наличие ДА в ткани аркуатпого ядра и его выделение в ответ на деполяризацию мембран, возможно, обеспечивается не только нейронами МБГ, но и аксонами ДА-псиронов других областей мозга, проецирующимися в срединное возвышение. Использование культуры клеток МБГ позволило уточнить биохимические и функциональные показатели собственных нейронов аркуатпого ядра. По данным литературы развитие ДА-

нейронов в первичной культуре целого гипоталамуса в течение первых недель соответствует таковому in vivo (Murray and Gillies, 1993).

В настоящем исследовании ДА и его метаболит ДОФУК обнаружены в экстрактах клеток культуры (рис 4), что свидетельствует, с одной стороны, о синтезе этого медиатора нейронами аркуатного ядра, а с другой - об экспрессии моиоаминокепдазы.

Согласно предварительным данным (Ugrumov et al. 1996), в этот период в аркуатном ядре практически отсутствуют нейроны, содержащие одновременно первый и второй ферменты синтеза ДА. Можно предположить, что последовательные этапы синтеза ДА происходят в разных нейронах аркуатного ядра. Возможно, ТГ-неироны вентролатералыюи части ядра синтезируют промежуточный продукт - л-дпоксифенилаланин (л-ДОФА), который затем поступает в ДДК-нейроны дорзомедналыюй части, где происходит его декарбоксилирование в ДА. Это согласуется с пространственной взаимной локализацией ТГ-, ДДК (ДОФА-декарбоксилаза)- и ДА-содержащих нейронов.

На 7-й день in vitro содержание ДА у самцов достоверно выше, чем у самок (р<0,05). Половые различия в концентрации ДОФУК статистически недостоверны, но проявляют аналогичную тенденцию. Отношение ДОФУК/ДА составляло у самцов и самок соответственно 2,4+0,15 и 2,84+0,44. В культуралыюй среде, как и в экстрактах клеток, содержание ДОФУК превышало концентрацию ДА (рис. 5), причем ДОФУК/ДА составляло у самцов 3,07+0,15, а у самок 3,3+0,18. Достоверных различий в содержании ДА и ДОФУК в культуралыюй среде у самцов и самок не обнаружено.

Высокое отношение ДОФУК/ДА в культуре по сравнению с экстрактами ткани может свидетельствовать о более высокой скорости катаболизма ДА или о меньшем уровне его синтеза в культуре. Возможно, это связано с дополнительным источником ДА в ткани МБГ - аксонами, пересекающими эту область. Кроме того, относительно высокое содержание ДОФУК в культуре может быть следствием более высокой активности моноамнноксидазы in vitro.

Деполяризация мембран приводила к увеличению скорости выделения ДА как у самцов (в 3,6 раза), так и у самок (в 1,8 раза) (рис. 6). При этом

12 s

величина реакции на деполяризацию у самцов была достоверно выше, чем у самок (р<0,05).

Это означает, что в отличие от показателей метаболизма ДА, его стимулированное выделение в культуре соответствовало показателям, зарегистрированным in vivo.

Половой диморфизм показателей метаболизма и выделения ДА, обнаруженный при культивировании, не может быть объяснен влиянием эндогенных половых гормонов, т.к. взятие материала для посадки производилось до начала активного синтеза и секреции тестостерона у плодов (Weisz and Ward 1980). По-видимому, обнаруженные половые различия детерминированы генетически, или определяются другими факторами, связанными с полом, но не половыми стероидами. В пользу этого предположения говорят также данные W. Friedman с соавт (Friedman et al. 1989), продемонстрировавших, что активность ТГ нейронов МБГ плодов мышеи не чувствительна к действию половых стероидов, в отличие от взрослых животных (Luine et al. 1977).

Таким образом, нейроны аркуатного ядра синтезируют ДА и способны к его выделению в ответ на деполяризацию мембран уже в пренаталыюм периоде развития.

2. Секреция пролактина гипофизом и ее гипоталамическая регуляция в пренаталъном периоде развития.

Пролактин в гипофизе крыс обнаружен впервые на Э20 (рис. 7). Несмотря на значительное повышение уровня пролактина в гипофизе с Э20 по Э22, выделение гормона в кровь в этот период незначительно у самок и практически отсутствует у самцов, о чем свидетельствуют результаты, .полученные на декапптированных плодах (рис. 8). Действительно, декапнтация плодов, то есть устранение гипофизарного источника пролактина, не изменила базальный уровень этого гормона в плазме самцов и незначительно снизила его у самок -(рис. 8). У ложнооперированных животных, использованных в качестве дополнительного контроля, все параметры не отличались от неоперированных, что позволило объединить их в единую контрольную группу. Наличие пролактина в плазме крови декапнтированных плодов может также свидетельствовать об экстрагипофизарном синтезе пролактина или

фолактиноподобных белков у плодов, либо о проницаемости плаценты крыс 1ля ряда негипофизарных пролактиноподобпых белков, на что косвенно /называют н некоторые литературные данные (Harigava et al. 1988, Wilder and Linzer 1989).

Галоперндол, селективный антагоннст Д2 рецепторов, повышает уровень 1ролактила в крови впервые на Э20 (рис. 8). В гипофизе на этом сроке ¡аблюдается лишь тенденция к снижению уровня пролактниа (рис. 7), что связано, вероятно, с низким содержанием гормона. Полученные результаты свидетельствуют о включении дофаминового контроля секреции пролактина на Э20. Этот вывод косвенно подтверждай^ и данные литературы. На 20-й день эазвития выявлена чувствительность лактотрофов к агонисту ДА - апоморфнну \п vitro (Khorram 1984), а также способность ДА-агопнста - бромкрнптш/а юдавлять выделение пролактина у плодов in vico (Reusens et al 1979).

К Э22 а полной мере обнаруживается дофаминовый контроль секреции пролактина гипофизом. Об этом свидетельствует, с одной стороны, повышение уровня пролактниа в плазме (pite. 8), а с другой - снижение его в гипофизе в этвет на блокаду ДА-рецепторов галоперпдолом (рис. 7).

Результаты, полученные на энцефалэктомлрованных плодах, указывают на гнпоталамическое происхождение ДА, участвующего в этой регуляции, подобно взрослым животным (Mioduszewski and Critchlow 1981, Kaler et al. 1984). Высокий уровень пролактина в плазме и следовые количества его в гипофизе энцефалэктомнрованных плодов (рис. 7,8), связаны, по всей видимости, с неспособностью лактотрофов удерживать синтезируемый пролактин в отсутствии гипоталамуса в период между Э18 н Э22. Таким образом, у интактных плодов в указанный период гипоталамус оказывает тоническое ¡шгпбирующее влияние на секрецию пролактина.

Отсутствие изменений в содержании пролактина в плазме декапитированных плодов в ответ на галоперндол позволяет заключить, что материнский гппофнзарный пролактин не проходит через плаценту, а секреция внегипофизарного пролактина не регулируется ДА. Таким образом, весь регистрируемый выброс пролактнна в ответ на блокаду Д2-рецепторов у неоперированных плодов обеспечивается гипофизом плода.

Повышенный уровень пролактина в плазме кровн самок на Э22 по сравнению с самцами (рис. 8), вероятно, связан с влиянием эндогенных половых стероидов на секретно этого гормона. Известно, что пик синтеза собственных половых стероидов у крыс наблюдается в пренаталыюм периоде (Weisz and Ward 1980), и в это же время тестостерон способен подавлять секрецию пролактнпа гипофизом (Nakai et al. 1972). С другой стороны, различное содержание пролактнпа в плазме самцов и самок может быть связано с разным уровнем выделения ДА-непронами аркуатного ядра. 3■ Влияние серотоничергичсских нейронов на экспрессию тирозингидроксилазы в нейронах аркуатного ядра.

Сравнительный анализ содержания ТГ в нейронах аркуатного ядра и серотоннна в нейронах ядра шва не выявил различий между самцами и самками (рис. Э). Совместное культивирование нейронов этих областей приводило к достоверному увеличению содержания ТГ в нейронах аркуатного ядра, причем только у самцов (рис. 9). При этом уровень серотонина в нейронах ядра шва не менялся (рис. 9).

Таким образом, серотонинергические нейроны стимулируют экспрессию ТГ в нейронах аркуатного ядра у самцов. Данный эффект опосредуется гуморальными факторами, поскольку контакт между клетками этих областей в ко-культуре был исключен. По предварительным данным, полученным на модели in vivo с подавлением синтеза серотонина и последующим анализом количества ТГ в нейронах аркуатного ядра, дефицит серотонина приводит к снижению содержания ТГ в нейронах МБГ. Эти данные позволяют предположить, что активным веществом, действующим на экспрессию ТГ в ко-культуре является серотонцн.

Выявленное стимулирующее влияние серотонина на развитие нейронов аркуатного ядра укладывается в существующее представление о влиянии афферентных входов на морфогенетические процессы в развивающихся нейронах-мишенях.

ВЫВОДЫ

1) В пренатальиом периоде развития нейроны медпобазального гипоталамуса способны синтезировать дофамин и выделять его в ответ па деполяризацию мембран.

2) Функциональное созревание и активность лофампп-сиптезирующей системы медпобазального гипоталамуса характеризуется половым диморфизмом.

3) Гиноталамнческпп дофаминовый ипгибиторнын контроль секреции пролактииа устанавливается у крыс к 20-му дшо препатального периода развития.

4) Дпфферепцпровкя нейронов медпобазального гипоталамуса, экспресспруюпшх тпрозингпдроксплазу, контролируется серотошшергичсскпми нейронами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Захарова Л.А., Малкжопа И.В., Сапронова А.Я., Прошлякова Е.В.,

Мельникова В.И., Угрюмов М.В. Участие гппоталамо-гппофизарного звена ненроэндокршшон системы в развитии иммунного ответа у плодов крыс. Доклады Академии Наук. 1995. Т. 345. 6. С. 830-832. I. Сапронова А.Я., Прошлякова Е.В., Панаева С.В., Мельникова В.И., Воронова С.Н., Угрюмов М.В., Турпаев Т.М.. Развитие серотонинергпческой системы среднего и промел<уточного мозга мышей и роль серотошша в этом процессе. Бюлл. экса. бнол. мед., 122, N8 (1996). i. Мельникова В.И., Прошлякова Е.В., Сапронова А.Я., Блюэ-Пажо М.Т., Калас А., Угрюмов М.В. Секреция пролактииа гипофизом в пренаталыгом периоде развития крыс и роль дофамина в этом процессе. Онтогенез, (принято в печать), i. Мельникова В.И., Прошлякова Е.В., Сапронова А.Я., Блюэ-Пажо М.Т., Калас А., Угрюмов М.В.. Гииоталамическни дофаминовый ннгпбиторный контроль секреции пролактииа гипофизом в пренаталмюм периоде развития. Онтогенез, (принято в печать). 5. A.Sapronova, V.Melnikova, M.Ugrumov, A.Faivre, C.Loudes, C.Kordon Role of catecholamines in the development of the hypothalamic somatostatin system

in rat fetuses. 11th Biennial Meeting of International Society for Developmena! Neurosciences. Tampere, Finland, 30 июля—Завгуста 1996, стр. 91.

6. M.Ugruinov, A.Calas, I.Balan, V.Mclnikova, M. Orosco, P. Mailly, N. Delhaye-Bouchaud, J.Thibault, M. Kriegcr, S. Nikolaidis. Non-monoaminergic differentiating neurons co-operate in dopamine synthesis. 8th International Catecholamine Symposium.California, USA, 13-18 октября 1996, стр. 203.

7. M.Ugrumov, A.Calas, M. Beltramo, A. Tremhleau, A.Sapronova, V.Mclnikova. Role of hypothalamic catecholamines in differentation of the target neurons. . 8th International Catecholamine Symposium. California, USA, 13-18 октября 1996, стр. 203.

<

х х

г <

в

О с

Ш "С

3 с

X

ш

с

ш

л ш

200 -

150 -

100

50 -

| | 3 мМ КС1 I | 50 мМ КС|

т

I

I

самцы самки

не. I. Споптанное и К^-стимулнровшшое выделение дофамина из МБГ плодов на 9-11 день развития. *- р<0,01

<

х х

г <

в

4 2

ё 1

X

Ш

С

ш

5 л ш

300 250 Н 200 150 -100 -50

| | 3 мМ КС1 Г~~1 60 мм КС!

X

X

самцы

'не. 2. Спонтанное н К'-стнмулпрованное выделение дофамина из МБГ плодов на 1-й день развития. *- р<0,01

200 -

150

s

< 100 в о ч

50

I I самцы I I самки

I

250 - 200

- 150

- 1.00 - 50

О

sc >>

в О

Рис. 3. Содержание дофамина и ДОФУК в ткани МБГ плодов на 21-й день развития.

800 700 -1 600 -| 500 I 400 1 300 § 200 -* 100 -о

I ] самцы

I -■-" ■ I самки

800

- 700

- 600

- 500

- 400

- 300 200

h 100

Рис. 4. Содержание дофамина и ДОФУК в клетках культуры МБГ плодов на 7-день in vitro. *- р<0,05.

с х"

X

5 <

© о

200

150

100

50 -

I I самцы I I самки

If]

250 200 150 100 50 0

в О

ч

'ис. 5. Содержание дофамина и ДОФУК о культуральной среде на 7-й день in i tro.

<

х х

e

Si Si

x

Ш

c; ш

-O ffl

350 300 -250 -200 -150 100 -50 0

I | 3 MM KCI (~~~l 60 mM kci

T

самцы

Знс. 6. Спонтанное и К+-стпмулпрованное выделение дофамина клетками культуры *1БГ плодов на 7-й день in vitro. *- р<0,05

самцы самки самцы * самки

Рис. 7. Содержание пролактнна в гипофизах плодов на 18-й, 20-и и 22-й дни развития.

"ЭН" - энцефалэктомированные плоды, "Э" - эмбриональный день. *- р<0,01.

самцы * самки

самцы + самки

Я ЭН самим

Д ЭН самки

Рис. 8. Содержание пролактина в плазме крови плодов на 18-й, 20-и и 22-й дни развития.

"ЭН" - энцефалэктомнровашше плоды, "Д" - декапнтированные плоды, "-" -неоперированные плоды, "Э" - эмбриональный день. *- р<0,05, **- р<0,01.

I Í культура I I ко-культура

0.40

0.35 -

С

ь

д

I-

о

0

1 но с с

СЕ <

О ш

У S н с о

0.30 -

0.25 -

0.20

0.15 -

0.10 -

0.05 -

0.00

АРКУ АТНОЕ ЯДРО

ЯДРО ШВА

0.40

- 0.35

самцы самки

самцы самки

Рис. 9. Оптическая плотность тнрознигидрокснлаза (ТГ)- и серотоннн-иммунопознтивных нейронов. *- р<0,05