Молекулярно-генетические основы наследственных форм болезни Паркинсона

Пчелина, Софья Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические основы наследственных форм болезни Паркинсона
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические основы наследственных форм болезни Паркинсона"

На правах рукописи

ПЧЕЛИНА Софья Николаевна

Молекулярно-генетические основы наследственных форм болезни Паркинсона

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 А В Г 2012

Санкт-Петербург 2012

005046548

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова» и Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова».

Научный консультант:

доктор биологических наук Шварцман Александр Львович.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки Р

доктор медицинских наук, профессор Владислав Сергеевич Баранов, Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» Северо-Западного отделения РАМН, г. Санкт-Петербург,

доктор биологических наук, профессор Петр Андреевич Сломинский,

Федеральное государственное бюджетное учреждение нау! «Институт молекулярной генетики» РАН, г. Москва,

доктор биологических наук, профессор Елена Сергеевна Корнилова,

Федеральное государственное бюджетное учреждение нау «Институт цитологии» РАН, г. Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН.

Защита состоится 2012 г. вТ^часов на заседании диссертационного

совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан <(//л 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.212.232.12 доктор биологических наук

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием. Частота встречаемости БП среди лиц старше 60 лет составляет 1-2 %. В то же время около 17 % случаев заболевания обнаруживается до 50 лет, т. о. поражая трудоспособную часть населения.

Развитие симптомов БП (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы) коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в стриатуме. В цитоплазме дегенерирующих нейронов обнаруживаются специфичные белковые включения — тельца Леви. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 60-80 % дофаминергических нейронов черной субстанции мозга человека.

В настоящее время БП относят к классу конформационных болезней мозга, т. е. к заболеваниям, в генезе которых лежит нарушение конформации и внутриклеточного процессинга определенного белка, приводящее к формированию белковых агрегатов, инициирующих процесс нейродегенерации. Предполагается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфа-синуклеина (SNCA), основного компонента телец Леви, приводящая к селективной гибели дофаминергических нейронов черной субстанции. Однако полностью механизм нейродегенерации при БП остается неясным. По этой причине не существует лабораторных диагностических тестов БП, и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25 %. Выяснение механизма нейродегенерации при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом одним из актуальных подходов изучения молекулярно-генетических основ БП представляется исследование моногенных форм заболевания с известной этиологией.

Открытие локусов, ответственных за развитие наследственных форм БП, в последнее пятнадцатилетие позволило по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП имеет спорадический характер, у 15 % пациентов выявляется семейная форма БП, когда заболевание имеет место у нескольких родственников из одного или разных поколений. Сегодня картировано 18 локусов, ассоциированных с БП (PARK1-PARK18) (Bekris, 2010). Доказано, что мутации по крайней мере в пяти генах определенно приводят к развитию менделирующих форм заболевания: гены альфа-синуклеина (SNCA) и обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2) ассоциированы с развитием аутосомно-доминантных форм БП, а гены паркина (PARK2), DJ1, PINK1 - с аутосомно-рецессивной формой заболевания с ранним началом (Cookson, Bandmann, 2010). К генам высокого риска БП относят ген глюкоцереброзидазы (GBA) (Hardy, 2010).

консультирования необходимо знание о спектре мутаций генов наследственных форм, характерных для данной популяции, частотах распространения данного заболевания, а также особенностях его течения. Комплексное молекулярно-генетическое исследование наследственных форм БП, с одной стороны, позволяет разработать алгоритм ДНК-диагностики наследственных форм заболевания, с другой стороны, молекулярно-генетическая характеристика наследственных форм БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией заболевания. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.

Цель исследования

Целью работы явилось молекулярно-генетическое исследование наследственных форм БП.

Задачи исследования

1. Разработать методы анализа делеций/мультипликаций гена SNCA, экзонов гена PARK2, а также точковых мутаций в гене LRRK2.

2. Выявить мутации в генах SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с БП.

3. Охарактеризовать клинические особенности течения наследственных форм БП, ассоциированных с мутациями в генах SNCA, PARK2, LRRK2, GBA. Выявить генетические факторы риска развития БП и оценить их влияние на возраст начала ¿Л/?ЛГ2-ассоциированной формы заболевания.

4. Разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственных форм БП.

5. Исследовать уровень мРНК гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.

6. Оценить апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA.

Научная новизна

Данная работа, включившая молекулярно-генетический анализ генов SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с БП, является первым комплексным исследованием генетических основ наследственных форм БП в России. Впервые описан спектр мутаций в генах LRRK2 и PARK2 у пациентов с БП в России. У пациентов с семейной формой БП впервые в мире описана мутация Т4838С (V1613A), приводящая к развитию ¿ЯЛ/Г2-ассоциированной БП с преобладающим тремором. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у пациентов с выявленными мутациями в гене LRRK2 с пациентами БП отличной этиологии с отсутствием мутаций в этом гене. Отмечено преобладание побочных эффектов от терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами в виде дистоний, дискинезий и психопатологии среди пациентов с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) в гене LRRK2. Впервые в России среди пациентов с БП выявлена форма заболевания,

обусловленная дупликацией гена SNCA. Показано, что наличие мажорных мутаций гена GBA (L444P, N370S) повышает риск развития БП в отечественной популяции.

Впервые исследована ассоциация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PONI и активности параоксоназы 1 с возрастом начала /./^^-ассоциированной БП, показано отсутствие влияния исследуемых параметров на клиническое течение ¿/УЖ?-ассоциированной БП. Впервые для отечественной популяции выявлена ассоциация аллеля G (генотипы AG и GG, rs356219) гена SNCA и генотипа АА (rsl052553) теш МАРТ с БП.

Разработаны простые методы идентификации мутаций в гене LRRK2 (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T, V1613A) на основе ПЦР и рестрикционного анализа, идентификации мутаций, связанных с изменениями копийности гена/экзонов гена в генах SNCA и PARK2 на основе количественной ПЦР в режиме реального времени. Впервые предложена схема проведения ДНК-диагностики наследственных форм БП в России.

Впервые у пациентов с ¿Л/?К2-ассоциированной формой БП проведено исследование уровня альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитах периферической крови. Показано снижение альфа-синуклеина лимфоцитов крови у пациентов с £ЛКАТ2-ассоциированной БП по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые проведена оценка апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA и выявлено повышение уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов в исследуемых группах. Показано стабильное увеличение уровня мРНК гена FAS у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП.

Теоретическое и практическое значение работы

Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах БП, в частности при наиболее распространенной 1ЛЛАГ2-ассоциированной форме заболевания, позволяет ближе подойти к пониманию патогенеза спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза БП. Проведенные исследования позволяют предположить, что снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови характеризует особенность патогенеза только LRRK2-ассоциированной БП, в то время как повышение спонтанного апоптоза лимфоцитов является более общей характеристикой, присутствующей при различных формах заболевания.

Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации G6055A (G2019S) в гене LRRK2 может быть использован в клинической практике при выявлении ¿ЛЛА"2-ассоциированных форм БП. Также в клинической практике может быть использован предложенный алгоритм проведения ДНК-диагностики наследственных форм заболевания. Проведение ДНК-диагностики наследственных форм БП может быть полезно с целью проведения дифференциальной диагностики заболевания. Выявленные в настоящем исследовании особенности течения БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA, следует принимать во

внимание при проведении медико-генетического консультирования. Проведение ДНК-диагностики пациентам с БП и членам их семей позволит осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мутация G6055A (G2019S) в гене LRRK2 является наиболее распространенной причиной развития наследственных форм БП в Северо-Западном регионе России.

2. В группе пациентов с БП, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) в гене LRRK2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении JI-ДОФА-содержащих препаратов.

3. Мутации гена GBA (L444P и N370S) играют важную роль в формировании предрасположенности к развитию БП. Наличие мутации L444P повышает риск развития БП в возрасте до 50 лет.

4. Мутации в гене PARK2 не являются значимой причиной развития БП с началом заболевания в возрасте от 40 до 50 лет.

5. Наличие мутаций в гене LRRK2 ассоциировано со снижением уровня белка альфа-синуклеина, повышением уровня мРНК гена FAS и усилением спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической крови у пациентов с БП.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002); на совещании общества «GEO-PD» (Париж, Франция, 2005); V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); XVIII Всемирном конгрессе по неврологии (Сидней, Австралия, 2005); Международной летней школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005); конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2005); конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006); 20-ом конгрессе европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Вена, Австрия, 2007), Европейской конференции по генетике человека (Ницца, Франция, 2007); на Совещании общества «GEO-PD» (Трондхейм, Норвегия, 2008); 12-ом конгрессе Европейской федерации неврологических ассоциаций (Мадрид, Испания, 2008); II Всемирном конгрессе по вопросам неврологии (Афины, Греция, 2008); I Национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения (Москва, 2008); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2008); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); 9-й Международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона (Прага, Чехия, 2009); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2009); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2010); на

1-ом конгрессе «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); Европейском конгрессе по генетике человека (Гетеборг, Швеция, 2010); 14-ом конгрессе Европейской федерации общества неврологов (Женева, Швейцария, 2010); 15-ом конгрессе Европейской федерации неврологических ассоциаций (Будапешт, Венгрия, 2011); 24-ом конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Париж, Франция, 2011), II Национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения (Москва, 2011).

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику учебной и лечебной работы ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» и ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН соответственно.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, из них 14 статей в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 монография, 4 главы в монографиях, 8 статей в сборниках и 30 тезисов.

Структура н объем работы

Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, иллюстрирована 56 рисунками и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 444 источника (49 - на русском языке и 395 - на иностранном).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных групп

В плане реализации консультативно-диагностических мероприятий в МКДЦ СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова в период с 1996 по 2006 г. было обследовано 1 200 пациентов с подозрением на БП, что сделало возможным формирование репрезентативных выборок пациентов с семейной формой БП, а также с началом заболевания до 50 лет. В исследование вошло 330 пациентов (средний возраст 63,8 ±9,8, средний возраст начала заболевания 49,0 ±10,9, 180 женщин и 150 мужчин) с четкой симптоматикой, установленным диагнозом БП с отсутствием других дегенеративных заболеваний головного мозга, не связанных узами родства, и 14 родственников пациентов (11 с диагнозом БП и 3 с отсутствием заболевания). Стадии заболевания пациентов, вошедших в исследование, соответствовали I—III степеням тяжести по Хен и Яру (Hoehn Yarh, 1967).

Отобранная для исследования группа не является случайной выборкой пациентов. При формировании группы для последующего молекулярно-генетического исследования ставилась задача собрать группу пациентов с отягощенным по БП анамнезом (наличие родственников с БП), а также формирование группы пациентов с ранним началом заболевания (начало до

50 лет включительно). В группу с семейной формой БП вошло 100 пробандов, имеющих отягощенный наследственный анамнез по БП с аутосомно-доминантным характером наследования. Характер наследования определялся при проведении клинико-генеалогического исследования. В группу со спорадической формой БП (с отсутствием семейного анамнеза заболевания) вошло 230 пациентов. Среди всех пациентов с БП, вошедших в исследование, раннее начало заболевания (<50 лет) имело 85 пациентов (средний возраст 56,4 ±7,9; средний возраст начала заболевания 44,1 ±8,2, 50 женщин, 35 мужчин).

Контрольная группа состояла из 308 индивидуумов (средний возраст 67,7 ± 8,8), состоящих на учете в Санкт-Петербургском городском гериатрическом центре. Все члены контрольной группы проходили обследование у невролога с целью исключения диагноза БП и других нейродегенеративных заболеваний. Данная выборка является случайной и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц с БП. Включенная в исследование группа пациентов не отличалась от контрольной группы по полу и возрасту.

Методы исследования

С целью исследования молекулярной этиологии наследственных форм БП нами были выбраны гены SNCA, PARK2, LRRK2, GBA и разработана стратегия поиска мутаций в этих генах у пациентов с БП (рис. 1).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. При поиске мутаций на первом этапе проводили амплификацию интересующих фрагментов ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклерах «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Россия) и iCycler (BioRad, США).

Секвенирование кодирующей области гена LRRK2 (51 экзон) проводили с использованием набора Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA) на приборе ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers (Applied Biosystems, Foster City, CA). Анализ результатов секвенирования проводился с использованием программного пакета Sequencher™ 4.14. (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) (Pchelina et ah, 2008).

Оценку мультикопийности гена SNCA и делеций/мультпликаций отдельных экзонов гена PARK2 проводили методом «дозы гена» на основе количественной ПЦР в режиме реального времени (описан в разделе «Результаты исследования») (Пчелина и др., 2012). Оценку гомозиготных делеций в гене PARK2 проводили методом мультиплексной ПЦР, амплифицируя одновременно несколько фрагментов ДНК, содержащих различные экзоны гена (Hattori et al., 1998). Поиск однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) в кодирующей области гена PARK2 был осуществлен с использованием SSCP-анализа (анализ полиморфизма конформаций однонитевой ДНК) для экзонов 2-12 (Иванова и др., 2005). Проводили электрофоретическое разделение одноцепочечных фрагментов ДНК с последующей окраской серебром (Markoff et al., 1997). Образцы с измененной

подвижностью однонитевых фрагментов ДНК секвенировали в лаборатории «Хеликс», Санкт-Петербург.

Рис. 1. Стратегия поиска мутаций в генах.SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с БП

Для выявления однонуклеотидных замен в гене LRRK2, приводящих к аминокислотным заменам R1441C/G/H, V1613A, G2019S, I2020T, I2012T, нами были разработаны методы на основе ПЦР и рестрикционного анализа (описаны в разделе «Результаты исследования»), Однонуклеотидные замены в гене GBA, приводящие к аминокислотным заменам N370S и L444P, идентифицировали методом ПЦР и рестрикционного анализа, как описано ранее (Aharon-Peretz et al., 2004). Идентификацию ОНП в генах PONI, SNCA, МАРТ проводили разработанными нами методами на основе ПЦР и рестрикционного анализа (Akhmedova (Pchelina) et al., 2001).

Уровень мРНК генов SNCA, FAS и BCL2 оценивали методом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборах ABI7000 Prism (Applied Biosystems, США) и ¡Cycler (BioRad, США). В качестве референсного гена использовали ген GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein (G белок)). В экспериментах были использованы разработанные нами олигонуклеотидные праймеры и зонды, синтезированные фирмой «Синтол», Москва. Лимфоциты выделяли из периферической крови методом градиентного центрифугирования в растворе Фиколла (р = 1,077, БиоЛот, Санкт-Петербург). Из лимфоцитов выделяли

тотальную РНК с использованием набора для выделения РНК AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad Laboratories, 94547, США) или RNeasy Mini Kit (Qiagen, 74104, США). кДНК получали методом обратной транскрипции с использованием набора ¡Script™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, США) или ¡Script™ cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва) (Усенко и др., 2012).

Уровень белка альфа-синуклеина определяли методом вестерн-блоттинга с использованием соответствующих антител (1:1000, BD Transduction Labs, США). Результаты нормировали относительно окрашивания бета-актина (1:5000, Abeam, Великобритания). Лимфоциты лизировали, количество общего белка определяли по методу Лоури с использованием соответствующего набора (Синтакон, Россия) на спектрофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США). В экспериментах использовали следующие «вторичные антитела»: для альфа-синуклеина - „rabbit anti-mouse" 1:5000, Amersham Pharmacia Biotech, США; для бета-актина - „goat anti-rabbit" IgG-H&L (HRP) 1:3000, Abeam, Великобритания. Результаты идентифицировали с использованием набора Lumigen PS-3 (GE Healthcare UK Limited, Великобритания) с использованием фотопленки KODAK BioMax. Данные вестерн-блоттинга анализировали с помощью программы ImageJ (версия 1.38а для Windows,

http://rsb.info.nih.gov/ij/) (Пчелина и др., 2010).

Активность параоксоназы 1 измеряли в плазме крови относительно субстратата параоксон (Sigma, США) на спектрофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США) согласно методу, описанному ранее (Ayub et al., 1999).

При исследовании индукции апоптоза лимфоцитов периферической крови клетки ресуспендированы в культуральной среде (RPMI-1640, 10% фетальной сыворотки, 5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин)). Для индукции апоптоза в питательную среду добавляли 2-дезокси-О-рибозу (dRib) до конечной концентрации 10 ммоль. Клеточную суспензию распределяли в лунки на плашке по 2 х 106 клеток/лунку. Клетки культивировались в С02 -инкубаторе (5 % С02, 37 °С) в течение 48 часов. Количество клеток, вошедших в апоптоз, определяли методом проточной цитофлуорометрии с использованием набора FITC ANNEXIN V APOPTOSIS DETECTION KITI (BD Pharmingen, США) на проточном цитометре Cytomics FC-500 (Beckman Coulter, США) (Пчелина и др., 2012).

Статистический анализ был проведен с использованием программы SPSS, версия 17.0. Для сравнения распределения генотипов между группами и проверки соответствия распределения генотипов равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали критерий у 2. Отношение шансов (OR) рассчитывали с 95%-м доверительным интервалом (ДИ) по формуле: OR = a/b х d/c, где а и b - количество пациентов, имеющих и не имеющих мутантный аллель, end- количество человек контрольной группы, имеющих и не имеющих мутантный аллель, соответственно. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам: ORmin = OR(1 ~''9<W¡c2) и ORmax = OR(1 + '-96Wx2), где x2 = ((a*d-bxc)- 0,5n)2 x (n - l)/(n0 x n, x m0 x m,); n, = a + b; n0 = с + d; m, = a + c; m0 = b + d; n = n, + n0 + m, + m0.

Сравнение полученных значений между отдельными группами предполагало использование непараметрического критерия Крускала-Уоллеса

для К-независимых выборок. В случае обнаружения значимых различий проводилось последующее попарное сравнение вариационных рядов исследуемых групп с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок. Значения Р < 0,05 считались статистически значимыми. Средние величины приведены с указанием стандартной ошибки среднего.

Автор выражает благодарность проф. А. Ф. Якимовскому за формирование группы пациентов, вошедших в настоящее исследование, проф. С. Н. Иллариошкину, предоставившему контрольные образцы ДНК пациентов для отработки методики, сотрудникам Национального института здоровья, США (NIA NIH) А. Синглтону (A. Singleton), Д. Миллеру (D. Miller), А. Беилиноп (A. Beilina), Дж. Брас (J. Bras), К. Панзан-Рунз (С. Paisan-Ruiz) и коллегам из Лаборатории молекулярной генетики человека ПИЯФ РАН за консультации и теоретическую помощь, а также всем пациентам, принявшим участие в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генетические основы наследственных форм БП

Ген LRRK2

В группе пациентов из 100 случаев БП с семейной формой заболевания выявление мутаций в гене LRRK2 осуществлялось следующим образом: у 85 пробандов с семейной формой БП проводилось прямое секвенирование кодирующей области гена LRRK2, включающей 51 экзон, и у 15 пробандов был проведен скрининг отдельных мутаций гена LRRK2 (R1441C/G/H, V1613A, G2019S, I2020T, I2012T) предложенными нами методами на основе ПЦР и рестрикционного анализа. Скрининг указанных мутаций был также проведен в группе со спорадической формой БП (230 пациентов) и в контрольной группе (240 человек) (Пчелина и др., 2006; Pchelina et al., 2006; Pchelina et al., 2008).

При проведении прямого секвенирования экзонов гена LRRK2 у 5 пробандов (5/85, 5,9 %) в 51 экзоне гена нами была обнаружена нуклеотидная замена гуанина на аденин в положении 6055 в гетерозиготном состоянии, приводящая к замене глицина на серии в положении 2019 (G2019S). У одного пробанда (1/85, 1,2 %) в 34 экзоне нами впервые была выявлена нуклеотидная замена тимина на цитозин в положении 4838, приводящая к замене валина на аланин в положении 1613 (V1613A) (Pchelina et al., 2008). Кроме этого, в различных экзонах гена LRRK2 нами обнаружено 15 ранее описанных однонуклеотидных замен, рассматривающихся как полиморфные варианты гена, не влияющие на развитие БП.

Для идентификации мутации G2019S нами был разработан метод на основе ПЦР с введенным сайтом рестрикции в амплифицируемый фрагмент (Pchelina et al., 2006). Результаты рестрикционного анализа визуализировали после электрофоретического разделения в УФ-свете (рис. 2).

Скрининг мутации G2019S у 15 пациентов с семейной формой БП, у 230 -со спорадической формой БП, 14 членов семей пробандов и 240 лиц контрольной группы позволил выявить мутацию у двух пробандов с семейной

формой БП и у одного - со спорадической формой заболевания. Всего нами было описано семь семей (рис. 2), в которых БП обусловлена наличием мутации 020198. Данная мутация также выявлена у одного пациента со спорадической формой БП и не обнаружена в контрольной группе. Также у одного пациента со спорадической формой БП выявлена мутация С4321Т (Ш441С) (Пчелина и др., 2006; РсЬеНпа ег" а1, 2008). Мутации 12012Т, 12020Т, Я1441 в и Ш441Н не обнаружены.

а)

III

1-1 1-2 (75)

РО

11-1

|-2

(75) ,

раз .

И-2

75(67) И , О 111-1 111-2 53(35) О 1У-1

1 1-2

1-1 11-^ (60)

111-1 | | Ш-2 Ш-З ш п 70(50) 72

РО 4

Яг

и & и Д-^п^

Ц-1 ||-2 ||-3 И-4

„, А» ¿У

111-1 Ш-2Ш-3 Ш-4 Ш-5

б) 78(59)

т а 8 с т а с г? в е « т то : т

1У-1 1У-2 т п 40 32

РО 5

1 (65)

РО 6

11-1 И-2 п т 73 78(68)

11-1 (50)

1-1 | Ш-2

54(39) <

1У-1 п 20

РО 7

11-1 И-2 т т 76(74) 74(69)

В)

Рис. 2. а) Родословные семей с БП, обусловленной мутацией 020198. Закрашенные элементы показывают членов семей с БП. Внизу элементов обозначены: генотип (ш -гетерозиготное носительство мутации 020198; п - отсутствие мутации), возраст на момент исследования и возраст начала заболевания (указан в скобках); б) хроматограмма, показывающая 06055—»А-замену, приводящую к аминокислотной замене 02019Б; в) электрофоретическое разделение продуктов рестрикционного анализа гена ¿ЯЯК2 при идентификации мутации 06055А (020198): 1 - маркер молекулярного веса рВК.322/ВзиЯ1, 2 - ПЦР-продукт, 3, 4 - гетерозиготное носительство мутации 06055А (020198), 5 - норма (РсЬеНпа е/ а1., 2006; Пчелина и др., 20116)

Частота £ЛЖ2-ассоциированной БП среди семейных форм БП составила 8 %. Наиболее распространенной являлась мутация G2019S (7 % среди семейной БП (87,5 % мутантных аллелей), 0,4 % среди спорадических форм БП). Мутации в гене LRRK2 приводят к развитию аутосомно-доминантной формы БП (Paisan-Ruiz et al, 2005). В европейских популяциях мутация G2019S обнаруживается в 5 % случаев семейной БП (75 % мутантных аллелей) и примерно в 0,5 % спорадических случаев (Giasson, Van Deerlín, 2008). Считается, что мутация R1441С является второй по частоте встречаемости и отвечает за 10 % мутантных аллелей. В нашем исследовании мутация R1441C найдена у одного пациента (0,4%) со спорадической формой БП. Таким образом, наиболее распространенной среди пациентов с БП в Северо-Западном регионе России является мутация G2019S с встречаемостью среди семейной формы БП - 7 %, что соответствует полученным в европейских популяциях частотам, а также данным по распространению этой мутации для г. Москвы (Шадрина и др., 2007). В некоторых изолированных популяциях, например среди арабов Северной Африки и евреев ашкенази, частота данной мутации среди семейных форм БП достигает 30-40 % (Ozelius et al., 2006; besage et al, 2005). В то же время мутация G2019S не обнаружена в некоторых азиатских популяциях (Fung et al, 2006; Tan et al, 2005). Интересно отметить, что все выявленные носители мутации G2019S сообщали о происхождении, связанном с евреями ашкенази, что не удивительно, принимая во внимание высокую частоту этой мутации среди данной популяции. Таким образом, из всех мутаций гена LRRK2 мутация G2019S является наиболее распространенной среди пациентов с БП и отвечает за развитие 7% случаев семейной формы заболевания в Северо-Западном регионе России.

Выявленная нами впервые мутация Т4838С (V1613A) (рис. 36) была обнаружена в гетерозиготном состоянии у пробанда и его сестры, также больной БП (рис. За), и отсутствовала в группе контроля и среди других пациентов с БП. Эта мутация расположена в функционально значимом домене LRRK2 - COR-домене (рис. Зг) и приводит к замене консервативного в эволюционном ряду аминокислотного остатка (рис. Зв). Эти результаты дают возможность предположить патогенную роль данной аминокислотной замены. Интересно, что в вышеописанном домене LRRK2 ранее была описана мутация Y1699C с клиническим проявлением, часто отличным от идиопатической БП (Zimprich

et al, 2004; Giasson, Van Deerlin, 2008). В случае мутации V1613A оба описанных нами пациента имели вариант течения БП с преобладанием тремора покоя - в их клинической картине отсутствовала ригидность скелетной мускулатуры пластического типа и брадикинезия, несмотря на длительное течение заболевания (17 и 19 лет).

Можно предположить, что мутация V1613A приводит к развитию паркинсонизма с преобладающим тремором (tremor dominant parkinsonism). Фенотипические проявления БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2, могут быть шире, чем классическая форма.

PD6 I

аЛ

В)

г)

11-1 m 79(70)

Нот о sapiens Рэп troglodytes Mus т use utus Bos taums

II-2 II-3 m 77 (GD)

сИ maqiltvkvegcp к cki maqilt vkvegcp к ckvmaqiltvkvdgcl к ckvmaqi Itvkvegfp к

S1228T

LJ-151T II I22VI S1096C 1| Q930R. S973N

тшшш'

ш-н; it: 11 s i' lit

P755L R793M

A211V K544E

|R1067Q

ANK Ш LRR

j 2527

Рис. 3. а) Родословная семьи PD8. Внизу элементов обозначены: генотип (ш -гетерозиготное носительство мутации (Т4838С) V1613A), возраст на момент исследования и возраст начала заболевания (указан в скобках); б) хроматограмма, показывающая 4838Т^С замену (V1613A): 1 - генотип дикого типа, 2 -гетерозиготное носительство. Приведен сиквенс антисмысловой цепи; в) аминокислотная последовательность области LRRK2 белка, содержащей мутацию VI61 ЗА человека, а также шимпанзе, мыши и быка; г) доменная структура LRRK2 с указанием некоторых мутаций. Мутации, определенно приводящие к развитию аутосомно-доминантной формы БП, выделены жирным. Показана локализация аминокислотной замены VI61 ЗА (указана курсивом) в функционально значимом домене LRRK2 (Pchelina el al., 2008)

Клиническое течение ¿Л/г/К-ассоциированной БП

Всего различные мутации в гене LRRK2 (G2019S, V1613A и R1441C) выявлены нами у 13 пациентов с БП. Мутации G2019S и R1441C относятся к пяти мутациям (R1441C, R1441G, Y1699C, G2919S, I2020T), рассматриваемым сегодня как безусловно патогенные (Giasson, Van Deerlin, 2008). Мутация V1613A выявлена нами впервые.

Большинство пациентов имели БП с классической триадой симптомов (акинетико-ригидно-треморная форма). Исключение составили носители

мутации У1613А и одна пациентка с мутацией 020198, у которой, несмотря на длительное течение заболевания, в качестве симптомов БП проявлялись только тремор и нарушение позы (родословная Р05, рис. 1). Необходимо отметить широкий диапазон возраста начала заболевания, наблюдаемый в настоящем исследовании даже у носителей одной и той же мутации. Наблюдаемый разброс в возрасте начала заболевания у носителей мутации 020195 составил 39 лет (от 35 до 74 лет). Сегодня очевиден широкий фенотипический полиморфизм внутри группы с БП, связанной с мутацией в гене 1Ш1К2. Так, возраст начала заболевания, а также тяжесть его течения может варьировать у носителей одной и той же мутации даже в пределах одной семьи (собственные данные (родословная Р01 на рис. 1) и результаты зарубежных исследований) (Ра1зап-Яшг ее а/., 2005; Пчелина и др., 20116).

Нами проведено сопоставление клинической картины заболевания (возраст начала заболевания, наличие в клинической картине заболевания различных симптомов БП, ответ на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами) у пациентов с 1ЛЯАГ2-ассоциированной БП и пациентов с БП отличной этиологии (группа пациентов, не имеющих мутаций в гене ЫШК2, сопоставимая с группой ¿/¿КО-ассоциированной БП по полу, возрасту, длительности заболевания и приему Л-ДОФА-содержащих препаратов) (Пчелина и др., 20116). При сравнении двух вышеуказанных групп по формам заболевания и возрасту начала заболевания достоверных отличий не выявлено. Восемь из 13 пациентов с ¿ЯЛЮ-ассоциировашюй БП и 46 пациентов из группы сравнения получали терапию препаратами Л-ДОФА. Суточная доза колебалась в пределах 200-800 мг. Положительный ответ на Л-ДОФА зарегистрирован у 87,5 % пациентов с /,/?ЛА'2-ассоциированной БП и у 78 % пациентов группы сравнения, что соответствует значениям, показанным ранее (Неа1у е! а!., 2008). Все пациенты с 1/?/?ЛГ2-ассошшрованноП БП с положительным ответом на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами являлись носителями мутации 02019Б и принимали препараты Л-ДОФА более пяти лет. Слабый ответ на терапию препаратами Л-ДОФА наблюдался у пациента с мутацией У1613А.

Таблица 1

Ответ на терапию Л-ДОФА-содержащнмн препаратами у пациентов с^Д/Г^-ассоцинровапнон БП и БП отличной этиологии (Пчелина и др., 20116)

Пациенты с ЬЯЯК2-ассоциированной БП* Пациенты с отсутствием мутаций в гене Ыи1К.2* Р

Хороший эффект терапии 7 из 8 (87,5 %) 35 из 42 (83,3) 0,87

Побочные эффекты 4 из 7 (57.1 %) 6 из 35 (17,1 %) 0,02

Дистопии 0 3 из 6

Дискинезии 2 из 4 2 изб

Психопатология 2 из 4 0

* Все пациенты получали терапию препаратами Л-ДОФА более пяти лет.

При сопоставлении частот осложнений при приеме препаратов Л-ДОФА между группами сравнения (пациенты с положительным ответом на терапию Л-ДОФА, принимающие препарат более пяти лет: 1) с мутацией G2019S и 2) с отсутствием мутаций в гене LRRK2) была выявлена повышенная частота побочных эффектов в группе с наследственной формой БП, обусловленной мутацией G2019S (OR 6,4, 95 % ДИ: 0,81-50,24, р < 0,02) (табл. 1). Повышенная частота Л-ДОФА-индуцированных дискинезий при /.ЯЛО-ассоциированной БП была выявлена также в работах зарубежных авторов (Lesage et al., 2008; Nishioka et al., 2010). Можно заключить, что БП, обусловленная мутацией G2019S LRRK2, характеризуется повышенной частотой осложнений при проведении терапии JI-ДОФА-содержащими препаратами.

Генетические факторы риска развития БП и их влияние на возраст начала ¿ДЛЯЗ-ассоциированной БП

Пенетрантность мутации G2019S LRRK2 не зависит от пола и составляет, по оценкам различных авторов, в возрасте до 59 лет 13^5 %, в возрасте до 69 лет - 21-85 % и в возрасте 79 лет - 74-100 % (Elbaz, 2008). Выявление генетических факторов, модифицирующих возраст начала LRRK2-ассоциированной БП позволит прогнозировать развитие заболевания у бессимптомных носителей мутаций в гене LRRK2 и имеет важное значение при проведении медико-генетического консультирования у таких пациентов.

В настоящее исследование по выявлению генетических факторов риска развития БП в отечественной популяции были включены наиболее значимые факторы риска развития БП (по результатам исследований по полногеномному анализу ассоциаций (GWAS)) (Li et al., 2012) - однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) в генах SNCA (rs356219) и МАРТ (rsl052553), а также варианты гена параоксоназы 1 {PONI), фермента, участвующего в детоксикации потенциальных нейротоксинов. При сопоставлении уровня активности параоксоназы 1 между носителями различных генотипов гена PONI (п = 43) нами подтверждено влияние вариантов L54M и Q191R гена PONI на активность параоксоназы 1 (Пчелина и др., 2011а), выявленное ранее (Ginsberg et al., 2009). Данные о частотах исследуемых ОНП в генах PONI, SNCA и МАРТ в группе пациентов с БП и в контроле, полученные в настоящем исследовании, указаны в табл. 2. Полученное распределение генотипов в исследуемых группах соответствовало ожидаемому согласно равновесию Харди-Вайнберга.

Нами выявлена ассоциация с БП носительства аллеля М54 (rs854560) гена PONI, носительства аллеля G (rs356219) гена SNCA и генотипа АА (rsl052553) гена МАРТ. Ассоциация различных вариантов ОНП генов SNCA и МАРТ с БП была продемонстрирована в ряде ассоциативных исследований (Maragonjre et al., 2006; Tobin et ai, 2008; Шадрина, 2011). Ассоциация аллеля G (rs356219) гена SNCA и генотипа A A (rs 1052553) гена МАРТ с БП выявлена нами впервые для российской популяции. Ранее возрастание риска развития БП при наличии указанных вариантов генов SNCA и МАРТ было продемонстрировано зарубежными авторами (Elbaz et al., 2011; Lili et al, 2012). В настоящее время ассоциация варианта М54 гена PONI с повышенным риском развития БП, выявленная нами впервые в 2001 году (Akhmedova (Pchelina) et al., 2001), подтверждена в целом ряде

исследований (ИпШгю е1 а1, 2004). Наряду с генотипами на риск развития БП оказывает также снижение активности фермента параоксоназы 1 в плазме крови (Вепшоуа1-5еяа1 е/ а!., 2005; МапАтрпщааа е/ а/., 2010).

Таблица 2

Частоты генотппов генов-кандидатов предрасположенности к БП в группе пациентов с БП н в контроле

Ген, ОНП, N (БП/контроль) БП, % Контроль, % Р

АА АВ ВВ АА АВ BR

SNCA A/G (rs356219) 224/308 38,8 47,8 13,4 50 40,9 9,1 *

МАРТ A/G (rs 1052553) 211/260 79,2 18,0 2,8 69,2 28,9 1,9 **

PONI Q191R(rs 662) 117/207 60,7 34,2 5,1 51,7 40,6 7,7 НД

PONI L54M (rs854560) 117/207 30,8 52,1 17,1 49,3 38,6 12,1 ***

1,р = 0,01.

< 1,7 [95 %С1:1.58-1.82], х2 = 5,9, df= 1, р = 0,01.

** (Ж(АА У5 АО + СЮ);

*** СЖ(ММ + МЬ уз. IX) = 2,2[95 %С1:1.52-3.14],"х2 = 10,5, (К= 1, р = 0,001. А обозначает наиболее распространенный аллель, В - редкий аллель, АА - гомозигота по наиболее распространенному аллелю, АВ - гетерозигота, ВВ - гомозигота по редкому аллелю. НД - недостоверно.

При выявлении генетических факторов, влияющих на возраст начала ¿ЛЛЮ-ассоциированной БП, пациенты с мутациями в гене LRRK2 были разделены на группы в зависимости от возраста начала заболевания (дебют до 60 лет (п = 5) и после 60 лет (п = 8)). В исследование были включены только факторы риска развития БП, значимость которых была подтверждена нами для популяции Северо-Западного региона России, а именно: ОНП генов SNCA (rs356219), МАРТ (rs 1052553), PONI (M54L, rs854560). Также было оценено влияние активности фермента параоксоназы 1, кодируемого геном PONI (Пчелина и др., 2011а). Достоверных различий в распределении исследуемых маркеров в группах сравнения не выявлено. Таким образом, показано, что варианты генов SNCA (rs356219, аллель G), МАРТ (rsl052553, генотип АА), PONI (M54L, rs854560, аллель М) повышают риск развития БП в популяции Северо-Западного региона России. Указанные генетические варианты, а также активность параоксоназы 1 не оказывают влияния на возраст начала Ш11К2-ассоциированной БП.

Ген PARK2

В исследование по поиску мутаций в гене PARK2 было включено 70 пробандов с началом БП в возрасте до 50 лет (средний возраст начала заболевания ± стандартное отклонение: 42,6 ± 7,4, диапазон возраста начала заболевания 194) лет, из них 55 (78,6 %) пациентов имели возраст начала заболевания от 40 до 50 лет). Проведена оценка гомозиготного носительства делеций экзонов методом мультиплексной ПЦР, гетерозиготного носительства

делеций/мультипликаций экзонов методом «дозы гена» на основе количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов TaqMan, а также поиск ОНП в кодирующей области гена методом SSCP-анализа и секвенирования. Разработанные нами праймеры и зонды TaqMan для проведения анализа «дозы-гена» на 11 экзонов (экзоны 2-12) гена PARK2 позволили проводить совместную амплификацию исследуемого и референсного генов в одной пробирке. В качестве референсного гена был использован однокопийный ген человека бета-глобин (ген НВВ). Исследования на приборе ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, США) с построением стандартной кривой для каждого экзона гена PARK2 и референсного гена позволяют вычислять исходную концентрацию «дозу» анализируемого образца. Значение отношения концентрации образца, полученное с использованием зонда для соответствующего экзона, нормированное на показатели, полученные для референс гена, интерпретировалась следующим образом: 0,4-0,6 -гетерозиготная делеция, 0,8-1,2 - норма (отсутствие делеции/мультипликации соответствующего экзона, 1,5 и более - гетерозиготная мультипликация экзона). Метод «дозы гена» на основе количественной ПЦР в режиме реального времени для диагностики гетерозиготного носительства делеций экзонов гена PARK2 был отработан на контрольных образцах с делецией 3 и 4 экзонов гена PARK2 в гетерозиготном состоянии трех пациентов с аутосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом (AR-JP), предоставленных нам проф. С.Н. Иллариошкиным (НЦ Неврология, Москва) (Illarioshkin et al., 2003; Shadrina et al., 2007). В анализируемой выборке пациентов с началом БП до 50 лет из 70 человек молекулярные изменения в гене PARK2 были выявлены у 8 пациентов (табл. 3) (Иванова и др., 2005; Пчелина и др., 2012). У пациента PD39 была обнаружена миссенс-мутация С1101Т в экзоне 9 гена PARK2, сцепленная с делецией пяти нуклеотидов в интроне 8 (от -21 до -17), приводящая к замене аргинина в 334 положении белка на цистеин (R334C) в одном из функциональных доменов паркина (IRB домен).

Таблица 3

Выявленные молекулярные изменения в гене РАЯК2 у пациентов с БП с началом заболевания до 50 лет (Пчелнна и др., 20126)

№ Пациент Пол Изменения в ДНК Название мутации Возраст/ возраст начала Симптомы Ответ на терапию Л-ДОФА

1 PD39 муж. С1101Т R334C 59/43 А.Р.Т. плохой

2 PD84 жен. G821C Т240Т 53/42 Т. не лечен

3 PD66 жен. G601A S167N 66/50 А.Р.Т. не лечен

4 PD90 жен. G601A S167N 49/46 А.Р.Т. не лечен

5 PD17 муж. del ехЗ del ехЗ 65/32 А.Р.Т. хороший

6 PD73 жен. del ех4, ех9, G601A del ех4, ех9, S167N 55/50 А.Т. умеренный

7 PD97 жен. del ех8 del ех8 47/44 А.Р.Т. хороший

8 PD101 жен. del ex 7 del ex 7 79/45 Т не лечен

Примечание: Т. - тремор, А. - акинезия (брадикинезия), Р. - мышечная ригидность.

Известно, что мутации в гене PARK2 приводят к развитию аутосомно-рецессивного ювенильного паркинсонизма (AR-JP). Ранее выявленная нами мутация была описана в гомозиготном состоянии у пациентов с AR-JP и не обнаружена в контрольной группе (Lucking et al., 2000). Таким образом, данную мутацию можно рассматривать как патогенную, однако в нашем случае она была выявлена в гетерозиготном состоянии, во втором аллеле мутаций не выявлено. У трех пациентов выявлена однонуклеотидная замена G601A, приводящая к замене серина в 167 положении на аспарагин (S167N). Частота мутации в анализируемой выборке составила 4,2 % (3/70). Данный вариант был описан ранее. В настоящее время считается, что мутация S167N является полиморфным вариантом гена PARK2 и не рассматривается как функционально значимая, а носительство аллеля А601 не повышает риск развития спорадических форм БП (Mclnerney et al., 2003). По данным зарубежных авторов, частота этого ОНП у пациентов с БП и в контрольной группе не отличается и составляет около 4,1 % (Lucking et al., 2003; Kay et al., 2010). У одного пациента выявлен ОНП G821C, не приводящий к аминокислотной замене (Т240Т). Нами выявлено 4 пациента с делениями различных экзонов гена PARK2. У трех делеции различных экзонов выявлены в гетерозиготном состоянии. Отсутствие родственников пациента PD73 (делеции экзонов 4 и 9) не позволяет в рамках данного исследования установить аллельную локализацию делеций. Обнаруженные нами делеции экзонов гена PARK2 приводят к сдвигу рамки считывания и образованию укороченного белка. Очевидно, в этом случае происходит потеря функциональной активности белка, так как в С-концевом домене находятся сайты связывания паркина (убиквитин-лигаза) с другим ферментом (убиквитин-конъюгирующий фермент) комплекса, осуществляющего убиквитин-зависимый протеолиз белков в клетке.

Частота мутаций в гене PARK2 в исследуемой выборке составила 7,1 % (исключены полиморфные варианты гена, а также ОНП, не приводящий к аминокислотной замене). У большинства пациентов мутаций во втором аллеле гена не обнаружено. Нужно отметить, что возраст начала большинства пациентов исследуемой выборки варьировал в диапазоне от 40 до 50 лет. Так же, как и в нашей выборке, гетерозиготное носительство мутаций гена PARK2 у пациентов с БП с началом заболевания старше 40 лет описано ранее (Hedrich et al., 2002; Lassage et al., 2008; Clark et al., 2006). Такие случаи представляют сложность для клинической интерпретации, так как до настоящего времени нет однозначности в ответе о связи БП и гетерозиготного носительства мутаций в гене PARK2. Ряд авторов склоняются к мнению, что гетерозиготное носительство мутаций в гене PARK2 может рассматриваться как фактор риска развития БП и приводить к более позднему проявлению заболевания (Foroud et al., 2003; Sun et al., 2006; Khan et al., 2005). Проведенное в 2010 году широкомасштабное исследование по оценке частоты гетерозиготного носительства мутаций в гене PARK2 среди пациентов с БП и в контроле, включавшее несколько тысяч обследованных, различий не выявило (Кау et al., 2010). В сумме, полученные данные говорят о том, что гомозиготные мутации в гене PARK2 ассоциированы с развитием БП с ранним началом (ювенильные

формы и начало до 30 лет), в то время как наличие мутаций в гетерозиготном состоянии не влияет на риск развития заболевания.

В настоящей работе впервые в России проведено исследование спектра мутаций в гене PARK2 у пациентов с БП со спорадической формой заболевания с ранним началом и показано, что он характеризуется разнообразием мутаций. Преимущественное выявление гетерозиготного носительства мутаций у пациентов со спорадической формой БП с началом заболевания в диапазоне от 40 до 50 лет затрудняет оценку клинической значимости выявляемых мутаций. Поскольку делеции и мультипликации отдельных экзонов гена PARK2 составляют не менее половины спектра выявляемых мутаций гена, разработка и совершенствование методов, позволяющих проводить их быструю и корректную детекцию, является крайне актуальной. Разработанный нами метод выявления делеций/мультипликаций отдельных экзонов гена PARK2 обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов, удобен в исполнении, имеет достаточно невысокую стоимость и может быть применен для массового скрининга.

Ген SNCA

Поиск мультипликаций гена SNCA проводился у 58 пациентов с семейной формой БП с аутосомно-доминантным типом наследования методом «дозы гена» на основе количественной ПЦР в режиме реального времени с зондами TaqMan. Скрининг мультикопийности гена с использованием праймеров и зондов на 3 экзон гена показывал в одной пробе отношение количества ДНК для гена SNCA к референсному гену (ген НВВ) в диапазоне от 1,4 до 1,6, что интерпретировалось как дупликация гена (в отличие от однокопийного гена -значения от 0,8 до 1,2).

2,5 -|----

43 (58) Норма (экзон 3) Дупликация Дупликация

(экзон 3) (экзон 6)

Рис. 4. а) Родословная пациента с дупликацией гена БЫСА. Указан возраст на момент обследования, в скобках - возраст начала заболевания; б) результаты анализа «дозы гена» для выявления мультикопийности гена ЗА'СА (Пчелина и др., 20126)

Для подтверждения результатов нами были разработаны праймеры и зонд ТаяМап на 6 экзон гена БЫСА. При проведении анализа «дозы гена» на 6 экзон

гена получаемые значения составили 1,5-1,7, в отличие от пациентов с однокопийным геном БЫСА. Таким образом, среди 58 пациентов с семейной формой БП нами выявлен один пациент с дупликацией гена БИСА (Пчелина и др., 20126). Трипликации гена выявлено не было. Пациент с выявленной мутацией (мужчина, 48 лет) имеет акинетико-ригидно-треморную форму заболевания. Дебют заболевания с 38 лет. Ответ на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами положительный. Имеются выраженные осложнения от длительного приема данных препаратов в виде дискинезии. Со слов пациента, его бабушка по материнской линии имела дрожание конечностей и затруднения в ходьбе с 60 лет (клинически не подтвержденная БП). Интересно, что тяжесть заболевания коррелирует с числом копий гена БЫСА. В отличие от трипликации, дупликация гена БЫСА обладает неполной возрастзависимой пенетрантностью (ГЬапег е/ а/., 2009) и может выявляться у пациентов со спорадической формой БП, что согласуется с отсутствием клинических симптомов заболевания у родителей пробанда в нашем исследовании.

Зарубежные исследования показали, что мультипликации гена БМСА являются более частой причиной развития наследственных форм БП, чем точковые мутации гена, и выявляются с частотой 1,5-1,8 % среди семейных форм БП в различных популяциях (N¡51110143, 2006; Шапег е1 а!., 2009). Анализ мультипликации гена БЫСА у 61 пациента с семейной формой БП в Москве не выявил носителей мутации (Семенова и др., 2009). Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что дупликации и трипликации гена Б КС А являются редкой причиной развития БП в России.

Ген вВА

Гомозиготное носительство мутаций в гене ОБА приводит к развитию редкой патологии, относящейся к болезням обмена - болезни Гоше. Увеличение риска развития БП в 5-6 раз для гетерозиготных носителей мутаций в гене йВА показано для различных популяций (Г>еРао1о е( а!., 2009). В ряде популяций в спектре мутаций гена СБА выявляются мажорные мутации -А1226С (N3705) и Т1448С (Ь444Р) (Уе1ауа1! е/ а1., 2010). Эти же мутации превалируют в спектре мутаций гена ОБА среди пациентов с болезнью Гоше в России, составляя 45 и 23 % мутантных аллелей соответственно (Букина, 2005). В настоящем исследовании проведен скрининг мутаций Ь444Р и N3708 среди 330 пациентов с БП и 240 лиц контрольной группы. Полученные частоты указаны в табл. 4.

Нами выявлено 9 носителей мутаций гена ОБА в гетерозиготном состоянии среди пациентов с БП (6 - мутации Ь444Р и 3 - мутации N3708) и 1 носитель мутации Ь444Р в контрольной группе (Ете1уапоу е! а1., 2011). ОЯ развития БП для носителей мутаций Ь444Р и N3708 составил 6,7. В подгруппе пациентов с БП с ранним началом (начало заболевания до 50 лет включительно), а также среди пациентов с семейной формой БП была выявлена только мутация Ь444Р. Риск развития семейных форм БП для носителей мутации Ь444Р возрастал более чем в 7 раз, а риск развития БП с ранним началом - в 15 раз. В нашей выборке пациентов с БП мутация Ь444Р встречалась чаще, чем мутация N3708, что соответствовало результатам, полученным ранее в зарубежных

исследованиях для популяций, отличных от популяции евреев ашкенази (Velayati et al., 2010).

Таблица 4

Частоты мутаций N370S и L444P у пациентов с БП и в контрольной группе (Emelyanov et al., 2011)

Пациенты с БП (N = 330) БП с началом заболевания <50 лег (N = 85) Семейная форма БП (N=100) Контрольная группа (N = 240)

L444P 6(1,8%) 5 (5,9 %) 14,9 (2,9-77,0) р = 0,001* 3 (3,0 %) 7,4(0,4-156,9) р = 0,044* 1 (0,4 %)

N370S 3 (0,9 %) 0 0 0

L444P+N370S 9 (2,7 %) 6,7 (1,05-12,4) р = 0,038*

* Отношение шансов (95 % ДИ), р - значение достоверности.

Повышенный риск развития БП для носителей анализируемых мутаций в гетерозиготном состоянии был ранее выявлен в ряде популяций, включая Италию, Бразилию, Китай, а также среди евреев ашкенази (Aharon-Peretz et al., 2004; De Marco et al., 2008; Mata et al., 2008; Velayati et al., 2010). В ряде исследований детекция мутаций в гене GBA проводилась путем прямого секвенирования кодирующей области гена (Clark et al., 2007; Neumann et al., 2009; Bras et al., 2009). Во всех исследованиях, риск развития БП у носителей мутаций в гене GBA возрастал примерно в 5 раз, что сопоставимо с 6-кратным увеличением риска развития БП, полученным нами для носителей мутаций гена GBA в настоящем исследовании.

Клиническое течение БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA, не отличалось от пациентов с БП с отсутствием мажорных мутаций в этом гене (также с отсутствием мутаций в гене LRRK2). В нашем исследовании частота мутации L444P была максимальна среди пациентов с началом заболевания до 50 лет. Риск развития БП с началом до 50 лет у носителей мутации L444P возрастает в 15 (!) раз. Интересно, что мутация N370S выявлена нами только у пациентов с началом заболевания в возрасте старше 50 лет. Возможно, это объясняется тем, что при аминокислотной замене N370S остаточная активность фермента глюкоцереброзидазы выше, благодаря чему этот вариант ассоциирован с мягким течением заболевания у пациентов с болезнью Гоше, в то время как вариант L444P в гомозиготном состоянии ассоциирован с тяжелой неврологической формой заболевания (Gupta et al., 2011).

Алгоритм проведения ДНК-диагностнки наследственных форм БП

Настоящее исследование является одним из самых больших по объему проведенных на сегодня исследований по выявлению генетических основ развития наследственных форм БП в России. В исследование включено два гена аутосомно-доминантных форм БП (гены SNCA и LRRK2), ген аутосомно-

рецессивной БП с ранним началом (ген PARK2), а также ген высокого риска развития БП - ген GBA. В ходе исследования собран банк ДНК, включающий образцы ДНК от 100 пробандов с наследственными формами БП.

Полученные нами данные дают основание предполагать, что гомозиготное носительство мутаций в гене PARK2 является редкой причиной развития спорадических случаев БП с ранним началом. Также редкой причиной развития семейных форм БП являются мультипликации гена SNCA. Исследование мутаций в этих генах при проведении ДНК-диагностики БП нецелесообразно. Нужно, однако, отметить, что в наше исследование были включены единичные пробанды с возрастом начала заболевания в интервале от 20 до 30 лет. Основываясь на данных зарубежных авторов, поиск мутаций в гене PARK2 следует включать в исследование при проведении ДНК-диагностики пациентам с ранним началом заболевания в возрасте до 30 лет (Klein, Djarmati, 2011). Мутации в гене PARK2 были ранее выявлены у отечественных пациентов с аутосомно-рецессивной ювенильной формой БП (Illarioshkin et al., 2003).

Молекулярно-генетическое обследование пациентов с болезнью Паркинсона

. I I

Семейные формы Семейные и спорадические формы

I I

Скрининг мутации G2019S Скрининг мутаций L444P и N370S LRRK2 GBA

Методы: ПЦР, Методы: ПЦР, рестрикционный рестрикционный анализ анализ

Молекулярно-генетическое обследование родственников пациентов с выявленными мутациями Медико-генетическое консультирование

I I

Особенности клинического Особенности клинического

течения: мутации в гене ЬЛЯК2 течения: мутации в гене СБА -

приводят к развитию аутосомно- фактор высокого риска

доминантной формы болезни развития болезни Паркинсона.

Паркинсона с возрастзавнсимой Мутация Ь444Р существенно (в

пенетрантностью, повышенная 15 раз!) повышает риск

частота осложнений при терапии развития заболевания в

Л-ДОФА возрасте до 50 лет

Рис. 5. Алгоритм молекулярно-генетического исследования с целью диагностики БП и проведения медико-генетического консультирования

Наиболее частой причиной развития БП в Северо-Западном регионе России являются мутации в гене 1М1К2 (8 % всех случаев с семейной формой БП). При этом выявляется мажорная мутация 020198 (7 % всех случаев с семейной формой БП). В европейских странах распространенность 020198-ассоциированной БП имеет тот же уровень и составляет 5 % (О!аз5оп, Уап

БеегНп, 2008). Проведенное нами секвенирование кодирующей области гена показало крайне низкую частоту других мутаций гена 1КЯК2 среди пациентов с наследственными формами БП. Таким образом, учитывая широкое распространение мутации 020198 среди семейных форм БП в России, следует рекомендовать скрининг мутации 020193 ЬЯШ2 среди пациентов с БП, сообщающих о положительном семейном анамнезе заболевания (рис. 5).

При проведении медико-генетического консультирования пациентов и их родственников (в том числе бессимптомных носителей мутации) следует принимать во внимание зависимую от возраста пенетрантность мутаций и выявленную в настоящем исследовании повышенную частоту осложнений при терапии препаратами Л-ДОФА. В настоящее время нет показаний по изменению схемы лечения пациента с диагнозом БП при выявлении у него мутации в гене ЬШК2 (Неа1у е/ а!., 2008). С другой стороны, относительная распространенность С20 ^-ассоциированных форм БП среди семейных случаев заболевания (теоретическая частота данной формы БП в популяции составляет 5 случаев на 100 000 человек, что сравнимо с распространенностью другого наследственного заболевания нервной системы - хореи Генгтингтона) впервые дает возможность исследования репрезентативных групп пациентов с однородной этиологией заболевания, что, несомненно, подчеркивает научную важность проведения ДНК-диагностики пациентам с семейной формой БП. Выделение групп риска развития БП дает неврологам шанс подбора терапии, способной отодвинуть клиническое проявления болезни. Рост числа пациентов с выявленной молекулярной этиологией (в том числе на доклинической стадии заболевания) будет способствовать развитию новых подходов к диагностике, профилактике и лечению БП.

В исследуемой выборке пациентов мутации в гене СБА распространены с частотой, сопоставимой с распространенностью мутации 020198 ЬШ1К2 среди пациентов с семейной формой БП. В общей выборке пациентов суммарная частота мажорных мутаций гена СБА (Ь444Р, N3708) составила 2,7 %, в то время как частота мутации Ь444Р среди пациентов с началом заболевания до 50 лет практически достигала 7 %. Мутации в гене СБА являются значимым фактором риска развития БП во многих популяциях, повышая риск развития заболевания в 5-6 раз ^¡ёгапзку е/ а1, 2009). В настоящем исследовании риск развития ранних форм БП у носителей мутации Ь444Р возрастал в 15 раз! Учитывая высокие риски развития БП у носителей мутаций в гене СБА, следует рекомендовать включение скрининга мутаций в предлагаемую нами схему проведения молекулярно-генетических исследований с целью диагностики БП (рис. 5). Очевидно, что клиническое применение генетического тестирования БП поднимает ряд этических вопросов.

В настоящее время БП остается неизлечимым заболеванием. В число возможных негативных последствий генетического скрининга входят: психологический стресс, вызванный информацией, которую нельзя использовать для определенного личного выбора, трудно понять и интерпретировать; чрезмерное давление на личный выбор со стороны общества, врачей, членов семьи; неправомерное использование информации и дискриминация на основании результатов теста при использовании данных

третьими сторонами, например работодателями. При проведении генетического консультирования и скрининга следует придерживаться ключевых определенных принципов медико-генетического консультирования (Ижевская,

Молекулярные характеристики лимфоцитов периферической крови пациентов с мутациями в генах LRRK2 и GBA

Уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с ¿ÄÄÄ^-ассоцнированной БП

Современные представления о нейроиммунных взаимодействиях дают возможность предположить, что лимфоциты периферической крови могут отражать нарушения обменных процессов при нейродегенеративных заболеваниях, в частности благодаря схожести путей синтеза и обмена дофамина (Cosentino et al, 1999; Marazziti et al, 2008). Простота получения биоматериала способствует росту исследований, использующих лимфоциты периферической крови в качестве объекта исследования при изучении механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний.

В настоящее время нет полного представления о физиологической роли белков, аномальная работа которых приводит к развитию наследственных форм БП. Остается также неизвестным, оказывают ли влияние мутации в генах наследственных форм БП на метаболизм альфа-синуклеина и индукцию апоптоза.

Исследование уровня мРНК гена SNCA и уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови проведено в трех группах: 1) пациенты с мутациями в гене LRRK2 (Bn-LRRK2); 2) пациенты со спорадической формой БП (сБП); 3) контрольная группа (контроль). Все исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и полу. В группе пациентов со сБП были исключены мутации в гене LRRK2 и мультипликации гена SNCA. Группы Bn-LRRK2 и сБП не отличались по количеству пациентов, принимающих препараты Л-ДОФА.

Уровень мРНК гена SNCA определяли в лимфоцитах периферической крови 7 пациентов с ¿Л/г/£2-ассоциированной БП (6 - с мутацией G2019S, 1 -с мутацией V1613A), 15 пациентов со сБП и 15 индивидуумов контрольной группы методом количественной ПЦР в режиме реального времени с зондами TaqMan. Различий в уровне экспрессии гена SNCA между группами не выявлено. Также различий не было выявлено при исследовании отдельно пациентов с мутацией G2019S. Для пациентов со сБП в ряде предыдущих исследований также не выявлено различий в уровне мРНК гена SNCA по сравнению с контролем (Tan et al, 2005; Fuchs et al., 2008).

Уровень белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови был определен у 8 пациентов с L/í/iO-ассоциированной формой БП (6 - с мутацией G2019S, 2-е мутацией V1613A), у 34 пациентов со сБП и у 23 лиц контрольной группы методом вестерн-блоттинга. На блотах наблюдали одну зону, соответствующую мономерному белку альфа-синуклеину (рис. 6). Нами выявлено достоверное снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в группе пациентов с En-LRRK2, а также в группе

пациентов с мутацией 020198 по сравнению как с группой со сБП, так и с контролем (рис. 7). При этом значения среднего уровня белка между группами сБП и контроля не отличались (Пчелина и др., 2010).

EIILRKK2 G2019S

сБП

Контроль

Рис. 7. Относительный уровень альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови в исследуемых группах: BÜ-LRRK2 - пациенты с £ЯЛ£2-ассоциированной БП (п = 8), G2019S - пациенты с мутацией G6055A (G2019S) (п = 6), сБП - пациенты со спорадической БП (п = 34) и контрольная группа (п = 23): *р = 0,03 при сравнении со сБП, р = 0,01 при сравнении с контролем; **р = 0,02 при сравнении со сБП, р = 0,03 при сравнении с контролем (ось абсцисс - исследуемые группы; ось ординат -относительное среднее количество белка (o.e.)) (Пчелина и др., 2010)

За последние семь лет проведен ряд исследований по оценке возможности использования уровня периферического альфа-синуклеина в качестве прогностического маркера развития БП (Eller, Williams, 2011). В этой связи

Альфа-

синуклеин

(19кДа)

g О.»-

il «

Г" я

>в s s **

1 I î §•

Ë "

о «

5 i

о «

Бета-актин (42кДа)

12 3 4

Рис. 6. Результат вестерн-блоттинга: 1 - носитель мутации С6055А (020198); 2 -пациент со сБП; 3 - индивидуум контрольной группы; 4 - рекомбинантный белок альфа-синуклеин (Пчелина и др., 2010)

предпринимались попытки сопоставления уровня альфа-синуклеина клеток крови и физиологических жидкостей (СМЖ, плазма) в группах пациентов со сБП и контроле. Аналогично полученным нами данным ряд авторов отмечал вариабельность уровня альфа-синуклеина клеток крови и отсутствие различий в уровне мономерного альфа-синуклеина между пациентами со сБП и контрольной группой (Michell et al., 2005; Fuchs et al., 2008; Brighina el al., 2010).

Нами впервые исследован уровень альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 и показано снижение альфа-синуклеина лимфоцитов крови у данных пациентов на фоне неизмененной экспрессии гена SNCA по сравнению как с группой пациентов со сБП, так и с контрольной группой (Пчелина, 2011а). В том числе аналогичные результаты получены нами для пациентов с наиболее часто выявляемой мутацией G2019S. Ранее показана способность белка LRRK2 регулировать транскрипцию гена SNCA (Carballo-Carbajal et al., 2010). Выявленное нами снижение уровня альфа-синуклеина у пациентов с мутациями в гене LRRK2 нельзя объяснить влиянием LRRK2 на транскрипцию гена SNCA, поскольку мы не наблюдали снижения уровня мРНК гена SNCA у пациентов с ¿/?&К2-ассоциированной БП. Полученные результаты скорее позволяют предположить изменения на посттрансляционном уровне.

LRRK2 является мультидоменной протеинкиназой. В ряде исследований показано, что мутация G2019S, локализованная в киназном домене LRRK2, повышает киназную активность LRRK.2 (Smith et al., 2006, Jaleel et al., 2007). В одном исследовании продемонстрировано фосфорилирование рекомбинантного альфа-синуклеина лизатом клеток с гиперэкспрессией гена LRRK2 (Qing et al., 2009), в то время как данных о прямом участии LRRK2 в фосфорилировании альфа-синуклеина не получено. Нельзя, однако, исключить накопление фосфорилированных форм альфа-синуклеина или его агрегатов у пациентов с мутациями в гене LRRK2. Суммируя результаты зарубежных исследований и настоящей работы, можно предположить, что уровень мономерпого альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови зависит от этиологии заболевания и не может быть использован как прогностический маркер развития БП.

Апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA

С целью оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови в группах пациентов нами был определен уровень спонтанного и индуцированного (10 ммоль 2-дезокси-0-рибоза (dRib)) апоптоза, а также маркеров апоптоза (уровень мРНК генов FAS и BCL2). Уровень спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови определяли у четырех пациентов с мутациями в гене LRRK2 (группа En-LRRK2: 3 пациента с мутацией G2019S, 1 - с мутацией V1613A), у 2 пациентов с мутациями в гене GBA (БП-GBA: 1 - с мутацией L444P, 1 - с мутацией N370S), у 9 пациентов со спорадической формой БП (сБП) и в контрольной группе, состоящей из 9 человек с отсутствием неврологических заболеваний. Группа пациентов с различными формами БП не различались по доле пациентов, принимающих препараты Л-ДОФА. Оценку апоптоза проводили на проточном цитометре путем двойного

окрашивания клеток на аннексии V - Р1ТС и пропидиум иодидом через 1, 24 и 48 часов инкубации лимфоцитов. У лиц со спорадической формой БП были исключено наличие наиболее распространенных мутаций в генах ЬЯЯК2 и СБА (мутации 020195, Я1441С/0/Н, 12020Т, 12012Т, У1613А и Ь444Р, N3708 соответственно), а также мультипликации гена SNCA.

При оценке спонтанного апоптоза нами выявлено достоверное увеличение количества лимфоцитов, вошедших в апоптоз, во всех исследуемых группах пациентов с БП по сравнению с контролем (табл. 5).

Таблица 5

Уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови в исследуемых группах (Усенко и др., 2012)

Группа (Ы) Уровень апоптоза (%), Р*

1ч 24ч 48 ч

БП-ЫШС2 6,2 ± 4,5 9,9 ± 3,3 10,3 ±3,1

(п = 4) р = 0,02 р = 0,03

БП-ОВА 10,5 ±2,4 7,1 ±3,7 9,0 ± 0,6

(п = 2) р = 0,03

сБП 4,4 ± 2,4 8,9 ±3,1 8,4 ± 2,9

(п = 9) Р = 0,01

Контроль (п = 9) 3,3 ±2,0 4,8 ± 2,4 6,4 ±3,3

* Указан процент клеток, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза от общего количества клеток; р - достоверность отличий при сравнении с контролем.

У пациентов с мутациями в гене СБА усиление спонтанного апоптоза наблюдалось через 1 час, в группе пациентов с мутациями в гене ЬЯЯК2 - через 24 и 48 часов. После 24 часов инкубации лимфоцитов по сравнению с контролем нами выявлено достоверное повышение уровня спонтанного апоптоза также в группе сБП (Пчелина и др., 2012). а) 6)

10г-

ю1

= 31 : о.1% 32 1.0% ю»! 10- . Е Ю'1 10% 31 0.1% 32 0.4%

-вз ^ 89.7% ... 34 -9.2% вз Як* 34 2.2%

......1Ь»......1 )<......1Ьг'' 1оэ '""й»......1 а1......Л2' ' ш-'

Рис. 8. Пример цитограмм спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови через 24 часа инкубации: а) пациент с мутацией 02019Э ЫШК2; б) контроль. Правый нижний квадрат - клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза (Аппехт-У /РГ). Правый верхний квадрат - поздний апоптоз (Аппехт-У+/Р1+) (Усенко и др., 2012)

В качестве примера на рис. 8 представлены цитограммы, полученные при исследовании спонтанного апоптоза лимфоцитов пациента с мутацией G2019S LRRK2 и индивидуума контрольной группы.

В нашем эксперименте уровень индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови достоверно возрастал по всех исследованных группах по сравнению с уровнем спонтанного апоптоза (при сравнении с уровнем спонтанного апоптоза через 48 часов культивирования лимфоцитов в стандартных условиях) (р < 0,05). Однако степень индукции была различной. Уровень апоптоза возрастал: в группе БП-1ЛШК2 - в 3,1 раза, в группе БП-GBA -в 2,9 раза, в группе сБП - в 4,9 раза и в контрольной группе - в 6,2 раза. Таким образом, лимфоциты пациентов с наследственными формами БП (мутации в генах LRRK2 и GBÄ) проявляли наименьший ответ на индукцию апоптоза. При этом достоверных отличий между группами в уровне индуцированного апоптоза не наблюдали.

Известно, что апоптоз индуцируется преимущественно через внешний (рецепторный) и внутренний (митохондриальный) пути. С целью выявления преимущественного пути активации апоптоза при наличии мутации в гене LRRK2 нами проведена оценка уровня экспрессии генов наиболее важных регуляторов апоптоза (поверхностный рецептор Fas (CD95, АРО-1) и ингибитор апоптоза белка Вс1-2) у пациентов с 1Л/?А'2-ассоциированной БП. Рецептор Fas является поверхностным белком, индуцирующим гибель клеток путем связывания Fas с Fas-лигандом и активации рецепторного пути апоптоза. Вс1-2 регулирует клеточную смерть, контролируя проницаемость митохондриальной мембраны, предотвращая высвобождение цитохрома С из митохондрий и ингибируя митохондриальный путь апоптоза.

Уровень мРНК генов FAS и BCL2 был оценен в группе пациентов с мутациями в гене LRRK2 (Bn-LRRK2) (5 пациентов с мутацией G2019S, 1 - с мутацией V1613A), у б пациентов со спорадической БП (сБП) и у 10 индивидуумов контрольной группы (контроль 1). Длительное наблюдение пациентов с 1ЛЛАГ2-ассоциированной БП в СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова позволило осуществить повторный забор периферической крови у тех же пациентов с мутациями в гене LRRK2 (3 пациента с мутацией G2019S, 1 - с мутацией V1613A) и оценить уровень мРНК гена FAS у носителей мутаций гена LRRK2 с интервалом в три года. В исследования вошла вновь сформированная контрольная группа (контроль 2), состоящая из 9 человек. Все исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и полу. Исследования, проведенные в 2007 году, выявили повышение уровня мРНК гена FAS лимфоцитов периферической крови в группе Bn-LRRK2 по сравнению как с группой сБП, так и с контрольной группой (рис. 9а). При этом изменений в уровне мРНК гена BCL2 между исследуемыми группами не наблюдалось. Повторный забор периферической венозной крови у тех же пациентов через три года и повторное измерение уровня мРНК гена FAS выявило достоверное увеличение уровня мРНК гена FAS у пациентов с ¿ЯЛАЗ-ассоциированной БП по сравнению с контролем (рис. 96). Таким образом, нами выявлено стабильное увеличение экспрессии гена FAS у пациентов с 1ЛЛО-ассоциированной БП (Усенко и др., 2012).

Нами впервые проведено исследование апоптоза лимфоцитов крови у пациентов с мутациями в генах ЬЯЯК2 и вВА. Ранее повышенный апоптоз лимфоцитов был выявлен у пациентов с мутациями в гене БЫСА (ВаП1з11 С. е/ а/., 2007). В цитируемое исследование было включено два сибса с мутацией А53Т, в группу сравнения входило пять человек с отсутствием неврологических заболеваний. Достоверные различия в количестве клеток, вошедших в апоптоз, между пациентами и контрольной группой наблюдались через 24, 48 и 72 часа при инкубации лимфоцитов как в присутствии индуктора апоптоза (10 ммоль (ЖШ), так и без него.

БП I.RRK2 сБП контроль!

БП LRRK2 контроль 2

Рис. 9. Уровень мРНК гена FAS лимфоцитов периферической крови в исследуемых группах: а) исследования 2007 года; б) исследования 2010 года (ось абсцисс -исследуемые группы; ось ординат - относительное среднее количество мРНК гена FAS (o.e.)) (Усенко и др., 2012)

При этом интересно наблюдение авторов о том, что индукция апоптоза происходила значительно сильнее в контроле, чем у пациентов с мутацией в гене SNCA, что полностью согласуется с полученными нами данными о менее выраженной индукции апоптоза у пациентов с мутациями в генах LRRK2 и GBA. Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что пациенты с БП, обусловленной мутациями в генах SNCA и LRRK2, имеют повышенный уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, но большую «сопротивляемость» окислительному стрессу, вызванному присутствием 2-дезокси-0-рибозы.

Учитывая наблюдаемый нами повышенный уровень экспрессии гена FAS (при отсутствии изменений в экспрессии гена BCL2) и повышенный спонтанный апоптоз лимфоцитов у пациентов с ¿^^¿-ассоциированной формой БП, можно предположить, что мутации в гене LRRK2 приводят к предпочтительной активации внешнего пути апоптоза. Механизм влияния мутантной формы LRRK.2 на жизнедеятельность и гибель клеток остается малоизученным. Изучение функций LRRK2 осложняется отсутствием представлений о физиологических субстатах этой киназы. В экспериментах

in vitro было показано, что экспрессия мутантной LRRK2 (мутация G2019S) вызывает индукцию апоптоза и гибель клеток (Smith et а!., 2006). Позднее, также в исследовании in vitro, было продемонстрировано взаимодействие LRRK2 с белком FADD (Fas-associated death domain), приводящее к активации внешнего пути апоптоза (Но et al., 2009).

Изменение маркеров апоптоза неоднократно выявлялось в лимфоцитах периферической крови у пациентов со спорадической формой БП. Так, в различных исследованиях было выявлено снижение уровня BCL-2, увеличение FAS, возрастание уровня активных каспаз 3, 8 и 9 (Blandini et al., 2003; Kim et al., 2004). В настоящем исследовании нами получены данные об усилении спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов со спорадической формой БП по сравнению с контролем. Ранее аналогичные результаты получены в работах отечественных и зарубежных исследователей (Calopa et al., 2010; Внуков и др., 2011). Полученные нами результаты, а также данные зарубежных исследователей, свидетельствуют об усилении апоптоза лимфоцитов периферической крови при БП. Как показано в настоящем исследовании, повышенный спонтанный апоптоз лимфоцитов наблюдается при различных формах БП, т. е. не зависит от этиологии заболевания. Предполагается, что выявляемые изменения могут отражать индукцию апоптоза в нейронах мозга. Поскольку изменение уровня апоптоза лимфоцитов крови может наблюдаться при различных заболеваниях (Григорьев и др., 2003; Варга, 2007; Rosen, Casciola-Rosen, 1999; Salmon, Gordon, 1999; Fried'lander' 2003), повышение апоптоза лимфоцитов не может являться селективным маркером БП.

Заключение

Настоящее исследование направлено на изучение молекулярно-генетических основ наследственных форм БП и выявление особенностей их патогенеза. В работе была изучена частота мутаций генов наследственных форм БП (гены PARK2, SNCA и LRRK2), а также гена высокого риска развития БП, гена GBA, среди пациентов с БП Северо-Западного региона России и предложен алгоритм проведения ДНК-диагностики БП и последующего медико-генетического консультирования. Выделение групп высокого риска развития БП дает неврологам шанс подбора терапии, способной отодвинуть клинические проявления болезни, а также будет способствовать развитию новых подходов к диагностике заболевания. С другой стороны, относительная распространенность БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA, впервые дает возможность исследования репрезентативных групп пациентов с однородной этиологией заболевания, что, несомненно, подчеркивает научную важность проведения ДНК-диагностики пациентам с семейной формой БП. Выявленные нами нарушения в лимфоцитах крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной БП могут отражать нарушение обменных процессов при данной форме заболевания.

Выводы

1. Частота мутаций в гене LRRK2 среди семейных форм болезни Паркинсона в Северо-Западном регионе России составляет 8 %. В спектре мутаций гена LRRK2 преобладает мутация G6055A (G2019S) (85,5 % аллелей). Впервые выявленная мутация V1613A приводит к болезни Паркинсона с преобладающим тремором. Наличие мутации G6055A (G2019S) в гене LRRK2 характеризуется высокой частотой осложнений при терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами в виде дистоний, дискинезий и психопатологии.

2. Мутации в гене GBA (L444P и N370S) являются факторами высокого риска развития болезни Паркинсона. Наибольший эффект оказывает мутация L444P На риск развития болезни Паркинсона с началом до 50 лет.

3. Спектр мутаций гена PARK2 у пациентов с началом болезни Паркинсона в возрасте до 50 лет характеризуется уникальностью вариантов. Мутации выявляются преимущественно в гетерозиготном состоянии, что затрудняет оценку их клинической значимости.

4. Дупликации гена SNCA являются редкой причиной развития семейных форм болезни Паркинсона в Северо-Западном регионе России.

5. Варианты генов SNCA (аллель G rs356219), МАРТ (генотип АА rsl052553), PONI (аллель М54, rs854560) ассоциированы с риском развития БП в Северо-Западном регионе России. Указанные варианты, а также активность параоксоназы 1 не влияют на возраст начала ¿ЛЯ/Г2-ассоциированной болезни Паркинсона.

6. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2, характеризуется снижением уровня белка альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови по сравнению со спорадической формой заболевания и лицами без неврологических заболеваний при отсутствии изменений уровня мРНК гена SNCA.

7. Повышение уровня спонтанного апоптоза является общей характеристикой лимфоцитов периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона и выявляется как у пациентов с болезнью Паркинсона, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA, так и у пациентов со спорадической формой заболевания. В лимфоцитах крови пациентов с LRRK2-ассоциированной болезнью Паркинсона наблюдается стабильное повышение экспрессии гена FAS.

8. Предлагаемый алгоритм молекулярно-генетического исследования позволяет проводить молекулярную диагностику наследственных форм болезни Паркинсона. Выявленные особенности клинического течения болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA, следует учитывать при проведении медико-генетического консультирования пациентов.

Практические рекомендации

1. Для выявления наследственной аутосомно-доминантной формы болезни Паркинсона показано тестирование мутации G2019S LRRK2 у пациентов с семейной формой заболевания в качестве дополнительного диагностического теста. Молекулярно-генетическое обследование родственников пациентов с выявленной мутацией позволит выявить больных с болезнью Паркинсона на предклинической стадии заболевания.

2. При проведении медико-генетического консультирования носителей мутации G2019S LRRK2 следует принимать во внимание зависимую от возраста пациента пенетрантность этой мутации, а также повышенный риск развития осложнений при проведении терапии Л-ДОФА.

3. Для выявления больных с высоким риском развития болезни Паркинсона целесообразно проводить скрининг мажорных мутаций в гене GBA (L444P и N370S) среди пациентов с различными формами заболевания (семейные и спорадические). При выявлении мутации в гене GBA у пациента рекомендовано молекулярно-генетическое обследование родственников пациента.

4. При проведении медико-генетического консультирования у носителей мутаций в гене GBA следует учитывать большой риск развития болезни Паркинсона в возрасте до 50 лет при наличии мутации L444P.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Монографии, главы в монографиях

Х.Горбунова В. К, Пчелина С. Н., Шварцман А. Л. Введение в молекулярную медицину. СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2011.214с.

2. Пчелина С. Н., Якимовский А. Ф„ Горбунова В. Н. Болезнь Паркинсона, паркинсонизм. В кн.: Молекулярная неврология. - Т. П. / В. Н. Горбунова, Е. А. Савельева-Васильева, В. В. Красильников. СПб.: Интер-медика, 2002. С. 111-150.

3. Пчелина С. Н. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене лейцинбогатой киназы 2: распространенность, диагностика, патогенез. В кн.: Нейродегенеративные заболевания. Фундаментальные и прикладные аспекты / под ред. акад. М. В. Угрюмова. М.: «Наука», 2010. С. 153-162.

4. Пчелина С. Н., Усенко Т. С., Боганькова Н. А., Якимовский А. Ф., Емельянов А. К, Дроздова А. С., Вавилова Т. В., Шварцман А. Л. Механизм клеточной гибели при LRRK2-accomiHpoBaHiroft болезни Паркинсона. В кн.: Болезнь Паркинсона и расстройства движений. Руководство для врачей / под ред. С. Н. Иллариошкина, О. С. Левина. М.: ЗАО «Серебряные нити», 2011. С. 33^0.

5. Якимовский А. Ф„ Иванова О. Н., Емельянов А. К, Пчелина С. Н. Особенности клинического течения болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене LRRK2. В кн.: Болезнь Паркинсона

и расстройства движений. Руководство для врачей / под ред. С. Н. Илла-риошкина, О. С. Левина. М.: ЗАО «Серебряные нити», 2011. С. 20-32.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОН России

6. Akhmedova (Pchelina) S., Yakimovsky A., Schwartz E. Paraoxonase 1 Polymorphism Met-Leu 54 Is Associated with Parkinson's Disease // J. Neurol. Sci. 2001. V. 184. P. 179-182.

7. Пчелина С. H., Якшювский А. Ф„ Шварц Е. И. Наследственные основы болезни Паркинсона// Медицинская генетика. 2003. Т. 9. С. 411-425.

8. Иванова О. Н„ Якшювский А. Ф„ Пчелина С. Н. Молекулярно-генетический анализ ранних форм болезни Паркинсона // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 2005. Т. XII, № 4. С. 105-106.

9. Пчелина С. //., Иванова О. Н., Емельянов А. К., Якимовский А. Ф., Шварцман А. Л. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Медицинская генетика. 2006. Т. 5, № 2. С. 48-51.

10. Pchelina S. N.. Yakimovskii A. F., Ivanovo О. N.. Emelianov А. К., ZakharchukA. Н„ Schwarzman A. L. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson's Disease in Russia // Mov. Disord. 2006. V. 21, № 12. P. 2234-2236.

11. Pchelina S. N., Yakimovskii A. F., Emelyanov A. K., Ivanovo O. N., Schwarzman A. L„ Singleton A. B. Screening for LRRK2 Mutations in Patients with Parkinson's Disease in Russia: Identification of a Novel LRRK2 Variant // Eur. J. Neurol. 2008. V. 5. P. 692-696.

12.Пчелина С. П., Емельянов А. К., Якимовский А. Ф., Миллер Д. В., Шабалина И. Г., Дроздова А. С., Шварцман А. Л. Сниженный уровень альфа-синуклеина в лейкоцитах периферической крови у пациентов с ¿Л/Ю-ассоциированной болезнью Паркинсона // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 150, № 12. С. 619-621.

13.Пчелина С. Н., Дроздова А. С., Мироишикова В. И., Родыгина Т. И., Емельянов А. К., Якимовский А. Ф„ Шварцман А. Л. Влияние генотипов и активности параоксоназы 1 (PON1) на возраст начала LRRK2-ассоциированной болезни Паркинсона // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 201 la. Т. XVIII, № 3. С. 31-34.

14.Пчелина С. Н., Иванова О. И., Емельянов А. К., Якшювский А. Ф. Клиническое течение 1ЛШС2-ассоциированной болезни Паркинсона // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. 20116. Т. 111, № 12. С. 56-62.

15.Emelyanov A., Boukina Т., Yakimovskii A., Usertko Т., Drosdova А., Zakharchuk A., Andoskin P., Dubina М„ Schwarzman A., Pchelina S. Glucocerebrosidase Gene Mutations are Associated with Parkinson's Disease in Russia//Mov. Disord. 2012. V. 1. P. 158-159.

16.Пчелина С. H. Альфа-синуклеин как биомаркер болезни Паркинсона // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2011в. Т. 6. С. 46-51.

17.Усенко Т. С., Емельянов А. К., Якимовский А. Ф., Боганькова Н. А., Вавилова Т. В., Шварцман А. Л., Пчелина С. Н. Апоптоз лимфоцитов

периферической крови у пациентов с ЬЯЯК2-ассоциированной формой болезни Паркинсона // Цитология. 2012. Т. 54, № 1. С. 44-48.

П.Пчелина С. Н., Усенко Т. С., Боганькова Н. А., Якгшовский А. Ф„ Емельянов А. К., Вавилова Т. В., Шварцман A. J1. Повышенный спонтанный апопотоз лимфоцитов у пациентов с болезнью Паркинсона // Медицинская иммунология. 2012а. Т. 14, № 1-2. С. 149-152.

19.Пчелина С. Н., Емельянов А. К, Дроздова А. С., Якимовский А. <£>., Шварцман А. Л. Метод «дозы гена» на основе количественной ПЦР в реальном времени для выявления мультипликаций генов SNCA и PARK2 у пациентов с болезнью Паркинсона // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 20126. Т. XIX, № 1. С. 82-86.

Статьи в других периодических изданиях, сборниках

20. Пчелина С. П., Иванова О. Н„ Якимовский А. Ф„ Шварцман А. Л. Болезнь Паркинсона: наследственные формы, молекулярная диагностика // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: Альфа Виста, 2005. Выпуск 8. С. 39-67.

21. Пчелина С. П., Ханина Н. М„ Демина Е. П., Иванова О. Н., Якимовский А. Ф. Использование метода количественной ПЦР в реальном времени для поиска гетерозиготного носительства делеций/мульти-пликаций экзонов гена PARK2 у больных с болезнью Паркинсона // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: Альфа Виста, 2006. Выпуск 9. С. 49-56.

22. Пчелина С. Н. Болезнь Паркинсона: наследственные формы, молекулярные механизмы нейродегенерации // Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня: сб. науч. тр. / под общ. ред. В. А. Ланцова. СПб: ПИЯФ РАН. 2007. Выпуск 2. С. 189-202.

23. Пчелина С. Н., Иванова О. Н„ Емельянов А. К, Якимовский А. Ф. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2 II Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: Альфа Виста 2008. Выпуск 12. С. 191-204.

24. Улитина А. С., Пчелина С. Н„ Дубина М. В. Молекулярно-генетическое исследование в клинической практике: диагностические возможности и этические принципы метода // Клинико-лабораторный консилиум. 2009. Т. 2, № 27. С. 25-32.

25. Пчелина С. Н. ДНК-диагностика болезни Паркинсона: пришло ли время? // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: Альфа Виста, 2009. Выпуск 13. С. 164-173.

26. Емельянов А. К., Пчелина С. Н. Альфа-синуклеин и его роль в патогенезе болезни Паркинсона // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: АртЛайн, 2010. Выпуск 14. С. 65-81.

27. Усенко Т. С., Боганькова Н. А., Пчелина С. Н. Использование метода окрашивания на аннексии V для оценки раннего апоптоза лимфоцитов у пациентов с ЫШК2-ассоциированной болезнью Паркинсона // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А. Б. Масленникова. Новосибирск: Альфа Виста, 2010. Выпуск 15. С. 44-55.

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ»

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 123, тир. 100, уч.-изд. л. 2; 11.05.2012 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Пчелина, Софья Николаевна

Оглавление.стр.

Список сокращений.стр.

ВВЕДЕНИЕ.стр.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.стр.

1.1. ДНК-диагностика неврологических заболеваний.стр.

1.2. Патогенез БП.стр.

1.2.1 .Клиническая характеристика БП.стр.

1.2.2. ГІатоморфологические признаки БП.стр.

1.2.3.Диагностика БП.стр.

1.2.4.Средовые факторы риска БП.стр.

1.3.Наследственные формы БП.стр.

1.3.1.Что называют генами БП?.стр.

1.3.2.Ген БИСА.стр.

1.3.3.Ген Ы1ЯК2.стр.

3A.GBA - ген высокого риска развития БП.стр.

1.3.5.Гены аутосомно-рецесивного ювенильного паркинсонизма.стр.

1.3.6.Гены атипичных форм паркинсонизма.стр.

1.3.7.Гены предрасположенности к БП.стр.

1.4.Альфа-синуклеин в патогенезе БП.стр.

1.4.1.Структура и свойства альфа-синуклеина.стр.

1.4.2.Функции альфа-синуклеина.стр.

1.4.3.Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация.стр.

1.4.4.Модели паркинсонизма на животных на основе экзогенной экспрессии гена 5ЖМ.стр.

1 ^.Предполагаемый механизм гибели дофаминергических нейронов при БП.стр.

1.5.1. Гипотетические молекулярные механизмы нейродегенерации при БП .стр.

1.5.2. Роль программируемой клеточной гибели (апоптоза) в патогенезе

БП.стр.

1.6. Лимфоциты периферической крови как объект исследования при изучении патогенеза нейродегенеративных заболеваний.стр.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.стр.

2.1. Характеристика обследованных групп.стр.

2.2. Выделение ДНК.стр.

2.3. Идентификация мутаций при наследственных формах БП.стр.

2.3.1. Стратегия поиска мутаций в генах наследственных форм БП.стр.

2.3.2.Ген PARK2.!.стр.

2.3.3. Ген SNCA.стр.

2.3.4. Ген LRRK2.стр.

2.3.5. Ген GBA.стр.

2.4. Идентификация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PON1.стр.

2.5. Измерение активности параоксоназы 1.стр.

2.6. Выделение фракции лимфоцитов периферической крови.стр.

2.7. Оценка уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР в режиме реального ремени.стр.

2.7.1. Оценка уровня мРНК гена SNCA.стр.

2.7.2. Оценка уровня мРНК гена FAS и BCL2.стр.

2.8. Измерение уровня альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови.стр.

2.9. Оценка уровня апоптоза лимфоцитов периферической крови.стр.

2.10. Статистическая обработка данных.стр.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.стр.

3.1. Генетические основы наследственных форм БП.стр.

3.1.1. Спектр мутаций в гене PARK2 у пациентов с БП с ранним началом.стр.

3.1.2.Мультипликации гена SNCA у пациентов с семейной формой БП.стр.

3.1.3. Мутаций в гене ЬЯЯК2 у пациентов с семейной и спорадической формой БГ1.стр.

3.1.4. Клиническое течение £7?і?Ю-ассоциированной БГІ.стр.

3.1.5. Генетические факторы риска развития БП и их влияние на возраст начала /.І^Ю-ассоциированной БП.стр.

3.1.6. Частота мутаций гена ЄВА (N3708 и Ь444Р) у пациентов с БП .стр.

3.1.7. Алгоритм проведения ДНК-диагностики наследственных форм

БП.стр.

3.2. Молекулярные характеристики лимфоцитов периферической крови в группах пациентов с мутациями в генах ЬЯЯК2 и ЄВА.стр.

3.2.1.Альфа-синуклеин лимфоцитов периферической крови у пациентов с ¿/^^-ассоциированной БГІ.стр.

3.2.2. Влияние клинических характеристик на уровень мРНК гена БЫСА и белка альфа-синуклеина.стр.

3.2.3. Апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в генах ЬЯЯК2 и ЄВА.стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические основы наследственных форм болезни Паркинсона"

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием. Частота встречаемости БП среди лиц старше 60 лет составляет 1-2%. В тоже время около 17% случаев заболевания обнаруживается до 50 лет, т.о. поражая трудоспособную часть населения [Скоромен, и др., 2005; Левин, Федорова, 2012].

Развитие симптомов БП (ригидность мускулатуры, тремор, брадикинезия, нарушение позы), коррелирует с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) мозга, приводя к снижению концентрации дофамина в стриатуме. В цитоплазме дегенерирующих нейронов обнаруживаются специфичные белковые включения - тельца Леви. Следует отметить, что симптомы БП проявляются при гибели 60-80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека [Голубев, Левин, Вейн, 2000; Литвиненко, 2006].

В настоящее время БП относят к классу конформационных болезней мозга [Иллариошкин, 2002], т.е. к заболеваниям, в генезе которых лежит нарушение конформации и внутриклеточного процессинга определенного белка, приводящее к формированию белковых агрегатов, инициирующих процесс нейродегенерации. Предполагается, что в основе молекулярных механизмов БП лежит нарушение фолдинга и полимеризация белка альфа-синуклеина (SNCA), основного компонента телец Леви, приводящая к селективной гибели дофаминергических нейронов ЧС [Cookson, van der Brug, 2008]. Однако, полностью механизм нейродегенерации при БГ1 остаётся неясным. По этой причине не существует лабораторных диагностических тестов БП и доля случаев неправильной постановки диагноза достигает 25% [Hughes et al., 2001; Bower et al, 2002]. Выяснение механизма гибели дофаминергических нейронов при БП является важной задачей не только для понимания общего патогенеза заболевания, но и для разработки превентивной терапии. При этом одним из актуальных подходов изучения молекулярно-генетических основ БП представляется исследование моногенных форм, заболевания с известной этиологией.

Открытие локусов, ответственных за развитие наследственных форм БП в последнее пятнадцатилетие позволило по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза и диагностики БП. Хотя в большинстве случаем БП имеет спорадический характер, у 15% больных встречается семейная форма БП, когда заболевание имело место у нескольких родственников из одного или разных поколений [Gasser, 2007]. Сегодня картировано 18 локусов, ассоциированных с БП (PARK 1-PARK 18) [Bekris, 2010]. Доказано, что мутации, по крайней мере, в пяти генах определенно приводят к развитию менделирующих форм заболевания: гены альфа-синуклеина (SNCA) и обогащенной лейциновыми повторами киназы 2 (LRRK2) ассоциированы с развитием аутосомно-доминантных форм БП и гены паркина (PARK2), DJ1, PINK1 - с аутосомно-рецесивной формой заболевания с ранним началом [Cookson, 2010]. К генам высокого риска БП относят ген глюкоцереброзидазы (GBA) [Hardy, 2010].

Выявление молекулярной этиологии наследственных форм БП позволяет говорить о проведении ДНК-диагностики этих форм заболевания. При проведении ДНК-диагностики и последующего медико-генетического консультирования необходимо знание о спектре мутаций генов наследственных форм, характерных для данной популяции, частотах распространения данного заболевания, а также особенностях его течения [Горбунова, Баранов, 1997; Гинтер, 2002; Баранов, 2009; Горбунова, Пчелина, Шварцман, 2011]. Комплексное молекулярно-генетическое исследование наследственных форм БП, с одной стороны, позволяет разработать алгоритм ДНК-диагностики наследственных форм заболевания, с другой стороны, молекулярно-генетическая характеристика наследственных форм БП впервые дает возможность создания репрезентативной группы пациентов с однородной этиологией заболевания. Такая группа пациентов может быть использована как для исследования молекулярных механизмов развития БП, так и для выявления биомаркеров развития более общих форм заболевания.

В настоящее время нет полного представления о физиологической роли белков, аномальная работа которых приводит к развитию наследственных форм БП. Считается, однако, что выявленные мутации могут приводить к нарушению деградации белков в клетке, работы митохондрий, транспорта пресинаптических везикул, выброса дофамина и увеличению окислительного стресса [Cookson, 2010; Plowey, Chu, 2011; Shapira, Gregg, 2011]. При этом, остается неизвестным, оказывают ли влияние мутации в генах наследственных форм БП на метаболизм альфа-синуклеина и индукцию апоптоза.

Цель исследования

Целью работы явилось молекулярно-генетическое исследование наследственных форм БГ1.

Задачи:

2. Выявить мутации в генах SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с болезнью Паркинсона.

3. Охарактеризовать клинические особенности течения наследственных форм болезни Паркинсона, ассоциированных с мутациями в генах SNCA, PARK2, LRRK2, GBA. Выявить генетические факторы риска развития болезни Паркинсона и оценить их влияние на возраст начала LRRK2-ассоциированной формы заболевания.

4. Разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственных форм болезни Паркинсона.

5. Исследовать уровень мРНК гена SNCA и уровень белка альфа-синуклеина в лимфоцитах периферической крови у пациентов с LRRK2-ассоциированной болезнью Паркинсона.

6. Оценить апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA.

Научная новизна

Данная работа, включившая молекулярно-генетический анализ генов SNCA, PARK2, LRRK2, GBA у пациентов с БП, является первым комплексным исследованием генетических основ наследственных форм БП в России. Впервые описан спектр мутаций в генах LRRK2 и PARK2 у пациентов с БП в России. У пациентов с семейной формой БП впервые в мире описана мутация Т4838С (VI61 ЗА), приводящая к развитию Ц^ЛО-ассоциированной БП с преобладающим тремором. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у пациентов с выявленными мутациями в гене LRRK2 с пациентами БП отличной этиологии с отсутствием мутаций в этом гене. Отмечено преобладание побочных эффектов от терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами в виде дистоний, дискинезий и психопатологии среди пациентов с БГ1, обусловленной мутацией G6055A (G2019S) в гене LRRK2. Впервые в России среди пациентов с БП выявлена форма заболевания, обусловленная дупликацией гена SNCA. Показано, что наличие мажорных мутаций гена GBA (L444P, N370S) повышает риск развития БП в отечественной популяции.

Впервые исследована ассоциация ОНП в генах SNCA, МАРТ, PONI и активности параоксоназы 1 с возрастом начала ¿^^-ассоциированной БГ1 и показано отсутствие влияние исследуемых параметров на клиническое течение ¿/^^-ассоциированной БГ1.

Разработаны простые методы идентификации мутаций в гене LRRK2 (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T, • V1613A) на основе ПЦР и рестрикционного анализа, идентификации мутаций, связанных с изменений копийности гена/экзонов гена в генах SNCA и PARK2 на основе количественной ПЦР в режиме реального времени. Впервые предложена схема проведение ДНК-диагностики наследственных форм БП в России.

Впервые у пациентов с /.^^-ассоциированной формой БГІ проведено исследование уровня альфа-синуклеина и мРНК гена SNCA в лимфоцитов периферической крови, и показано снижение альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови у пациентов с ¿^^-ассоциированной БП по сравнению с группой пациентов со спорадической БП и контролем. Впервые проведена оценка апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов с БГІ, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA и выявлено повышение уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов в исследуемых группах. Показано стабильное увеличение уровня мРНК гена FAS у пациентов с ¿^^-ассоциированной БГІ.

Теоретическое и практическое значение работы

Изучение механизма нейродегенерации при моногенных формах БГІ, в частности, при наиболее распространенной ¿^^-ассоциированной форме заболевания, позволяют ближе подойти к пониманию патогенеза спорадических форм БП. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных основ патогенеза БП. Проведенные исследования позволяют предположить, что снижение уровня альфа-синуклеина лимфоцитов периферической крови характеризует особенность патогенеза только ¿^^-ассоциированной БП, в то время как повышение спонтанного апоптоза лимфоцитов является более общей характеристикой, присутствующей при различных формах заболевания.

Разработанный метод генотипирования наиболее распространенной среди семейных случаев БП мутации G6055A (G2019S) в гене LRRK2 может быть использован в клинической практике при выявлении LRRK2-ассоциированных форм БП. Также в клинической практике может быть использован предложенный алгоритм • проведения ДНК-диагностики наследственных форм заболевания. Проведение ДНК-диагностики наследственных форм БП может быть полезно с целыо проведения дифференциальной диагностики заболевания. Выявленные в настоящем исследовании особенности течения БП, ассоциированной с мутациями в генах LRRK2 и GBA, следует принимать во внимание при проведении медико-генетического консультирования. Проведение ДНК-диагностики пациентам с БП и членам их семей позволит осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутации до начала проявления клинических симптомов заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

4. Мутации в гене PARK2 не являются значимой причиной развития БГ1 с началом заболевания в возрасте от 40 до 50 лет.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении», Москва, (2002); на совещании общества «GEO-PD», Париж, Франция (2005); V съезде Российского общества медицинских генетиков, Уфа, (2005); XVIII всемирном конгрессе по неврологии, Сидней, Австралия (2005); международной летней школе по нейрогенетике поведения, Москва (2005); конференции Фундаментальные науки -медицине, Москва, (2005); конференции Фундаментальные науки -медицине, Москва, (2006); 20 конгрессе европейской коллегии по нейропсихофармакологии, Вена, Австрия, (2007), европейской конференции по генетике человека, Ницца, Франция (2007); на совещании общества «ОЕО-РВ», Трондхейм, Норвегия, (2008); 12 конгрессе европейской федерации неврологических ассоциаций, Мадрид, Испания (2008); 2 всемирном конгрессе по вопросам неврологии, Афины, Греция (2008); I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике», Новосибирск, (2008); V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2009); 9-ой международной конференции по болезням Альцгеймера и Паркинсона, Прага, Чехия (2009); научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике», Новосибирск, (2009); 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино (2010); на 1ом конгрессе «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное», Санкт-Петербург, (2010); VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону (2010); Европейском конгрессе по генетике человека, Гетеборг, Швеция (2010); Ном конгрессе Европейской федерации общества неврологов, Женева, Швейцария (2010); 15 конгрессе европейской федерации неврологических ассоциаций, Будапешт, Венгрия (2011); 24 конгрессе европейской коллегии по нейропсихофармакологии, Париж, Франция, (2011), II национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2011).

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику учебной и лечебной работы ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский

Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова» и ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН, соответственно.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 печатных работ из них 14 статей в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 монография, 4 главы в монографиях, 8 статей в сборниках и 30 тезисов.

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Пчелина, Софья Николаевна

Выводы:

1. Частота мутаций в гене LRRK2 среди семейных форм болезни Паркинсона в Северо-Западном регионе России составляет 8%. В спектре мутаций гена LRRK2 преобладает мутация G6055A (G2019S) (85.5% аллелей). Впервые выявленная мутация. VI613А приводит к болезни Паркинсона с преобладающим тремором. Наличие мутации G6055A (G2019S) в гене LRRK2 характеризуется высокой частотой осложнений при терапии JI-ДОФА-содержащими препаратами в виде дистоний, дискинезий и психопатологии.

2. Мутации в, гене GBA (L444P и N370S) являются факторами высокого риска развития болезни Паркинсона. Наибольший эффект оказывает мутация L444P на риск развития болезни Паркинсона с началом до 50 лет.

3. Спектр мутаций гена PARK2 у пациентов началом болезни Паркинсона в возрасте до 50 лет характеризуется уникальностью вариантов. Мутации выявляются преимущественно в гетерозиготном состоянии, что затрудняет оценку их клинической значимости.

5. Варианты, генов SNCA (аллель G rs356219), МАРТ (генотип АА rs 1052553), PONI (аллель М54, rs854560) ассоциированы с риском развития БП в Северо-Западном регионе России. Указанные варианты, а также активность параоксоназы 1, не влияют на возраст начала LRRK2-ассоциированной болезни Паркинсона.

-ассоциированной болезни Паркинсона наблюдается стабильное повышение экспрессии гена FAS.

Практические рекомендации

1. Для выявления наследственной • аутосомно-доминантной формы болезни Паркинсона, показано тестирование мутации G2019S LRRK2 у пациентов с семейной формой заболевания в качестве дополнительного диагностического теста. Молекулярно-генетическое обследование родственников пациентов с выявленной мутацией позволит выявить больных с болезнью Паркинсона на преклинической стадии заболевания.

3. Для выявления больных с высоким риском развития болезни Паркинсона целесообразно проводить скрининг мажорных мутаций в гене GBA (L444P и N370S) среди пациентов с различными формами заболевания (семейные и спорадические). При выявлении мутации в гене GBA у пациента рекомендовано йюлекулярно-генетическое обследование родственников пациента.

4. При проведении медико-генетического консультирования носителей мутаций в гене GBA следует учитывать большой риск развития болезни Паркинсона в возрасте до 50 лет у носителей мутации L444P.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Пчелина, Софья Николаевна, Санкт-Петербург

1. Ахмедова (Пчелина С.Н.). Молекулярно-генетические основы предрасположенности к болезни Паркинсона. Автореф. на соискание к-та биол. наук. СПб. 2000. - 19с

2. Баранов B.C. Генетический паспорт основа индивидуальной и предиктивной медицины. - СПб.: Н-Л, 2009. - 528с

3. Бочков Н.П., Клиническая генетика. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002.448с

4. Букина Т.М. Биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика болезни Гоше у российских пациентов.- Автореф. на соискание к-та биол. наук. Москва. 2005.-22 с

5. Букина Т.М., Цветкова И.В. Характеристика мутаций гена кислой betta-D-глюкозидазы (GBA) среди 68 российских пациентов с болезнью Гоше // Биомедицинская химия. 2007. - Т.53, №5. - С.593 - 602

6. Варга О.Ю. Влияние метилпреднизолона и циклофосфана in vitro на активность апоптоза лимфоцитов периферической крови при системной красной волчанке // Российский биомедицинский журнал Med-line.ru. 2007, Т.8, №47.-С.518-525

7. Айламазян Э. К., Баранов В. С. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней. М.: МЕДпресс-информ, 2007. -416с.

8. Вахарловский В. Г., Романенко О. П., Горбунова В. Н. Генетика в практике педиатра. — СПб., 2009. — С. 251—253

9. Внуков В.В., Даниленко А.О., Головатенко О.И., Ананян A.A., Милютина Н.П. Апоптоз и структурное состояние мембран лимфоцитов при болезни Пркинсона// Валеология. 2011. - Т. 1. - С.45-50

10. Гинтер Е. К. Наследственные болезни в популяциях человека. М.: Медицина, 2002. - 304с

11. Голубев, В.Л., Левин Я.И., Вейн A.M. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма. М.: МЕДпресс, 2000. - 416 с

12. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная Литература, 1997. - 285с

13. Горбунова В. Н., Пчелина С. Н., Шварцман А. Л. Введение молекулярную медицину, СПб., Издательство политехнического университета, 2011. 214 с

14. Гордеева А. В., Лабас Ю. А., Звягильская Р. А. Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция// Биохимия. 2004. -Т.69, №10. - С. 1301-131

15. Григорьев М.Ю., Имянитов E.H., Хансон К.П. Апоптоз в норме и патологии// Медицинский академический журнал. 2003. - Т.З. - С.3-11

16. Давыдова A.B. ЛИЗОСОМНЫЕ БОЛЕЗНИ НАКОПЛЕНИЯ: БОЛЕЗНЬ ГОШЕ// Сибирский медицинский журнал. 2009 - Т.5. - С. 9-14

17. Иванов В.И., Киселев Л.Л. Геномика медицине. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2005. — 389с

18. Иванова О.Н., Якимовский А.Ф., Пчелина С.Н. Молекулярно-генетический анализ ранних форм болезни Паркинсона // Ученые записки СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова. 2005. - T.XII, №4. - С. 105-106

19. Ижевская В. Л., Иванов В. И. Геномика и основные биоэтические проблемы медицинской генетики // Вестник РАМН. 2001. - Т. 10. - С.59-64

20. Ижевская, В.Л. Этические и правовые аспекты генетического тестирования и скрининга// Медицинская генетика. 2006. - Т.5. - С. 3-8

21. Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М.: Янус-К, 2002.-246с

22. Иллариошкин С.Н. Течение болезни Паркинсоан и подходы к ранней диагностике // В руководстве для врачей Болезнь Паркинсона и расстройства движений. Под ред. С.Н.Иллариошкина, О.С.Левина. М.: ЗАО «Серебряные нити», 2011. - С.41-47

23. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И. А. Дрожательные гиперкинезы. М.:Атмосфера, 2011. - 354с •

24. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 591с

25. Иллариошкин С.Н. Современные подходы к лечению болезни Паркинсона // Атмосфера. Нервные болезни. 2004. - Т.4. - С. 14-21

26. Катунина Е.А., Титова Н.В., Авакян Г.Н. Методы диагностики болезни Паркинсона на ранних стадиях // Журнал неврологтт и психиатрии им. С.С.Корсакова- 2010. Т. 12. -С.112-118

27. Крыжановский Г.Н. Болезнь Паркинсона (этиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика). М.: Медицина, 2002. - 336с

28. Лаврик И., Краммер П. Решение «жизнь-или-смерть» в системе CD95: основне про- и антиапоптозные модуляторы» // ACTA NATURAE.-2009. -T.l. -С.80-83

29. Левин О.С., Федорова Н.В. Болезнь Паркинсона. М.: МЕДпресс-Информ, 2012. -351с

30. Левин, О.С., Докадина Л.В. Эпидемиология паркинсонизма и болезни Паркинсона // Неврологический журнал. 2005. - Т. 10, № 5. — С. 41-49

31. Литвиненко И.В. Болезнь Паркинсона. М.: Миклош, 2006.216с

32. Пчелина С.Н. Альфа-синуклеин как биомаркер болезни Паркинсона // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. -2011в. Т.6. - С. 46-51

33. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф. Клиническое течение ЬККК2-ассоциированной болезни Паркинсона // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 20116. - Т. 111, №12. - С.56-62

34. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф., Шварцман A.JI. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России // Медицинская генетика. 2006. - Т.5, №2. - С.48-51

35. Пчелина С.Н., Усенко Т.С., Боганькова H.A., Якимовский А.Ф., Емельянов А.К., Вавилова Т.В., Шварцман A.JI. Повышенный спонтанный апопотоз лимфоцитов у пациентов с болезнью Паркинсона // Медицинская иммунология, 2012а.- Т.14, №1-2,- С.149-152

36. Пчелина С.Н., Якимовский А.Ф., Шварц Е.И. Наследственные основы болезни Паркинсона // Медицинская генетика. 2003. - Т.9, № . -С.411-425

37. Семенова Е.В., Шадрина М.И., Сломинский П.А., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х., Карабанов A.B., Иванова-Смоленская И.А., Лимборская

38. С.А. Анализ дозы гена а-синуклеина при аутосомно-доминантной форме болезни Паркинсона // Генетика. 2009. - Т.45, №4.-С. 1-3

39. Скоромец A.A., Скоромец А.П., Скоромец Т.А. Нервные болезни. -М. :МЕДпресс-информ, 2005. 544с

40. Сломинский П.А., Милосердова О.В., Попова С.Н., и др. Анализ делеционных мутаций в гене PARK2 у больных идиопатической формой болезни Паркинсона // Генетика. 2003. - Т.39. - С.223-228

41. Степанов В.А. Геномы, популяции, болезни: этническая геномика и персонифицированная медицина // Acta Naturae. 2010. - Т. 2, №4. - С. 1833

42. Угрюмов М. В. Нейродегенеративные заболевания. Фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука, 2010. - 447с

43. Усенко Т.С., Емельянов А.К., Якимовский А.Ф., Боганькова H.A., Вавилова Т.В., Шварцман A.JI., Пчелина С.Н. Апоптоз лимфоцитов периферической крови у пациентов с Г11ЯК2-ассоциированной формой болезни Паркинсона // Цитология. 2012. - Т.54, №1. - С.44-48

44. Федотова Е.Ю., Чечеткин А.О., Шадрина М.И., Сломинский П.А., Иванова Смоленская И.А., Иллариошкин С.Н. Транскраниальная сонография при болезни Паркинсона // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 2011. - Т. 111, №.1. - С. 49-55

45. Шадрина М.И. Молекулярно-генетические основы болезни Паркинсона Автореф. на соискание д-ра биол. наук. Москва. 2011. - 48с

46. Шадрина М. И.; Иллариошкин С.Н.; Багыева Г. X.; Беспалова Е.

47. Adam D. Pesticide use linked to Parkinson's disease // Nature. 2000. - Vol.408.-P.125

48. Aerts M.B., Esselink R.A., Abdo W.F., Bloem B.R., Verbeek M.M. CSF a-synuclein does not differentiate between parkinsonian disorders // Neurobiol Aging. 2012. -Vol.33, №2. -P.430

49. Aharon-Peretz J., Rosenbaum H., Gershoni-Baruch R. Mutations in the glucocerebrosidase gene and Parkinson's disease in Ashkenazi Jews // N Engl J Med. 2004. - Vol.351, №19. -P.1972-7

50. Akhmedova (Pchelina) S., Yakimovsky A., Schwartz E. Paraoxonase 1 Polymorphism Met-Leu 54 Is Associated with Parkinson's Disease // J Neurol Sci. 2001,- Vol.184.-P. 179-182

51. Akhmedova S., Anisimov S., Yakimovsky A., Schwartz E. Gln-Argl91 polymorphism of paraoxonase and Parkinson's disease // Human Heredity.- 1999.-Vol. 49.-P. 178-180

52. Aktas O., Ullrich O., Infante-Duarte C., Nitsch R., Zipp F. Neuronal damage in brain inflammation // Arch Neurol. 2007. - Vol.64, №2. - P. 185-9

53. Alberio T., Bossi A., Milli A., Parma E., Gariboldi M., Tosi G., Lopiano L., Fasano M. Proteomic analysis of dopamine and alpha-synuclein interplay in a cellular model of Parkinson's disease pathogenesis // FEBS J. -2010. Vol.277. - P.4909-4919

54. Ardestani A., Yazdanparast R., Nejad A.S. 2-Deoxy-D-ribose-induced oxidative stress causes apoptosis in human monocytic cells: prevention by pyridoxal-5'-phosphate // Toxicol In Vitro. 2008. - Vol.22, №4. - P.968-79

55. Ascherio A., Zhang S.M., Hernan M.A., Kawachi I., Colditz G.A., Speizer F.E., Willett W.C. Prospective study of caffeine consumption and risk of Parkinson's disease in men and women // Ann Neurol. 2001. - Vol.50. - P.56-63

56. Autere J.M., Moilanen J.S., Myllyla V.V., Majamaa K. Familial aggregation of Parkinson's disease in Finnish population // J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2000. - Vol.69, №1. - P. 107-109

57. Ayub A., Mackness M.I., Arrol S., Mackness B., Patel J., Durrington P.N. Serum paraoxonase after myocardial infarction // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999. - Vol.19.-P.330-5

58. Banerjee R., Beal M.F., Thomas B. Autophagy in neurodegenerative disorders: pathogenetic roles and therapeutic implications // Trands in Neurosci. -2010. Vol.33. -P.541-549

59. Bas J., Calopa M., Mestre M. Lymphocyte populations in Parkinson's disease and in rat models of parkinsonism // J Neuroimmunol. 2001. - Vol.113, №1. - P.146-152

60. Battisti C., Formichi P., Tripodi S.A., Mangiavacchi P., Tosi P., Federico A. Increased apoptotic response to 2-deoxy-D-ribose in ataxia-telangiectasia//J Neurol Sci. 1996. - Vol.144, №1-2. -P. 128-34

61. Battisti C., Formichi P., Radi E., Federico A. Oxidative-stress-induced apoptosis in PBLs of two patients with Parkinson disease secondary to alpha-synuclein mutation//J Neurol Sci. 2008. - Vol.15, №267. - P. 120-124

62. Beck G., Brinkkoetter P., Hanusch C., Schulte J., van Ackern K., van der Woude F.J., Yard B.A. Clinical review: immunomodulatory effects of dopamine in general inflammation // Crit. Care. 2004. - Vol.8. - P.485-491

63. Behnke S., Schroder U., Berg D. Transcranial sonography in the premotor diagnosis of Parkinson's disease // Int Rev Neurobiol. 2010. - Vol.90. -P.93-106

64. Bekris L.M., Mata I.F., Zabetian C.P. The genetics of Parkinson's disease // J Geriatr Psychiatry Neurol. 2010. - Vol.23. - P.228-242

65. Bennett D.A., Beckett L.A., Murray A.M., Shannon K.M., Goetz C.G., Pilgrim D.M., Evans DA. Prevalence of Parkinsonian Signs and Associated Mortality in a Community Population of Older People // N. Engl. J.Med. 1996. -Vol. 334.-P. 71-76

66. Berg D., Merz B., Reiners K., Naumann M., Becker G. Five-year follow-up study of hyperechogenicity of the substantia nigra in Parkinson's disease // Mov Disord. 2005. - Vol.20. - P.383-5

67. Besser M.J., Ganor Y., Levite M. Dopamine by itself activates either D2, D3 or D1/D5 dopaminergic receptors in normal human T-cells and triggers the selective secretion of either IL-10, TNFalpha or both // J. Neuroimmunol. 2005. -Vol.169. -P.161-171

68. Beyer K. Alpha-synuclein structure, posttranslational modification and alternative splicing as aggregation enhancers // Acta Neuropathol. 2006. -Vol.112, №3, - P.237-51

69. Bisaglia M., Greggio E., Marie D., Miller D.W., Cookson M.R., Bubacco L. a-Synuclein overexpression increases dopamine toxicity in BE(2)-M17 // Cells BMC Neuroscience. 2010. - Vol. 11. - P. 41

70. Bisaglia M., Mammi S., Bubacco L. Structural insights on physiological functions and pathological effects of alpha-synuclein // FASEB J. -2009,- Vol.23. -P.329-40

71. Blandini F., Sinforiani E., Pacchetti C., Samuele A., Bazzini E., Zangaglia R., Nappi G., Martignoni E. Peripheral proteasome and caspase activity in Parkinson disease and Alzheimer disease // Neurology. 2006. - Vol.66, №4. -P.529-34

72. Blandini F., Mangiagalli A., Cosentino M., Marino F. Peripheral markers of apoptosis in Parkinson's disease: the effect of dopaminergic drugs // AnnN Y Acad. Sei. 2003. - Vol.1010. - P. 675-678

73. Bodin L., Beaune P.H., Loriot M.A. Determination of Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) Gene Copy Number by Real-Time Quantitative PCR // J Biomed Biotechnol. 2005. - Vol.3. - P.248-53

74. Bonifati V., Rizzu P., van Baren M.J., Samuele A., Bazzini E., Zangaglia R., Nappi G., Martignoni E. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism // Science. 2003. -Vol.299. -P.256-259

75. Bossy-Wetzel E., Schwarzenbacher R., Lipton S.A. Molecular pathways to neorodegeneration // Nature Medicine. 2004. - Vol.10. -P.S2-S9

76. Bower J.A., Dickson D.W., Taylor L., Maraganore D.M., Rocca W.A. Clinical correlates of the pathology underlying parkinsonism: a population perspective // Mov. Disord. 2002. - Vol. 17. - P. 910-916

77. Bras J.M., Singleton A. Genetic susceptibility in Parkinson's disease // Biochim Biophys Acta. -2009. Vol.1792. - P.597-603

78. Bredesen D.E., Rao R.V., Mehlen P. Cell death in the nervous system // Nature. 2006. - Vol.443, №7113. - P.796-802

79. Brighina L., Prigione A., Begni B., Galbussera A., Andreoni S., Piolti R., Ferrarese C. Lymphomonocyte alpha-synuclein levels in aging and in Parkinson disease // Neurobiol Aging. 2010. - Vol.31. -P.884-5

80. Brochard V., Combadiere B., Prigent A., et al. Infiltration of CD4+ lymphocytes into the brain contributes to neurodegeneration in a mouse model of Parkinson disease // Clin Invest. 2009. - Vol. 119, № 1. - P. 182-192

81. Brooks A.I., Chadwick C.A., Gelbard H.A., et al. Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss // Brain Research. 1999.-Vol.823. P.l-10

82. Brooks D.J. The early diagnosis of Parkinson's disease // Ann Neurol. -1998. Vol.44, Supp.l. - P.S10-S18

83. Bueler H. Impaired mitochondrial dynamics and function in the pathogenesis of Parkinson's disease // Exp Neurol. 2009. - Vol.218, №2. -P.235-46

84. Cabin D.E., Shimazu K., Murphy D., et al. Synaptic vesicle depletion correlates with attenuated synaptic responses to prolonged repetitive stimulation in mice lacking alpha-synuclein // J Neurosci. 2002. - Vol.22. - P.8797-8807

85. Calopa M., Bas J., Callen A., Mestre M. Apoptosis of peripheral blood lymphocytes in Parkinson patients // Neurobiol- Dis. 2010. - Vol.38, №1. -P. 1 -7

86. Chandra S., Gallardo G., Fernandez-Chacon R., Schluter O.M., Sudhof TC. Alpha-synuclein cooperates with CSPalpha in preventing neurodegeneration // Cell. 2005. - Vol.123, №33. -P.383-96

87. Chen M., Wang J. Gaucher disease: review of the literature //Arch Pathol Lab Med. 2008. - Vol. 132, №5. - P.851-3

88. Chen Q., Book M., Fang X., Hoeft A., Stuber F. Screening of copy number polymorphisms in human beta-defensin genes using modified real-time quantitative PCR.//.J Immunol Methods. 2006. - Vol.308. - P. 231-40

89. Choi J.H., Velayati A., Stubblefield B.K., Orr-Urtreger A., Gan-Or Z., Tayebi N., Sidransky E. False-Positive Results Using a Gaucher Diagnostic Kit -RecTL and N370S // Mol Genet Metab. 2010. - Vol. 100, № 1. - P. 100-102

90. Choi J.H., Stubblefield B., Cookson M.R., Goldin E., Velayati A., Tayebi N., Sidransky E. Aggregation of a-synuclein in brain sa mples from subjects with glucocerebrosidase mutations // Mol Genet Metab. 2011. -Vol.104, №1-2.-P.185-8

91. Choi W.S., Kruse S.E., Palmiter R.D., Xia Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat // Proc Natl Acad Sci USA.- 2008. Vol. 105,№39. -P.15136-41

92. Clark I.E., Dodson M.W., Jiang C., Cao J.H., Huh J.R., Seol J.H., Yoo S.J., Hay B.A., Guo M. Drosophila pinkl is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin // Nature. 2006. -Vol.441, №7097. -P. 1162-6

93. Colombo C., Cosentino M., Marino F. Dopaminergic modulation of apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells // Ann N Y Acad Sci. -2003.-Vol.1010.-P.679-682

94. Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P.T. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease // Nat Med. 1998. - Vol.4. -P.1318-1320

95. Cookson M.R., Bandmann O. Parkinson's disease: insight from pathways // Hum Mol Genet. 2010. - Vol.19. - P.R21-R27

96. Cookson M.R. A feedforward loop links Gaucher and Parkinson's disease // Cell. 2011. - Vol.146. - P. 9-11

97. Cookson M.R., van der Brug M. Cell systems and the toxic mechanism(s) of alpha-synuclein // Exp Neurol. 2008. - Vol.209. - P.5-11

98. Cosentino M., Marino F., Bombelli R., Ferrari M., Lecchini S., Frigo G. Endogenous catecholamine synthesis, metabolism, storage and uptake in human neutrophils // Life Sci. 1999. - Vol. 64, №11. - P.975-81

99. Covy J.P., Yuan W., Waxman E.A., Hurtig H.I., Van Deerlin V.M., Giasson B.I. Clinical and pathological characteristics of patients with leucine-rich repeat kinase-2 mutations // Mov Disord. 2009. - Vol.24, №1. - P.32-9

100. Cuervo A.M., Stefanis L., Fredenburg R., Lansbury P.T, Sulzer D. Impaired degradation of mutant alpha-synuclein by chaperone-mediated autophagy // Science. 2004. - Vol.305. - P. 1292-5

101. Davidson W.S., Jonas A., Clayton D.F., George J.M. Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes // J Biol Chem. 1998. - Vol.273. -P.9443-9449

102. Dawson T.M. Parkinson's Disease Genetics and Pathogenesis. New York: Informa healthcare USA, 2007. - 398p.

103. Dawson T.M., Dawson V.L. Molecular pathways of neurodegeneration in Parkinson's disease // Science. 2003. - Vol.302. - P.819-822

104. De Marco E.V., Annesi G., Tarantino P., Nicoletti G., Civitelli D., Messina D., Annesi F., Arabia G., Salsone M., Condino F., Novellino F.,

105. Provenzano G., Rocca F.E., Colica C., Morelli M., Scornaienchi V., Greco V., Giofre L., Quattrone A. Glucocerebrosidase gene mutations are associated with Parkinson's disease in southern Italy // Mov Disord. 2008. - Vol.23, №3. -P.460-3

106. Dekker M.C., Eshuis S.A., Maguire R.P., Veenma-van der Duijn L., Pruim J., Snijders P.J., Oostra B.A., van Duijn C.M., Leenders K.L. PET neuroimaging and mutations in the DJ-1 gene // J Neural Transm. 2004. -Vol.111, №12. -P.1575-81

107. DePaolo J., Goker-Alpan O., Samaddar T., Lopez G., Sidransky E. The association between mutations in the lysosomal protein glucocerebrosidase and parkinsonism // Mov Disord. 2009. - Vol.24. - P. 1571-1578

108. Dunnett S.B., Björklund A. Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease // Nature. 1999. - Vol.399, №6738,Suppl. - P.A32-9

109. Eberhardt O., Schulz J.B. Apoptotic mechanisms and antiapoptotic therapy in the MPTP model of Parkinson's disease // Toxicol Lett. 2003. -Vol.139, №2-3.-P.135-51

110. Elbaz A., Alperovitch A. Bias in association studies resulting from gene-environment interactions and competing risks // Am J. Epidemiol. 2002. -Vol.155.-P.265-272

111. Elbaz A. LRRK2: bridging the gap between sporadic and hereditary Parkinson's disease,// Lancet Neurol.- 2008.- Vol. 7.-P.562-4

112. Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P., Vizi E.S. The sympathetic nerve—an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system // Pharmacol. Rev. 2000. - Vol. 52. - P.595- 638

113. Eller M., Williams D.R. a-Synuclein in Parkinson disease and other neurodegenerative disorders. Clin Chem Lab Med. 2011. - Vol.49, №3. - P.403-8

114. Falcone D.C., Wood E.M., Xie S.X., Siderowf A., Van Deerlin V.M. Genetic testing and Parkinson disease: assessment of patient knowledge, attitudes, and interest // J Genet Couns. 2011. - Vol.20, №4. - P.384-95

115. Farrer M., Maraganore D.M., Lockhart P., Singleton A., Lesnick T.G., de Andrade M., West A., de Silva R., Hardy J., Hernandez D. alpha-Synuclein gene haplotypes are associated with Parkinson's disease // Hum Mol Genet. 2001. -Vol.10, №17.-P. 1847-51

116. Farrer M.J. Genetics of Parkinson's disease paradigm shifts and future prospects // Nature Reviews. 2006. - Vol.7. - P. 306-318

117. Feany M.B., Bender W.W. A drosophila model of Parkinson's disease // Nature. 2000. - Vol.404. -P.394-398

118. Flower T.R., Chesnokova L.S., Froelich C.A., Dixon C., Witt S.N. Heat shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of Parkinson's disease // J Mol Biol. 2005. - Vol.351, №5. - P. 1081-100

119. Franco R., Pacheco R., Lluis C., Ahern G.P., O Connell P.J. The emergence of neurotransmitters as immune modulators // Trends Immunol. 2007. - Vol.28. - P.400^40

120. Friedlander RM. Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases // N Engl J Med. 2003. - Vol.348, №14. - 1365-75

121. Fuchs J., Tichopad A., Golub Y., Munz M., Schweitzer K.J., Wolf B., Berg D., Mueller J.C., Gasser T. Genetic variability in the SNCA gene influences alpha-synuclein levels in the blood and brain. // J. FASEB. 2008. - Vol.22, № 5. -P.1327-1334

122. Fujita K., Nakabeppu Y., Noda M. Therapeutic effects of hydrogen in animal models of Parkinson's disease // Parkinsons Dis. 2011. - Vol.2011. - P. 307875

123. Fukushima T., Yamada K, Hojo N, Isobe A, Shiwaku K, Yamane Y. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. III. The effects of acute paraquat exposure on the electron transport system in rat mitochondria // Exp Toxicol Pathol. 1994. -Vol.46.-P.437^141

124. Funayama M., Hasegawa K., Kowa H., Saito M., Tsuji S., Obata F. A new locus for Parkinson's disease (PARK8) maps to chromosome 12p 11.2-p 13.1. // Ann. Neurol. 2002. - Vol.51. - P.296-301

125. Fung H.C., Chen C.M., Hardy J., Hernandez D., Singleton A., Wu Y.R. Lack of G2019S LRRK2 mutation in a cohort of Taiwanese with sporadic Parkinson's disease // Mov Disord.- 2006.-Vol.21.-P.880-881

126. Gasser T. Update on the Genetics of Parkinson's Disease. // Mov. Disord. 2007. - Vol.22. - P.S343-S350

127. Giasson B.I., Covy J.P.,. Bonini N.M, Hurtig H.I., Farrer M.J., Trojanowski J.Q., Van Deerlin V.M. Biochemical and pathological characterization of Lrrk2. //Ann.Neurol. 2006. - Vol. 59. - P.315-322

128. Giasson B.I., Murray I.V., Trojanowski J.Q., Lee V.M. A hydrophobic stretch of 12 amino acid residues in the middle of alpha-synuclein is essential for filament assembly // J Biol Chem. 2001. - Vol.276. -P.2380-2386

129. Giasson B.I., Van Deerlin V.M. Mutations in LRRK2 as a Cause of Parkinson's disease. //Neurosignals. -2008. Vol.16. -P.99-105

130. Giasson B.I., Covy J.P., Bonini N.M., Hurtig H.I., Farrer M.J., Trojanowski J.Q., Van Deerlin V.M. Biochemical and pathological characterization of Lrrk2 // Ann Neurol. 2006. - Vol.59. - P.315-322

131. Giasson B.I., Duda J.E., Quinn S.M., Zhang B., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Neuronal alphasynucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein // Neuron. 2002. - Vol.34. - P.521-533

132. Gillardon F. Leucine-rich repeat kinase 2 phosphorylates brain tubulin-beta isoforms and modulates microtubule stability a point of convergence in Parkinsonian neurodegeneration. // J Neurochem. - 2009. - Vol.110. - P. 15141522

133. Ginsberg G., Neafsey P., Hattis D., Guyton K.Z., Johns D.O., Sonawane B. Genetic polymorphism in paraoxonase 1 (PON1): Population distribution of PON1 activity // J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 2009.-Vol.12.- P.473-507

134. Gispert S., Del Turco D., Garrett L., et al. Transgenic mice expressing mutant A53T human alpha-synuclein show neuronal dysfunction in the absence of aggregate formation. Mol Cell Neurosci. 2003. - Vol.24. - P.419-429

135. Gloeckner C. J., Schumacher A., Boldt K., Ueffmg M. The Parkinson disease-associated protein kinase LRRK2 exhibits MAPKKK activity and phosphorylates MKK3/6 and MKK4/7, in vitro. // J Neurochem. 2009. - Vol.109. - P.959-968

136. Goker-Alpan O., Lopez G., Vithayathil J., Davis J., Hallett M., Sidransky E. The spectrum of parkinsonian manifestations associated with glucocerebrosidase mutations // Arch Neurol. 2008. - Vol.65, №10. -P.1353-7

137. Goker-Alpan O., Stubblefield B.K., Giasson B.I., Sidransky E. Glucocerebrosidase is present in a-synuclein inclusions in Lewy body disorders // Acta Neuropathol. 2010. - Vol.120, №5. - P.641-9

138. Gomez C., Bandez M.J., Navarro A. Pesticides and impairment of mitochondrial function in relation with the parkinsonian syndrome // Front Biosci. -2007.-Vol.12. -P.1079-93

139. Pfeiffer RF, Uitti RJ, Stoessl AJ, Wszolek ZK, Farrer MJ, Mueller JC, Gasser T, Fuchs J.et al. Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic markers in human alpha-synuclein A30P transgenic mice. Neurobiol Aging 2003; 24:245-258

140. Gonzalez-Polo RA, Rodriguez-Martin A, Moran JM, Niso M., Soler G., Fuentes J.M. Paraquat-induced apoptotic cell death in cerebellar granule cells // Brain Res. 2004. - Vol.1011, №2. -P. 170-176

141. Greene J.C., Whitworth A.J., Kuo L, Andrews L.A., Feany M.B., Pallanck L.J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. Vol.100, №7. -P.4078-83

142. Greggio E., Cookson M.R. Leucine-rich repeat kinase 2 mutations and Parkinson's disease: three questions // ASN Neuro. 2009. - Vol.1, №1. - P.pii: e00002. doi: 10.1042/AN20090007

143. Greggio E., Singleton A. Kinase signaling pathways as potential targets in the treatment of Parkinson's disease. // Expert Review of Proteomics. -2007. Vol.4,Suppl.6. -P.783-792

144. Greggio E., Bisaglia M., Civiero L., Bubacco L. Leucine-rich repeat kinase 2 and alpha-synuclein: intersecting pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease? Mol Neurodegener. 2011. - Vol.6. - P.6

145. Gupta N., Oppenheim I.M., Kauvar E.F., Tayebi N., Sidransky E. Type 2 Gaucher disease: phenotypic variation and genotypic heterogeneity // Blood Cells Mol Dis. 2011. - Vol.46, №1. -P.75-84

146. Hanrott K., Gudmunsen L., O'Neill M.J., Wonnacott S. 6-hydroxydopamine-induced apoptosis is mediated via extracellular auto-oxidationand caspase 3-dependent activation of protein kinase Cdelta // J Biol Chem. -2006. Vol.281, №9. - P.5373-82

147. Hardy J. Genetics analysis of pathways to Parkinson's disease // Neuron. -2010. Vol.68. - P.201-206

148. Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypotesis of Alzheimer's diseaseA progress and problems on the road to therapeutics // Science. 2002. - Vol.297. -P.353-356

149. Hartmann A., Hirsch E.C. Parkinson's disease. The apoptosis hypothesis revisited // Adv Neurol. 2001. - Vol.86. - P. 143-53

150. Hashimoto M., Rockenstein E., Masliah E. Transgenic models of alpha-synuclein pathology:past, present, and future // Ann NY Acad Sci. 2003. -Vol.991.-P.171-188

151. Hattorf N., Mizuno Y. Pathogenetic mechanisms of parkin in Parkinson' Disease // Lancet. 2004. - Vol.364. -P.722-724

152. Hayashi T., Ishimori C., Takahashi-Niki K., Taira T., Kim Y.C., Maita FI., Maita C., Ariga H., Iguchi-Ariga S.M. DJ-1 binds to mitochondrial complex I and maintains its activity // BBRC. 2009. - Vol.390. - P.667-672

153. Healy D.G., Wood N.W., Schapira A.H. Test for LRRK2 mutations in patients with Parkinson's disease// Pract Neurol. 2008. - Vol.8. - P.381-385.

154. Hedrich K., Eskelson C., Wilmot B., Marder K., Harris J., Garrels J., Meija-Santana H., Vieregge P., Jacobs H., Bressman S.B., Lang A.E., Kann M.,

155. Abbruzzese G., Martinelli P., Schwinger E., Ozelius .LJ., Pramstaller P.P., Klein C, Kramer P. Distribution, type, and origin of Parkin mutations: review and case studies // Mov Disord. 2004. - Vol.19, №10. - P. 1146-57

156. Hernán M.A., Zhang S.M., Rueda-deCastro A.M., Colditz G.A., Speizer F.E., Ascherio A. Cigarette smoking and the incidence of Parkinson's disease in two prospective studies // Ann Neurol. 2001. - Vol.50. - P.780-786

157. Hoehn M.M., Yarh H.D. Parkinsonism: Onset, Progression and Mortality // Neurology. 1967. - Vol.17. - P.427-442

158. Horowitz M.P., Greenamyre J.T. Gene-environment interactions in Parkinson's disease: the importance of animal modeling // Clin Pharmacol Ther. -2010. Vol.88, №4. - P.467-74

159. Hruska K.S., LaMarca M.E., Scott C.R., Sidransky E. Gaucher disease: mutation and polymorphism spectrum in the glucocerebrosidase gene (GBA) // Hum Mutat. 2008. - Vol.29, №5.-P.567-83

160. Huerta S., Goulet E.J., Huerta-Yepez S., Livingston E.H. Screening and detection of apoptosis // J Surg Res. 2007. - Vol.139, №1. -P. 143-56

161. Hughes A.J., Ben-Shlomo Y., Daniel S.E., Lees A.J. What features improve the accuracy of clinical diagnosis in Parkinson's disease: a clinicopathologic study 1992 // Neurology. 2001. - Vol.57, №10, Suppl 3. -P.S34-8

162. Iaccarino C., Crosio C., Vitale C., Sanna G. Apoptotic mechanisms in mutant LRRK2-mediated cell death // Hum Mol Genetic. 2007. - Vol.16, №11.- P. 1319-26

163. Ibänez P., Bonnet A.M., Debarges B., Lohmann E., Tison F., Pollak P., Agid Y., Dürr A., Brice A. Causal relation between alpha-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease // Lancet. 2004. - Vol.364, №9440. -P.l 169-71

164. Imai Y., Gehrke S., Wang H. Q., Takahashi R., Hasegawa K., Oota E., Lu B. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila // EMBO J. 2008. - Vol. 27. - P.2432-2443

165. Ishihara-Paul L., Hulihan M.M., Kachergus J., Upmanyu R., Warren L., Amouri R., Elango R., Prinjha R.K., Soto A., Kefi M., Zouari M., Sassi S.B.,

166. Yahmed S.B., El Euch-Fayeche G., Matthews P.M., Middleton L.T., Gibson R.A., Hentati F., Farrer M.J. PINK1 mutations and parkinsonism // Neurology. 2008. -Vol.71, №12.-P.896-902

167. Jellinger K.A., Stadelmann C. Mechanisms of cell death in neurodegenerative disorders // J Neural Transm Suppl. 2000. - Vol.59. - P.95-114

168. Jellinger K.A. Challenges in neuronal apoptosis // Curr Alzheimer Res. -2006.-Vol.3, №4. P.377-91

169. Johnson S.J., Wade-Martins R. A BACwards glance at neurodegeneration: molecular insights into disease from LRRK2, SNCA and MAPT BAC-transgenic mice // Biochem Soc Trans. 2011. - Vol.39№4. - P.862-7

170. Josephs K.A., Joseph Y., Matsumoto J., Ahlskog E. Benign Tremulous Parkinsonism // Arch Neurol. 2006. - Vol.63. -P.354-357

171. Katoh N., Soga F., Nara T., Tamagawa-Mineoka R., Nin M., Kotani H., Masuda K., Kishimoto S. Effect of serotonin on the differentiation of human monocytes into dendritic cells // Clin. Exp. Immunol. 2006. - Vol.146. - P.354-361

172. Kawashima K., Fujii T. The lymphocytic cholinergic system and its contribution to the regulation of immune activity // Life Sci. 2003. - Vol.74. -P.675-696

173. Khan N.L., Graham E., Critchley P., Schrag A.E., Wood N.W., Lees A.J., Bhatia K.P., Quinn N. Parkin disease: a phenotypic study of a large case series // Brain. -2003. Vol.126, Pt 6. - P. 1279-92

174. Khan N.L., Scherfler C., Graham E., Bhatia K.P., Quinn N., Lees A.J., Brooks D.J., Wood N.W., Piccini P. Dopaminergic dysfunction in unrelated, asymptomatic carriers of a single parkin mutation // Neurology. 2005. - Vol.64, №1,-P. 134-6

175. Kawashima K., Fujii T. The lymphocytic cholinergic system and its contribution to the regulation of immune activity // Life Sci. 2003. - Vol.74, №6. -P.675-96

176. Kim H.J., Kim H.J., Lee J.Y., Yun J.Y., Kim S.Y., Park S.S., Jeon B.S. Phenotype analysis in patients with early onset Parkinson's disease with and without parkin mutations // J Neurol. 2011. - Vol.258, №12. - P.2260-7

177. Kim S., Seong M., Jeon B., Kim S., Ko H., Kim J., Park S. Phase analysis identifies compound heterozygous deletions of the PARK2 gene in patients with early-onset Parkinson disease // Clin Genet. 2011. - doi: 10.1111/j.l 399-0004.2011.01693 .x

178. Kim Y., Park J., Kim S., Song S., Kwon S.K., Lee S.H., Kitada T., Kim J.M., Chung J. PINK1 controls mitochondrial localization of Parkin through direct phosphorylation // BBRC. 2008. - Vol.377. - P.975-980

179. Kimura H., Kurimura M., Wada M., Kawanami T., Kurita K., Suzuki Y., Katagiri T., Daimon M., Kayama T., Kato T. Female preponderance of Parkinson's disease in Japan // Neuroepidemiology. 2002. - Vol.21, №6. - P.292

180. Kitada T., Pisani A., Karouani M., Haburcak M., Martella G., Tscherter A., Platania P., Wu B., Pothos E.N., Shen J. Impaired dopamine release and synaptic plasticity in the striatum of parkin-/- mice // J Neurochem. 2009. -Vol.110, №2.-P.613-21

181. Kitada T., Asakawa S., Hattori N., Matsumine H., Yamamura Y., Minoshima S., Yokochi M., Mizuno Y., Shimizu N. Mutation in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism // Nature. 1998. - Vol.392. -P.605-608

182. Klein C., Chuang R., Marras C.; Lang A.E. The curious case of phenocopies in families with genetic Parkinson's disease // Mov Disord. 2011. -Vol.26, №10.-P.1793-802

183. Klein C., Djarmati A. Parkinson disease: genetic testing in Parkinson disease-who should be assessed? Nat Rev Neurol. 2011. - P.7, №1. -P.7-9

184. Kruger R., Kuhn W., Muller T. Woitalla D., Graeber M., Kösel S., Przuntek H., Epplen J.T., Schöls L., Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding alphasynuclein in Parkinson's disease // Nat Genet. 1998. - Vol. 18, №2. - P. 106-108

185. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage "1 "4 // Nature (Lond.). 1970. - Vol.227. - P.680-685

186. Lander E.S. Initial impact of sequencing of the human genom // Nature. -2011. Vol.470. -P.187-197

187. Lasage S., Brice A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors // Hum Molec Genet. 2009. - Vol.18, №1. - P.R48-R59

188. Lee F.J.S., Liu F., Pristupa Z.B., Niznik H.B. Direct binding and functional coupling of alpha-synuclein to the dopamine transporters accelerate dopamine-induced apoptosis // Faseb J. 2001. - Vol.15. - P.916-926

189. Lee J.A. Autophagy in neurodegeneration: two sides of the same coin // BMB Rep. 2009. - Vol.42, №6. - P.324-30

190. Lee P.H., Lee G., Park H.J., Bang O.Y., Joo I.S., Huh K. The plasma alpha-synuclein levels in patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy // J Neural Transm. 2006. - Vol.13. - P. 1435-9

191. Lee S.J. Origins and effects of extracellular alpha-synuclein: implications in Parkinson's disease // J Mol Neurosci. 2008. - Vol.34, №1. -P. 17-22

192. Leon-Ponte M., Ahern G.P., O Connell P.J. Serotonin provides an accessory signal to enhance T-cell activation by signaling through the 5-HT7 receptor // Blood . 2007. - Vol. 109. - P.3139-3146

193. Lesage S., Lohmann E., Tison F., Durif F., Diirr A., Brice A. Gene symbol: PARK2. Disease: Parkinsonism, juvenile, autosomal recessive // Hum Genet. 2008. - Vol.123, №1. - P.l 14

194. Li M.J., Wang P., Liu X., Lim E.L., Wang Z., Yeager M., Wong M.P., Sham P.C., Chanock S.J., Wang J. GWASdb: a database for human genetic variants identified by genome-wide association studies // Nucleic Acids Res. -2012. Vol.40. - P.D1047-54

195. Li Q.X., Mok S.S., Laughton K.M., McLean C.A., Cappai R., Masters C.L., Culvenor J.G., Home M.K. Plasma alpha-synuclein is decreased in subjects with Parkinson's disease // Exp Neurol. 2007. - Vol.204, № 2. - P.583-588

196. Lichuan Y., Kesheng Z., Calingasan N.Y., Luo G., Szeto H.H., Beal M.F. Mitochondria Targeted Peptides Protect Against l-Methyl-4-Phenyl-l,2,3,6-Tetrahydropyridine Neurotoxicity // Antioxid Redox Signal. 2009. - Vol.11, №9.-P. 2095-2104

197. Lucking C.B., Chesneau V., Lohmann E,. Verpillat P., Dulac C., Bonnet A.M., Gasparini F., Agid Y., Diirr A., Brice A. Coding Polymorfisms in the Parkin Gene and Susceptibility to Parkinson Disease // Arch Neurol. 2003. -Vol.60.-P.1253-1256

198. Luk K.C., Song C., O'Brien P., Stieber A., Branch J.R., Brunden K.R., Trojanowski J.Q., Lee V.M. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells // PNAS. 2009. - Vol. 106.-P.20051-6

199. Lwin A., Orvisky E., Goker-Alpan O., LaMarca M.E., Sidransky E. Glucocerebrosidase mutations in subjects with parkinsonism // Mol Genet Metab. -2004,- Vol.81, №l.-P.70-3

200. Mackness M.I., Mackness B., Durrington P.N., Connelly P.W., Hegele R.A. Paraoxonase: biochemistry, genetics and relationship to plasma lipoproteins // Curr Opin Lipidol. 1996. - Vol.7.- P.69-76

201. Macleod D., Dowman J., Hammond R., Leete T., Inoue K., Abeliovich

202. A. The familial Parkinsonism gene LRRK2 regulates neurite process morphology // Neuron. 2006. - Vol.52, №4. -P.587-93

203. Manning-Bog A.B., Schiile B., Langston J.W. Alpha-synuclein-glucocerebrosidase interactions in pharmacological Gaucher models: a biological link between Gaucher disease and parkinsonism // Neurotoxicology. 2009. -Vol.30№6. - P. 1127-32

204. Manthripragada A.D., Costello S., Cockburn M.G., Bronstein J.M., Ritz

205. B. Paraoxonase 1, agricultural organophosphate exposure, and Parkinson disease // Epidemiology.- 2010,- Vol.21.- P.87-94

206. Maraganore D.M., de Andrade M., Elbaz A., Farrer M.J., Ioannidis J.P., Kriiger R., Rocca W.A., Schneider N.K., Lesnick T.G., Lincoln S.J., Hulihan M.M., Aasly J.O., Ashizawa T., Chartier-Harlin M.C., Checkoway H., Ferrarese

207. C., Hadjigeorgiou G., Hattori N., Kawakami H., Lambert J.C., Lynch T., Mellick G.D., Papapetropoulos S., Parsian A., Quattrone A., Riess O., Tan E.K., Van Broeckhoven C; Genetic Epidemiology of Parkinson's Disease (GEO-PD)

208. Consortium. Collaborative analysis of alpha-synuclein gene promoter variability and Parkinson disease // JAMA. 2006. - Vol. 296. - P.661-70

209. Marder K., Levy G., Louis E.D., Mejia-Santana H., Cote L., Andrews PL, Harris J., Waters C., Ford B., Frucht S., Fahn S., Ottman R. Familial aggregation of early- and late-onset Parkinson's disease // Ann Neurol. 2003. -Vol.54, №4. -P.507-13

210. Maries E., Dass B., Collier T.J., Kordower J.H., Steece-Collier K. The role of alpha-synuclein in Parkinson's disease: insights from animal models // Nat Rev Neurosci. 2003. - Vol.4, №9. - P.727-38

211. Marino F., Cosentino M., Bombelli R., Ferrari M., Lecchini S., Frigo G. Endogenous catecholamine synthesis, metabolism storage, and uptake in human peripheral blood mononuclear cells // Exp Hematol. 1999. - Vol.27, №3. -P.489-95

212. Markoff A., Savov A., Vladimirov V., Bogdanova N., Kremensky I., Ganev V. Optimization of single-strand conformation polymorphism analysis in the presence of polyethylene glycol // Clin Chem. 1997. - Vol.43, №1. - P.30-3

213. Maroteaux L., Campanelli J.T., Scheller R.H. Synuclein — a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve-terminal // J Neurosci. 1988.-Vol.8.-P.2804-2815

214. Martin L.J., Pan Y., Price A.C., Sterling W., Copeland N.G., Jenkins N.A., Price D.L., Lee M.K. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death // J Neurosci. 2006. -Vol.26.-P.41-50

215. Maruyama M., Ikeuchi T., Saito M., Ishikawa A., Yuasa T., Tanaka H., Hayashi S., Wakabayashi K., Takahashi H., Tsuji S. Novel Mutation, Pseudo

216. Dominant Inheritance, and Possible Familial Affects in Patients with Autosomal Recessive Juvenile Parkinsonism // Ann Neurol. 2000. - Vol 48, №2. - P245-250

217. Mazzulli J.R., Xu Y., Sun Y., et al. Gaucher disease glucocerebrosidase and alpha-synuclein form a bidirectional pathogenic loop in synucleopathies // Cell. 2011. V.146. P.37-52

218. McCarthy S., Somayajulu M., Sikorska M., Borowy-Borowski H., Pandey S. Paraquat induces oxidative stress and neuronal cell death; neuroprotection by'water-soluble coenzyme Q(10) // Toxicol Appl Pharmacol. -2004.-Vol.201.-P.21-31

219. McCormack A.L., Atienza J.G., Johnston L.C., Andersen J.K., Vu S., Di Monte D.A. Role of oxidative stress in paraquat-induced dopaminergic cell degeneration // J Neurochem. 2005. - Vol.93. - P.1030-1037

220. McGeer P.L., McGeer E.G. Glial reactions in Parkinson's disease // Mov Disord. 2008. - Vol.23, №4. - P.474-83

221. Mclnerney A., Hadley D.W., Gwinn-Hardy K., Hardy J. Genetic testing in Parkinson's disease // Mov Disord. 2005. - Vol.20. - P.1-10

222. Michell A.W., Luheshi L.M., Barker R.A. Skin and platelet alpha-synuclein as peripheral biomarkers of Parkinson's disease // Neurosci Lett. 2005. - Vol.381,№3.-P.294-8

223. Miller D.W., Hague S.M., Clarimon J., Baptista M., Gwinn-FIardy K., Cookson M.R., Singleton A.B. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson disease with SNCA locus triplication // Neurology. 2004. - Vol.62, №10.-P.1835-1838

224. Milosevic J., Schwarz S.C., Ogunlade V., Meyer A.K., Storch A., Schwarz J. Emerging role of LRRK2 in human neural progenitor cell cycle progression, survival and differentiation // Mol Neurodegener. 2009. - Vol.4.-P.25

225. Moos T., Jensen P.H. Absence of prostate apoptosis response-4 protein in substantia nigra of Parkinson's, disease autopsies // Acta Neuropathol. -2004. Vol.l07№l . - P.23-6

226. Nakano K., Higashi T., Takagi R., Hashimoto K., Tanaka Y., Matsushita S. Dopamine released by dendritic cells polarizes Th2 differentiation // Int. Immunol. 2009. - Vol.21, № 6. - P.645-654

227. Narendra D., Tanaka A., Suen D.F., Youle R.J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy // J Cell Biol. -2008. Vol.183, №5. - P.795-803

228. Nemani V.M., Lu W., Berge V., Nakamura K., Onoa B., Lee M.K., Chaudhry F.A., Nicoll R.A., Edwards R.H. // Neuron. 2010. - Vol.65. - P.66-79

229. Neudorfer O., Giladi N., Elstein D., Abrahamov A., Turezkite T., Aghai E., Reches A., Bembi B., Zimran A. Occurrence of Parkinson's syndrome in type I Gaucher disease // QJM. 1996. - Vol.89, №9. - P.691-4

230. Nicholl D.J., Bennett P., Hiller L., Bonifati V., Vanacore N., Fabbrini G., Marconi R., Colosimo C., Lamberti P., Stocchi F., Bonuccelli U., Vieregge P., Ramsden D.B., Месо G., Williams A.C. A study of five candidate genes in

231. Parkinson's disease and related neurodegenerative disorders; European Study Group on Atypical Parkinsonism // Neurology. 1999. - Vol.53, №7. - P.1415-21

232. O'Connell P.J., Wang X., Leon-Ponte M., Griffiths C., Pingle S.C., Ahern G.P. A novel form of immune signaling revealed by transmission of the inflammatory mediator serotonin between dendritic cells and T cells // Blood. -2006. Vol.107.-P.1010-101

233. Ohta E., Kubo M., Obata F. Prevention of intracellular degradation of I2020T mutant LRRK2 restores its protectivity against apoptosis // Biochem Biophys Res Commun. 2010. - Vol.391№1. - P.242-7

234. Olanow C.W., McNaught K. Parkinson's disease, proteins, and prions: milestones // Mov Disord. 2011. - Vol.26№6. - P. 1056-71

235. Oyama G., Yoshimi K., Natori S., Chikaoka Y., Ren Y.R., Funayama M., Shimo Y., Takahashi R., Nakazato T., Kitazawa S., Hattori N. Impaired invivo dopamine release in parkin knockout mice // Brain Res. 2010. - Vol.17, №1352. - P.214-22

236. Pacheco R., Prado C.E., Barrientos M.J., Bernales S. Role of dopamine in the physiology of T-cells and dendritic cells // J Neuroimmunol. 2009. -Vol.216№l-2. - P.8-19

237. Pacheco R., Ciruela F., Casado V., Mallol J., Gallart T., Lluis C., Franco R. Group I metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation // J. Biol. Chem. 2004. - Vol.279. - P.33352-33358

238. Pacheco R., Gallart T., Lluis C., Franco R. Role of glutamate on T-cell mediated immunity // J. Neuroimmunol. -2007. Vol.185. - P.9-19

239. Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W., Gilks W., Simon J., van der Brug M., de Munain A ., Aparicio S., Gil A., Khan N. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease // Neuron. 2004. - Vol. 44. - P.595-600

240. Palacino J.J., Sagi D., Goldberg M.S., Krauss S., Motz C., Wacker M., Klose J., Shen J. Mitochondrial dysfunction and oxidative damage in parkin-deficient mice // J Biol Chem. 2004. - Vol.279, №18. - P. 18614-22

241. Parkinson J. An essay on the shaking palsy // J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2002,- Vol. 14. - P.223-236

242. Payami H., Larsen K., Bernard S., Nutt J.G. Increased risk of Parkinson's disease in parents and siblings of patients // Am Neurol. 1994. -Vol.36, №4,-P.659-661

243. Pchelina S. N., Yakimovskii A. F., Ivanova O. N., Emelianov A. K., Zakharchuk A. FI. , Schwarzman A. L. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson's Disease in Russia // Mov Disord. 2006. - Vol.21, №12. -P.2234-2236

244. Peng J., Mao X.O., Stevenson F.F., Hsu M., Andersen J.K. The herbicide paraquat induces dopaminergic nigral apoptosis through sustained activation of the JNK pathway // J Biol Chem. r 2004. Vol.279, №31. - P.32626-32

245. Perez R., Waymire JC, Lin E, Liu J.J., Guo F., Zigmond M.J. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis // J Neurosci. 2002. -Vol.22.-P.3090-3099

246. Perez R.G., Hastings T.G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. -2004. Vol.89, №6. - P. 1318-24

247. Periquet M., Fulga T., Myllykangas L., Schlossmacher M.G., Feany M.B. Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo // J Neurosci. 2007. - Vol.27№12. - P.3338-46

248. Pirkevi C., Lesage S., Brice A., Ba§ak A.N. From genes to proteins in mendelian Parkinson's disease: an overview // Anat Rec (Hoboken). 2009. -Vol.292, №12. -P.1893-901

249. Plowey E.D., Chu C.T. Synaptic dysfunction in genetic models of Parkinson's disease: a role for autophagy? Neurobiol Dis. 2011. - Vol.43, №1. -P.60-7

250. Polwey E.D., Cherra S.J., Liu Y., Chu C,T. Role of autophagy in G2019S-LRRK2-associated neurite shortenibg in differentiated SH-SY5Y cells // J Neurocem. 2008. - Vol.105. - P.1048-1056

251. Poorkaj P., Bird T.D., Wijsman E., Nemens E., Garruto R.M., Anderson L., Andreadis A., Wiederholt W.C., Raskind M., Schellenberg G.D. Tau is a candidate gene for chromosome 17 frontotemporal dementia // Ann Neurol.1998.-Vol.43, №6.-P.815-25

252. Popescu B. O., Toescu E. C., Popescu L. M., Bajenaru O., Muresanu D. F., Schultzberg M., Bogdanovic, N. Blood-brain barrier alterations in ageing and dementia//J. Neurol. Sci. -2009. Vol.283. -P.99-106

253. Poulopoulos M., Levy O.A., Alcalay R.N. The neuropathology of genetic Parkinson's disease // Mov Disord. 2012. - doi: 10.1002/mds.24962

254. Priyardarshi A., Khuder S.A., Schaub E.A., Shrivastava S. A metaanalysis of Parkinson's disease and exposure to pesticides // Neurotoxicology. -2000. Vol.21, №4. - P.435-440

255. Qi Z., Yang W., Liu Y., Cui T., Gao H., Duan C., Lu L., Zhao C., Zhao H., Yang H. Loss of PINK1 function decreases PP2A activity and promotes autophagy in dopaminergic cells and a murine model // Neurochem Int. 2011. -Vol.59, №5.-P.572-81

256. Qing H., Wong W., McGeer E.G., McGeer P.L. Lrrk2 phosphorylates alpha-synuclein at serine 129: Parkinson disease implications // BBRC. 2009. -Vol.387.-P.149-152

257. Rajda C., Dibö G, Vécsei L, Bergquist J. Increased dopamine content in lymphocytes from high-dose L-Dopa-treated Parkinson's disease patients // Neuroimmunomodulation. 2005. - Vol.12, № 2. - P.81-84

258. Ramachandiran S., Hansen J.M., Jones D.P., Richardson J.R., Miller G.W. Divergent mechanisms of paraquat, MPP+, and rotenone toxicity: oxidation of thioredoxin and caspase-3 activation // Toxicol Sei. 2007. - Vol.95 №1. -P.163-71

259. Rocca W.A., McDonnell S.K., Strain K.J., Bower J.H., Ahlskog J.E., Elbaz A., Schaid D.J, Maraganore D.M. Familial aggregation of Parkinson's disease: The Mayo Clinic family study // Ann Neurol. 2004. - Vol.56, №4. -P.495-502

260. Roho C.F., Montagna P., Breedveld G. Cortelli P., Oostra B.A., Bonifati V. Homozygous PINK1 C-Terminus mutation causing early-onset parkinsonism // Ann Neurol. 2004. - Vol.56. - P.427-431

261. Rosen A., Casciola-Rosen L. Autoantigens as substrates for apoptotic proteases: implications for the pathogenesis of systemic autoimmune disease // Cell death and differentiation. 1999. - Vol.6. - P.6-12

262. Ruiz-Ponte C., Carracedo A., Barros F. Duplication and deletion analysis by fluorescent real-time PCR-based genotyping // Clin Chim Acta. -2006. Vol.363, №1-2.-P.138-46

263. Salmon M., Gordon C. The role of apoptosis in systemic lupus erythematosus // Rheumatology. 1999. - Vol.38. - P.l 177-1183

264. Savitt M., Dawson V.L., Dawson T.M. Diagnosis and treatment of Parkinson's disease: molecules to medicine // J Clin Investigation. 2006. -Vol.116.-P.1744-1754

265. Schaefer S., Vogt T., Nowak T., Kann P.H., German KIMS board. Pituitary function and the somatotrophic system in patients with idiopathic

266. Parkinson's disease under chronic dopaminergic therapy // J Neuroendocrinol. -2008 -Vol.20, №1.-P. 104-109

267. Shapira A.H., Gegg M. Mitochondrial contribution to Parkinson's disease pathgenesis // Parkinson's disease. 2011. - Vol.2011, ID 159160. - P.7

268. Shapiro H.M. (Ed.). Practical Flow Cytometry, 4 ed. 2003, New York: John Wiley & Sons Inc. - 736p

269. Shimura H., Hattori N., Kubo S. et al. Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase // Nature Genet. 2000. - Vol.25. -P.302-305.

270. Shimura H., Hattori N., Kubo S., Mizuno Y., Asakawa S., Minoshima S., Shimizu N., Iwai K., Chiba T., Tanaka K., Suzuki T. Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase // Nature Genet. 2000. -Vol.25.-P.302-305

271. Shulman J.M., DeJager P.L., Feany M.B. Parkinson's disease: Genetics and Pathogenesis // Ann Rev Pathol Mech. 2011. - Vol.6. - P. 193-222

272. Shults C.W., Barrett J.M., Fontaine D. alpha-synuclein from platelets is not phosphorylated at serine 129 in Parkinson's disease and multiple system atrophy // Neurosci Lett. 2006. - Vol.405, №3. - P.223-5

273. Shults C.W., Rockenstein E., Crews L., Adame A., Mante ML, Larrea

274. Sidransky E., Nails M.A., Aasly J.O., Aharon-Peretz J., Annesi G., Barbosa E.R., Bar-Shira A., Berg D., Bras J., Brice A., Chen C.M., Clark L.N., Condroyer C., De Marco E.V., Dürr A., Eblan M.J., Fahn S., Farrer M.J., Fung

275. H.C., Gan-Or Z., Gasser T., Gershoni-Baruch R., Giladi N., Griffith A., Gurevich T., Januario C., Kropp P., Lang A.E., Lee-Chen G.J., Lesage S., Marder K., Mata

276. Sidransky E., Samaddar T., Tayebi N. Mutations in GBA are associated with familial Parkinson disease susceptibility and age at onset // Neurology. -2009.- Vol.73, №17. -P. 1424-5

277. Sidransky E. Gaucher disease: complexity in a "simple" disorder // Mol Genet Metab. 2004. - Vol.83, №1-2. - P.6-15

278. Singh M., Khan A.J., Shah P.P., Shukla R., Khanna V.K., Parmar D. Polymorphism in environment responsive genes and association with Parkinson disease // Mol Cell Biochem. 2008. - Vol.312, .№1-2. - P.131-8

279. Singleton A. What does PINK1 mean for Parkinson disease? Neurology. 2004. - Vol.63. - P. 1350-1351

280. Smith W. W., Pei Z., Jiang H., Dawson V. L., Dawson T. M., Ross C. A. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates-neuronal toxicity // Nat Neurosci. -2006. Vol. 9.-P.1231-1233

281. Smith W.W., Pei Z., Jiang H., Dawson V.L. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity // Nat Neurosci. 2006. - Vol.10. - P. 12311233

282. Sogorb M.A., Vilanova E. Enzymes involved in the detoxification of organophosphorus, carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis // Toxicol Lett.- 2002.-Vol.128,- P.215-28

283. Sorge J., West C., Westwood B., Beutler E. Molecular cloning and nucleotide sequence of human glucocerebrosidase cDNA // Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. - Vol.82, №21. - P.7289-93

284. Spillantini M.G., Schmidt M.L., Lee VMY, Trojanowski J.Q., Jakes R., Goedert M. Alph-asynuclein in Lewy bodies // Natureio 1997. - Vol. 388. -P.839-840

285. Tan E.K., Chandran V.R., Fook-Chong S., Shen H., Yew K., Teoh M.L., Yuen Y., Zhao Y. Alpha-synuclein mRNA expression in sporadic Parkinson's disease // Mov Disord. 2005. - Vol.20, № 5. - P.620-623

286. Tan E.K., Khajavi M., Thornby J.I., Nagamitsu S., Jankovic J., Ashizawa T. Variability and validity of polymorphism association studies in Parkinson's disease,// Neurology. 2000. - Vol.55, №4. - P.533-8

287. Tanji K., Mori F., Kakita A., Takahashi H., Wakabayashi K. Alteration of autophagosomal proteins (LC3, GABARAP and GATE-16) in Lewy body disease // Neurobiol Dis. 2011. - Vol.43. - P.690-7

288. Tatti M., Motta M., Salvioli R. Autophagy in Gaucher disease due to saposin C deficiency // Autophagy. 2011. - Vol.7. - P.94-5

289. Tatton N.A. Incresed caspase 3 and BAX immunoreactivity accompany nuclear GAPGH translocation and neuronal apoptosis in Parkinson disease // Exp. Neurol. 2000 - Vol.166. - P. 29-43

290. Tatton W.G., Chalmers-Redman R., Brown D., Tatton N. Apoptosis in Parkinson's disease: signals for neuronal degradation // Ann Neurol. 2003. -Vol.53, Suppl 3. - P.S61-70

291. Tawara T., Fukushima T., Hojo N., Isobe A., Shiwaku K., Setogawa T., Yamane Y. Effects of paraquat on mitochondrial electron transport system and catecholamine contents in rat brain // Arch Toxicol. 1996. - Vol.70. - P.585-589

292. Taymans J., Cookson M.R. Mechanisms in dominant parkinsonism: The toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein, and tau // BioEssays. 2010. -Vol.32. - P.227-235

293. Thiruchelvam M.J., Powers J.M., Cory-Slechta D.A., Richfield E.K. Risk factors for dopaminergic neuron loss in human alpha-synuclein transgenic mice // Eur J Neurosci. 2004. - Vol. 19. - P.845-854

294. Tian, J., Lu Y., Zhang H., Chau C.H., Dang H.N., Kaufman D.L. Gamma-aminobutyric acid inhibits T cell autoimmunity and the development of inflammatory responses in a mouse type 1 diabetes model // J. Immunol. 2004. -Vol.173.-P.5298-5304

295. Todes C.J., Lees A.J. The pre-morbid personality of patients with Parkinson's disease // J Eur Neurosurg Psychiatry. 1985. - Vol.48. - P.97-100

296. Tong Y., Pisani A., Martella G., Karouani M., Yamaguchi H., Pothos E.N., Shen J. R1441C mutation in LRRK2 impairs dopaminergic neurotransmission in mice // Proc Natl Acad Sci USA.- 2009. Vol.106, №34. -P. 14622-7

297. Tong Y., Shen J. Alpha-synuclein and LRRK2: Partnes in Crime // Neuron. 2009. - Vol.64. - P.771 - 773

298. Trojanowski J.Q. Rotenone neurotoxicity: a new window on environmental causes of Parkinson's disease and related brain amyloidoses // Exp Neurology. 2003. - Vol. 179. - P.6-8

299. Tunner C.M., Ottoman R., Goldman S.M., Ellenberget J. Parkinson's disease in twins: An etiologic study // JAMA. 1999. - Vol.281. - P.341-346

300. Ueda K., Fukushima H., Masliah E., Xia Y., Iwai A., Yoshimoto M., Otero D.A., Kondo J, Ihara Y, Saitoh T. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease // PNAS. 1993. -Vol.90.-P.l 1282-11286

301. Vaux D.L., Flavell R.A. Apoptosis genes and autoimmunity. Curr Opin Immunol. -2000. Vol.12, №6. - 719-24

302. Velayati A., Yu W.H., Sidransky E. The role of glucocerebrosidase mutations in Parkinson disease and Lewy body disorders // Curr Neurol Neurosci Rep. 2010. - Vol. 10, №3. - P. 190-8

303. Vernon A.C., Ballard C., Modo M. Neuroimaging for Lewy body disease: is the in vivo molecular imaging of a-synuclein neuropathology required and feasible? Brain Res Rev. 2010. - Vol.65. - P.28-55

304. Vieregge P., Heberlein I. Increased risk of Parkinson's disease in relatives of patients // Ann Neurol. 1995. - Vol.37, №5. - P.685

305. Vila M., Przedborski S. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease // Nature Med. 2004. - Vol.10. - P.S58-S62

306. Wang M.S., Boddapati S., Emadi S., Sierks M.R. Curcumin reduces a-synuclein induced cytotoxicity in Parkinson's disease cell model // BMC Neurosci. -2010.-Vol.ll.-P.57

307. Watanabe Y., Nakayam T., Nagakubo D., LIieshima K., Jin Z., Katou F., Hashimoto K., Yoshie O. Dopamine selectively induces migration and homing of naive CD8+ T cells via dopamine receptor D3 // J Immunol. 2006. - Vol.176. - P.848-856

308. Waxman E.A., Giasson B.I. A novel, high-efficiency cellular model of fibrillar alpha-synuclein inclusions and the examination of mutations that inhibit amyloid formation // J Neurochem. 2010. - Vol.113. - P.374-88

309. White L.R., Toft M., Kvam S.N., Farrer M.J., Aasly, J.O. MAPK-pathway activity, Lrrk2 G2019S, and Parkinson's disease // J Neurosci Res 2007. - Vol.85.-P.1288-1294

310. Xiongwei Z., Babar A., Siedlak S.L., Yang Q., Ito G., Iwatsubo T., Smith M.A., Perry G., Chen S.G. LRRK2 in Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies // Molecular Neurodegeneration. 2006. - Vol.1. - P. 17

311. Xu J., Kao S.Y., Lee F.J., Song W., Jin L.W., Yankner B.A. Dopamine-dependent neurotoxicity of alpha-synuclein: a mechanism for selective neurodegeneration in Parkinson disease // Nat Med. 2002. - Vol.8, №6. - P.600-6

312. Xu P.Y., Liang R., Jankovic J., Hunter C., Zeng Y.X., Ashizawa T., Lai D., Le W.D. Association of homozygous 7048G7049 variant in the intron six of Nurrl gene with Parkinson's disease // Neurology. 2002. - Vol.58, №6. - P.881-4

313. Yamada M., Kida K., Amutuhaire W., Ichinose F., Kaneki M. Gene disruption of caspase-3 prevents MPTP-induced Parkinson's disease in mice // Biochem Biophys Res Commun. 2010. - Vol.402, №2. - P.312-8

314. Yamamura Y. The long journey to the discovery of PARK2 // Neuropathology. 2010. - PMID: 20667007

315. Yang Q., She H., Gearing M., Colla E., Lee M., Shacka J.J., Mao Z. Regulation of neuronal survival factor MEF2D by chaperone-mediated autophagy // Science. 2009. - Vol.323. - P. 124-7

316. Yang Q., Mao Z. Parkinson disease: a role for autophagy // Neuroscientist.- 2010 Vol.16, №4,- P. 335-341

317. Yap T.L., Gruschus J.M., Velayati A., Westbroek W., Goldin E., Moaven N., Sidransky E., Lee J.C. Alpha-synuclein interacts withdiseases // J Biol Chem. -2011.- Vol.286, №32. P.28080-8

318. Youle R.J., Narendra D.P. Mechanisms of mitophagy // Nature Rev., 2011, V.12. P.9-14

319. Zhou W., Zhu M., Wilson M.A., Petsko G.A., Fink A.L. The oxidative state of DJ-1 regulates its chaperone activity toward alpha-synuclein // J Mol Biol. 2006. - Vol.356. - P.1036-1048

320. Zimprich A., Biskup S., Leitner P., Farrer M., Lincoln S., Kachergus J., Hulihan M., Uitti R., Calne D. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology // Neuron. 2004. - Vol. 44. - P.601-607

321. Zintzaras E., Hadjigeorgiou G.M. Association of paraoxonase 1 gene polymorphisms with risk of Parkinson's disease: a meta-analysis // J Hum Genet. -2004. Vol.49, №9. - P.474-81

Информация о работе

Пчелина, Софья Николаевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетические основы наследственных форм болезни Паркинсона - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы