Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль альфа-синуклеина в механизмах сопряжения процессов нейровоспаления и нейродегенерации в черной субстанции мозга крыс

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль альфа-синуклеина в механизмах сопряжения процессов нейровоспаления и нейродегенерации в черной субстанции мозга крыс"

На правах рукописи

Сергеева Татьяна Николаевна

РОЛЬ АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В МЕХАНИЗМАХ СОПРЯЖЕНИЯ ПРОЦЕССОВ НЕЙРОВОСПАЛЕНИЯ И НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ В ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ МОЗГА КРЫС

03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАР 2015

005559767

Оренбург-2015

005559767

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Удмуртский государственный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Чучков Виктор Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Орлянская Татьяна Яковлевна, заведующая кафедрой биологии с экологией и курсом фармакогнозии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский универститет» им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор Семченко Валерий Василевич, профессор кафедры анатомии, гистологии, физиологии и патологической анатомии ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» им. П.А. Столыпина

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский медицинский государственный университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится ^¿/¿У^.С 2015 г. в /3 час.^кин. на

заседании диссертационного совета Д 208.066.04 Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, Россия, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 446000, г. Оренбург, ул. Советская, 6 ; http://www.orgma.ru/.

Автореферат разослан « ^ »¿?'Л/"2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

щ

Шевлюк Николай Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое, прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся мышечной ригидностью, тремором, брадикинезией, нарушением походки, неустойчивостью позы, вегетативной дисфункцией, дисомнией, депрессией, в ряде случаев снижением интеллекта и памяти вплоть до развития деменции (Голубев В. Л. и др., 1999; 1998; Левин О.С. и др., Lang А.Е., Lozano A.M., 2003; Looi J.C. et al., 2005; Fernandez H.H., 2012; Singer С., 2012). Высокое социально-экономическое бремя БП для общества, прогрессирующий рост числа больных за счет старения популяции, тенденция к более ранним срокам манифестации болезни и отсутствие эффективных этиотропных схем лечения в силу недостаточной изученности этиологии и патогенеза этого нейродегенеративного заболевания определяют актуальность исследований, посвященных его молекулярным и клеточным механизмам.

Различают редко встречаемую семейную форму БП (не более 10-15% от числа всех заболевших), вызываемую мутацией генов, кодирующих такие белки как альфа-синуклеин (SNCA), PARK2, DJ1, LRKK2, PINK1 и ND5 (Mclnerney-Leo., 2005; Hirsch Е.С. et al., 2003; Rappold P.M., Tieu К. 2010; Pan-Montojo F. et al., 2010; Wang H.L. et al., 2011), и спорадическую форму, этиология и многие аспекты патогенеза которой остаются до сих пор неизученными. Независимо от формы БП моторные нарушения, характерные для этой болезни, вызываются гибелью дофаминергических (ДА) нейронов компактной части черной субстанции (ЧС) мозга, проецирующихся в стриатум (полосатое тело).

Гибель дофаминергических нейронов как при семейной, так и спорадической формах БП, сопровождается повышением производства и/или мисфолдингом в них белка альфа-синуклеина (А-син) (Polymeropoulos М.Н. et al., 1997; Krüger R. et al., 1998; Singleton A.B. et al., 2003; Chartier-Harlin M.C. et al., 2004; Ibanez P. et al., 2004; Yu S. et al., 2005; Farrer M.J., 2006). Бета-складчатые амилоидподобные фибриллы агрегированного А-син служат основой телец Леви (Conway К.А. et al., 2000) - крупных шггранейрональных цитоплазматических включений, наличие которых рассматривается как основной патоморфологический признак БП и других синуклеопатий. В процессе агрегации А-син образуются промежуточные формы - олигомеры, обладающие ярко выраженной нейротоксичностью (Conway К.А. et al., 2000; Volles M.J. et al., 2001; Ding T.T. et al., 2002; Volles M.J., Lansbury P.T., 2002; Fredenburg R.A. et al., 2007).

На сегодняшний день получено значительное количество свидетельств того, что гиперпродукция или постгрансляционные модификации А-син могут запускать внутриклеточные молекулярные события, итогом которых становятся повреждение и гибель дофаминергических нейронов, однако, причины, ведущие к спонтанным нарушениям гомеостаза А-син в нейронах ЧС, остаются невыясненными.

Работами последнего десятилетия установлено, что индуцирующие БП нейродегенеративные изменения в ЧС сопровождаются

нейровоспалением, ключевую роль в котором играют активированные микроглиоциты (Orr C.F. et al., 2002; Block M.L. et al., 2007; Hunot S., Hirsch E.C., 2003; McGeer P.L., McGeer E.G., 2004; Gao H.M., Hong J.S., 2008; Hirsch E.C., Hunot S., 2009). Секретируемые ими провоспалительные факторы, такие как цитокины (интерлейкин-1, фактор некроза опухоли-a), монооксид азота, простагландины, специфические протеазы и свободнорадикальные производные кислорода (Hunot S. et al., 1996; Knott P.G. et al., 2000; Arai T. et al., 2006), индуцируют окислительный стресс в нейронах, который, как принято считать, ведет к их повреждению и гибели. Вероятно, одним из патофизиологических механизмов, ведущих к этому результату, может быть индуцированное окислительным стрессом нарушение метаболизма А-син, однако, этот вопрос остается неисследованным.

Обнаруженное ранее свойство А-син выводиться нейронами посредством везикулярного экзоцитоза в межклеточную среду вне областей синаптических контактов (Lee H.J. et al., 2005; Liu J. et al., 2009) и индуцировать провоспалительную активацию окружающих микроглиальных клеток (Zhang W. et al., 2005; Klegeris A. et al., 2008), позволяет предположить, что этот белок может играть ключевую роль в механизмах сопряжения процессов нейровоспаления и нейродегенерации.

Мы полагаем, что в основе БП могут лежать два взаимообусловленных процесса: индукция глиальными провоспалительными факторами нарушений метаболизма А-син в ДА нейронах, который секретируется во внеклеточную среду и активирует (или поддерживает в активированном состоянии) микроглиоциты. Таким образом, этот патофизиологический самоподдерживающийся цикл может обеспечить длительное персистирование воспаления в нервной ткани и, как следствие, постепенно прогрессирующую дегенерацию ДА нейронов. Данное предположение не имеет достаточного экспериментального обоснования, и требуется проведение дополнительных исследований, которые позволили бы подтвердить феномен взаимного усиления процессов провоспалительной активации микроглиоцитов и дисфункции А-син в дофаминергических нейронах.

В исследовании такого рода важно учитывать, что в механизмы нейровоспаления помимо микроглиальных клеток вовлечены и другие клеточные типы: астроциты, эндотелиоциты и перициты кровеносных сосудов, а также лимфоциты, мигрирующие в нервную ткань. Для формирования более полного и многостороннего представления о механизмах сопряжения процессов нейровоспаления и нейродегенерации необходимо учитывать сложный характер их взаимодействий между собой.

Вышесказанное легло в основу исследования, для которого была сформулирована следующая цель: выяснить роль альфа-синуклеина в молекулярных и клеточных механизмах нейровоспаления и нейродегенерации в экспериментальных моделях синуклеопатий у крыс.

В связи с поставленной целью были сформулированы следующие

задачи:

1. провести сравнительный анализ влияния гиперпродукции альфа-синуклеина в нейронах черной субстанции крыс, вызванной переносом гена альфа-синуклеина человека или крысы при помощи рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ), на дегенерацию дофаминергических нейронов, интенсивность провоспалительной активации глиальных клеток, и интенсивность миграции в нервную ткань лимфоцитов;

2. исследовать влияние интраперитонеально вводимого ацетата-кортикостерона на интенсивность гибели дофаминергических нейронов через 8 недель после введения в черную субстанцию рААВ с геном альфа-синуклеина человека;

3. изучить влияние альфа-синуклеина, вводимого в область черной субстанции крыс, на интенсивность нейровоспалительного и нейродегенеративного процессов;

4. исследовать влияние нейровоспаления, вызываемого введением бактериального липополисахарида в область черной субстанции крыс, на интенсивность экспрессии альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах и ультраструктурные изменения в нигростриарной системе мозга.

Положения, выносимые на защиту диссертации.

1. Дисфункция А-син в ДА нейронах и нейровоспаление взаимно индуцируют и усиливают друг друга. Повышенная экспрессия А-син в нейронах ЧС крыс вследствие введения в эту область мозга рекомбинантного вируса, несущего ген А-син, вызывает гибель ДА нейронов, провоспалительную активацию микроглиоцитов и астроцитов, сосудистую реакцию и интенсивную миграцию в нервную ткань лимфоцитов. В то же время провоспалительная активация микроглиальных клеток под воздействием бактериального эндотоксина вызывает накопление в ДА нейронах агрегатов А-син и дегенерацию синапсов в области проекций этих нейронов — стриатуме. Фармакологическое ингибирование нейровоспаления вызывает достоверное снижение вектор-индуцированной гибели ДА нейронов, что свидетельствует о значительном вкладе нейровоспаления в механизмы нейродегенерации.

2. Различия в аминокислотной последовательности молекул А-син человека и крысы обусловливают различия в интенсивности нейродегенерации ДА нейронов, вызываемой векторным переносом в них соответствующих генов. Гиперэкспрессия в ДА нейронах крыс А-син человека вызывает их более быструю и более массированную гибель по сравнению с индуцированным гиперпроизводством А-син крыс. Аминокислотные остатки в локусах А-син человека, отличающиеся от таковых у крысы, могут быть ответственными за повышенную токсичность формируемых в цитоплазме нейронов олигомеров, индуцирующих повреждение и гибель нейронов.

3. Характер межклеточных взаимодействий в функциональном модуле ткани мозга, представленном нейроном и ассоциированным с ним локальным микроокружением (микроглиоциты, астроциты, перициты и эндотелиоциты

кровеносных сосудов, лимфоциты, мигрирующие из кровеносного русла), определяет преобладание репаративных или дегенеративных воздействий на нейроны.

Научная новизна работы. В ходе выполнения работы получены оригинальные данные по характеристике модельной системы синуклеинопатии у трансгенных крыс, воспроизводящих основные молекулярные и клеточные механизмы патогенеза БП. Экспериментально подтверждено, что дисфункция А-син в нейронах и провоспалительная активация микроглиоцитов усиливают друг друга, обусловливая существование замкнутого самоподдерживающегося патологического цикла, который может лежать в основе хронического нейровоспаления и прогрессирующей дегенерации ДА нейронов. Тот факт, что экзогенный А-син, введенный в область черной субстанции, способен индуцировать хроническое нейровоспаление, свидетельствует о ключевой роли этого белка в сопряжении процессов нейровоспаления и нейродегенерации.

Расширено представление о функциональной организации мозга, в основе которой лежит активность клеточных микросистем (функциональных модулей), представленных как резидентными (нейроны, микроглиоциты, астроциты, эндотелиоциты, перициты), так и транзиторными (лимфоциты) элементами, образующими интегративное единство за счет позитивных и негативных обратных связей. Основная функция таких элементарных клеточных систем - поддержание локального тканевого гомеостаза, под которым понимается не только обеспечение эффективной трофики нейронов, сохранение ионного и медиаторного баланса, но и обеспечение нейропротекции в условиях действия повреждающих факторов. Вместе с тем, наличие большого количества реципрокных связей между элементами такой системы обеспечивает возможность персистирования воспаления в нервной ткани, что может служить предрасполагающим фактором для развития нейродегенеративного процесса.

Практическая значимость работы. Использованная модель трансгенного переноса у крыс воспроизводит ключевые звенья патогенеза синуклеопатии, лежащей в основе БП: дегенерацию дофаминергических нейронов, образование цитоплазматических включений, аналогичных тельцам Леви, в сохранившихся нейронах черной субстанции мозга и нейровоспаление. Таким образом, данная модель переноса в нейроны крыс гена А-син посредством вектора, сконструированного на основе аденоассоциированного вируса (ААВ), может рассматриваться как наиболее адекватная из всех известных моделей для изучения молекулярных и клеточных механизмов развития болезни Паркинсона и может использоваться для тестирования потенциальных нейропротекторных препаратов.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что поиск новых подходов в формировании нейропротективной терапии' болезни Паркинсона должен рассматривать в качестве терапевтической мишени интегральную нейроглиососудистую систему. Ключевым событием инициации патофизиологических процессов служит провоспалительная активация микроглиоцитов, которая, в свою очередь, способна стимулировать

астроциты, перициты и эндотелиоциты, провоцируя тем самым сосудистую реакцию и миграцию в нервную ткань лимфоцитов. Поскольку в основе хронического нейровоспаления и нейродегенерации лежит активность нескольких патофизиологических самоподдерживающихся циклов, становится очевидным, что лечение БП должно базироваться на комплексной терапии, учитывающей подбор фармакологических агентов для ключевых участников этой системы. Например, фармакологическое ингибирование активности микроглиоцитов должно сопровождаться применением средств, снижающих провоспалительную активность клеточных элементов ГЭБ и индуцирующих синтез астроцитами ростовых факторов или активирующих регуляторную популяцию лимфоцитов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II и III международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2013), 21-м и 22-м съездах Физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга, 2010; Волгоград 2013), на 7, 8, 9, 10-м Международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011, 2012, 2013, 2014), Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в науке и образовании» (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Инновации в науке, технике и технологиях» (Ижевск, 2014), III Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные науки сегодня» (North Charleston, USA, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 13 статей в периодических изданиях, соответствующих Перечню ВАК, и 11 работ в сборниках докладов научных съездов и конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 160 страницах и иллюстрирована 33 рисунками. Список цитируемой литературы включает 460 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Организация исследования.

Эксперименты проведены на 78 самцах крыс линии Вистар (сток питомника «Пущино»), которые содержались в стандартных условиях. Все экспериментальные манипуляции осуществлялись в соответствии с международными нормами этического обращения с животными.

Для доказательства предположения о том, что микроглиоциты активируются под действием секретируемого нейронами А-син, мы индуцировали повышение уровня синтеза этого белка в нейронах ЧС посредством унилатерального стереотаксического введения 2 мкл раствора, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус (рААВ) с геном человеческого или крысиного А-син (по 12 животных) (Kirik D. et al., 2002). Контрольная группа (12 животных) получала тот же вектор, но содержащий ген зеленого флуоресцирующего белка (ЗФБ). В работе использовались

векторы, сконструированные в лаборатории молекулярной и клеточной терапии Университета Флориды, любезно предоставленные для проведения наших экспериментов: рААВ А-син крысы (1,4x1012 МЕ/мл), рААВ А-син человека (1,4x1012 МЕ/мл), рААВ ЗФБ (1,4x1012 МЕ/мл).

Через 4 и 8 недель оценивали нейродегенеративный эффект, индуцированный гиперэкспрессией А-син при помощи иммуногистохимического метода, сравнивая количество ДА нейронов в ЧС на стороне инъекции вектора и контрлатеральной (рассматриваемой в качестве контрольной) стороне мозга, а также количественного определения концентраций А-син и тирозингидроксилазы (ТГ) в стриатуме (области проекции ДА нейронов ЧС) при помощи Вестерн-блоттинга. О провоспалительных реакциях нервной ткани судили по результатам иммуногистохимического окрашивания и подсчета иммунопозитивных микроглиоцитов, астроцитов и лимфоцитов.

Для иммуногистохимического окрашивания использовали антитела против тирозингидроксилазы (мышиные IgG, 1:1000; Millipore), везикулярного моноаминового транспортера-2 (VMAT-2) (кроличьи IgG, 1:5000; Chemicon), альфа-синуклеина человека (мышиные IgG, 1:2000; Sigma), нейронального ядерного маркера (NeuN) (мышиные IgG, 1:2000; Sigma), белка главного комплекса гистосовместимости второго типа (MHCII) (мышиные IgG, 1:1000; Abeam), глиального фибриллярного кислого белка (ГКФБ) (мышиные IgG, 1:1000; Abeam), кластера дифференцировки лимфоцитов (CD3) (мышиные IgG, 1:1000; Abeam), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) (мышиные IgG, 1:1000; Abeam), транскрипционного фактора FoxP3 (мышиные IgG, 1:1000; Abeam). Вторые антивидовые антитела были коньюгированы с флуорохромами: флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ), РЕ-Су5, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 647, или биотином (ВА2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Визуализацию биотилированных антител проводили раствором, содержащим авидин-биотин-пероксидазный комплекс (ABC Elite; Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Поскольку в данной экспериментальной модели нейродегенерация может быть вызвана как дисфункцией А-син, инициирующей внутриклеточные процессы нейрональной гибели, так и активацией микроглиоцитов, секретирующих нейротоксические факторы, вклад последних в нейродегенеративный процесс оценивали в дополнительном эксперименте с фармакологическим ингибированием активности микроглиальных клеток. Животные (6 крыс) с перенесенным в нейроны ЧС геном А-син человека на протяжении 8 недель с интервалом в три дня получали интраперитонеально инъекции ацетата-кортикостерона-21 (Sigma, USA; 2 мг/100 г веса тела), разведенного в 1 мл стерильного физраствора, который, способен проникать через гематоэнцефалический барьер и ингибировать активность микроглиоцитов. Сравнение количества ДА нейронов в ЧС этих животных и животных, не получавших гормон, позволил в численной форме выразить степень вклада нейровоспаления в интенсивность нейродегенерации.

Для ответа на вопрос - вызывается ли нейровоспаление действием гиперпродуцируемого нейронального А-син или дебрисом, остающимся на месте погибших нейронов, — исследовали провоспалительные эффекты однократно стереотаксически вводимого 12-ти животным в область черной субстанции экзогенного А-син (Sigma, USA) в концентрации 15 нгр/мл. Через 8 недель оценивали интенсивность индуцируемого нейровосиаления по вышеописанным изменениям в количестве и функциональному состоянию микроглиоцитов и астроцитов.

Для проверки предположения о том, что дисфункция А-син в ДА нейронах может быть вызвана нейровоспалением, 12-ти крысам инъецировали при помощи стереотаксической установки однократно унилатерально в область ЧС 2 мкл бактериального липополисахарида (ЛПС) Escherichia Coli (Sigma, USA) в концентрации 0,01мкг/мкл и исследовали интенсивность экспрессии в нейронах иммунопозитивного А-син, подсчитывали количество ДА нейронов, а также методом просвечивающей электронной микроскопии изучали ультраструктурные изменения тел нервных клеток в ЧС и синаптических окончаний в области их проекций -медиодорзальной части стриатума на уровнях от 0 до 1 мм ростральнее брегмы - на стороне введения и контрлатеральной стороне мозга, которая рассматривалась в качестве контроля. При этом контрольной группе животных в область ЧС унилатерально вводили стерильный физиологический раствор (12 крыс).

Измерение экспрессии иммунореактивных белков, об уровне которой судили по интенсивности флуоресцентного свечения, и подсчет количества дофаминергических нейронов, микроглиоцитов, астроцитов и лимфоцитов в ЧС производили при помощи микроскопа Nikon Eclipse Е200, совмещенного с цифровой камерой MicroPublisher 3,0 (USA), и компьютерной программы ImagePro Insight (Media Cybernetics, USA).

Обсчитывался каждый восьмой срез черной субстанции на всем ее протяжении как на стороне введения исследуемых веществ, так и на контрлатеральной (контрольной левой) стороне. Результат подсчета представляли в процентном выражении относительно контроля, количество исследуемых клеток в котором принималось за 100%.

Результаты исследований проверяли на нормальность распределения значений с помощью W-теста Шапиро-Вилкоксона. При нормальном распределении сравнение выборок проводили в зависимости от количества сравниваемых групп с помощью t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. При распределении, отличном от нормального, сравнение двух несвязанных выборок проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости Р<0,05. Результаты представляли как М±т (среднее±стандартное отклонение). Статистический анализ проводили в компьютерной программе Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Межвидовые различия способности гиперэкспрессированного в ДА-эргических нейронах А-син человека и крысы индуцировать нейродегенерацию

Подсчет в ЧС иммунопозитивных к тирозингидроксилазе нейронов через 4 недели после введения рААВ, несущего ген А-син человека или крысы, продемонстрировал наличие выраженной нейродегенерации в группе животных, экспрессирующих А-син человека (61,8±8,2%, Р<0,01 в сравнении с количеством нейронов контрольной стороны мозга). Через 8 недель после введения в нейроны ЧС крыс гена А-син человека количество ДА-нейронов в этой области резко снижалось, составляя в среднем, 12,6±8,2% (Р<0,001) (рис.1). Падение количества ДА нейронов, вызванное повышенным производством в них А-син крысы, было менее выраженным (62,2±12,3% относительно контроля), но также достигало достоверных отличий (Р<0,01). Разница в интенсивности гибели ДА нейронов после индукции в них синтеза А-син человека и А-син крысы (Р<0,01) может свидетельствовать о том, что А-син человека, гиперпродуцируемый в ДА нейронах, обладает более выраженным нейротоксическим эффектом, чем А-син крыс. Введение в ЧС рААВ с геном ЗФБ не приводило к редукции количества ДА нейронов ни на одном из изученных сроков.

Гиперэкспрессия в ДА-эргических нейронах А-син человека и крысы вызывает образование в нейронах агрегатов А-син

На всех исследованных сроках в цитоплазме переживающих нейронов ЧС на стороне введения вектора обнаруживались А-син-позитивные гранулярные включения, отсутствующие на контрольной стороне мозга. Кроме того, в нейронах ЧС животных экспериментальных групп диффузная или гранулярная иммунопозитивная окрашенность обнаруживалась и в клеточных ядрах (рис.2). При визуальной оценке характера грануляции обнаруживалась закономерность - гранулы агрегированного А-син крыс были многочисленными и имели более крупные размеры. Иммуногистохимическое исследование нейронов в области введения вектора с ЗФБ не обнаружило различий с нейронами контрольной стороны. Сопоставление этих фактов с результатами подсчета количества дегенерирующих нейронов может свидетельствовать о том, что образование крупных агрегатов из полимеризованного А-син играет нейропротективную роль в ситуации повышенной продукции этого белка.

Векторный перенос в ДА нейроны ЧС крыс гена А-син вызывает увеличение содержания А-син и падение тирозингидроксилазы в стриатуме

Об уровне экспрессии А-син и ТГ в пробах ткани стриатума на различных сроках после введения векторов в ЧС судили по результатам Вестерн-блотинга, в котором идентифицировали бенды, окрашенные антителами, перекрестно связывающимися с А-син крыс и человека (рис.3).

рААВ ЗФБ

pAAB А-син чел рААВ А-сим крысы

J&-..* ■ ,f '

4 нед

8 нед

w

2 в о

* „

ш

рААВ ЗФБ рААВ А-еин рАА8 А-Сни крысы человека

П 4 недели Щ в недель

Рис.1. Изменение количества нейронов, иммунопозитивных к тирозингидроксилазе, в ЧС крыс через 4 и 8 недель после унилатерального введения рААВ зеленого флуоресцирующего белка (ЗФБ), рААВ А-син человека и рААВ А-син крысы. Обозначения: ВТО - вентральная тегменталъная область; ЧСк - компактная часть черной субстанции; ЧСр — ретикулярная часть черной субстанции. ***-Р<0,001; **-Р<0,01 относительно контроля (стороны мозга противоположной стороне введения). Длина линии = 600 мкм.

Рис.2. Образование гранулярных цитоплазматических включений, иммунопозитивных к А-син (зеленое окрашивание), в цитоплазме нейронов ЧС крыс после введения рААВ А-син человека (б), рААВ А-син крысы (в), и диффузное распределение иммунопозитивного А-син в цитоплазме нейронов контрольной стороны (а). Стрелкой выделена иммунопозитивная к А-син гранулярность в ядрах нейронов, докрашенных пропидий йодидом (красное окрашивание). Длина линии = 5 мкм.

Денсиметрическое измерение интенсивности окрашивания иммунопозитивных бендов Вестерн блотов, проведенное при помощи компьютерной программы ImagePro Insight, показало, что через 4 недели эксперимента экспрессия А-син человека и крысы на стороне введения значительно не отличалась, превышая в обоих случаях уровень эндогенного А-син на противоположной половине мозга примерно в 3,7 раз. Содержание альфа-синуклеина через 8 недель незначительно снижалось, достоверно превышая теперь в обоих случаях уровень эндогенного А-син на

противоположной половине мозга примерно в 3 раза. Через 8 недель после инъекции векторов обнаружены значительные различия в концентрации ТГ в стриатуме на стороне введения между этими экспериментальными группами. Векторный перенос гена А-син крысы вызывал достоверно меньшее падение концентрации белка по сравнению с экспериментом по переносу в нейроны гена А-син человека (Р<0,05).

ЛП ЛП ЯП лп лп лп

------------Туб

Альфа-синуклеин

рААВЗФБ рДАВ А-син рААВ А-син крысы человека

рААВ ЗФБ рААВ А-син рДАВ А-син крысы человека

Тирозингидроксилаза

*** * ***

! [4 недели Ц 8 недель

Рис.3. Содержание иммунореактивных А-син и ТГ в стриатуме крыс на стороне введения в ЧСрААВ ЗФБ, рААВ А-син человека и рААВ А-син крысы (77, правая) и неинъецированной стороне (Л, левая) мозга через 4 и 8 недель после инъекции векторов и кортикостерона (КСТ). ***-Р<0,001; *-Р<0,05 относительно контроля (контрлатерального стриатума). Интенсивность окраски бенда, содержащего иммунореактивный тубулин использована в качестве контроля, относительно которого нормализовали значения содержания детектируемых белков.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что гиперэкспрессия А-син человека вызывает более выраженную гибель ТГ-позитивных нейронов ЧС и падение уровня ТГ в стриатуме на повреждаемой стороне по сравнению с таковыми при повышенном производстве А-син крысы. Поскольку по данным иммуноблоттинга уровни экспрессии А-син человека и крысы на вводимой стороне были сходными, различия в их нейротоксичности могут быть объяснены межвидовыми различиями в аминокислотной последовательности А-син.

Вектор-индуцированное повышение экспрессии А-син в нейронах черной субстанции ведет к увеличению количества микроглиоцитов и астроцитов

Исследование срезов мозга крыс экспериментальных групп продемонстрировало значительное увеличение количества микроглиоцитов и астроцитов, а также усиление ими экспрессии соответственно иммунореактивного МНС II и глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) в ЧС стороны введения как рААВ А-син человека, так и рААВ А-син крысы (рис.4).

Независимо от того, какая видовая форма А-син гиперэкспрессировалась в нейронах ЧС, на стороне введения отмечался трехкратный рост количества микроглиоцитов и астроцитов как через 4, так и через 8 недель после введения вектора. Важно отметить, что увеличение количества глиальных клеток, характерное для нейровоспалительного процесса, наблюдалось до начала нейродегенерации ДА нейронов. Вышесказанное может свидетельствовать о выраженном провоспалительном эффекте эндогенно гиперэкспрессируемого в нейронах А-син, который проявляется до начала нейрональной гибели.

Индукция повышенной экспрессии уровней А-син в ДА нейронах ЧС сопровождается сосудистой реакцией и инфильтрацией лимфоцитов в область введения вектора

В области введения вектора, вне зависимости от видовой принадлежности трансфецируемого гена, в исследованные сроки отмечалось значительное усиление интенсивности свечения иммунореактивного ГФКБ в астроцитарных отростках, контактирующих с кровеносными сосудами (Рис.5а), и выраженная сосудистая реакция (рис.56). На окрашенных крезиловым фиолетовым срезах сосуды отличались увеличенным диаметром, накоплением в просвете и в периваскулярной области небольших клеток с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы, фенотип которых был схож с лимфоцитарным. Иммуногистохимическое окрашивание на лимфоцитарный маркер (СЕ)3) подтвердило предположение о том, что эти клетки являются лимфоцитами (рис.5в).

Интраперитонеальное введение кортикостерона снижает интенсивность нейровоспаления и гибели дофаминергических нейронов, индуцированных введением в ДА нейроны рААВ с геном А-син человека

Введение кортикостерона в течение 8 недель животным с гиперэкспрессией А-син человека вызывало снижение количества МНС II- и ГФКБ-иммунопозитивных клеток на соответственно 37,9±10,2% (Р<0,01) и 28,4±8,8% (Р<0,01), а также повышение количества выживших дофаминергических нейронов на 36,3±10,6% (Р<0,01) по сравнению с животными, не получавшими гормон (рис.6).

рААВ ЗФБ

рААВ А-син крысы рААВ А-син человека

ЧСк „ -ЧСр -г - - 'У Ж? * - Ч ЧГ-"

ЧСк - -ЧСр • .., * 5 оо

ш

ш

рААНЗее рДЛвА-сми

□ « ШДМ» | I МАП

Рис.4. Количество микроглиоцитов, экспрессирующих МНС II, и астроцитов, экспрессирующих глиалъный фибриллярный кислый белок (ГФКБ), в ЧС крыс после унилатералъного введения рААВ зеленого флуоресцирующего белка (ЗФБ), рААВ А-син крысы и рААВ человека. ***-Р<0,001 относительно контроля (стороны мозга противоположной стороне введения). Длина линии= 600 мкм.

•9* £

<Г N

е? а

• ч

в • %

Рис.5. Интенсивное свечение иммунореактивного глиального фибриллярного кислого белка в астроцитарных отростках, контактирующих с кровеносными сосудами, в ЧС через 8 недель после введения рААВ А-син человека (а), сочетаемое с накоплением в кровеносных сосудах и периваскулярных инфильтратах клеток с лимфоцитарным фенотипом (выделены стрелками) на срезах, окрашенных крезиловьш фиолетовым (б). Ддвойное иммуногистохимическое мечение клеток, экспрессирующих лимфоцитарный маркер СВЗ (зеленое окрашивание) и ТГ (красное окрашивание), в области ЧС крыс (в). Звездочками обозначены просветы сосудов. Длина линии (а, б)= 100 мкм, (в) = 50 мкм.

Полученные результаты свидетельствуют о противовоспалительном и нейропротективном эффекте вводимого глюкокортикоида. Вероятно, его действие может быть как прямым, в виде непосредственного ингибирования провоспалительной активности микроглиальных клеток, так и опосредованным, через ингибирование клеточного и гуморального ответа иммунной системы и/или снижение реактивных изменений клеток стенки кровеносных сосудов. Наблюдаемая разница в количестве гибнущих клеток между исследуемыми группами может отражать степень вклада нейровоспаления в процесс нейродегенерации при данных экспериментальных условиях.

Введение А-син в ЧС вызывает увеличение количества микроглиоцитов и астроцитов

Через 8 недель после инъекции А-син в область ЧС мы обнаружили целый ряд морфофункциональных изменений нервной ткани, свидетельствующих о наличии в ней воспалительной реакции. Иммуногистохимическое исследование срезов с использованием антител против молекул МНС II и глиального кислого фибриллярного белка (ГФКБ) продемонстрировало увеличение в ЧС количества клеток, интенсивно экспрессирующих эти белки (рис.7).

Сопоставление этих данных с результатами ранее описанного эксперимента, обнаружившего нейровоспалительную реакцию в ЧС при вектор-индуцированном повышении синтеза А-син в ДА нейронах, позволяет сделать вывод о том, что при повышенном производстве в нейронах А-син увеличивается скорость выведения этого белка в межклеточную среду, где он способен вызывать провоспалительную активацию микроглиоцитов и астроцитов.

Однократное введение липополисахарида в ЧС вызывает хроническое нейровоспаление и повышение экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС

Через 8 недель после однократной инъекции ЛПС в область ЧС мы не обнаруживали в ней падения количества дофаминергических нейронов, но наблюдали целый ряд морфофункциональных изменений, свидетельствующих о наличии нейровоспалительного процесса. На срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым, область введения ЛПС отличалась выраженной сосудистой реакцией (Рис.8а) и цитозом, наблюдаемым как в ретикулярной, так и компактной частях ЧС. В области введения ЛПС достоверно увеличивалось количество клеток, иммунопозитивных к МНС II и ГФКБ (Рис.86) (на +178,2±24,2% и 255,2±43,2% соответственно).

4

Рис.6. ТГ-иммунопозитивные нейроны в ЧС крыс через 8 недель после инъекции в ЧСрААВ ЗФР (а), рААВ А-син человека (б) и рААВ А-син человека в сочетании с интраперитонеалъным введением кортикостерона (в). Обозначения: ВТО - вентральная тегменталъная область; ЧСк -компактная часть черной субстанции; ЧСр - ретикулярная часть черной субстанции. Длина линии=500 мкм.

СФР

лпс

о

X

ш в

- - "ЧСк а / ^ - > ■ • Л " >

« б " у м - / ЯР

I

***

I

□ СФР ■ лпс

Рис. 7. Количество микроглиоцитов, экспрессирующих МНС II (а), и астроцитов, экспрессирующих ГФКБ (б), в ЧС крыс через 8 недель после унилатерального введения в нее стерильного физраствора (СФР) и апьфа-синуклеина (А-син). ***-Р<0,001 относительно контроля (стороны мозга противоположной стороне введения). Длина линии= 150 мкм.

В стенке кровеносных сосудов и периваскулярной области ЧС экспериментальных животных выявлялись клетки, интенсивно синтезирующие фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-а). Фенотипически эти клетки были схожи с перицитами и микроглиоцитами (рис.8в). Помимо описанных изменений введение ЛПС повышало экспрессию в нейронах ЧС иммунопозигивного А-син (на 98,6±33,4% относительно контроля с введенным стерильным физиологическим раствором) (рис.8г).

Сосудистая реакция, индукция синтеза ФНО-а клетками стенки кровеносных сосудов и значительное усиление интенсивности свечения иммунореактивного ГФКБ в отростках астроглиоцитов, образующих своеобразную муфту вокруг сосудов, позволяют предположить, что в описываемых экспериментальных условиях повышалась проницаемость гематоэнцефалического барьера. В пользу этого свидетельствовало наличие клеток, экспрессирующих лимфоцитарный маркер (СБЗ), не только в просвете сосудов, но и паренхиме нервной ткани (рис.9). Двойная иммуногистохимическая окраска позволила выявить в ядрах части лимфоцитов, мигрировавших в нервную ткань, транскрипционный фактор РохРЗ, который служит маркером регуляторной популяции лимфоцитов, активность которых, как свидетельствуют данные литературы, направлена на ингибирование воспалительного процесса.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что однократное введение в ЧС липополисахарида способно индуцировать в этой области длительно персистирующее нейровоспаление, вызывающее повышение экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС.

Введение липополисахарида в ЧС вызывает ультраструктурные изменениями нейронов и дегенерацию аксонных окончаний в стриатуме Электронномикроскопическое исследование ЧС крыс через 8 недель после введения в нее ЛПС свидетельствовало об увеличении количества нейронов с повышенной электронной плотностью цитоплазмы и расширенными цистернами гранулярной эндоплазматической сети (рис. 10а). Такого рода изменения могут характеризовать нейроны с высокой синтетической активностью.

„

* О

<3 -

ЧСк

Рис.8. Морфофункциональные изменения черной субстанции мозга крыс через 8 недель после введения в нее стерильного физиологического раствора (СФР) и липополисахарида (ЛПС). На срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым (КФ), стрелками выделены расширенные сосуды, содержащие большое количество клеток с лимфоцитарньш фенотипом (а). Увеличивается количество астроцитов, экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ), после введения ЛПС (б). Эндотоксин индуцирует синтез фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) в клетках микроглиоцитарного (тонкие стрелки) и перицитарного (контурные крупные стрелки) фенотипа (в). В нейронах увеличивается интенсивность экспрессии иммунореактивного А-син (г). Обозначения: ЧСк - компактная часть черной субстанции; ЧСр - ретикулярная часть черной субстанции; звездочки -просвет кровеносных сосудов. Длина линии для КФ = 200 мкм; для ГФКБ = 150 мкм; для ФНО-а = 100 мкм; для А-син=140 мкм.

. "Г %

Рис.9. Двойное иммуногистохимическое меченые клеток, экспрессирующих лимфоцитарный маркер СИЗ (красное окрашивание) и ГохРЗ (зеленое окрашивание), в области ЧС крыс через 8 недель после введения в нее ЛПС. Часть клеток демонстрирует солокализацию маркеров (выделены стрелками). Звездочкой обозначен просвет сосуда. Длина линии = 50 мкм

В цитоплазме части нейронов мы обнаруживали крупные цитоплазматические включения. Как правило, в их центре локализовался аморфный материал умеренной электронной плотности, окруженный электронноплотными гранулярными структурами (рис. 106). Количество нейронов с подобными включениями составило, в среднем 2,4% от общего числа нейронов, подсчитанных на стандартной площади 1280 мкм2. Сопоставление этого наблюдения с данными иммуногистохимического исследования о повышении экспрессии в этих условиях в нейронах А-син дает основание полагать, что описываемые ультраструктурные образования представляют собой агрегаты этого белка.

Рис.10, (а) Электронная микрофотография гипертрофированного нейрона ЧС через 8 недель после введения в эту область ЛПС. Обозначения: тонкие стрелки - набухшие митохондрии; толстые стрелки - расширенные перинуклеарные пространства; звездочки - расширенные цистерны гранулярной эндоплазматической сети. Длина линии = 100 нм. (б) Цитоплазматическое включение в нейроне ЧС, обнаруженное через 8 недель после введения в эту область ЛПС (выделено стрелкой). Обозначения: я -ядро; м - митохондрии. Длина линии = 60 нм.

Анализ состояния синаптических контактов контрольных и экспериментальных животных продемонстрировал тот факт, что нейровоспаление, индуцированное унилатеральным введением ЛПС в ЧС, вызывало в ипсилатеральном стриатуме дегенерацию аксонов по «темному типу» (рис.11). Дегенерирующие аксоны имели высокую электронную плотность и набухшие митохондрии. Число дегенерирующих аксонов составило в среднем 4,8% от общего количества аксонных окончаний, подсчитанных на стандартной площади 1280 мкм2.

Описанные наблюдения позволяют говорить о том, что нейровоспаление, индуцированное введением ЛПС в ЧС, вызывает дегенерацию части аксонных окончаний в стриатуме - области проекций нейронов ЧС - без выраженной дегенерации самих нейронов.

М. - I .

анр. я *

Рис. 11. Ультраструктура аксодендритных синапсов в норме (а) и дегенерирующих пресинаптических окончаний в ипсилатеральном стриатуме через 8 недель после уншатерального введения ЛПС в черную субстанцию мозга крыс (б). Стрелками обозначены синапсы. Обозначения: а - аксон; д -дендрит; м — митохондрия. Длина линии = 50нм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты гистофизиологического исследования черной субстанции мозга крыс в сопоставлении с данными литературы позволили нам представить схему клеточных взаимодействий, лежащих в основе хронического нейровоспаления и последующей нейродегенерации (рис.12). В механизмы нейровоспаления вовлекаются перициты, микроглиоциты, астроциты и мигрирующие в нервную ткань лимфоциты. Описанные ранее прямые контакты между ними и паракринная межклеточная регуляция служат основой для формирования прямых и обратных связей и позволяют рассматривать совокупность этих взаимодействующих клеток как локальную функциональную систему, которую мы предлагаем обозначить как нейроглиоваскулярная единица. Активность такой микросистемы изначально направлена на обеспечение защиты нейронов в условиях угрозы их повреждения и гибели. Однако, наличие большого количества петель обратной связи между элементами нейроглиоваскулярной единицы обеспечивает циркуляцию в ней провоспалительной активности, т.е.

сохранение персистирующего воспаления даже после однократной стимуляции.

Ключевую роль в механизме нейровоспаления играют микроглиоциты, способные активироваться в ответ на действие различных факторов. Секретируемый нейронами в окружающее пространство А-син может быть одним из них. Гипотетически можно предположить, что определенный уровень секретируемого поврежденным нейроном А-син может служить сигналом, инициирующим нейровоспаление, которое облегчает деструкцию этого нейрона. Вместе с тем, нарушить метаболизм А-син может и хроническое нейровоспаление, вызванное действием внешнего фактора, что, в итоге, также может запустить патофизиологический механизм отсроченной нейродегенерации. Таким образом, нейровоспаление и нарушение метаболизма А-син в нейронах обусловливают и усиливают друг друга, а сам белок может играть ключевую роль в механизмах сопряжения процессов нейровоспаления и нейродегенерации.

Рас. 12. Схема клеточных взаимодействий, лежащих в основе хронического нейровоспаления и последующей нейродегенерации

ВЫВОДЫ

1. Вектор-индуцированный синтез альфа-синуклеина человека в дофаминергических нейронах черной субстанции крыс через 8 недель после переноса соответствующего гена вызывал их гибель (-87,4±8,2%; Р<0,001, относительно контроля) и нейровоспаление, о котором свидетельствовало достоверное увеличение в черной субстанции количества микроглиоцитов (+210,8±16,3%; РОДИ) и астроцитов (+202,9±12,8%; Р<0,001), а также миграция в эту область лимфоцитов из кровеносного русла.

2. Выявлены видовые различия в нейротоксичности гиперпродуцируемых в дофаминергических нейронах альфа-синуклеина человека и крысы. Гибель нейронов через 4 и 8 недель после вектор-опосредованного переноса в нейроны гена альфа-синуклеина человека была

достоверно более выраженной (на 31,7±14,4%; Р<0,01 и 49,6±10,6%; Р<0,01, соответственно), чем дегенерация, вызываемая повышенным производством в них альфа-синуклеина крысы.

3. Интраперитонеальное введение кортикостерона крысам с вектор-индуцированной гибелью дофаминергических нейронов оказывало нейропротективный эффект, повышая количество выживших дофаминергических нейронов с 12,6±8,2% (у не получавших гормон) до 48,9±12,6% (Р<0,01).

4. Экзогенный альфа-синуклеин человека, вводимый в черную субстанцию крыс, индуцировал нейровоспаление, о котором свидетельствовали увеличение количества микроглиоцитов и астроцитов (на 168,5±32,3% и 155,2±43,2%, соответственно), сосудистая реакция и миграция лимфоцитов в паренхиму мозга.

5. Нейровоспаление, индуцированное введением липополисахарида в область черной субстанции крыс, вызывало достоверное повышение в дофаминергических нейронах экспрессии иммунопозитивного альфа-синуклеина (+98,6±33,4%, Р<0,01), накопление в их цитоплазме электронноплотных включений и дегенерацию 4,8% синаптических окончаний в ипсилатеральном стриатуме.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи из списка ВАК:

1. Сергеева, Т.Н., Сергеев В.Г. Введение ЛПС-стимулированных аутологичных макрофагов вызывает агрегацию альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах мозга крыс / Сергеева, Т.Н., Сергеев В.Г. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2010,- Т. 150, № 10,-С.376-378.

2. Сергеева, Т.Н., Сергеев В.Г., Толстолуцкая, Т.О. Влияние бактериального эндотоксина на экспрессию альфа-синуклеина в лейкоцитах лимфатических узлов крыс / Сергеева, Т.Н., Сергеев В.Г., Толстолуцкая, Т.О. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 2010. Т. 150, № 9.-С.317-320.

3. Сергеева, Т.Н., Толстолуцкая Т.О., Сергеев В.Г. Введение крысам аутологичных лейкоцитов, стимулированных in vitro липополисахаридом, индуцирует синтез антител к альфа-синуклеину / Сергеева, Т.Н., Толстолуцкая Т.О., Сергеев В.Г. // Иммунология.- 2010.- Т.31, № 4,- С.186-189.

4. Косарева Е.В., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Роль альфа-синуклеина в ЛПС-индуцированных реакциях лимфоцитов и макрофагов крыс / Косарева Е.В., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический сборник по аллергологии и иммунологии. -2010.- № 2/1.-С.41.

5. Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Аутоиммунные механизмы паркинсоноподобных нарушений у крыс / Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // Вестник Удмуртского университета. Сер. Биология. Науки о земле.- 2011.-Вып. 1.- С.81-87.

6. Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г., Вежеева O.A. Электронномикроскопическое исследование нейродегенеративных изменений мозга крыс в модели индуцированной аутоиммунной синуклеопатии / Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г., Вежеева O.A. // Вестник Удмуртского университета. Сер. Биология. Науки о земле,- 2011,- Вып 4 - С 113-118.

^ 7. Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г., Стенькина A.A. Индукция хронического нейровоспаления в области черной субстанции мозга, вызванная однократным внутрижелудочковым введением бактериального липополисахарида / Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г., Стенькина A.A. // Вестник Уральской медицинской академической науки,- 2012,- № 4.- С.161.

^ 8. Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. Глюкокортикоиды ингибируют нейровоспаление и снижают дегенерацию дофаминергических нейронов, индуцированную вектор-ассоциированной гиперпродукцией в них альфа-синуклеина / Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. // Вестник Уральской медицинской академической науки,- 2012,- №4. - С.58-59.

9. Сергеева Т.Н., Стенькина A.A., Вежеева O.A., Сергеев В.Г. Дозозависимое влияние бактериального липополисахарида на нейрогенез в латеральной субвентрикулярной зоне мозга взрослых крыс / Сергеева Т.Н., Стенькина A.A., Вежеева O.A., Сергеев В.Г. // Вестник Удмуртского университета. Сер. Биология. Науки о земле.- 2013,- Вып.1,- С. 115-120.

^ 10. Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Сопряжение процессов нейровоспаления и нейродегенерации в модели вектор-индуцированной паркинсонподобной нейродегенерации у крыс / Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // Российский иммунологический журнал.- 2013,- Том 7 № 2-3 -С.308. > - ■

11. Вежеева O.A., Сергеева Т.Н.; Сергеев В.Г. Ингибирование нейровоспаления редуцирует нейродегенерацию дофаминергических нейронов черной субстанции мозга, индуцированную гиперэкспрессией в них рекомбинантного гена альфа-синуклеина человека / Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // Медицинский академический журнал,- 2013,- №6,- С 5462.

12. Сергеева Т.Н., Белослудцева Н.С., Швецова М.А., Вежеева O.A., Сергеев В.Г. Отсроченные нейровоспалительные и поведенческие эффекты введения альфа-синуклеина в черную субстанцию мозга крыс / Сергеева Т.Н., Белослудцева Н.С., Швецова М.А., Вежеева O.A., Сергеев В.Г. // Вестник Удмуртского университета. Сер. Биология. Науки о земле - 2014-Вып.2,- С.83-88.

13. Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г., Чучков В.М. Клеточные механизмы хронического нейровоспаления / Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г., Чучков В.М. // Морфологические ведомости,- 2014,- №4,- С.31-36.

Другие работы:

1. Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. Возможная роль экспрессии альфа-синуклеина мононуклеарных лейкоцитов в нейровоспалении / Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. // II международный симпозиум «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии».- Санкт-Петербург, 2009.- Р.60.

2. Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Введение активированных липополисахаридом аутологичных макрофагов индуцирует нарушения обмена альфа-синуклеина в дофаминэргических нейронах крыс / Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г // Тез. Докл. XXI Съезд Физиологического общества им. И. П. Павлова.-Калуга, 2010.- С.554.

3. Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. Механизмы ЛПС - индуцированных нейродегенеративных изменений в черной субстанции мозга крыс / Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. // VII международный междисциплинарный конгресс "Нейронаука для медицины и психологии".- Судак, 2011.- С.381-382.

4. Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. Периферическое воспаление усиливает дегенерацию дофаминергических нейронов, в которых индуцирована гиперпродукция альфа-синуклеина / Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н // VIII международный междисциплинарный конгресс "Нейронаука для медицины и психологии",- Судак, 2012.- С.364-365.

5. Сергеева Т.Н., Стенькина A.A., Сергеев В.Г. Исследование отсроченных поведенческих реакций крыс в модели ЛПС-индуцированного нейровоспаления / Сергеева Т.Н., Стенькина A.A., Сергеев В.Г. // Тез. докл. XXII съезда Физиологического общества имени И.П. Павлова,- Волгоград, 2013,- С.477.

6. Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. Фосфорилирование серина в молекуле альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах при помощи рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ) ингибирует паркинсонподобную нейродегенерацию у крыс / Сергеев В.Г., Сергеева Т.Н. // IX Международный междисциплинарный конгресс "Нейронаука для медицины и психологии",- Судак, 2013,- С.288-289.

7. Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Ингибирование нейровоспаления редуцирует нейродегенерацию дофаминергических нейронов чёрной субстанции мозга, индуцированную гиперэкспрессией в них рекомбинантного гена альфа-синуклеина человека / Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // Тез. докл. IV Международный симпозиум "Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии,- Санкт-Петербург, 2013,- С.89

8. Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Исследование патофизиологических механизмов Болезни Паркинсона в модели гиперэкспрессии нейронами черной субстанции мозга крыс рекомбинантного альфа-синуклеина человека / Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // Всероссийская научно-практическая конференция "Инновации в науке, технике и технологиях".- Ижевск, 2014.- С.21-23.

9. Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Исследование возможности редукции дегенерации дофаминергических нейронов черной субстанции мозга, индуцированной гиперэкспрессией в них рекомбинантного

гена альфа-синуклеина человека, путем ингибирования нейровоспаления / Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г // Международная научно-практическая конференция «Современные тенденции в науке и образовании».- Москва, 2014,- С.16-17.

10. Вежеева О. А., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Роль микроглии в паркинсонподобной нейродегенерации, индуцированной гиперэкспресией альфа-синуклеина в нейронах черной субстанции мозга крыс / Вежеева О. А., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // X Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии».- Судак, 2014,- С. 100.

11. Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Влияние противовоспалительной терапии на агрегирование альфа-синуклеина и выживание нейронов в модели паркинсонподобной нейродегенерации у крыс / Вежеева O.A., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. // III Международная научно-практическая конференция «Фундаментальные и прикладные науки сегодня».- North Charleston, 2014. - Р.37-40.

Отпечатано с оригинал-макета заказчика

Подписано в печать 22.01.2015. Формат 60x84 '/16. Тираж 150 экз. Заказ № 96.

Типография ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Ижевск, ул. Университетская, 1, корп. 2. Тел. 68-57-18