Экспрессия гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови при болезни Паркинсона, обусловленной мутациями гена LRRK2

Емельянов, Антон Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови при болезни Паркинсона, обусловленной мутациями гена LRRK2
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови при болезни Паркинсона, обусловленной мутациями гена LRRK2"

.САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

005002627

ЕМЕЛЬЯНОВ Антон Константинович

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА SNCA И УРОВЕНЬ БЕЛКА АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА, ОБУСЛОВЛЕННОЙ МУТАЦИЯМИ ГЕНА £ДЖ2

Специальность: 03.02.07 - генетика

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

005002627

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Учреждения Российской академии наук «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН»,

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Пчелина Софья Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горбунова Виктория Николаевна, Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Санкт-Петербург,

доктор биологических наук, профессор Иващенко Татьяна Эдуардовна, НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, г. Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии

медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН».

Защита состоится «Л» г. в /& часов на заседании

диссертационного совета Д.2^12.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции,аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «-/'»

2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.212.232.12 доктор биологических наук

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием среди лиц среднего и пожилого возрастов. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 60 лет составляет 1-2 % (Brooks et al., 2002). Развитие симптомов (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы) коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в полосатом теле. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 50-80 % дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Механизм гибели дофаминергических нейронов ЧС при БП остаётся неясным. По этой причине не существует лабораторных диагностических тестов БП и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25 % (Bennett et al., 1996; Bower et al., 2002). Выяснение механизма гибели дофаминергических нейронов при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом важным подходом для изучения молекулярно-генетических основ БП представляется исследование моногенных форм заболевания с известной этиологией.

Семейные формы БП составляют 10-15 % всех случаев БП (Gasser et. al., 2007). В настоящее время описано шесть генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных форм БП (besage et al., 2009). Наиболее частой причиной развития наследственных форм БП являются мутации в гене обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), приводящие к аутосомно-доминантной форме заболевания (Farrer et al., 2006). Шесть мутаций в гене LRRK2 в настоящее время признаны определенно патогенными: G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), C4321G (R1441G), G4322A (R1441H), A5096G (Y1699C) и Т6059С (I2020T), из которых наиболее распространенной является мутация G6055A (G2019S) (85 % от всех £ЛЛАГ2-ассоциированных случаев БП). На втором месте по частоте выявления - мутация С4321Т (R1441C) (около 10 %) (Giasson et al., 2008). В зависимости от популяции G6055A (G2019S)-ассоциированная БП встречается в 5^Ю % случаев семейной БП (Di Fonzo et ah, 2005). В Европе мутация G6055A (G2019S) выявляется также в 1 % случаев спорадической БП (Giasson et al., 2008).

Ранее нами было показано, что частота ¿/ШГ2-ассоциированной БП среди пациентов с семейной формой БП в Северо-Западном регионе России составляет 6%. В пяти семьях была выявлена G6055A (G2019S)-ассоциированная БП, в одной семье описана новая мутация Т4838С (V1613A), приводящая к развитию БП с преобладающим тремором (Иванова, 2008). Выявление ¿.КЖЗ-ассоциированной БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией БП. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.

В настоящее время считается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфа-синуклеина (ген

SNCA) (Singleton et al., 2005; Cookson, van der Brug, 2008). Альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, как при наследственных, так п при спорадических формах БП (сБП) (Spillantini et al., 1997; Hasegawa et al., 2006; Periquet et al, 2007). Точечные мутации в гене SNCA (Polymeropoulos et al., 1997; Conway et al., 1998; Fredenburg et al., 2007), а также дупликация и трипликация гена SNCA приводят к развитию наследственных форм БП (Miller et al., 2004); нейротоксичность агрегатов альфа-синуклеина была многократно продемонстрирована in vitro, а также на трансгенных животных (мыши и дрозофила) (Conway et al, 1998; Waxman et al., 2008; Feany et al, 2000). Известно, что фосфориллирование альфа-синуклеина повышает его нейротоксичность (Anderson et al., 2006).

В большинстве случаев при ХЯЖ2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в которых LRRK2 обнаруживается наряду с альфа-синуклеином (Репу et al., 2008). Показано, что мутация G6055A (G2019S) приводит к повышению киназной активности LRRK2 (Jaleel et al., 2007). При этом физиологические субстраты LRRK2 и механизмы, лежащие в основе развития БП при мутациях в гене LRRK2, остаются неизвестными. Неизвестно также, оказывают ли влияние мутации гена LRRK2 на метаболизм альфа-синуклеина.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования

Исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови у пациентов с £7?&0-ассоциировашгой БП.

Задачи исследования

1. Определение частоты мутаций G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), Т4838С (VI613А) гена LRRK2 у пациентов с БП в Северо-Западном регионе России.

2. Анализ уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с £ЯЯЛТ2-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.

3. Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень белка альфа-синуклеина в исследуемых группах.

4. Анализ уровня мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови у пациентов с ¿АДЛГ2-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.

5. Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA в исследуемых группах.

Научная новизна

Впервые у пациентов с Lft/iO-ассоциированной формой БП

проведено исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA

лимфоцитов периферической крови. Впервые показано снижение уровня

белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с 1/ШС2-ассоциированной БП по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые оценено влияние возраста, пола, возраста начала заболевания, длительности заболевания, приема Л-ДОФА-• содержащих препаратов на уровень мРНК и альфа-синуклеина среди пациентов с БП в России.

Практическая значимость работы

Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах БП, в частности при £/У£КГ2-ассоциированной форме заболевания, позволит ближе подойти к пониманию патогенеза более распространенных спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза 1ЛЛО-ассоциированной БП. Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации 06055А (020198) гена ЬИЯК2 может быть использован в клинической практике при выявлении ¿ЛЖ2-ассоциированных форм БП. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей пациентов с данной формой заболевания и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Частота мутации 06055А (020198) гена ЬЯЯК2 выше среди пациентов с семейной формой БП (7 %), чем среди пациентов со спорадической формой заболевания (0,4 %). Частота мутации С4321Т (Ш441С) среди спорадических случаев БП в Северо-Западном регионе России составляет 0,4 %.

2. Уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови снижен в группе пациентов с £ДЖ2-ассоциированной БП по сравнению с пациентами со спорадической БП и лицами с отсутствием неврологических заболеваний.

3. Пациенты с ранней формой БП (начало до 50 лет) характеризуются высоким уровнем белка альфа-синуклеина по сравнению с пациентами с более поздним дебютом заболевания.

4. У лиц с отсутствием неврологических заболеваний наблюдается увеличение уровня мРНК гена БЫСА с возрастом.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Осмотр пациентов, забор у них периферической крови осуществлялся д.м.н., профессором А. Ф. Якимовским. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа проведены совместно с О. Н. Ивановой. Скрининг мутаций в группе пациентов с БП выполнен автором лично. Измерение уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена БМСА в лимфоцитах периферической крови пациентов с БП, обусловленной мутациями гена ЬШ1К2, пациентов со сБП и в контроле проведены автором лично. Оценка мультипликаций гена 5ДТСА была проведена автором лично. Автор провел статистический анализ

всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы

Предложенные к защите результаты были доложены на конференции «Человек и здоровье-2007», Санкт-Петербургская медицинская академия им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург (2007); европейской конференции по генетике человека, Ницца, Франция (2007); 12-м конгрессе европейской федерации неврологических ассоциаций, Мадрид, Испания (2008); I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009); 9-й международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона, Прага, Чехия (2009); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино (2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону (2010).

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 20 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 6 статей, из них 4 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы (198 наименований). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами, 26 рисунками и фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика групп

В ходе проведения исследования был расширен имеющийся банк ДНК пациентов с БП. Дополнительно обследовано 35 пациентов с семейной формой БП и 230 пациентов со сБП, прошедших неврологическое обследование в консультативно-диагностическом центре Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Критериями отбора служило сочетание хотя бы двух фенотипических проявлений, характерных для БП: гипокинезия, ригидность, тремор покоя, постуральная неустойчивость. Все пациенты с семейной формой БП имели аутосомно-доминантный тип наследования. Характер наследования определялся при проведении клинико-генеалогического исследования.

При исследовании уровня экспрессии альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови у пациентов с БП в контрольную группу было включено 23 человека, не являющихся близкими родственниками, с отсутствием

неврологических заболеваний и состоящих на учёте в СПб городском гериатрическом центре. Все члены контрольной группы проходили обследование невролога с целью исключения диагноза БП и других нейродегенеративных заболеваний. Данная выборка является случайной и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц с БП.

Во всех обследованных группах был осуществлён забор крови для последующего проведения молекулярно-генетического анализа и создания банка лимфоцитов периферической крови. Данная работа одобрена этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.

Экспериментальные методы

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984).

С целью выявления ¿/¿/¿/^-ассоциированной БП нами проведен скрининг мутаций G6055A (G2019S), С4321Т (R144IC), Т4838С (V1613A) гена LRRK2 среди пациентов с БП. Нами разработаны методы идентификации вышеуказанных мутаций на основе ПЦР с введением сайтов рестрикции для соответствующих эндонуклеаз. ПЦР проводили на автоматическом термоциклере Терцик (ДНК-Технология, Москва). Нормальный и мутантный аллели различали по длине рестрикционных фрагментов, используя электрофорез в ПААГ с окраской раствором бромистого этидия. Выявленные мутации G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C) были подтверждены методом прямого секвенирования на приборе ABI 377.

Для оценки мультипликаций гена SNCA был использован метод «дозы гена» на основе проведения количественной ПЦР в режиме реального времени с зондами TaqMan на приборе ABI7000 Prism (Nishioka et al., 2006). В качестве референс-гена был использован однокопийный ген НВВ (бета-глобин).

Лимфоциты периферической крови выделяли методом градиентного центрифугирования при 1600 об./мин. в растворе Фиколла (р = 1,077, БиоЛот, Санкт-Петербург). Тотальная РНК была выделена с использованием набора для выделения РНК AquaPure RNA Isolation Kit, (Bio-Rad, USA). 10 нг РНК использовали для получения кДНК методом обратной транскрипции с использованием набора iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, USA) согласно условиям производителя сразу после выделения РНК.

Определение уровня мРНК гена SNCA и референс-гена проводилось методом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе ABI7000 Prism с использованием разработанных нами праймеров и зондов TaqMan. В качестве референс-гена был использован ген GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein (G белок)). Зонды отжигались на кДНК в местах экзон-экзонных стыков с целью исключения амплификации геномной ДНК. В качестве флуоресцентной метки зонда для кДНК гена GNB2L1 использовался краситель R6G, зонда для кДНК гена SNCA - FAM. В результате проведения ПЦР с использованием зонда на кДНК гена SNCA и соответствующего референс-гена получали кинетические кривые, отображающие накопление ПЦР-продукта. Для построения стандартной кривой

использовались следующие разведения контрольной кДНК: 1, 1/8, 1/32. Стандартная кривая строилась в каждом эксперименте как для гена SNCA, так и референс-гена.

Для измерения количества альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови лимфоциты лизировали в растворе (10 мМ Tris рН 7,4; 2 % додецилсульфат (ТХ-100)), включающем ингибиторы протеаз (Sigma Р8340). Количество общего белка определяли по методу Лоури с использованием соответствующего набора (Синтакон, Россия) на спектрофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США). Для измерения содержания альфа-синуклеина был использован метод вестерн блоттинга. Количество исследуемого белка было нормировано сравнением с бета-актином. Для этого были использованы следующие антитела: к альфа-синуклеину - BD Transduction Labs, США в разведении 1:1000, для бета-актина - Abeam, Великобритания в разведении 1:5000) и «вторичные антитела», конъюгированные с пероксидазой: для альфа-синуклеина — „rabbit anti-mouse" 1:5000, Amersham Pharmacia Biotech, ClIIA; для бета-актина - „goat anti-rabbit" IgG-H&L (HRP) 1:3000, Abeam, Великобритания. Результаты идентифицировали с использованием набора Lumigen PS-3 (GE Healthcare UK Limited, Великобритания) с использованием фотоплёнки KODAK BioMax. Данные вестерн блотинга анализировали с помощью программы ImageJ (версия 1.38а для Windows, http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Статистический анализ был проведен с использованием программы SPSS, версия 17.0. Соответствие полученных данных нормальному распределению проверялось с использованием критерия Шапиро-Уилка. Сравнение вариационных рядов исследуемых групп проведено с использованием критерия Крускал-Уоллеса и Манна-Уитни. Значения Р < 0,05 считались статистически значимыми. Данные представлены в виде среднего ± ст. ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление пациентов с ЦШ|Г2-ассоциированной БП

Мутация G6055A (G2019S) обнаружена в двух семьях с БП (родословные PD6, PD7) (рис. 1). В семье PD6 мутация G6055A (G2019S) выявлена только у пробанда (II-1, муж, начало заболевания в возрасте 65 лет). В семье PD7 данная мутация была обнаружена у пробанда (II-1, жен., начало заболевания в возрасте 74 лет) и ее сестры (II-2), также больной БП (начало заболевания в 69 лет). Все трое ранее не описанных пациентов с мутацией G6055A (G2019S) имели БП с классической триадой симптомов (акинетико-ригидно-треморная форма) с поздним началом заболевания. Также было выявлено два спорадических случая с мутациями G6055A (G2019S) и С4321Т (R1441C), имеющие классическую картину идиопатической БП.

Таким образом, описанная ранее (Иванова, 2008) частота случаев БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) среди пациентов с семейной формой БП в Северо-Западном регионе России была уточнена и составила 7 % (7/100), что сопоставимо с данными, полученными для европейских популяций. Частота мутации G6055A (G2019S) среди пациентов со сБП составила 0,4 %

(1/230). Аналогичная частота получена для мутации С4321Т (Я1441С). Мутации Т4838С (У1613А) в исследуемых группах обнаружено не было.

а)

б)

/У\ДчМмд/УЬА

PD6

1 |14п-»-1 87 п.".

11-1 77(55)

PD7

ВТ С ЕЬ

1-2 ' 1-1

11.1 II-2 ш m 76|74) 74(65)

Д)

Рис. 1. а) Результаты секвенирования фрагмента ДНК, содержащего транзицию G6055A (G2019S); б) Идентификация мутации G6055A (G2019S): 1 - маркер молекулярного веса pBR322/BsuRI, 2 - ПЦР-продукт, 3, 4 - гетерозиготное носительство мутации G6055A (G2019S), 5 - норма; в) Родословные семей PD6, PD7 с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) (внизу элементов указаны: генотип (m-мутация в гетерозиготном состоянии), возраст обследования, в скобках - возраст начала заболевания); г) Результаты секвенирования фрагмента ДНК, содержащего транзицию С4321Т (R1441С). Приведен сиквенс антисмысловой цепи; д) Идентификация мутации С4321Т (R1441C): 1 - маркер молекулярного веса pBR322/BsuRI, 2 - ПЦР-продукт, 3 - гетерозиготное носительство мутации С4321Т (R1441C), 4 - норма

Полученные результаты предполагают, что для выявления LRRK2-ассоциированной БП в первую очередь целесообразно проводить скрининг мутации G6055A (G2019S) у пациентов с семейной формой БП. При этом разработанный нами метод идентификации мутации G6055A (G2019S) может быть широко использован в клинической практике, что позволит выявлять случаи 1ЯЖ2-ассоциированной БП и проводить доклиническую диагностику БП в семьях с выявленной молекулярной этиологией заболевания.

В последующее исследование была включена группа согласившихся на исследование пациентов с ¿^^-ассоциированной БП (6 - с мутацией G6055A (G2019S), и 2 - с Т4838С (VI61 ЗА)).

Уровень мРНК гена S1SCA в лимфоцитах периферической крови

В настоящем исследовании у всех пациентов с БП была исключена мультипликация гена SNCA. Полученные нами результаты можно объяснить невысокой частотой встречаемости мультипликаций данного гена (1-1,5 %) среди пациентов с БП (Hope et al., 2004; Williams-Gray et al., 2006). В недавней работе Е. Семёновой и соавторов при исследовании 52 пациентов из Москвы с аутосомно-доминантной формой БП мультипликаций гена SNCA также обнаружено не было (Semenova et al., 2009).

Уровень мРНК гена SNCA определяли в лимфоцитах периферической крови 7 пациентов с ¿ЯЛО-ассоциированной БП, 15 пациентов со сБП и

15 индивидуумов контрольной группы. Полученные значения уровня мРНК гена ХУС4 в группе пациентов с 1ЛЖ2-ассоциированной БП достоверно не отличались, как от группы со сБП (р = 0,17), так и от контроля (р = 0,31) (рис. 2).

Пациенты^ Лиукаиа Пациенты Kumjjwjjs

LRRK3 ЕП, обуслоил.ннэй Сс сБЛ

CG2019SJ

Рис. 2. Средний уровень мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови в группах: пациенты с 1М&ассоциированной БП (п = 7), пациенты с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) (п = 6), со сБП (п = 15) и в контроле (п = 15)

Также различий не было выявлено при исследовании отдельно пациентов с мутацией G6055A (G2019S).

Уровень мРНК гена SNCA в группе с ¿,М£2-ассоциированной БП измерялся впервые. Для пациентов со сБП в ряде предыдущих исследований также не выявлено различий в уровне мРНК гена SNCA по сравнению с контролем (Tan et al., 2005; Fuchs et al., 2008).

Уровень альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови

Измерение белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови было проведено в следующих группах: пациенты с ¿АК/£2-ассоциированной формой БП (п = 8), пациенты со сБП (п = 34) и в контроле (п = 23). На всех блотах наблюдали один специфичный бенд, соответствующий мономерному альфа-синуклеину с молекулярной массой 19 кДа (рис. 3).

Рис. 3. Результаты вестерн-блоттинга: 1 - носитель мутации 06055А (020195); 2 - пациент со сБП; 3 - индивидуум контрольной группы; 4 - рекомбинантный белок альфа-синуклеин

Нами выявлено достоверное снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с ¿Л/Ж?-ассоциированной БП по сравнению как с группой сБП (р = 0,03), так и с контролем (р = 0,01) (рис. 4)

Р=0.01

1 Р=0.03

р=о.оз

Пациенты с Пациенты с Пациенты Контроль

LRRIO- БП, обусловленной со сЕП

ассоциированной БП мутацией G60jjA (G2019S)

Рис. 4. Относительный уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в исследуемых группах: пациенты с ¿ЛЯА2-ассоциированной БП (п = 8), с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) (п = 6), со сБП (п = 34) и в контроле (п = 23) (ось абсцисс -исследуемые группы; ось ординат - относительное среднее количество белка (o.e.))

При этом значения среднего уровня белка между группами сБП и контроля не отличались (р = 0,5). Отдельно был исследован уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов с мутацией G6055A (G2019S). Было выявлено его достоверное снижение в данной группе

пациентов по сравнению как с группой сБП (р = 0,02), так и с контролем (р = 0,03) (рис.4).

Исследования уровня альфа-синуклеина в однородной по этиологии группе пациентов с БП проведено нами впервые. В ранее опубликованные исследования по изучению уровня альфа-синуклеина клеток крови входили гетерогенные группы пациентов со сБП неизвестной этиологии. Несколько групп исследователей предположили, что уровень периферического альфа-синуклеина может служить маркером развития БП. Так, сниженный уровень альфа-синуклеина плазмы крови пациентов с БП был выявлен в работе Li X. с соавторами (Li et al., 2007). Однако в работе Fuch J. с соавторами уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови не отличался у пациентов со сБП при сравнении с контролем (Fuchs et al., 2008). В работе KimS. с соавторами было показано увеличение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП (Kim et al., 2004).

Полученные нами показатели уровня альфа-синуклеина для групп сБП и контроля были крайне вариабельны. В работе Michell А. с соавт. альфа-синуклеин тромбоцитов пациентов с БП демонстрировал также крайне вариабельные значения и не отличался от контрольной группы (Michell et al., 2005). Аналогичные результаты были недавно получены при сопоставлении альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе сБП и в контроле американскими исследователями (Brighina et al., 2010). Результаты нашего исследования не позволяют рассматривать уровнь альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в качестве прогностического маркера развития БП.

Мы впервые показали снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с /,Л/УС2-ассоциированной БП по сравнению с пациентами со сБП и контролем. Ранее группа пациентов с LRRK2-ассоциированной БП была исследована с целью выявления нарушений в работе киназного каскада при этой форме заболевания (White et al., 2007). Белок LRRK2 имеет киназный домен, обладающий гомологией с МАРККК-киназами, которые задействованы в различных процессах, таких как пролиферация, дифференцировка и др. (Miloso et al., 2008; Sweatt et al., 2004). МАРККК-киназы являются ферментами, часто выступающими в качестве инициаторов сигнальных каскадов, являясь регуляторами транскрипции (Yang et al., 2003). Недавно Carballo-Carbajal и соавторы показали in vitro способность белка LRRK2 регулировать транскрипцию гена SNCA (Carballo-Carbajal et al., 2010). Выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 нельзя объяснить влиянием LRRK2 на транскрипцию гена SNCA, поскольку мы не наблюдали снижения уровня мРНК гена SNCA у пациентов с 1&/Ж2-ассоциированной БП. Полученные результаты скорее позволяют предположить изменения на посттрансляционном уровне.

Известно, что альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, которые являются нейропатологическим признаком различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе и БП. В большинстве случаев при £ДЖ2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в

которых белок LRRK2 оказывается колокализован с альфа-синуклеином (Репу et al., 2008). В то же время появились первые результаты, указывающие на вовлеченность LRRK2 в непосредственное взаимодействие с альфа-синуклеином (Qing et al., 2009). В системе in vitro было продемонстрировано участие LRRK2 в фосфорилировании альфа-синуклеина по серину в 129 положении. При этом было также показано, что уровень фосфорилирования в случае LRRK2 дикого типа ниже, чем в случае LRRK2 с мутацией G6055A (G2019S). Необходимо отметить, что ранее многократно показана повышенная киназная активность LRRK2 при мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 (West et al., 2005; Greggio et al., 2006; MacLeod et al., 2006; Smith et al., 2006).

В нашем исследовании мы использовали антитела к альфа-синуклеину человека (BD Transduction Labs, США), иммуногенные к 15-123 аминокислотам, позволяя выявлять формы альфа-синуклеина, содержащие все известные на сегодняшний день сайты фосфорилирования (у125, sl29, у133, sl36), кроме белка, фосфорилированного по серину в позиции 87 (s87). Нами выявлено снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2, на фоне неизменённого уровня мРНК гена SNCA, что не исключает накопление фосфорилированной формы s87 альфа-синуклеина у этих пациентов.

В настоящее время основная гипотеза гибели дофаминергических нейронов ЧС связана с агрегацией альфа-синуклеина. В нашем исследовании бэндов с изменённой подвижностью, свидетельствующих о наличии олигомерных форм белка, в лимфоцитах периферической крови пациентов с ¿.К&Ю-ассоциированной БП обнаружено не было. Нельзя, однако, исключать отсутствие иммуногенности используемых антител к агрегированным формам альфа-синуклеина.

Снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов с £Я/Ж?-ассоциированной БП, выявленное в нашем исследовании, может приводить к нарушению его функций, в частности, как ингибитора тирозин-гидроксилазы, вызывая увеличение свободного дофамина в клетке, развитие окислительного стресса и запуск каскада апоптоза. Мы полагаем, что выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с 1ЛЖ2-ассоциированной БП по сравнению с группой со сБП и контроля, может отражать нарушение общих обменных механизмов при данной форме заболевания.

Суммируя результаты зарубежных исследований и настоящей работы, можно предположить, что уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован как прогностический маркер развития БП.

Влняние клинических характеристик пациентов со сБП и лиц контрольной группы на уровень мРНК гена SNCA и белка альфа-синуклеина

В настоящем исследовании было изучено влияние возраста, пола, возраста начала заболевания, длительности заболевания, а также приема JI-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA и белка альфа-

синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов со сБП. В контрольной группе оценивалось влияние возраста и пола.

В результате исследования влияния пола на уровень мРНК гена SNCA и альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови пациентов со сБП и индивидуумов контрольной группы достоверных различий выявлено не было, что согласуется с ранее полученными данными (Li et al., 2007; Tan et al., 2005; Kim et al., 2004; Fuch et al., 2008). Следует, однако, отметить исследование Brighina L. и соавторов, где было показано повышение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у мужчин по сравнению с женщинами контрольной группы (Brighina et al., 2010).

При изучении влияния возраста на уровень мРНК гена SNCA и альфа-синуклеина у лиц контрольной группы старше 70 лет было выявлено двукратное увеличение уровня мРНК гена SNCA по сравнению с лицами моложе 70 лет (р = 0,04). Подобная тенденция отмечалась также в группе пациентов со сБП (р = 0,059). Возрастание уровня мРНК гена SNCA с возрастом было показано ранее (Kim et al., 2004). В другом исследовании с возрастом отмечалось увеличение белка (Brighina et al., 2010), не отмеченное в настоящем исследовании.

Нами также выявлен повышенный уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП с возрастом начала заболевания до 50 лет по сравнению с пациентами с началом заболевания старше 50 лет (р = 0,013). Интересно отметить, что при сопоставлении длительности заболевания у пациентов с ранним и поздним началом БП выявлено достоверное увеличение длительности БП в группе пациентов с началом заболевания до 50 лет по сравнению с пациентами с более поздним началом заболевания (р = 0,006).

Таким образом, выявленное увеличение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с началом заболевания до 50 лет может объясняться более длительным течением заболевания у этих пациентов. Важно отметить, что в работе Fuch J. и соавторов показана прямая корреляция уровня альфа-синуклеина периферической крови и длительностью течения заболевания у пациентов со сБП (Fuch et al., 2008).

При сопоставлении приёма Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена SNCA были выявлены достоверные различия между группами пациентов со сБП, принимающих и не принимающих Л-ДОФА-содержащие препараты (р = 0,037). Следует отметить, что ранее было показано, что уровень дофамина лимфоцитов периферической крови у пациентов со сБП, принимающих Л-ДОФА-содержащие препараты, повышен (Rajda et al., 2005). Последние исследования in vitro выявили прямое влияние уровня дофамина на экспрессию гена SNCA с участием транскрипционного фактора NF-kB (Alberio et al., 2010).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования нами была уточнена частота случаев G6055A (G20198)-ассоциированной БП в Северо-Западном регионе России (7 % - среди

семейных форм БП, 0,4 % - среди спорадических), а также впервые в России описана частота С4321Т (R1441 (^-ассоциированной БП (0,4 % - среди спорадической БП). Полученные результаты указывают на целесообразность скрининга мутации G6055A (G2019S) среди пациентов с семейной формой БП. Впервые измерен уровень белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в однородной по этиологии группе пациентов с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2 и показано снижение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП при отсутствии изменений в уровне мРНК гена SNCA. Полученные данные предполагают, что уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован для диагностики БП.

ВЫВОДЫ

1. В Северо-Западном регионе России частота мутации G6055A (G2019S) гена LRRK2 среди пациентов с семейной формой БП составляет 7 % (7/100), среди спорадических случаев заболевания - 0,4 % (1/230). Частота мутации С4321Т (R1441C) составляет 0,4% (1/230) среди пациентов со спорадической БП.

2. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2, характеризуется снижением уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови по сравнению со спорадической БП и лицами без неврологических заболеваний при отсутствии изменений уровня мРНК mmSNCA.

3. Уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови выше в группе пациентов со спорадической БП с ранним началом заболевания (до 50 лет) по сравнению с пациентами с более поздним развитием заболевания.

4. Уровень мРНК гена SNCA лимфоцитов периферической крови у лиц с отсутствием неврологических заболеваний увеличивается с возрастом.

5. Уровень мРНК гена SNCA у пациентов со спорадической БП, проходящих терапию JI-ДОФА-содержащими препаратами, выше по сравнению с пациентами, не принимающими данных препаратов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОИ России

1. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Ivanova O.N., Emelianov A.K., Zakharchuk A.H., Schwarzman A.L. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson's Disease in Russia // Movement Disorders. - 2006. -Vol. 21. -№ 12.-P. 2234-2236.

2. Пчелина C.H., Иванова O.H., Емельянов A.K., Якимовский А.Ф., Шварцман А.Л. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Медицинская генетика. - 2006. - Т. 5. - № 2. -С. 48-51.

3. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Emelyanov A.K., Ivanova O.N., Schwarzman A.L., Singleton A.B. Screening for LRRK2 Mutations in Patients with Parkinson's Disease in Russia: Identification of a Novel LRRK2 Variant // Eur J Neurol. - 2008. - Vol. 5. - P. 692-696.

4. Пчелина C.H., Емельянов A.K., Якимовский А.Ф., Миллер Д.В., Шабалина И.Г., Дроздова A.C., Шварцман A.JI. Сниженный уровень альфа-синуклеина в лейкоцитах периферической крови у пациентов с ¿ЯЛЮ-ассоциированной болезнью Паркинсона II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 150. - № 12. -С. 619-621.

Публикации в других изданиях

5. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2 II Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А.Б. Масленникова, Новосибирск: Альфа Виста Н. - 2008. -Выпуск 12.-С. 191.

6. Емельянов А.К., Пчелина С.Н. Альфа-синуклеин и его роль в патогенезе болезни Паркинсона // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А.Б. Масленникова, Новосибирск: АртЛайн. - 2010. - Выпуск 14. - С. 65-81.

Список тезисов

7. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Соловьева A.B., Якимовский А.Ф. Молекулярная диагностика болезни Паркинсона // Конференция «Фундаментальные науки - медицине»: сборник тезисов. -Москва. - 2006. - С. 24-25.

8. Иванова О.Н., Емельянов А.К., Соловьева A.B., Якимовский А.Ф., Пчелина С.Н. Исследование распространения мажорных мутаций в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Сосудистые заболевания нервной системы у блокадников, лиц пожилого и старческого возраста: сборник тезисов. - Санкт-Петербург. - 2006. -Выпуск 3. - С. 26.

9. Емельянов А.К., Соловьева A.B., Смирнова Е.Ю. Рук. Пчелина С.Н. Уровень экспрессии гена SNCA у больных с семейной формой болезни Паркинсона // Человек и здоровье-2007: сборник тезисов. - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 64-65.

Ю.Емельянов А.К., Смирнова Е.Ю., Соловьёва A.B. Молекулярная диагностика болезни Паркинсона // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных: сборник тезисов. - Пущино. -2007. - С.78-79.

11. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Taraskina А.Е., Emelianov A.K., Ivanova O.N., Smirnova E.Yu., Solovieva A.V., Schwarzman A.L. Expression of Alpha-Synuclein in Patients with Parkinson's Disease Caused by Mutations in the LRRK2 Gene // J Eur College Neuropsyhopharmacology. - 2007. -Vol. 17. - № 4. - P. S536-537 (Abstract).

12. Emelianov A.K., Taraskina A.E., Ivanova O.N., Smirnova E.Y., Solovieva A.V., Yakimovskii A.F., Pchelina S.N. LRRK2 Mutations and Alpha-Synuclein Level in Patients with Familial Parkinson's Disease // European Human Genetics Conference, France, June 16-9. - 2007. - Vol. 1. -№ 15.-P. 219 (Abstract).

13. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Taraskina A.E., Emelianov A.K., Ivanova O.N., Smirnova E.Yu., Solovieva A.V., Schwarzman A.L. Expression of Alpha-Synuclein in Patients with Parkinson's Disease Caused by Mutations in the LRRK2 Gene H J Eur College Neuropsyhopharmacology. - 2007. -Vol. 17. - № 4. - P. S536-537 (Abstract).

14. Емельянов A.K., Соловьева A.B., Смирнова Е.Ю. Уровень экспрессии гена SNCA у больных с семейной формой болезни Паркинсона // Человек и здоровье-2007: сборник тезисов. - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 64-65.

15. Emelyanov А.К., Yakimovsky A.F, Shabalina I.G., Schwarzman A.L., Pchelina S.N. Alpha-Synuclein Blood Levels in Parkinson's Disease Caused by the G2019S Mutation // Eur J Neurol. - 2008. - Vol. 15. - № 3. - P. 108 (Abstract).

16. Емельянов A.K., Якимовский А.Ф., Шабалина И.Г., Пчелина С.Н. Исследование уровня альфа-синуклеина и лимфоцитов периферической крови у больных с болезнью Паркинсона, обусловленной мутациями в гене LRRK2 // I национальный конгресс по болезни Паркинсона и расстройствам движений: сборник тезисов. - Москва. - 2008. - С. 358.

17. Pchelina S.N., Emelyanov А.К., Ivanova O.N., Yakimovskii A.F., Schwarzman A.L. Molecular Markers of Parkinson's Disease: LRRK2 Mutations and Alpha-Synuclein Level // 2nd World Congress on Controversies in Neurology, Greece, October 23-26. - 2008. - P. A-91 (Abstract).

18. Емельянов A.K., Якимовский А.Ф., Дроздова A.C., Шварцман A.JI., Пчелина С.Н. Пониженный уровень альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, обусловленной мутациями в гене LRRK2 // V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров: сборник тезисов. - Москва. -2009. - С. 420.

19. Emelyanov А.К., Yakimovskii A.F., Drosdova A.S., Schwarzman A.L., Pchelina S.N. Decreased Alpha-Synuclein Lymphocytes Level in Patients with LRRK2-Associated Parkinson's Disease // 9th International Conference Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Advances, Concepts and New Challenges. Neurodegenerative Diseases. - 2009. - Vol. 6. - № 1. - P. 1508 (Abstract).

20. Пчелина C.H., Емельянов A.K., Усенко T.C., Боганькова Н.А., Вавилова Т.В., Якимовский А.Ф., Шварцман А.Л. Экспрессия а-синуклеина и уровень апоптоза в лимфоцитах периферической крови у пациентов с ¿ЛЖ2-ассоциированной болезнью Паркинсона // Журнал медицинской генетики. VI съезд Российского общества медицинских генетиков: сборник тезисов. -Ростов-на-Дону. -2010. -С. 150.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БП - болезнь Паркинсона

сБП - спорадическая форма БП

ЧС - черная субстанция

Л-ДОФА - L-диоксифенилаланин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

LRRK2 - ген обогащённой лейциновыми повторами киназы 2

SNCA - ген альфа-синуклеина

o.e. - относительные единицы

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН 188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 279, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 21.10.2011 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Емельянов, Антон Константинович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Патогенез БП.

1.1.1. Клиническая характеристика БП.

1.1.2. Нейрогистологическая характеристика БП.

1.1.3. Спорадические и семейные формы БП.

1.2.Гипотетические молекулярные механизмы гибели дофаминергических нейронов при БП.

1.3. Альфа-синуклеин в патогенезе БП.

1.3.1. Моногенные формы БП, обусловленные мутациями в гене ХШ.

1.3.2. Модели БП на основе экзогенной экспрессии альфа-синуклеина.

1.3.3. Агрегация альфа-синуклеина.

1.3.4. Химические модификации альфа-синуклеина.

1.4. Обогащенная лейциновыми повторами киназа 2 (ЫЩК2) и БП.

1.4.1. Мутации в гене ЬЯЯК2 и их распространенность.

1.4.2. Функции иИ1К2 и влияние мутаций в гене ЬЯЯК2 на активность белка.

1.4.3 Нейрогистологическая картина мозга пациентов БП с мутациями в гене ЬЯКК2.

1.5. Лимфоциты периферической крови как объект исследования при изучении патогенеза нейродегенеративных заболеваний.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика обследованных групп.

2.2. Выделение ДНК из периферической крови человека.

2.3. Идентификация мутаций 06055А (020198), С4321Т (Ш441С), Т4838С(У1613А).

2.3.1 Идентификация мутации 06055А (020198).

2.3.2 Идентификация мутации С4321Т (Я1441С).

2.3.3 Идентификация мутации Т4838С(У1613А).

2.4. Метод «дозы гена» для определения мультипликаций гена БИСА.

2.5. Выделение фракции лимфоцитов периферической крови.

2.6. Оценка уровня мРНК гена £7ЧСА.

2.7. Измерение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови.

2.8. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выявление пациентов с /лК/?К2-ассоциированной БП

3.2. Оценка мультипликаций гена 57УСА.

3.3. Измерение уровня мРНК гена БИСА в лимфоцитах периферической крови исследуемых групп.

3.4. Измерение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови.

3.5. Влияние клинических характеристик на уровень мРНК гена БИСА и белка альфа-синуклеина.

3.5.1. Пол.

3.5.2. Возраст.

3.5.3. Возраст начала и длительность заболевания.

3.5.4. Приём Л-ДОФА-содержащих препаратов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови при болезни Паркинсона, обусловленной мутациями гена LRRK2"

Актуальность проблемы

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием среди лиц среднего и пожилого возрастов. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 60 лет составляет 1-2% (Brooks et al., 2002). Развитие симптомов (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы), коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в полосатом теле. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 50-80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Механизм гибели дофаминергических нейронов ЧС при БП остаётся неясным. По этой причине не существует лабораторных диагностических тестов БП и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25% (Bennett et al., 1996; Bower et al., 2002). Выяснение механизма гибели дофаминергических нейронов при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом важным подходом для изучения молекулярно-генетических основ БП представляется исследование моногенных форм заболевания с известной этиологией.

Семейные формы БП составляют 10-15% всех случаев БП (Gasser et al., 2007). В настоящее время описано шесть генов, мутации в которых приводят к развитию наследственных форм БП (besage et al., 2009). Наиболее частой причиной развития наследственных форм БП являются мутации в гене обогащённой лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2), приводящие к аутосомно-доминантной форме заболевания (Farrer et al., 2006). Шесть мутаций гена LRRK2 в настоящее время признаны определенно патогенными: G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), C4321G

R1441G), G4322A (R1441H), A5096G (Y1699C) и Т6059С (I2020T), из которых наиболее распространенной является мутация G6055A (G2019S) (85% от всех £&КАТ2-ассоциированных случаев БП). На втором месте по частоте выявления - мутация R1441C (около 10%) (Giasson et al., 2008). В зависимости от популяции G6055A (G20198)-ассоциированная БП встречается в 5^Ю% случаев семейной БП (Di Fonzo et al., 2005). В Европе мутация G6055A (G2019S) выявляется также в 1% случаев спорадической БП (Giasson В. et al., 2008).

Ранее нами было показано, что частота /,##ЛГ2-ассоциированной БП среди пациентов с семейной формой БП в северно-западном регионе России составляет 6%. В пяти семьях была выявлена G6055A (G2019S)-ассоциированная БП, в одной семье описана новая мутация Т4838С (VI61 ЗА), приводящая к развитию БП с преобладающим тремором (Иванова, 2008). Выявление Zif/iO-ассоциированной БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией БП. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.

В настоящее время считается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфасинуклеина (SNCA) (Singleton et al., 2005; Cookson, Van der Brug, 2008).

Альфа-синуклеин является основным компонентом телец Леви, как при наследственных, так и при спорадических формах БП (сБП) (Spillantini et al., 1997; Hasegawa et al., 2006; Periquet et al., 2007). Точечные мутации в гене SNCA (Polymeropoulos et al., 1997; Conway et al., 1998; Fredenburg et al., 2007), а также дупликация и трипликация гена SNCA приводят к развитию наследственных форм БП (Miller et al., 2004); нейротоксичность агрегатов альфа-синуклеина была многократно продемонстрирована in vitro, а также на трансгенных животных (мыши и дрозофила) (Conway et 7 al., 1998; Waxman et al, 2008; Feany et al., 2000). Известно, что фосфориллирование альфа-синуклеина повышает его нейротоксичность (Anderson et al., 2006).

В большинстве случаев при /Л£ЛК2-ассоциированной БП наблюдается классическая картина нейродегенерации с формированием телец Леви (Hernandez et al., 2005), в которых LRRK2 обнаруживается наряду с альфа-синуклеином (Perry et al., 2008). Показано, что мутация G6055A (G2019S) приводит к повышению киназной активности LRRK2 (Jaleel et al., 2007). При этом физиологические субстраты LRRK2 и механизмы, лежащие в основе развития БП при мутациях в гене LRRK2, остаются неизвестными. Неизвестно также, оказывают ли влияние мутации гена LRRK2 на метаболизм альфа-синуклеина.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Исследование уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.

Задачи исследования:

1. Определение частоты мутаций G6055A (G2019S), С4321Т (R1441C), Т4838С (V1613A) гена LRRK2 у пациентов с БП в северо-западном регионе России.

2. Анализ уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с ZiJÄA^-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.

4. Анализ уровня мРНК гена БИС А лимфоцитов периферической крови у пациентов с 1&&0-ассоциированной БП, у пациентов со спорадической БП и лиц с отсутствием неврологических заболеваний.

5. Оценка влияния возраста, пола и приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК гена БЫСА в исследуемых группах.

Научная новизна:

Впервые у пациентов с 1Л?&0-ассоциированной формой БП проведено исследование уровня альфа-синуклеина и мРНК гена 5АТСА лимфоцитов периферической крови. Впервые показано снижение уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с £&£0-ассоциированной БП по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые оценено влияние возраста, пола, возраста начала заболевания, длительности заболевания, приема Л-ДОФА-содержащих препаратов на уровень мРНК и альфа-синуклеин среди пациентов с БП в России.

Практическая значимость работы:

Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах

БП, в частности при /Л?/?К2-ассоциированной форме заболевания, позволит ближе подойти к пониманию патогенеза более распространенных спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза

-ассоциированной БП. Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации 9

06055А (020198) в гене ЬКВК2 может быть использован в клинической практике при выявлении ¿^^-ассоциированных форм БП. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей пациентов с данной формой заболевания и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Частота мутации в6055А (020198) гена ЬШК2 выше среди пациентов с семейной формой БП (7%), чем среди пациентов со спорадической формой заболевания (0,4%). Частота мутации С4321Т (Я 1441С) среди спорадических случаев БП в северо-западном регионе России составляет 0,4%.

2. Уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови снижен в группе пациентов с £&&0-ассоциированной БП по сравнению с пациентами со спорадической БП и лицами с отсутствием неврологических заболеваний.

4. У лиц с отсутствием неврологических заболеваний наблюдается увеличение уровня мРНК гена 57ЧСА с возрастом.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации:

Скрининг мутаций в группе пациентов с БП выполнен автором лично.

Измерение уровня белка альфа-синуклеина и мРНК гена ЭИСА в лимфоцитах периферической крови пациентов с БП, обусловленной мутациями гена ¿ЯЯК2, пациентов со сБП и в контроле проведены автором лично. Оценка мультипликаций гена &УС4 была проведена автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы:

Предложенные к защите результаты были доложены на конференции «Человек и здоровье -2007», Санкт-Петербургская медицинская академия им ИИ Мечникова, Санкт-Петербург, (2007); европейской конференции по генетике человека, Ницца, Франция (2007); 12-ом конгрессе европейской федерации неврологических ассоциаций, Мадрид, Испания (2008); I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008); V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009); 9-ой международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона, Прага, Чехия (2009); 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино (2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону (2010)

Публикации:

Результаты диссертационной работы отражены в 20 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 6 статей, из них 4 - в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации:

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Емельянов, Антон Константинович

выводы

1. В северо-западном регионе России частота мутации 06055А (020198) гена Ы№К2 среди пациентов с семейной формой БП составляет 7% (7/100), среди спорадических случаев заболевания -0,4% (1/230). Частота мутации С4321Т (К1441С) составляет 0,4% (1/230) среди пациентов со спорадической БП.

2. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене ЫШК2, характеризуется снижением уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови по сравнению со спорадической БП и лицами без неврологических заболеваний при отсутствии изменений в уровне мРНК гена БИС А.

4. Уровень мРНК гена 8ИСА лимфоцитов периферической крови у лиц с отсутствием неврологических заболеваний увеличивается с возрастом.

5. Уровень мРНК гена БИСА у пациентов со спорадической БП, проходящих терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами, выше по сравнению с пациентами, не принимающими данных препаратов.

Заключение

В результате исследования нами была уточнена частота случаев G6055A (С20198)-ассоциированной БП в северо-западном регионе России (7% - среди семейных форм БП; 0,4% - среди спорадических), а также впервые в России описана частота С4321Т (R1441 (^-ассоциированной БП (0,4% - среди спорадической БП). Полученные результаты указывают на целесообразность скрининга мутации G6055A (G2019S) среди пациентов с семейной формой БП. Впервые измерен уровень белка альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в однородной по этиологии группе пациентов с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2 и показано снижение уровня белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови в группе пациентов с LRRK2-ассоциированной БП при отсутствии изменений в уровне мРНК гена SNCA. Полученные данные предполагают, что уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован для диагностики БП.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Емельянов, Антон Константинович, Санкт-Петербург

1. Голубев B.JL, Левин Я.И., Вейн A.M. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма. М.: МЕДпресс, 2000. - 416с.

2. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург: Специальная литература, 1997.- 286с.

3. Иванова О.Н. Молекулярно-генетическиое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (.LRRK2) у лиц с болезнью Паркинсона. -Автореф. На соискание к-та мед. наук. Москва. 2008. 25 с.

4. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. -591с.

5. Крыжановский Г.Н и др. Болезнь Паркинсона (этиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика). М.: Медицина, 2002. - 336с.

6. Левин О.С., Докадина Л.В. Эпидемиология паркинсонизма и болезни Паркинсона // Неврологический журнал. 2005. - Т. 10, № 5. - с.41-49

7. Лосано А., Калиа С. Новые подходы к лечению болезни Паркинсона // В мире науки. 2005. - №10. - с. 58-61

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук. Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479с.

9. Пчелина С.Н., Якимовский А.Ф., Шварц Е.И. Наследственные основы болезни Паркинсона // (Обзор). Медицинская генетика. -2003.- Т.9 , № 411. с. 425

10. Шадрина М.И., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х., Беспалова Е.В., Загоровская Т.Б., Сломинский П.А., Маркова Е.Д., Клюшников

11. С.А., Лимборская С.А., Иванова-Смоленская И.А. РАЯК8-форма болезни Паркинсона: мутационный анализ гена LRRK2 в российской популяции. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2007. - Т. 107, № 3. - с. 46-50

12. Alberio Т., Bossi A., Milli A., Parma Е., Gariboldi M., Tosi G., Lopiano L., Fasano M. Proteomic analysis of dopamine and alpha-synuclein interplay in a cellular model of Parkinson's disease pathogenesis // FEBS J. 2010. - Vol.277. - P.4909-4919

13. Alegre-Abarrategui J., Ansorge O., Esiri M., Wade-Martins R. LRRK2 is a component of granular alpha-synuclein pathology in the brainstem of Parkinson's disease // Neuropathology and Applied Neurobiology. -2008. Vol.34. - P.272-283

14. Anderson J.et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease // J. BiolChem. 2006. - Vol.281. - P.29739-29752

15. Beck G., Brinkkoetter P., Hanusch C., Schulte J., van Ackern K., van der Woude F.J., Yard B.A. Clinical review: immunomodulatory effects of dopamine in general inflammation // Crit. Care. 2004. - Vol.8. -P.485-491

16. Bennett D.A., Beckett L.A., Murray A.M., Shannon K.M., Goetz C.G, Pilgrim D.M., Evans D.A., Engl N. Prevalence of Parkinsonian Signs and Associated Mortality in a Community Population of Older People // J.Med. 1996. -Vol.334. - P.71-76

17. Besser M.J., Ganor Y., Levite M. Dopamine by itself activates either D2, D3 or D1/D5 dopaminergic receptors in normal human T-cells and triggers the selective secretion of either IL-10, TNFalpha or both // J. Neuroimmunol. 2005. - Vol.169. - P. 161-171

18. Bhatia K. P., Gasser T., Lees A. J., Wood N. W. Phenotype, genotype and worldwide genetic penetrance of LRRK2-associated Parkinson's disease: a case-control study // Lancet Neurol. 2008. - Vol.7. - P.583-590

19. Bisaglia M , Greggio E., Dragan M., Miller D. W, Cookson M. R, Bubacco L. et al. a-Synuclein overexpression increases dopamine toxicity in BE(2)-M17 // cells BMC Neuroscience. 2010.- Vol.11. -P.41

20. Block M. L., Hong J. S. Microglia and inflammation-mediated neurodegeneration: multiple triggers with a common mechanism // Prog. Neurobiol. 2005. - Vol.76. - P.77-98

21. Bossy-Wetzel E., Schwarzenbacher R., Lipton S.A. Molecular pathways to neorodegeneration . // Nature Medicine. 2004. - Vol.10. -P.S2- S9

22. Bower J.A., Dickson D.W., Taylor L., Maraganore D.M., Rocca W.A. Clinical correlates of the pathology underlying parkinsonism: a population perspective // Mov. Disord. 2002. - Vol.17. - P.910-916

23. Cabin D.E., Shimazu K., Murphy D. et al. Synaptic vesicle depletion correlates with attenuated synaptic responses to prolonged repetitive stimulation in mice lacking alpha-synuclein // J. Neurosci. -2002. -Vol.22.- P.8797-8807

24. Caronti B., Tanda G., Colosimo C., Ruggieri S., Calderaro C., Palladini G., Pontieri F., Di Chiara G., Reduced dopamine in peripheral blood lymphocytes in Parkinson's disease // Neuroreport. 1999. Vol.10. -P.2907-2910

25. Chandra S., Gallardo G., Fernández-Chacón R., Schlüter O.M., Südhof T.C. Alpha-synuclein cooperates with CSPalpha in preventing neurodegeneration //Cell. 2005.- Vol.123. - P.359-361

26. Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P.T. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease//Nat Med. 1998.- Vol.4. - P.1318-1320

27. Cookson M.R., van der Brug M.Cell systems and the toxic mechanism(s) of alpha-synuclein // Exp Neurol. 2008. - Vol.209, № 1 . - P.5-11

28. Crowther R.A., Jakes R., Spillantini M.G., Goedert M. Synthetic filaments assembled from C-terminally truncated alpha-synuclein // FEBS Lett. 1998. - Vol.436. - P.309-312

29. Davidson W.S., Jonas A., Clayton D.F., George J.M. Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes // J. Biol Chem. 1998. - Vol. 273. - P.9443-9449

30. Dawson T.M., Dawson V.L. Molecular Pathways of Neurodegeneration in Parkinson's Disease // Science. 2003. - Vol.302. - P.819 - 822

31. Dawson T.M. Parkinson's Disease Genetics and Pathogenesis // New York : informa healthcare USA. 2007. - P.398

32. Dawson T. M., Dawson V. L., Chiosis G., Cookson M. R., Cai H. The chaperone activity of heat shock protein 90 is critical for maintaining the stability of leucine-rich repeat kinase 2 // J. Neurosci. 2008. -Vol.28. - P.3384-3391

33. Dunnet S.B., Bjorklund A. Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease // Nature. 1999. -Vol. 399. P.A32-A39

34. Elbaz A., Alperovitch A. Bias in association studies resulting from gene-environment interactions and competing risks // Am J. Epidemiol. 2002. - Vol.155.-P.265-272

35. Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P., Vizi E.S. The sympathetic nerve—an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system // Pharmacol. Rev. 2000. - Vol. 52. - P.595-638

36. Ellis C.E., Schwartzberg P.L., Grider T.L., Fink D.W., Nussbaum R.L. Alpha-synuclein is phosphorilated by members of the Src family ofprotein-tyrosine kinases // J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276. - P.3879-3884

37. Fairer M., Kachergus J., Forno L. et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and alpha-synuclein genomic multiplications // Ann Neurol. 2004. - Vol. 55, №2. - P. 174-179

38. Farrer M.J. Genetics of Parkinson's disease: paradigm shifts and future prospects // Nature Reviews. 2006. - Vol.7. - P.306-318

39. Feany M.B., Bender W.W. A drosophila model of Parkinson's disease // Nature. 2000. - Vol.404. - P.394-398

40. Foltynie T., Sawcer S., Brayne C., Barker R.A. The genetic basis of Parkinson's disease // Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry. 2002. - Vol.73. - P. 363-370

41. Franco R., Pacheco R., Lluis C., Ahern G.P., O Connell P.J. The emergence of neurotransmitters as immune modulators // Trends Immunol. 2007. - Vol.28. - P.400^07

42. Fuchs J., Tichopad A., Golub Y., Munz M., Schweitzer K.J., Wolf B., Berg D., Mueller J.C., Gasser T. Genetic variability in the SNCA gene influences alpha-synuclein levels in the blood and brain. // J. FASEB. -2008. Vol.22, № 5. - P.1327-1334

43. Funayama M., Hasegawa K., Kowa H., Saito M., Tsuji S., Obata F. A new locus for Parkinson's disease (PARK8) maps to chromosome 12pl 1.2-pl3.1 // Ann. Neurol. -2002. Vol.51. -P.296-301

44. Gasser T. Genetics of Parkinson's disease // Ann. Neurol. 1998. -Vol.44.- P.S53-S57

45. Gasser T. Update on the Genetics of Parkinson's Disease // Mov. Disord. 2007. - Vol.22. - P.S343-S350

46. George J.M., Jin H., Woods W.S., Clayton D.F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the Zebra Finch // Neuron. 1995. - Vol.15. - P.361-372

47. Giasson B.I., Uryu K., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Mutant and wild type human alpha-synucleins assemble into elongated filaments with distinct morphologies in vitro // J. Biol Chem. 1999. - Vol.274. -P.7619-7622

48. Giasson B.I., Murray I.V., Trojanowski J.Q., Lee V.M. A hydrophobic stretch of 12 amino acid residues in the middle of alpha-synuclein is essential for filament assembly // J. Biol Chem. 2001. - Vol. 276. -P.23 80-23 86

49. Giasson B.I., Forman M.S., Higuchi M., et al. Initiation and synergistic fibrillization of tau and alpha-synuclein // Science. 2003. -Vol.300. -P.636-640

50. Giasson B.I., Covy J.P., Bonini N.M, Hurtig H.I., Farrer M.J., Trojanowski J.Q., Van Deerlin V.M. Biochemical and pathological characterization of Lrrk2 //Ann.Neurol. 2006. - Vol.59. - P.315-322

51. Giasson B.I., Van Deerlin V.M. Mutations in LRRK2 as a Cause of Parkinson's disease // Neurosignals. 2008. - Vol. 16. - P.99-105

52. Gillardon F. Leucine-rich repeat kinase 2 phosphorylates brain tubulin-beta isoforms and modulates microtubule stability a point of convergence in Parkinsonian neurodegeneration // J. Neurochem. -2009. - Vol.110.-P.1514-1522

53. Gloeckner C. J., Schumacher A., Boldt K., Ueffing M. 2009 The Parkinson disease-associated protein kinase LRRK2 exhibits MAPKKK activity and phosphorylates MKK3/6 and MKK4/7, in vitro // J. Neurochem. 2009. - Vol.109. - P.959-968

54. Goldberg M.S., Lansbury P.T. Is there a cause-and-effect relationship between alpha-synuclein fibrillization and Parkinson's disease? // Nat. Cell Biol. 2000. - Vol.2. - P.EI 15-E119

55. Gotthardt K., Weyand M., Kortholt A., Van Haastert P.J., Wittinghofer A. Structure of the Roc-COR domain tandem of C. tepidum, a prokaryotic homologue of the human LRRK2 Parkinson kinase // EMBO J. 2008. - Vol.27. - P. 2239-2249

56. Greggio E., Singleton A. Kinase signaling pathways as potential targets in the treatment of Parkinson's disease // Expert Review of Proteomics. 2007. - Vol.4, Suppl.6. - P.783-792

57. Hasegawa K., Kowa H. Autosomal-dominant familial Parkinson's disease: older onset of age, and good response to levodopa therapy // European Neurology. 1997. - Vol.38. - P.39-43

58. Hasegawa M., Fujiwara H., Nonaka T. et al. Phosphorylated alpha-synuclein is ubiquitinated in alpha-synucleinopathy lesions // J. Biol Chem. 2002. - Vol.277. - P.49071^9076

59. Hashimoto M., Yoshimoto M., Sisk A. et al. NACP, a synaptic protein involved in Alzheimer's disease, is differentially regulated during megakaryocyte differentiation // Biochem Biophys Res Commun. -1997.-Vol.237.-P.611-616

60. Healy D.G., Abou-Sleiman P.M., Casas J.P., Ahmadi K.R., Lynch T.,

61. Gandhi S., Muqit M.M., Foltynie T., Barker R.,. Bhatia K.P,. Quinn

62. N.P, Lees A.J., Gibson J.M., Holton J.LRevesz, T., Goldstein D.B.,105

63. Wood N.W. UCHL1 is not a Parkinson's disease susceptibility gene // Ann. Neurol. 2006. - Vol.59. - P.627-633

64. Healy D. G., Falchi M, O'Sullivan S. S., Bonifati V., Durr A, Bressiftan S., Brice A., Aasly J., Zabetian C.P., Goldwurm S. Ferreira J. J., Tolosa E., Kay D. M., Klein C., Williams D. R., Marras C., Lang

65. Heo H. Y., Park J. M, Kim C. H., Han B. S., Kim K. S., Seol W. LRRK2 enhances oxidative stress-induced neurotoxicity via its kinase activity // Exp. Cell Res. 2010. - Vol.316. -P.649-656

66. Hirsch E. C., Hunot S. Neuroinflammation in Parkinson's disease: a target for neuroprotection? // Lancet.Neurol. 2009 - Vol.8. - P.382-397

67. Hsu C. H., Chan D., Greggio E., Saha S., Guillily M. D., Ferree A., Raghavan K., Shen G. C., Segal L., Ryu H., Cookson M. R., Wolozin

68. B. MKK6 binds and regulates expression of Parkinson's disease-related protein LRRK2 //J. Neurochem. 2010. - Vol.112.-P.1593-1604

69. Iaccarino C., Crosio C., Vitale C., Sanna G., Carri M. T., Barone P. Apoptotic mechanisms in mutant LRRK2-mediated cell death // Hum. Mol. Genet. 2007. - Vol.16. - P. 1319-1326

70. Illarioshkin S.N., Ivanova-Smolenskaya I.A., Markova E.D. et al. Lack of alpha-synuclein gene mutations in families with autosomal dominant Parkinson's disease in Russia // J.Neurol. 2000. - Vol.247. - P.968-969

71. Imai Y., Gehrke S., Wang H. Q., Takahashi R., Hasegawa K., Oota E., Lu B. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila // EMBO J. 2008. - Vol.27. -P.2432-2443

72. Ischiropoulos H. Oxidative modifications of alpha-synuclein. Parkinson's disease: the life cycle of the dopamine // Neuron. 2003. -Vol.991.-P. 93-100

73. It G., Okai T., Fujino G., Takeda K., Ichijo H., Katada T., Iwatsubo T. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease // Biochemistry. 2007. - Vol.46. - P.1380-1388

74. Iwai A., Masliah E., Yoshimoto M. et al. The precursor protein of nona-beta component of Alzheimers disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system // Neuron. 1995. - Vol.14. -P.467-475

75. Jenco J.M., Rawlingson A., Daniels B., Morris A.J. Regulation of phospholipase D2: selective inhibition of mammalian phospholipase D isoenzymes by alpha- and beta-synuclein // Biochemistry. 1998. -Vol.37. -P.4901-4909

76. Jensen P.H., Nielsen M.S., Jakes R., Dotti C.G., Goedert M. Binding of alpha-synuclein to brain vesicles is abolished by familial Parkinson's disease mutation // J. Biol Chem. 1998. - Vol.273. - P.26292-26294

77. Kamikawaji S., Ito G., Iwatsubo T. Identification of the autophosphorylation sites of LRRK2 // Biochemistry. 2009. - Vol.48. - P.10963-10975

78. Katoh N., Soga F., Nara T., Tamagawa-Mineoka R., Nin M., Kotani H., Masuda K., Kishimoto S. Effect of serotonin on the differentiation of human monocytes into dendritic cells // Clin. Exp. Immunol. 2006. -Vol.146.-P.354-361

79. Kawashima K., Fujii T. The lymphocytic cholinergic system and its contribution to the regulation of immune activity // Life Sci. 2003. -Vol.74. -P.675-696

80. Kessler J.C., Rochet J.C., Lansbury Jr. P.T. The N-terminal repeat domain of alphasynuclein inhibits beta-sheet and amyloid fibril formation // Biochemistry. 2003. - Vol.42. - P.672-678

81. Kim S., Seo J.H., Suh Y.H. Alha-synuclein, Parkinson's disease, and Alzheimer's disease Parkinsonism // Relat Disord. 2004. - Vol.10. -P.S9-13

82. Kruger R., Kuhn W., Muller T. et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alphasynuclein in Parkinson's disease // Nat Genet. 1998. -Vol. 18, №2.-P. 106-108

83. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage "1"4 // Nature (Lond.). 1970. - Vol.227. -P.680-685

84. Lashuel H.A., Hartley D., Peter B.M., Walz T., Lansbury P.T. Neurodegenerative disease: Amyloid pores from pathogenic mutations // Nature. 2002. - Vol.418. - P.291

85. Le W.D., Xu P., Jankovic J., Jiang H., Appel S.H., Smith R.G.,. Vassilatis D.K. Mutations in NR4A2 associated with familial Parkinson disease // Nature Genetics. 2003. - Vol.33. - P.85-89

86. Lee F.S., Liu F., Pristupa Z.B., Niznik H.B. Direct binding and functional coupling of alpha-synuclein to the dopamine transporters accelerate dopamine-induced apoptosis // Faseb J. 2001. - Vol.15. -P.916-926

87. Leon-Ponte M., Ahern G.P., O Connell P.J. Serotonin provides an accessory signal to enhance T-cell activation by signaling through the 5-HT7 receptor // Blood . 2007. - Vol.109. - P.3139-3146

88. Lesage S., Durr A., Tazir M., Lohmann E., Leutenegger A. L., Janin S., Pollak P., Brice A. LRRK2 G2019S as a cause of Parkinson's disease in North African Arabs // N. Engl. J. Med. 2006. - Vol.354. - P.422-423

89. Lesage S., Brice A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors // Hum Mol Genet. 2009. - Vol.15. -P.18(Rl):R48-59.

90. Lewis P.A., Greggio E., Beilina A., Jain S., Baker A., Cookson M.R. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - Vol. 357, Suppl. 3. - P.668-671

91. Li X., Tan Y.C., Poulose S., Olanow C.W., Huang X.Y., Yue Z. Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)/PARK8 possesses GTPaseactivity that is altered in familial Parkinson's disease R1441C/G mutants // J. Neurochem. 2007. - Vol.103. - P.238-247

92. Li Q.X., Mok S.S., Laughton K.M., McLean C.A., Cappai R., Masters C.L., Culvenor J.G., Home M.K. Plasma alpha-synuclein is decreased in subjects with Parkinson's disease // Exp Neurol. 2007. - Vol.204, № 2. - P.583-588

93. Liou A.K., Leak R.K., Li L., Zigmond M. J. Wild-type LRRK2 but not its mutant attenuates stress-induced cell death via ERK pathway // Neurobiol. Dis. -2008. Vol.32. - P. 116-124

94. Liu M., Dobson B., Glicksman M. A., Yue Z., Stein R. L. Kinetic mechanistic studies of wild-type leucine-rich repeat kinase2: characterization of the kinase and GTPase activities // Biochemistry. -2010. Vol.49. - P.2008-2017

95. Lotharius J., BrundinP. Pathogenesis ofparkinson's disease: dopamine, vesicles and -synuclein // Nature Reviews Neuroscience. Vol.3. -P.932-942

96. MacLeod D., Dowman J., Hammond R., Leete T., Inoue K., Abeliovich A. The familial Parkinsonism gene LRRK2 regulates neurite process morphology // Neuron. 2006. - Vol.52. - P.587-593

97. Maestroni G.J., Mazzola P. Langerhans cells beta 2-adrenoceptors: role in migration, cytokine production, Th priming and contact hypersensitivity // J. Neuroimmunol. 2003. - Vol.144. - P.91-99

98. Mann V., Cooper J., Schapira A. Quantitation of mitochondrial DNA deletion in Parkinson's disease // FEBS. 1992. - Vol.299. - P.218-222

99. Manning-Bog A.B., Schüle B., Langston J.W. Alpha-synuclein-glucocerebrosidase interactions in pharmacological Gaucher models: a biological link between Gaucher disease and parkinsonism // Neurotoxicology. 2009. - Vol.30, № 6. - P. 1127-32

100. Maries E., Dass B., Collier T. J., Kordower J.H., Steece-Collier K. The role of <x-synuclein in Parkinson's disease: insights from animal models // Nature Reviews Neuroscience. 2003. - Vol.4. - P.727-738

101. Maroteaux L., Campanelli J.T., Scheller R.H. Synuclein — a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve-terminal // J. Neurosci. 1988. - Vol.8. - P.2804-2815

102. McArdle B., Hofmann A. Coronin structure and implications // Subcell Biochem. 2008. - Vol.48. - P. 56-71

103. Michell A.W., Luheshi L.M., Barker R.A. Skin and platelet alpha-synuclein as peripheral biomarkers of Parkinson's disease // Neurosci Lett. 2005. - Vol.381, № 3. - P.294-8

104. Miller D.W., Hague S.M., Clarimon J., Baptista M., Gwinn-Hardy K., Cookson M.R., Singleton A.B. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson disease with SNCA locus triplication // Neurology. 2004. - Vol.62, № 10. - P. 1835-1838

105. Miloso M., Scuteri A., Foudah D., Tredici G. MAPKs as mediators of cell fate determination: an approach to neurodegenerative diseases // Curr Med Chem. 2008. - Vol. 15, № 6. - P.538-548

106. Moore D.J., Zhang L., Troncoso J., Lee M. K., Hattori N., Mizuno Y., Dawson T. M., Dawson V. L. Association of DJ-1 and parkin mediated by pathogenic DJ-1 mutations and oxidative stress // Hum. Mol. Genet. 2005. - Vol.14. - P.71-84

107. Nakano K., Higashi T., Takagi R., Hashimoto K., Tanaka Y., Matsushita S. Dopamine released by dendritic cells polarizes Th2 differentiation // Int. Immunol. 2009. - Vol.21, № 6. - P.645-654

108. Nishibori M., Takahashi H.K., Mori S. The regulation of ICAM-1 and LFA-1 interaction by autacoids and statins: a novel strategy for controlling inflammation and immune responses // J. Pharmacol. Sei. -2003.-Vol.92.-P.7-12

109. Norris E.H., Giasson B.I., Ischiropoulos H., Lee VMY. Effects of oxidative and nitrative challenges on alpha-synuclein fibrillogenesis involve distinct mechanisms of protein modifications // J. Biol Chem. -2003. Vol.278. - P.27230-27240

110. Norris E.H., Giasson B.I., Lee VMY. Alpha-synuclein: normal function and role in neurodegenerative diseases // Stem Cell Dev Disease. -2004.-Vol. 60.-P. 17-54

111. Olteanu A., Pielak G.J. Peroxidative aggregation of alpha-synuclein requires tyrosines // Protein Science. 2004. - Vol.13. - P.2852-2856

112. Pacheco R., Ciruela F., Casado V., Mallol J., Gallart T., Lluis C., Franco R. Group I metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation // J. Biol. Chem. 2004. -Vol.279.-P.33352-33358

113. Pacheco R., Oliva H., Martinez-Navio J.M., Climent N., Ciruela F., Gatell J.M., Gallart T., Mallol J., Lluis C., Franco R. Glutamate released by dendritic cells as a novel modulator of T cell activation // J. Immunol. 2006. - Vol.177. - P.6695-6704

114. Pacheco R., Gallart T., Lluis C., Franco R. Role of glutamate on T-cell mediated immunity // J. Neuroimmunol. 2007. - Vol.185. - P.9-19

115. Paglini G., Kunda P., Quiroga S., Kosik K., Caceres A., Suppression of radixin and moesin alters growth cone morphology, motility, and process formation in primary cultured neurons // J. Cell Biol. 1998. -Vol.143.-P.443^155

116. Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W., Gilks W., Simon J., van der Brug M., de Munain A ., Aparicio S., Gil A., Khan N. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease // Neuron. 2004. - Vol.44. - P.595-600

117. Paisan-Ruiz C., Lang A. E., Kawarai T., Sato C., Salehi-Rad S.,

118. Fisman G. K., Al-Khairallah T., St George-Hyslop P., Singleton A.,115

119. Rogaeva E. LRRK2 gene in Parkinson's disease. Mutation analysis and case control association study // Neurology. 2005. - Vol.65. - P.696-700

120. Paisân-Ruiz C. LRRK2 gene variation and its contribution to Parkinson disease // Hum Mutat. 2009. - Vol.30, № 8. - P. 1153-60

121. Perez R., Waymire J.C., Lin E, Liu J.J., Guo F, Zigmond M.J. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis // J. Neurosci. 2002. - Vol.22, № 8. - P.3090-3099

122. Perez R.G., Hastings T.G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? // J. Neurochem. 2004. - Vol.89. -P.1318-1324

123. Periquet M., Fulga T., Myllykangas L., Schlossmacher M.G., Feany M.B. Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo // J. Neurosci. 2007. - Vol.27, № 12. - P.338-3346

124. Polymeropoulos M.H., Lavedan C., Leroy E. et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identifi ed in families with Parkinson's disease // Science. 1997. - Vol.276. - P.2045-2047

125. Poorkaj P., Nutt J.G., James D., et al. Parkin mutation analisis in clinic patients with early-onset Parkinson's disease // Am J Med Genet. -2004. Vol.129A.-P.44-50

126. Popescu B. O., Toescu E. C., Popescu L. M., BajenaruO., Muresanu D. F., Schultzberg M., Bogdanovic, N. Blood-brain barrier alterations in ageing and dementia // J. Neurol. Sci. 2009. - Vol.283. - P.99-106

127. Hong Qing, Winne Wong, Edith G McGeer, Patrick L. McGeer, Lrrk2 phosphorylates alpha-synuclein at serine 129: Parkinson disease implications // BBRC. 2009. - Vol.387. - P. 149-152

128. Qing H., Zhang Y., Deng Y., McGeer E.G., McGeer P.L. Lrrk2 interaction with alpha-synuclein in diffuse Lewy body disease // Biochem Biophys Res Commun. 2009. - Vol.390, № 4. - P. 12291234

129. Rajda C., Dibô G, Vécsei L, Bergquist J. Increased dopamine content in lymphocytes from high-dose L-Dopa-treated Parkinson's disease patients // Neuroimmunomodulation. 2005. - Vol.12, № 2. - P.81-84

130. Rao G., Fisch L., Srinivasan S., et al. Does this patient have Parkinson disease? // JAMA. 2003. - Vol.289. - P.347-353

131. Sakaguchi-Nakashima A., Meir J.Y., Jin Y., Matsumoto K., Hisamoto N. LRK-1, a C. elegans PARK8-related kinase, regulates axonal-dendritic polarity of SV proteins // Current Biology. 2007. - Vol.17, Suppl. 7. -P.592-598

132. Savitt J.M., Dawson V.L., Dawson T.M. Diagnosis and treatment of Parkinson's disease: molecules to medicine // J. Clin. Invest. 2006. -Vol.116.-P. 1744-1754

133. Schapira A. Nuclear and mitochondrial genetics in Parkinson's disease // J. Med. Genet. 1995. - Vol.32. - P.411-414

134. Serpell L.C., Berriman J., Jakes R., Goedert M., Crowther R.A. Fiberdiffraction of synthetic alpha-synuclein filaments shows amyloid-like118cross-beta conformation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. -Vol.97. - P.4897-4902

135. Shimura H., Schlossmacher M.C., Hattori N., et al. Ubiquitination of a new form of alpha-synuclein by parkin from human brain: implications for Parkinson's disease // Science. 2001. - Vol.293. - P.263-269

136. Shin N., Jeong H, Kwon J., Heo H.Y., Kwon J.J., Yun H.J., Kim C.H., Han B.S., Tong Y.,Shen J., Hatano T., Hattori N., Kim K.S., Chang S., Seol W. LRRK2 regulates synaptic vesicle endocytosis // Exp Cell Res. 2008. - Vol.314. - P.2055-2065

137. Singleton A.B. What does PINK1 mean for Parkinson disease? / A. Singleton //Neurology. -2004. Vol.63. - P. 1350-1351

138. Singleton A.B. Altered a-synuclein homeostasis causing Parkinson'z disease: the potential roles of dardarin // Trends in Neurosciences. -2005.-Vol.28.-P.416-421

139. Smith W.W., Pei Z., Jiang H., Moore D.J., LiangY., WestA.B., Dawson V.L., Dawson T., Ross C.A. Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) interacts with parkin, and mutant LRRK2 induces neuronal degeneration // PNAS. 2005. - Vol.102. -P.18676-18681

140. Smith W. W., Pei Z., Jiang H., Dawson V. L., Dawson T. M., Ross C. A. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity // Nat. Neurosci. -2006. Vol.9. - P. 1231-1233

141. Spillantini M.G., Schmidt M.L., Lee VMY, Trojanowski J.Q., Jakes R., Goedert M. Alph-asynuclein in Lewy bodies // Nature. 1997. - Vol. 388. - P.839-840

142. Sveinbjornsdottir S., Hicks A., Jonsson T. Familial aggregation of Parkinson's disease in Iceland // N. Engl. J. Med. 2000. - Vol.343. -P. 1765-1770

143. Sweatt J.D. Mitogen-activated protein kinases in synaptic plasticity and memory // Curr. Opin. Neurobiol. 2004. - Vol.14. - P.311-317

144. Tan E.K., Khajavi M., Thoronby J.I. , Nagamitsu S., Jankovic J., Ashizawa T. Variability and validity of polymorphism association studies in Parkinson's disease // Neurology. 2000. - Vol.55. - P.533-538

145. Tan E.K., Chandran V.R., Fook-Chong S., Shen H., Yew K, Teoh M.L., Yuen Y., Zhao Y. Alpha-synuclein mRNA expression in sporadic Parkinson's disease // Mov Disord. 2005. - Vol.20, № 5. -P.620-623

146. Tian, J., Lu Y., Zhang H., Chau C.H., Dang H.N., Kaufman D.L. Gamma-aminobutyric acid inhibits T cell autoimmunity and the development of inflammatory responses in a mouse type 1 diabetes model // J. Immunol. 2004. - Vol.173. - P.5298-5304

147. Ueda K., Fukushima H., Masliah E. et al. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol.90. - P. 11282-11286

148. Vila M., Przedborski S. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease // Nature Medicine. 2004. - Vol.10. - P.S58-S62

149. Voiles M.J., Lansbury P.T. Zeroing in on the pathogenic form of alpha-synuclein and its mechanism of neurotoxicity in Parkinson's disease // Biochemistry. 2003. - Vol.42. -P.7871-7878

150. Watanabe Y., Nakayam T., Nagakubo D., Hieshima K., Jin Z., Katou F., Hashimoto K., Yoshie O. Dopamine selectively induces migration and homing of naive CD8+ T cells via dopamine receptor D3 // J. Immunol. 2006. - Vol.176. - P.848-856

151. Waxman E.A., Duda J.E., Giasson B.I. Characterization of antibodies that selectively detect alpha-synuclein in pathological inclusions // Acta Neuropathol. 2008. - Vol.116. - P.37-46

152. Weinreb P.H., Zhen W., Poon A.W., Conway K.A., Lansbury P.T. Jr. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded // Biochemistry. 1996. - Vol.35. - P.13709-13715

153. White L. R, Toft M, Kvam S. N, Farrer M. J., Aasly, J. O. MAPK-pathway activity, Lrrk2 G2019S, and Parkinson's disease // J. Neurosci. Res. 2007. - Vol.85. - P. 1288-1294

154. Williams-Gray C.H., Goris A., Foltynie T., Brown J., Maranian M., Walton A., Compston D.A., Sawcer S.J., Barker R.A. No alterations in alpha-synuclein gene dosage observed in sporadic Parkinson's disease // Mov Disord.- 2006. Vol.21, № 5. - P.731-732

155. Wongi Seol. Biochemical and molecular features of LRRK2 and its pathophysiological roles in Parkinson's disease // BMB Rep. 2010. -Vol. 43, № 4. -P.233-44

156. Wood N.W. Genetic risk factors in Parkinson's disease // Ann. Neurol. 1998. - Vol.44, Suppl.l. -P.S58-S62

157. Xu J., Kao S.Y., Lee F.J, Song W.H, Jin L.W., Yankner B.A. Dopamine-dependent neurotoxicity of alpha-synuclein: a mechanism for selective neurodegeneration in Parkinsondisease // Nat Med. -2002. Vol.8. - P.600-606

158. Yang S.H, Sharrocks A.D, Whitmarsh A.J. Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades // Gene. 2003. - Vol.320. -P.3-21

159. Zarranz J.J, Alegre J, Gomez-Esteban J.C, et al. The new mutation, E46K, of alpha- synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia // Ann Neurol. 2004. -Vol.55, № 2. - P.164-173

160. Zhou W, Zhu M, Wilson M.A, Petsko G.A, Fink A.L. The oxidative state od DJ-1 regulates its chaperone activity toward alpha-synuclein //J. Mol. Biol. -2006. Vol.356. -P.1036-1048

161. Zhu X, Babar A, Siedlak S.L, Yang Q, Ito G, Iwatsubo T, Smith M.A, Perry G, Chen S.G. LRRK2 in Parkinson's disease and dementiawith Lewy bodies // Molecular Neurodegeneration. 2006. - P. Vol.1. -P.17

162. Zimprich A, Biskup S., Leitner P., Farrer M., Lincoln S., Kachergus J., Hulihan M., Uitti R., Calne D. Mutations in LRRK2 cause autosomal -dominant parkinsonism with pleomorphic pathology // Neuron. 2004. - Vol.44.-P.601-607

163. Zintzaraz E., Hadjigeorgiou G. Association of paraoxonase 1 gene polymorphisms with risk of Parkinson's disease: a meta-analysis // J. Hum. Genet. 2004. - Vol.49. - P.474-481

Информация о работе

Емельянов, Антон Константинович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Экспрессия гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови при болезни Паркинсона, обусловленной мутациями гена LRRK2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы