Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ЛЕЙЦИНБОГАТОЙ КИНАЗЫ 2 (LRRK2) У ЛИЦ С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ЛЕЙЦИНБОГАТОЙ КИНАЗЫ 2 (LRRK2) У ЛИЦ С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА"

На правах рукописи

Иванова Ольга Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ЛЕЙЦИНБОГАТОЙ КИНАЗЫ 2 (ЫШК2) У ЛИЦ С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА

03.00.15 - генетика 14.00.13- нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата

Москва 2008

003454189

Работа выполнена в отделе молекулярно-генетических технологий НИЦ Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

Научные руководители: кандидат биологических наук,

Пчелина Софья Николаевна доктор медицинских наук, профессор Якимовский Андрей Федорович

Официальные оппоненты: кандидат медицинских наук,

Воскобоева Елена Юрьевна доктор медицинских наук, профессор Иванова-Смоленская Ирина Анатольевна

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт

экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

часов на заседании

Защита состоится «Р<Р» 2008 г. в ¿Г

Диссертационного Совета Д 001.016.01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу. 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН. Автореферат разослан «¿¿V» 2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 001.016.01, доктор медицинских наук

Зинченко Р.А

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Болезнь Паркиисона (БП) - одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среднего и пожилого возраста, впервые была описана Джеймсом Паркинсоном в 1817 году как дрожательный паралич. БП является хронической неуклонно прогрессирующей болезнью, которая встречается во всех популяциях мира. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 65 лет составляет 1-3% (Mata I.F. et al., 2005; Zhu X. et al., 2006). Основным в клинике БП является следующий симптомокомплекс: повышенный тонус скелетной мускулатуры по экстрапирамидному типу, пониженная двигательная активность (брадикинезия), низкочастотный тремор покоя конечностей и других частей тела, постуральная неустойчивость. Диагноз БП может быть поставлен только при наличии не менее двух из указанных симптомов. Однако, клинический диагноз, даже при развернутой картине заболевания не всегда -находит нейрогистопатологическое подтверждение (Bennet D.A. et al., 1996; Bower J.H. et al„ 2002).

Морфологическая картина при БП включает прогрессирующую гибель дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (ЧС), что приводит к резкому снижению концентрации дофамина в полосатом теле, а также наличие внутриклеточных эозинофильных включений в сохраненных нейронах, получивших названия телец Леви.

Необходимо также отметить, что симптомокомплекс БП проявляется при гибели 80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Процесс нейродегенерации начинается задолго до дебюта заболевания, а когда оно становиться явным, патогенетическая терапия может быть уже не эффективной. В арсенале медицины существует метод диагностики, который позволяет поставить диагноз БП до появления клинических симптомов - позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). ПЭТ позволяет прижизненно изучать структурно-функциональное состояние церебральных нейротрансмиттерных

структур. Широкое применение данного метода в клинической практике ограничено, так как ПЭТ относиться к дорогостоящим методам и в ряде случаев является не точным (Savitt J.M. et al., 2006). Таким образом, поиск маркеров БП, позволяющих проводить раннюю диагностику заболевания, а также при необходимости дифференциальную диагностику БП с другими неврологическими заболеваниями со сходными клиническими проявлениями -остается крайне актуальным.

Достижения молекулярной генетики последних лет позволили по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза, нозологической принадлежности и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП носит мультифакториальный характер, около 15% больных БП имеют семейную форму БП, когда заболевание имело место у нескольких родственников из одного или разных поколений (Gasser Т., 2007). Описаны семьи, где наследование заболевания происходит как по аутосомно-рецессивному, так и по аутосомно-доминантному типу.

За последние 11 лет описано одиннадцать генетических локусов, ответственных за развитие моногенных форм БП (Dawson Т.М., 2007). В шести случаях удалось идентифицировать конкретные гены и провести детекцию мутаций у больных. Мутации в генах паркина (PARK2), PTEN-индуцированной киназы l(PINKl) и DJ-1 выявлены при аутосомно-рецессивной форме БП, и мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA), убиквитин-С-концевой гидролазы LI (UCH-L1), лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) при аутосомно-доминантной форме заболевания (Gasser Т., 2007). ДНК-анализ в семьях с известной молекулярной природой БП может использоваться для доклинической диагностики данного заболевания, что позволит проводить у пациентов активное профилактическое лечение, своевременно начать адекватную симптоматическую терапию.

По существующим данным наиболее частым молекулярным дефектом, ответственным за развитие наследственной формы БП, являются мутации в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2, локус PARK8), кодирующем белок, названный дардарином (Gasser Т., 2007). Исследование мутаций гена LRRK2 и

их изучение стало возможным после картирования хромосомного локуса PARK8 в 2002 году (Funayama М. et al., 2002). В 2004 году впервые обнаружена сегрегация мутаций в гене LRRK2 с БП в семьях (Paisan-Ruis С. et al., 2004; Zimpritch A. et al., 2004). В настоящее время у больных с аутосомно-доминантной формой БП, выявлен ряд аминокислотных замен в кодирующей области гена. В гене имеются мажорные мутации (G2019S, R1441C/G, Y1699C, I2020T), обнаруживаемые у больных БП в различных популяциях (Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008). Наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП является мутация G2019S, которая встречается в европейских популяциях в 5-7% случаев семейной БП, но также была обнаружена в 0,6-1,6% спорадических случаев (Di Fonso A. et al., 2005; Gilks W. et al., 2005). В некоторых изолированных популяциях, например, среди арабов северной Африки и евреев-ашкенази, частота данной мутации среди семейных форм БП достигает 30-40% (Lesage S. et al., 2005; Ozelius L.J. et al., 2006). В то же время мутация G2019S не обнаружена в некоторых азиатских популяциях (Tan Е.К. et al., 2005; Fung Н.С. et al., 2006). Остальные мутации оказались менее распространенными, однако в ряде случаев их частота показывала сильные межпопуляционные различия. Так, неожиданно высокая частота мутации R1441G (16,4% и 4% среди семейных и спорадических форм БП, соответственно) была обнаружена среди популяции басков в Испании (Simón-Sánchez J. et al., 2006).

Кодирующая область гена LRRK2 содержит 51 экзон (2527 аминокислот). Несмотря на большую протяженность гена, в ряде популяций был определен полный спектр мутаций среди больных БП (Mata I.F. et al., 2005; Di Fonzo A. et al., 2006; Paisan-Ruiz C. et al., 2008). Определение популяционной специфичности мутаций является необходимым условием для проведения молекулярной диагностики заболевания и внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику. Разработка молекулярных методов диагностики БП остается особенно актуальной в силу отсутствия широкодоступных диагностических маркеров, позволяющих осуществлять

диагностику заболевания на ранних стадиях БП. До настоящего времени в России спектр мутаций в гене ЬНЯК2 среди больных БП остается неизвестным.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования. Цель исследования.

Выявление мутаций в гене лейцинбогатой киназы 2 {ЬЯЯК2) у лиц с БП и сопоставление клинического течения заболевания у больных БП, имеющих мутации в гене ЬШО(2, и пациентов с БП отличной этиологии. Задачи исследования.

1. Сопоставление клинического течения БП в зависимости от пола пациентов, возраста начала заболевания и наличия у них семейного анамнеза.

2. Разработка молекулярно-генетических методов идентификации мажорных мутаций (020198, К1441С/0/Н, 12020Т, 12012Т) в гене ШКК2 и их скрининг в группе пациентов с БП и в контрольной группе.

3. Поиск мутаций в кодирующей области гена ЬЯЯК2 у пациентов с семейной формой БП.

4. Разработка методов идентификации выявленных мутации на основе метода ПЦР с последующим рестрикционным анализом и их скрининг в группе пациентов со спорадической формой БП и в контрольной группе.

5. Молекулярно-генетическое и неврологическое обследование семей пробандов с выявленными мутациями в гене ЬШ1К2, а также сопоставление клинического течения БП, обусловленной известным молекулярным дефектом в гене ЬЯИК2 и БП отличной этиологии.

Научная новизна.

Впервые в России проведено определение спектра мутаций в гене ЬЯКК2 у больных с БП. У больных с семейной формой БП выявлены мутации 020195 и У1613А. Мутация VI613А в гене ЬКИК2 описана впервые в мире. У больных со спорадической формой БП впервые в России выявлены мутации 020198 и Я1441С. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у больных с выявленными мутациями в гене ЫШК2 с больными БП отличной этиологии. Впервые в мире среди больных с БП, обусловленной мутацией

020198, отмечено преобладание побочных эффектов от терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами. Разработаны простые методы идентификации мутаций (020198, Ш441С/0/Н, 12020Т, 12012Т, У1613А) в гене ЬКИК2 на основе ПЦР и рестрикционного анализа. Практическая значимость работы.

В данной работе охарактеризован спектр мутаций в гене ЫЖК2 среди больных БП Северо-Западного региона России. Разработанные нами методы экспресс-тестирования мутаций в гене могут быть использованы в клинической

практике при выявлении наследственных форм БП, обусловленных мутациями в гене ЬКЯК2, Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей больных БП, обусловленной мутациями в этом гене, и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутаций до начала проявления клинических симптомов заболевания. Такой подход может способствовать повышению эффективности лечения БП. Основные положения, выносимые на защиту.

1. В клинической картине БП выявлено преобладание определенных симптомов заболевания у пациентов в зависимости от пола, возраста начала заболевания и наличия семейного анамнеза. 2 Среди больных семейной формой БП Санкт-Петербурга выявлено пять семей, в которых развитие БП обусловлено ранее описанной мутацией 020195 в гене ЬШ1К2. В трех случаях из пяти клиническое течение БП в этих семьях не отличалось от классической БП.

3. Впервые обнаружена новая мутация VI61 ЗА, приводящая к развитию семейной формы БП с преобладающим тремором.

4. У больных со спорадической формой БП выявлены ранее известные мутации в гене ЬНКК2\ 020198 и Я1441С.

5. В группе больных с БП, обусловленной мутациями в гене ЫШК2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении Л-ДОФА-содержащих препаратов.

Личное участие автора в получении результатов,_изложенных_в

диссертации.

Неврологический осмотр пациентов с БП и забор венозной крови выполнены автором лично. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа, скрининг мутаций в группе пациентов с БП и в контрольной группе проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Апробация работы.

Предложенные к защите результаты были доложены на II международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения", Санкт-Петербург, СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова (2007), научно-практической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины", СПбМАПО (2007), конференции "Фундаментальные науки-медицине", РАН, Москва (2006), 11 международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология наука XXI века", Москва (2007), I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008). Публикации.

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 5 статей, 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику.

Методы ДНК-диагностики, разработанные на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом, внедрены в работе СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова для диагностики семейных форм БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов,

практических рекомендаций и списка литературы (96 наименования). Работа изложена на 101 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 17 рисунками и фотографиями.

Материалы и методы исследования Общая характеристика групп.

Обследовано 278 пациентов с различными формами БП (274 пробанда и 4 родственника с БП), проходивших обследование на базе консультативно-диагностического центра СПбГМУ имени академика И.П.Павлова. Критериями отбора служило сочетание хотя бы двух фенотипических проявлений, характерных для БП, и исключение других нейродегенеративных заболеваний (по данным клинического осмотра и дополнительных методов исследования). Все обследованные нами пациенты были разделены две группы:

1. Группа больных с семейной формой БП с аутосомно-доминантным характером наследования (85 пробанда и четыре родственника). Характер наследования определялся при проведении клинико-генеалогического исследования.

2. Группа больных со спорадической формой БП (189 человек). Контрольная группа состояла из 161 индивидуумов старше 85 лет,

состоящих на учёте в Санкт-Петербургском Городском Гериатрическом Центре. Все члены контрольной группы проходили обследование у невролога с целью исключения диагноза БП и других нейродегенеративных заболеваний. Данная выборка является спорадической и принадлежит к тому же географическому региону, что и включенная в анализ группа лиц с БП.

Во всех обследованных группах был осуществлен забор крови для последующего молекулярно-генетического анализа. Данная работа одобрена этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, протокол №79 от 20 февраля 2007 года. Экспериментальные методы.

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т. и др., 1984). Лизис клеток

проводили по методу Канкеля (Lahiri D. К. et al., 1992). ПЦР проводили на автоматическом термоциклере Терцик (ДНК-Технология, Москва).

Идентификация мажорных мутаций (G2019S, R144IC/G/H, I2020T, I2012T) в гене LRRK2 осуществлялась методом ПЦР и рестрикционного анализа. Нормальный и мутантный аллели различали по длине рестрикционных фрагментов, используя электрофорез в 8% ПААГ с окраской раствором бромистого этидия.

Для идентификации мутаций G2019S в экзоне 41 гена LRRK2 был разработан метод ПЦР с введением сайта рестрикции для эндонуклеазы BsuRI в амплифицируемый фрагмент и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием данной эндонуклеазы. Для идентификации мутаций R1441C/G/H в экзоне 31 гена LRRK2 был также разработан оригинальный метод на основе ПЦР фрагмента гена LRRK2, содержащего мутации R1441C/G/H, и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием эндонуклеазы Bsh 12361. Для поиска мутаций I2012T, I2020T в экзоне 41 гена LRRK2 разработан метод на основе ПЦР и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием эндонуклеазы Bse MI. Все выявленные мутации были подтверждены методом прямого секвенирования на приборе ABI 377.

Для секвенирования 51 экзона гена LRRK2 у больных с аутосомно-доминантной формой БП (83 пациента) были выбраны праймеры, фланкирующие 51 экзон и экзон-интронные стыки. ПЦР фрагментов, включающих экзоны гена LRRK2, проводилась на приборе ICycler (BIO-RAD, США) с использованием смеси для ПЦР Roche PCR Mix, при добавлении соответствующих праймеров. Реакция терминирования проводилась с использованием кита Big Dye Terminator (version 3,1) Cycle Sequencing Ready Reaction DNA Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) на приборе ICycler (BIO-RAD США). Образцы анализировались на приборе ABI PRISM 3100 Genetic Analyzers (Applied Biosystems, Foster City, CA). Анализ результатов секвенирования проводился с использованием программного обеспечения Sequencher™ 4.14.(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

Для скрининга выявленной мутации V1613A в экзоне 34 гена LRRK2 был также разработан оригинальный метод на основе ПЦР и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов с использованием эндонуклеазы Bshl236I. Нормальный и мутантный аллели различали по длине рестрикционных фрагментов, используя электрофорез в 12% ПААГ с окраской раствором бромистого этидия.

Статистический анализ был проведен с использованием программы Statistica версия 6.0 для Windows ХР. Для сравнения клинической характеристики между групп больных использовался критерий %2, при малочисленных группах х2 с поправкой Йетца. Сравнение среднего возраста пациентов проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при Р < 0,05.

Результаты и обсуждение Сопоставление клинического течения заболевания у пациентов с БП в зависимости от выбранных параметров.

Для сопоставления клинического течения БП было отобрано 160 пациентов, страдающих БП, пять и более лет. Эта подгруппа больных была создана исходя из того, что данное заболевание имеет прогрессирующий характер и с течением времени у пациентов, страдающих БП, в клинической картине к дебютным проявлениям добавляются новые дополнительные симптомы заболевания, что может привести к изменению клинической формы болезни. Сопоставление клинической картины БП в подгруппах проводилось по следующим параметрам: пол, наличие у больного определенной формы заболевания: треморной, акинетико-треморной, акинетико-ригидно-треморной, акинетико-ригидной, ригидно-треморной; средний возраст пациентов, средний возраст начала заболевания, наличие положительного эффекта и побочных явлений при лечении JI-ДОФА-содержащими препаратами. Последние два параметра оценивалась только у той части больных, которая получала препараты содержащие Л-ДОФА.

При сопоставлении клинического течения заболевания у пациентов с длительностью БП пять лет и более в нашем исследовании было обнаружены

следующие закономерности: треморная форма БП преобладает у

женщин по сравнению с мужчинами (р=0,007), а также при семейной БП по сравнению со спорадической (р=0,009); акинетико-ригидно-треморная форма преобладает у мужчин (р=0,003); ригидно-треморная форма достоверно чаще встречается в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП (р=0,04).

В литературе ранее описано превалирование треморной формы БП у женщин по сравнению с мужчинами (Haaxma С.А. et al., 2007), что согласуется с полученными нами данными. Однако необходимо отметить, что существуют исследования, в которых не было выявлено каких-либо клинических особенностей БП в зависимости от пола (Scott В. et al., 2000).

Ранее проводилось сопоставление клинического течения БП у пациентов с семейной формой заболевания и у больных со спорадической формой БП (Сагг J. et al., 2003). При этом анализировались следующие параметры: пол, возраст начала заболевания, наличие тремора в клинической картине болезни, побочных эффектов при приеме JI-ДОФА-содержащих препаратов. Было показано, что течение заболевания по данным параметрам у пациентов с семейной формой БП и со спорадической формой заболевания не отличается (Carr et al., 2003). В нашем случае выявлено преобладание треморной формы заболевания при семейной БП по сравнению со спорадической, а ригидно-треморной формы - в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП. Скрининг мажорных мутаций в гене LRRK2 у больных БП. Идентификация мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, I2012T) осуществлялась у 278 пациентов с БП разработанными нами методами на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Было обнаружено: 1) в 41 экзоне гена LRRK2 нуклеотидная замена гуанина на аденин в положении 6055 в гетерозиготном состоянии, приводящая к замене глицина на серин в положении 2019 (G2019S) у пяти пробандов с семейной формой БП (5/85, 5,9%) и у одного пациента со спорадической формой БП (1/189, 0,5%).

2) в 31 экзоне гена LRRK2 нуклеотидная замена С4321Т в

гетерозиготном состоянии, приводящая к замене аргинина в 1441 положении на цистеин (мутации R1441C), у одного пациента со спорадической формой БП (1/189,0,5%). Мутация G2019S.

Родословные пяти семей с БП, обусловленной мутацией G2019S представлены на рис. 1. Молекулярно-генетический анализ был проведен у кровных родственников пробандов. В одной семье PD1 выявлено два носителя мутации, оба пациента страдают БП. В семье PD2 мутация G2019S обнаружена у двух человек: больного БП и его сына, у которого на момент осмотра данных за неврологическую патологию нет. У всех пробандов мутация выявлена в гетерозиготном состоянии. Анализ всех пяти родословных позволяет говорить о аутосомно-доминантном наследовании БП в этих семьях.

Мутация G2019S расположена в киназном домене дардарина и приводит к увеличению его киназной активности, что соответствует доминантному наследованию с предположительным "gain off function" механизмом (Giasson B.I. et all., 2006; West A.B. et all., 2007; Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008).

По литературным данным, мутация G2019S является наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП. В данном исследовании мутация G2019S была обнаружена в 5,9% случаев среди пациентов с семейной формой БП и не обнаружена в контрольной группе больных. Интересно отметить, что все выявленные носители мутации G2019S сообщали о происхождении, связанном с евреями-ашкенази, что не удивительно, принимая во внимание высокую частоту этой мутации среди данной популяции (Lesage S. et all., 2005; Ozelius L.J. et all., 2006). Анализ гаплотипов показал, что есть эффект основателя для мутации G2019S в пределах популяций, но европейский эффект основателя отличается от редкого японского G2019S гаплотипа. Это наводит на мысль, что данная мутация происходит, по крайней мере, дважды, но становиться широко рассеянной среди популяций (Dawson Т.М., 2007).

Таким образом, частота встречаемости мутации 020198 среди больных с семейной формой БП в Северо-Западном регионе России соответствует данным, полученным для европейских популяций.

РЭ4

III

А»

Ш-1 М1-2 111-3

Р1Э2

^11-1 (60)

та

РРЗ

^ и-з

Ж ^ 1-2

' 11.2

111-2 111-Э 65(50) 72

¿>

Н=1 111-2

РР5

■У

о

11-1 11-2 п т

75(68)

111-4 111-5 т (60) 73(59)1 1

Рис. 1. Родословные пяти семей (РЭ1-Р05) с мутацией 020198 в гене 1ММК2. Закрашенные элементы показывают членов семей с БП. Внизу элементов обозначены: генотип (т - гетерозиготное носительство мутации 020198; п - отсутствие мутации), возраст на момент исследования и возраст начала заболевания (указан в скобках).

В европейских популяциях мутация С2019Б обнаруживается в 0.6-1.6% спорадических случаев (Б1 Роп/л А.Б. е1 а!., 2005; вИкв XV. е1.а1., 2005). В данном исследовании мутация 020198 найдена в 0,5 % случае. Таким образом, частота мутации С2019Б в спорадических случаях БП в Северо-Западном регионе России соответствует полученным данным в европейской популяции.

Кроме того, наши данные по частоте встречаемости мутации 020198 соответствуют данным, полученным по распространению данной мутации среди больных БП со спорадической формой БП для г. Москвы: мутация 020198 обнаружена в 0,7% спорадических случаев БП (Шадрина М. И. и др., 2007).

Мутация 111441 С.

В нашей выборке больных с БП у одного больного выявлена мутация И. 1441С. Кроме того, у одного пациента со спорадической формой БП мы выявили ранее

неописанную нуклеотидную замену С4323Т (R1441R). На сегодня в положении 1441 описано три аминокислотные замены (R1441C/G/H). Все вышеуказанные нуклеотидные замены в кодоне (R1441) локализуются в области CpGCpG-островков. Цитозин в районе CpGCpG-островков обычно метилирован, что может объяснять повышенную частоту транзиций С—>Т в данной области (Горбунова В.Н., Баранов B.C., 1997).

Считается, что мутация R1441C является второй из наиболее часто встречающихся изменений в гене LRRK2. Необходимо подчеркнуть, что в нашем исследовании в отличие от лиц, носителей мутации G2019S, пациент с БП, обусловленной мутацией R1441C имел славянские корни. Анализ гаплотипов показал, что для мутации R1441C эффект основателя может быть выявлен для четырех независимых популяций (Haugarvoll К. et al., 2008). Поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2. Мутация V1613A. В группе больных с семейной формой БП был осуществлен поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2 с использованием метода прямого секвенирования. В исследование были включены лица, у которых не было выявлено мутаций в гене LRRK2 методом ПЦР и рестрикционного анализа (83 пациента). В результате в 34 экзоне нами впервые была выявлена нуклеотидная замена тимина на цитозин в положении 4838, приводящая к замене валина на аланин в положении 1613 (V1613A) у одного пробанда (1/85, 1,2%). В группе больных со спорадической формой БП поиск данной мутации осуществлялся разработанными нами методами ПЦР и рестрикционного анализа. В данной группе пациентов, а также в контрольной группе данной мутации не обнаружено. Кроме этой мутации в различных экзонах гена LRRK2 обнаружено 15 ранее описанных однонуклеотидных полиморфизмов.

Родословная семьи с БП, обусловленной мутацией V161 ЗА представлена на рис 2а. Наследование БП в данной семье происходит по аутосомно-доминантному типу. Мутация V1613A обнаружена в гетерозиготном состоянии у брата и сестры. Все члены семьи являются этническими славянами.

Выявленная мутация располагается в функционально значимом домене гена LRRK2 - COR домене. Кроме того, выявленная мутация приводила к замене

консервативного аминокислотного остатка в эволюционном ряду (рис 2Ь). Эти результаты дают возможность предположить патогенетическую роль данной аминокислотной замены. Интересно, что в вышеописанном домене гена LRRK2 ранее была описана мутация Y1699C (Zimprich A., et al., 2004). Ее патогенетическая значимость подтверждена в ряде исследований, кроме того показано, что клиническое течение у больных с мутацией Y1699C отличается от типичной БП (Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008; Khan N.L. et al.,2005; Giasson B.I. et al., 2006; Zhu X. et al., 2006).

a)

PD 6

i*

¿Ti

1-2 (65)

79(70)

77(60)

b)

Homo sapiens Pan troglodytes Mus musculus Bos taurus

ckimaqlltvkvegcpk cklmaqlltvkvegcpk ekvmaqlttvkvdgclk ckvmaqlltvkvegfpk

Рис. 2. Мутация У1613А в гене

a) Родословная семьи РОб с мутацией У1613А в гене 1ЖНК2. Внизу элементов обозначены: генотип (т - гетерозиготное носительство мутации VI61 ЗА), возраст на момент исследования и возраст начала заболевания (указан в скобках).

b) Аминокислотная последовательность области белка, содержащей мутацию \4613A человека, а также шимпанзе, мыши и быка.

c) Хроматограмма, показывающая 4838Т—>С замену (V161 ЗА): 1 - генотип дикого типа; 2 - гетерозиготное носительство. Приведён сиквенс антисмысловой цепи.

Клиническое течение БП, обусловленной мутациями в гене 1ЖЛК2.

Клинические проявления заболевания у лиц с БП представлены в таблице 1. Таблица 1. Клиническая характеристика обследованных больных с БП, обусловленной выявленными мутациями гена

Пациент ^ Мутации Семья Пол Возраст ^ Возраст начала заболевания Симптомы БП на момент начала заболевания Симптомы заболевания на момент осмотра Эффективность терапии Л-ДОФА Побочные эффекты терапии Л-ДОФА

Т Р Б П н

1 020195 Р01 (Н-1) м 75 67 Б + + + Не принимал нет

2 020195 Р01 (ИМ) м 53 35 Б,Р + + + + хорошая Психические изменения

3 020195 Р02 (П-1) м 70 50 Т + + + + хорошая нет

4 020195 РЭЗ (111-1) ж 49 39 Б + + + + хорошая Гипер кинез

5 020Ш Р04 (Ш-4) м 73 59 Т + + + + хорошая нет

6 020195 Р05 (П-2) ж 75 68 Т + + Не принимал нет

7 У1613А Р06 (П-З) м 77 65 Т + + плохой нет

8 У1613А РИ6 (П-1) ж 79 70 Т + + Не принимал нет

9 020195 ж 60 47 Р + + + + хорошая Диски-незии

10 1*14410 м 75 61 Т + + - + Не принимал нет

Обозначения. Т-тремор, Р-ригидность, Б-брадикинезия, П.Н -постуральная нестабильность

Из литературных источников известно, что клиническое течение ЬЮ1К2-ассоциированной БП не отличается в семейных и спорадических случаях (Gasser Т., 2007). По литературным данным у пациентов с БП, обусловленной мутацией G2019S в гене LRRK2, имеется ряд клинических особенностей заболевания: относительно позднее начало, первым признаком болезни чаще был тремор и, как правило, хороший эффект при лечении JI-ДОФА-содержащими препаратами (Berg D. et all., 2005; Шадрина М. И. и др., 2007). Кроме того описано, что у носителей данной мутации и в гетерозиготном, и в гомозиготном состоянии клиническая картина заболевания и возраст начала БП не отличается (besage S. et al., 2005; Paisan-Ruiz С. et al., 2005).

У больных с семейной формой БП, обусловленной мутацией G2019S в гене LRRK2, в нашем исследовании возраст начала заболевания варьировал от 35 до 68 лет; у трех пациентов тремор был первым клиническим симптомом заболевания; четыре человека лечились JI-ДОФА-содержащими препаратами и все с хорошим эффектом, что согласуется с литературными данными (табл.1). Кроме того мы не обнаружили особенностей течения заболевания у больного со спорадической формой БП, обусловленной мутацией G2019S в гене LRRK2, в сравнении с выше описанными семейными случаями. Таким образом, можно предположить, что в Северо-Западном регионе России заболевание, обусловленное вышеописанными изменениями в гене LRRK2, встречается в различных возрастных группах.

Было показано, что пенетрантность данной мутации связана с возрастом: вероятность фенотипических проявлений в возрасте 50 лет -15-17 %, 32-100%-в возрасте 80 лет (Berg D. et al., 2005; Khan N.L. et al., 2005; Giasson B.I. et al., 2006; Giasson B.I., Van Deerlin V.M., 2008). Возможно, этим фактом объясняется отсутствие БП у родителей пробандов в семьях PD1, PD2, PD4. Хотя не исключено, что последнее может быть связано с отсутствием четких сведений, поскольку в большинстве случаев родословные составлены на основании клинико-генеалогического исследования со слов пробандов.

В данном исследовании мутация G2019S в гене LRRK2 была обнаружена у одного здорового родственника сорока лет. Учитывая выше изложенные

сведения, можно сделать вывод, что здоровый "носитель" мутации нуждается в тщательном неврологическом наблюдении и проведении профилактики БП.

Таким образом, в четырех семьях из пяти (за исключением PD5) течение заболевания соответствовало классической форме БП. Классический фенотип БП был выявлен у больных БП, обусловленной мутацией G2019S, ранее (Zhu X. et al., 2006; Gasser T., 2007).

Выявленная нами новая мутация V1613A в гене LRRK2 ассоциирована с БП с преобладающим тремором. Общим у обоих пациентов в клинической картине заболевания было наличие тремора покоя и постуральная нестабильность, причем за десять лет болезни никаких других дополнительных признаков (ригидность, акинезия) не появилось. В настоящее время в литературе описываются больные БП с преобладанием в клинической картине заболевания тремора, тогда как другие признаки заболевания выражены редко (Josephs К.А. et al., 2006; Clarimón J. et al., 2007). Кроме того терапия JI-ДОФА-содержащими препаратами у таких больных практически не эффективна. Ранее у пациентов БП с преобладающим тремором в Испании была обнаружена мутация Val2390Met (Clarimón J. et al., 2007).

Исходя из результата наших исследований, а также данных литературы, можно предположить, что фенотипические проявления БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2 могут быть шире, чем классическая форма БП. С другой стороны, паркинсонизм с преобладающим тремором (tremor dominant parkinsonism) вероятно является одной из форм БП.

Haugarvoll К. с соавторами сопоставил течение заболевания у 33 человек с БП, обусловленной мутацией R1441C и у больных со спорадической формой БП (Haugarvoll К. et al., 2008). Клиническое течение БП, обусловленной мутацией R1441C было идентично течению заболевания у лиц с мутацией G2019S и неотличимо от идиопатической БП. Средний возраст начала заболевания составляет около 60 лет (Gosal D. et al, 2007; Haugarvoll К. et al., 2008; Nuytemans К. et al., 2008). В нашем исследовании клиническая картина

заболевания у пациента с мутацией К1441С также не отличалась от идиопатической БП.

Сопоставление клинических характеристик БП у лиц с мутацией в гене Ы111К2 и у лиц БП отличной этиологии.

Все пациенты БП, длительность заболевания у которых составила пять лет и более, были разделены на 2 группы в зависимости от наличия мутаций в гене ЬЯКК2\ на пациентов имеющих мутацию в гене ЬЯКК2 (10 человек), пациентов с БП отличной этиологии (150 человек). Сравнительный анализ данных групп представлен в таблице 2.

Таблица 2. Сопоставление признаков БП у лиц с мутацией в гене 1ЯИК2 и у лиц с БП отличной этиологии.

характеристики пациентов БП Больные с мутацией в гене (10 человек) Больные БП отличной этиологии (150 человек) Р

Мужчины/женщины 6 (60%)/4(40%) 58 (38,7%)/92(61,3%) 0,3

Т. Ф 3 (30%) 56 (37,3%) 0,8

А-Т. Ф 0 1 (0,7%) 0,07

А-Р-Т Ф. 5 (50%) 57 (38%) 0,6

А-Р. Ф. 1 (10%) 12 (8%) 0,07

Р-Т. Ф. 1 (10%) 24(16%) 0,9

Средний возраст больных БП (лет) 67,6+10,2 63,7± 10,7 0,1

Средний возраст начала БП (лет) 55,9± 12,9 50,9± 12,8 0,2

X э. Л-ДОФА 5 из 6 (83,3%) 60 из 77 (77,9%) 0,8

Пэ Л-ДОФА 3 (50%) 4 (5,2%) 0,002

Обозначения' Т.Ф - греморная форма, А-Т.Ф. - акинетико-треморная форма, А-Р-Т. Ф -акинетико-ригидно-треморная форма, А-Р.Ф - акинетико-ригидная форма, Р-Т Ф -ригидно-треморная форма, X э Л-ДОФА - Наличие хорошего эффекта при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов, П.э.Л-ДОФА - побочные эффекты при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов.

При сопоставлении по выше описанным критериям течения заболевания и ответа на терапию Л-ДОФА-содержащими препаратами у пациентов с мутациями в гене ЬЯЯК2 и больных, отличной этиологии очевидно: достоверных различий по полу, формам заболевания, среднему возрасту пациентов, среднему возрасту манифестации симптомов БП, наличию положительного эффекта при приеме препаратов содержащих Л-ДОФА не

выявлено. В то время у лиц с мутациями в гене ЬШ1К2 показана повышенная частота побочных эффектов при приеме Л-ДОФА-содержащих препаратов.

В литературных источниках указывается, что в 50-80 % случаев появляются побочные эффекты при приеме выше указанных препаратов в течение пяти и более лет (Крыжановский Г.Н. и др., 2002). В настоящем исследовании большинство больных находились под длительным наблюдением, лечение БП у всех больных было комплексным, а прием препаратов содержащих Л-ДОФА начинался с небольших доз. Вероятнее всего, необходимо учитывать на какой стадии заболевания и в какой дозе были применены данные препараты. В нашем исследовании большинство больных являются амбулаторными пациентами (пациенты с 4 и 5 стадией заболевания по классификации М.НоеЬп и М.УаЬг не входили в исследование). Этим можно объяснить низкую частоту побочных эффектов от терапии Л-ДОФА в общей группе больных (7/160; 4,3%). В рамках настоящего исследования не представилось возможным учесть длительность приема препаратов Л-ДОФА, а также доз у всех пациентов. Однако у четырех из шести больных БП обусловленной мутацией 020198 выявлены побочные эффекты от Л-ДОФА-содержащих препаратов, что достоверно выше, чем в группе больных БП отличной этиологии (р=0,002).

Выводы

1. В клинической картине заболевания треморная форма БП преобладает у женщин по сравнению с мужчинами (р-0,007) и при семейной форме БП по сравнению со спорадической (р=0,009). Акинетико-ригидно-треморная форма преобладает у мужчин (р=0,003). Ригидно-треморная форма достоверно чаще встречается в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП с началом заболевания после 50 лет (р=0,04). ^

2. Разработаны методы идентификации мутаций 020198, К1441С/0/Н, 12020Т, 12012Т, У1613А на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

3. При скрининге мутаций 020198, К1441С/0/Н, 12020Т и 12012Т среди 278 больных БП выявлены: пять носителей мутации 020198 (5,9%; 5/85) среди

семейных случаев БП, один носитель мутации 020195 (0,5%; 1/189) и один носитель мутации И1441С (0,5%; 1/189) среди спорадических случаев заболевания. Мутации Я14410/Н, 12020Т и 12012Т среди больных БП в Санкт-Петербурге не выявлены.

4. Впервые выявлена мутация V1613А. Разработан простой метод ее идентификации на основе ПЦР и рестрикционного анализа. Данная мутация выявлена в одном семейном случае (1,2%; 1/85) и не встречалась в контроле.

5. Охарактеризован спектр мутаций гена ЬЯЯК2 у больных с семейными формами БП в Санкт-Петербурге. Частота мутаций в гене 1МЛК2 среди семейных форм БП составила 7%.

6. Клиническое течение БП, обусловленной мутацией 020195 в большинстве случаев не отличалось от идиопатической БП, в то время как больные с мутацией V161ЗЛ имели БП с преобладающим тремором. Течение заболевания среди лиц со спорадической формой БП, обусловленной мутациями 020195 и К1441С, не отличалось от идиопатической БП.

7. Выявлена повышенная частота побочных эффектов при терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами у больных БП, обусловленной мутациями в гене 1ККК2 (р=0.002).

Практические рекомендации

1. Полученные данные позволяют предположить, что при проведении молекулярной диагностики БП в Северо-Западном регионе России прежде всего следует проводить скрининг мутации 02019Б. При этом целесообразно проводить скрининг этой мутации в первую очередь у больных с семейной формой БП.

2. Разработанный нами простой и быстрый метод идентификации мутации 020195 может быть широко использован в лаборатории ДНК- диагностики.

3. При ведении пациентов с БП, обусловленной наличием мутации 020195, применение Л-ДОФА-содержащих препаратов, по-видимому, должно быть осторожным (небольшими дозами) с применением "лекарственных каникул", поскольку нами показана повышенная частота развития побочных эффектов от Л-ДОФА-содержащих препаратов в данной группе больных.

4. Особое внимание обращает тот факт, что мутации в гене LRRK2 обнаружены у пациентов БП с преобладающим тремором. Учитывая полученные данные, можно рекомендовать медицинскому сообществу быть более внимательным к "стертым" формам тремора, а так же при постановке диагноза пациенту с единственным симптомом - тремором, не исключать возможность наличия БП.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1. Емельянов, А.К. Молекулярная диагностика болезни Паркинсона / А.К. Емельянов, О.Н. Иванова, A.B. Соловьева // Политехнический симпозиум Молодые ученые - промышленности северо-западного региона: сборник тезисов. - Санкт-Петербург, 2006. - С. 187.

2. Иванова, О.Н. Исследование распространения мажорных мутаций в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России / О.Н. Иванова, А.К. Емельянов, A.B. Соловьева, А.Ф. Якимовский, С.Н. Пчелина // Сосудистые заболевания нервной системы у блокадников, лиц пожилого и старческого возраста: сборник тезисов. - Санкт-Петербург, 2006. - Выпуск 3. - С. 26.

3. Иванова, О.Н. Клиническое течение болезни Паркинсона у лиц с семейной формой заболевания, обусловленной мутацией G2019S в гене LRRK2 / О.Н. Иванова, А.К. Емельянов // Международный молодежный медицинский конгресс Санкт-Петербургские научные чтения: сборник тезисов. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 60.

4. Иванова, О.Н. Клиническое течение болезни Паркинсона у лиц с мутациями в гене LRRK2 / О.Н. Иванова, А.Ф. Якимовский, А.К. Емельянов, С.Н. Пчелина // Конференция Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 148.

5. Иванова, О.Н. Сопоставление клинической картины болезни Паркинсона и ответа на Л-ДОФА терапию в зависимости от пола, возраста начала заболевания, семейного анамнеза и наличия мутаций в гене LRRK2 / О.Н.

Иванова, А.Ф. Якимовский, С.Н. Пчелина // Болезнь Паркинсона и расстройства движений: руководство для врачей по материалам I Национального конгресса. - Москва, 2008. - С. 360.

6. Пчелина, С.Н. Болезнь Паркинсона: наследственные формы, молекулярная диагностика / С.Н. Пчелина, О.Н. Иванова, А.Ф. Якимовский, A.JI. Шварцман // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А.Б. Масленникова. - Новосибирск: Альфа Виста Н, 2005.- выпуск 8.- С. 39-67.

7. Пчелина, С.Н. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России / С.Н.Пчелина, О.Н. Иванова, А.К. Емельянов, А.Ф. Якимовский, A.JI. Шварцман // Медицинская генетика,- 2006,- Т.5- №2,- С. 48-51.

8. Пчелина, С.Н. Молекулярная диагностика болезни Паркинсона / С.Н.Пчелина, О.Н. Иванова, А.К. Емельянов, А.В. Соловьева, А.Ф. Якимовский // Конференция Фундаментальные науки - медицине: сборник тезисов. - Москва, 2006,- С. 24-25.

9. Пчелина, С.Н. Болезнь Паркинсона, обусловленная мутациями в гене LRRK2 / С.Н.Пчелина, О.Н. Иванова, А.К. Емельянов, А.Ф. Якимовский // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: сб. науч. тр. / под общ. ред. А.Б. Масленникова. - Новосибирск: Альфа Виста Н, 2008. - выпуск 12.-С. 191.

10. Pchelina, S.N. G2019S LRRK2 Mutation in Familial and Sporadic Parkinson's Disease in Russia / S.N. Pchelina, A.F. Yakimovskii, O.N. Ivanova, A.K. Emelianov, A.H. Zakharchuk, A.L. Schwarzman. //Movement Disorders. -2006. - Vol.21.- suppl.12. - P. 2234-2236.

11. Pchelina, S.N. Screening for LRRK2 mutations in patients with Parkinson's disease in Russia: identification of a novel LRRK2 variant / S.N. Pchelina, A.F. Yakimovskii, A.K. Emelyanov, O.N. Ivanova, A.L. Schwarzman, A.B. Singleton.// Eur. J. Neurol. - 2008. - Vol.15. - P. 692-696.

Список сокращений

БП - болезнь Паркинсона

ЧС - черная субстанция

ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография

Л-ДОФА - Ь-диоксифенилаланин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЫШК2 - ген лейцинбогатой киназы 2

Подписано в печать 23.10.2008г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 943.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Иванова, Ольга Николаевна

Оглавление.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клинические аспекты БП.

1.1.1. Клиническая характеристика БП.

1.1.2. Патогенез БП.

1.2. Генетические аспекты БП.

1.1.3. Наследственность в этиологии БП.

1.2.2. Генетические факторы риска развития мультифакториальных форм БП.

1.2.3. Локусы ответственные за развитие моногенных форм БП.

1.2.4. Ген лейцинбогатой киназы 2 (.LRRK2, дардарин).

1.2.5. Нейрогистологическая картина мозга пациентов БП с мутациями в гене LRRK2.

1.2.6. Функции дардарина и влияние мутаций в гене LRRK2 на активность белка.

1.2.7. Гипотетические молекулярные механизмы гибели дофаминергических нейронов при БП.

1.3. Диагностика и лечение БП.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика обследованных групп.

2.2. Выделение ДНК из периферической крови человека.

2.3. Идентификация мажорных мутаций в гене LRRK методом ПЦР и рестрикционного анализа.

2.3.1. Идентификация мутации G2019S.

2.3.2. Идентификация мутаций R1441C/G/H.

2.3.3. Идентификация мутаций I2020T, I2012T.

2.4. Секвенирование экзонов yqukLRRKI.

2.5. Идентификация мутации V1613A гена LRRK2.

2.6. Статистический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сопоставление клинического течения заболевания у пациентов с БП в зависимости от выбранных параметров.

3.1.1. Наличие семейного анамнеза.

3.1.2. Возраст начала заболевания.

3.1.3. Пол.

3.1.4. Наличие семейного анамнеза и возраста начала заболевания.

3.2 Поиск мутаций в гене LRRK2 у больных БП с семейной формой заболевания.

3.2.1. Семьи с БП, обусловленной мутацией G2019S.

3.2.2. Семья с мутацией V1613A.

3.3.Особенности течения БП у лиц с семейной формой заболевания, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

3.3.1. Мутация G2019S.

3.3.2. Мутация VI613А.

3.4. Поиск мутаций в гене LRRK2 у больных БП со спорадической формой заболевания.

3.5. Клиническое течение БП у лиц со спорадической формой заболевания, обусловленной мутацией в гене LRRK2.

3.6. Сопоставление клинического течения БП у лиц с мутацией в гене LRRK2 и у лиц с БП отличной этиологии.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ЛЕЙЦИНБОГАТОЙ КИНАЗЫ 2 (LRRK2) У ЛИЦ С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА"

Актуальность проблемы

Болезнь Паркинсона (БП) - одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среднего и пожилого возраста, впервые была описана Джеймсом Паркинсоном в 1817 году как дрожательный паралич. БП является хронической неуклонно прогрессирующей болезнью, которая встречается во всех популяциях мира. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 65 лет составляет 1-3% (Mata et al., 2005; Zhu et al., 2006). Основным в клинике БП является следующий симптомокомплекс: повышенный тонус скелетной мускулатуры по экстрапирамидному типу, пониженная двигательная активность (брадикинезия), низкочастотный тремор покоя конечностей и других частей тела, постуральная неустойчивость. Диагноз БП может быть поставлен только при наличии не менее двух из указанных симптомов. Однако, клинический диагноз, даже при развернутой картине заболевания, находит нейрогистопатологическое подтверждение, приблизительно, в 75% случаев (Bennet et al., 1996; Bower et al., 2002).

Морфологическая картина при БП включает прогрессирующую гибель дофаминергических нейронов компактной части ЧС, что приводит к резкому снижению концентрации дофамина в полосатом теле, а также наличие внутриклеточных эозинофильных включений в сохраненных нейронах, получивших названия телец Леви.

Необходимо также отметить, что симптомокомплекс БП проявляется при гибели 80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Процесс нейродегенерации начинается задолго до дебюта заболевания, а когда оно становиться явным, патогенетическая терапия может быть уже не эффективной. В арсенале медицины существует метод диагностики, который позволяет поставить диагноз БП до появления клинических симптомов позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). ПЭТ позволяет прижизненно изучать структурно-функциональное состояние церебральных нейротрансмиттерных структур. Широкое применение данного метода в клинической практике ограничено, так как ПЭТ относиться к дорогостоящим методам и в ряде случаев является не точным (Savitt et al., 2006). Таким образом, поиск маркеров БП, позволяющих проводить раннюю диагностику заболевания, а также при необходимости дифференциальную диагностику БП с другими неврологическими заболеваниями со сходными клиническими проявлениями - остается крайне актуальным.

Достижения молекулярной генетики последних лет позволили по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза, нозологической принадлежности и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП носит мультифакториальный характер, около 15% больных БП имеют семейную форму БП, когда заболевание имело место у нескольких родственников из одного или разных поколений (Gasser, 2007). Описаны семьи, где наследование заболевания происходит как по аутосомно-рецессивному, так и по аутосомно-доминантному типу.

За последние 11 лет описано одиннадцать генетических локусов, ответственных за развитие моногенных форм БП. В шести случаях удалось идентифицировать конкретные гены и провести детекцию мутаций у больных. Мутации в генах паркина (PARK2), PTEN-индуцированной киназы 1 (PINK1) и DJ-1 выявлены при аутосомно-рецессивной форме БП, и мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA), убиквитин-С-концевой гидролазы LI (UCH-L1), лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) при аутосомно-доминантной форме заболевания (Dawson, 2007). ДНК-анализ в семьях с известной молекулярной природой БП может использоваться для доклинической диагностики данного заболевания, что позволит проводить у пациентов активное профилактическое лечение, своевременно начать адекватную симптоматическую терапию.

По существующим данным наиболее частым молекулярным дефектом, ответственным за развитие наследственной формы БП, являются мутации в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2, локус PARK8), кодирующем белок, названный дардарином (Gasser, 2007). Исследование мутаций гена LRRK2 и их изучение стало возможным после картирования хромосомного локуса PARK8 в 2002 году (Funayama et al., 2002). В 2004 году впервые обнаружена сегрегация мутаций в гене LRRK2 с БП в семьях (Paisan-Ruis et al., 2004; Zimpritch et al., 2004). В настоящее время у больных с аутосомно-доминантной формой БП, выявлен ряд аминокислотных замен в кодирующей области гена. В гене имеются мажорные мутации (G2019S, R1441C/G, Y1699C, I2020T), обнаруживаемые у больных БП в различных популяциях (Giasson, Van Deerlin, 2008). Наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП является мутация G2019S, которая встречается в европейских популяциях в 5-7% случаев семейной БП, но также была обнаружена в 0,6-1,6% спорадических случаев (Di Fonso et al., 2005; Gilks et al., 2005). В некоторых изолированных популяциях, например, среди арабов северной Африки и евреев-ашкенази, частота данной мутации среди семейных форм БП достигает 30-40% (Lesage et al., 2005; Ozelius et al., 2006). В то же время мутация G2019S не обнаружена в некоторых азиатских популяциях (Tan et al., 2005; Fung et al., 2006). Остальные мутации оказались менее распространенными, однако, в ряде случаев их частота показывала сильные межпопуляционные различия. Так, неожиданно высокая частота мутации R1441G (16,4% и 4% среди семейных и спорадических форм БП, соответственно) была обнаружена среди популяции басков в Испании (Simon-Sanchez et al., 2006).

Кодирующая область гена LRRK2 содержит 51 экзон (2527 аминокислот). Несмотря на большую протяженность гена, в ряде популяций был определен полный спектр мутаций среди больных БП (Mata et al., 2005; Di Fonzo et al., 2006; Paisan-Ruiz et al., 2008). Определение популяционной специфичности мутаций является необходимым условием для проведения молекулярной диагностики заболевания и внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику. Разработка молекулярных методов диагностики БП остается особенно актуальной в силу отсутствия широкодоступных диагностических маркеров, позволяющих осуществлять диагностику заболевания на ранних стадиях БП. До настоящего времени в России спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП остается неизвестным.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Выявление мутаций в гене лейцинбогатой киназы 2 {LRRK2) у лиц с БП и сопоставление клинического течения заболевания у больных БП, имеющих мутации в гене LRRK2, и пациентов с БП отличной этиологии.

Задачи исследования:

1. Сопоставление клинического течения БП в зависимости от пола пациентов, возраста начала заболевания и наличия у них семейного анамнеза.

2. Разработка молекулярно-генетических методов идентификации мажорных мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, 12012Т) в гене LRRK2 и их скрининг в группе пациентов с БП и в контрольной группе.

3. Поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2 у пациентов с семейной формой БП.

4. Разработка методов идентификации выявленных мутации на основе метода ПЦР с последующим рестрикционным анализом и их скрининг в группе пациентов со спорадической формой БП и в контрольной группе.

5. Молекулярно-генетическое и неврологическое обследование семей пробандов с выявленными мутациями в гене LRRK2, а также сопоставление клинического течения БП, обусловленной известным молекулярным дефектом в гене LRRK2 и БП отличной этиологии.

Научная новизна:

Впервые в России проведено определение спектра мутаций в гене LRRK2 у больных с БП. У больных с семейной формой БП выявлены мутации G2019S и V1613A. Мутация V1613A в гене LRRK2 описана впервые в мире. У больных со спорадической формой БП впервые в России выявлены мутации G2019S и R1441C. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у больных с выявленными мутациями в гене LRRK2 с больными БП отличной этиологии. Впервые в мире среди больных с БП, обусловленной мутацией G2019S, отмечено преобладание побочных эффектов от терапии JI-ДОФА-содержащими препаратами. Разработаны простые методы идентификации мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, 12012Т, VI613А) в гене LRRK2 на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

Практическая значимость работы:

В данной работе охарактеризован спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП Северо-Западного региона России. Разработанные нами методы экспресс-тестирования мутаций в гене LRRK2 могут быть использованы в клинической практике при выявлении наследственных форм БП, обусловленных мутациями в гене LRRK2. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей больных БП, обусловленной мутациями в этом гене, и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутаций до начала проявления клинических симптомов заболевания. Такой подход может способствовать повышению эффективности лечения БП.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В клинической картине БП выявлено преобладание определенных симптомов заболевания у пациентов в зависимости от пола, возраста начала заболевания и наличия семейного анамнеза.

2. Среди больных семейной формой БП Санкт-Петербурга выявлено пять семей, в которых развитие БП обусловлено ранее описанной мутацией G2019S в гене LRRK2. В трех случаях из пяти клиническое течение БП в этих семьях не отличалось от классической БП.

3. Впервые обнаружена новая мутация VI61 ЗА, приводящая к развитию семейной формы БП с преобладающим тремором.

4. У больных со спорадической формой БП выявлены ранее известные мутации в гене LRRK2: G2019S и R1441C.

5. В группе больных с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении JI-ДОФА-содержащих препаратов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации:

Неврологический осмотр пациентов с БП и забор венозной крови выполнены автором лично. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа, скрининг мутаций в группе пациентов с БП и в контрольной группе проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы:

Предложенные к защите результаты были доложены на II международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения", Санкт-Петербург, СПбГМУ имени акад. И.П.Павлова (2007), научно-практической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины", СПбМАПО (2007), конференции "Фундаментальные науки-медицине", РАН, Москва (2006), 11 международной пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология наука XXI века", Москва (2007), I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008).

Публикации:

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 5 статей, 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику:

Методы ДНК-диагностики, разработанные на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом, внедрены в работе СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова для диагностики семейных форм БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (96 наименования). Работа изложена на 101 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 17 рисунками и фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Иванова, Ольга Николаевна

выводы

1. В клинической картине заболевания треморная форма БП преобладает у женщин по сравнению с мужчинами (р=0,007) и при семейной форме БП по сравнению со спорадической (р=0,009). Акинетико-ригидно-треморная форма преобладает у мужчин (р=0,003). Ригидно-треморная форма достоверно чаще встречается в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП с началом заболевания после 50 лет (р=0,04).

2. Разработаны методы идентификации мутаций G2019S, R1441C/G/H, I2020T, 12012Т, VI61 ЗА на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

3. При скрининге мутаций G2019S, R1441C/G/H, I2020T и 12012Т среди 278 больных БП выявлены: пять носителей мутации G2019S (5,9%; 5/85) среди семейных случаев БП, один носитель мутации G2019S (0,5%; 1/189) и один носитель мутации R1441C (0,5%; 1/189) среди спорадических случаев заболевания. Мутации R1441G/H, I2020T и 12012Т среди больных БП в Санкт-Петербурге не выявлены.

4. Впервые выявлена мутация V1613A. Разработан простой метод ее идентификации на основе ПЦР и рестрикционного анализа. Данная мутация выявлена в одном семейном случае (1,2%; 1/85) и не встречалась в контроле.

5. Охарактеризован спектр мутаций гена LRRK2 у больных с семейными формами БП в Санкт-Петербурге. Частота мутаций в гене LRRK2 среди семейных форм БП составила 7%.

6. Клиническое течение БП, обусловленной мутацией G2019S в большинстве случаев не отличалось от идиопатической БП, в то время как больные с мутацией V1613A имели БП с преобладающим тремором. Течение заболевания среди лиц со спорадической формой БП, обусловленной мутациями G2019S и R1441C, не отличалось от идиопатической БП.

7. Выявлена повышенная частота побочных эффектов при терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами у больных БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2 (р=0.002).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные позволяют предположить, что при проведении молекулярной диагностики БП в Северо-Западном регионе России прежде всего следует проводить скрининг мутации G2019S. При этом целесообразно проводить скрининг этой мутации в первую очередь у больных с семейной формой БП.

2. Разработанный нами простой и быстрый метод идентификации мутации G2019S может быть широко использован в лаборатории ДНК-диагностики.

3. При ведении пациентов с БП, обусловленной наличием мутации G2019S, применение JI-ДОФА-содержащих препаратов, по-видимому, должно быть осторожным (небольшими дозами) с применением "лекарственных каникул", поскольку нами показана повышенная частота развития побочных эффектов от Л-ДОФА-содержащих препаратов в данной группе больных.

4. Особое внимание обращает тот факт, что мутации в гене LRRK2 обнаружены у пациентов БП с преобладающим тремором. Учитывая полученные данные, можно рекомендовать медицинскому сообществу быть более внимательным к "стертым" формам тремора, а так же при постановке диагноза пациенту с единственным симптомом - тремором, не исключать возможность наличия БП.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Иванова, Ольга Николаевна, Москва

1. Голубев, В.Л. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма / В.Л. Голубев, Я.И. Левин, A.M. Вейн. М.: МЕДпресс, 2000. - 416 с.

2. Горбунова, В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / В.Н. Горбунова, B.C. Баранов. Санкт-Петербург: Специальная литература, 1997. - 286 с.

3. Иллариошкин, С.Н. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии / С.Н. Иллариошкин, И.А. Иванова-Смоленская, Е.Д. Маркова. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 591 с.

4. Иллариошкин, С.Н. Современные подходы к лечению болезни Паркинсона / С.Н. Иллариошкин // Атмосфера.Нервные болезни. 2004. - № 4. - С. 14-21.

5. Болезнь Паркинсона (этиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика) / Г.Н. Крыжановский и др.. М.: Медицина, 2002.-336 с.

6. Левин, О.С. Эпидемиология паркинсонизма и болезни Паркинсона / О.С. Левин, Л.В. Докадина // Неврологический журнал. 2005.- Т.10,№ 5. — С. 41-49.

7. Лосано, А. //Новые подходы к лечению болезни Паркинсона / А. Лосано, Калиа С. // В мире науки. 2005. - №10. - С. 58-61.

8. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 479 с.

9. Bossy-Wetzel, E. Molecular pathways to neorodegeneration / E. Bossy-Wetzel, R. Schwarzenbacher, S.A. Lipton // Nature Medicine. 2004. - Vol. 10.-P. S2- S9.

10. Bower, J.A. Clinical correlates of the pathology underlying parkinsonism: a population perspective / J.A. Bower, D.W. Dickson, L. Taylor, D.M. Maraganore, W.A. Rocca//Mov. Disord. 2002. - Vol. 17. - P. 910-916.

11. Brooks, D. The early diagnosis of Parkinson's disease / D. Brooks // Ann. Neurol. 1998. - Vol. 44. -P. S10-S18.

12. Carr, J. Familial and sporadic Parkinson's disease usually display the same clinical feature / J. Carr, R. de la Fuente-Ferna'ndez, M. Schulzer, E. Мак, S.M. Calne, D.B. Calne // Parkinsonism and Related Disorders. 2003. -Vol. 9.-P. 201-204.

13. Conway, K. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease / K. Conway, J. Harper, P. Lansbury // Nature Medicine. 1998. - Vol.4. - P. 1318-1320.

14. Dawson, T.M. Molecular Pathways of Neurodegeneration in Parkinson's Disease / T.M. Dawson, V.L. Dawson // Science. 2003. - Vol. 302. - P. 819 -822.

15. Dawson, T.M. Parkinson's Disease Genetics and Pathogenesis / T.M. Dawson. New York : informa healthcare USA, 2007. - 398 p.

16. Di Fonzo, A.D. Comprehensive analysis of the LRRK2 gene in sixty families with Parkinson's disease/ A.D. Di Fonzo, C. Tassorelli, M. De Mari, H.F. Chi, J. Ferreira, C.F. Rohe, G. Riboldazzi, A. Antonini, G. Albani, A.

17. Dunnet, S.B. Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease / S.B. Dunnet, A. Bjorklund // Nature. 1999. - Vol. 399.-P. A32-A39.

18. Farrer, M.J. Genetics of Parkinson's disease: paradigm shifts and future prospects / M.J. Farrer // Nature Reviews. 2006. - Vol. 7. - P.306-318.

19. Feany, M.B. A Drosophila model of Parkinson's disease / M.B. Feany, W.W. Bender // Nature. 2000. - Vol. 404. - P.394-398.

20. Foltynie, T. The genetic basis of Parkinson's disease / T. Foltynie, S. Sawcer, C. Brayne, R.A. Barker // Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry. 2002. - Vol. 73. - P. 363-370.

21. Foltynie, T. The heterogeneity of idiopathic Parkinson's disease/ T. Foltynie, C. Brayne, R.A. Barker // J. Neurol. 2002. - Vol. 249. - P. 138-145.

22. Funayama, M. A new locus for Parkinson's disease (PARK8) maps to chromosome 12pl 1.2-р13.1/ M. Funayama, K. Hasegawa, H. Kowa, M. Saito, S. Tsuji, F. Obata // Ann. Neurol. 2002. - Vol. 51. - P. 296-301.

23. Fung, H.C. Lack of G2019S LRRK2 mutation in a cohort of Taiwanese with sporadic Parkinson's disease / H.C. Fung, C.M. Chen, J. Hardy, D. Hernandez, A. Singleton, Y.R. Wu // Mov. Disord. 2006. - Vol. 21. - P.880-881.

24. Gasser, T. Genetics of Parkinson's disease / T. Gasser // Ann. Neurol. -1998.-Vol. 44.-P. S53-S57.

25. Gasser, T. Update on the Genetics of Parkinson's Disease / T. Gasser // Mov. Disord. 2007. -Vol. 22. - P. S343-S350.

26. Giasson, B.I. Biochemical and pathological characterization of Lrrk2 / B.I . Giasson, J.P. Covy, N.M. Bonini, H.I. Hurtig, M.J. Farrer, J.Q. Trojanowski, V.M. Van Deerlin //Ann.Neurol. 2006. - Vol. 59. - P. 315-322.

27. Giasson, B.I. Mutations in LRRK2 as a Cause of Parkinson's disease/ B.I. Giasson, V.M. Van Deerlin // Neurosignals. 2008. -Vol. 16. - P.99-105.

28. Gosal, D. Global Distribution and Reduced Penetrance: Lrrk2 R1441С in an Irish Parkinson's Disease Kindred / D. Gosal, T. Lynch, O.A. Ross, K. Haugarvoll, M. J. Farrer, J.M.Gibson // Mov. Disord. 2007. - Vol. 22, No. 2. -P. 291-292.

29. Greggio, E. Kinase signaling pathways as potential targets in the treatment of Parkinson's disease/ E. Greggio, A. Singleton // Expert Review of Proteomics. 2007. - Vol. 4, Suppl. 6. - P. 783-792.

30. Haaxma, C.A. Gender differences in Parkinson's disease/ C.A. Haaxma, B.R. Bloem, G.F. Borm, J.G. Oyen, K.L. Leenders, S. Eshuis, J. Booij, D.E. Dluzen, M. W. Horstink // Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 2007. - Vol. 78. - P. 819-824.

31. Bereznai, J.R. Vaughan, N.W. Wood, J. Hardy, B.A. Oostra, M.M. Breteler // Neuroscience Letters. 1999. - Vol. 270, Suppl. 1. - P. 1-4.

32. Hasegawa, K. Autosomal-dominant familial Parkinson's disease: older onset of age, and good response to levodopa therapy / K. Hasegawa, H. Kowa // European Neurology. 1997. - Vol. 38. - P. 39-43.

33. Josephs, K.A. Benign Tremulous Parkinsonism/ K.A. Josephs, Y.M. Joseph, J.E. Ahlskog // Arch. Neurol. 2006. - Vol. 63. - P. 354-357.

34. Kruger, R. Ala30Pro mutation in the gene encoding a-synuclein in Parkinson's disease / R. Kruger, W. Kuhn, T. Muller, D. Woitalla, M. Graeber, S. Kosel, H. Przuntek, J.T. Epplen, L. Schols, O. Riess // Nature Genetics. 1998.-Vol. 18.-P. 106-108.

35. Lashuel, H.A. Neurodegenerative disease: Amyloid pores from pathogenic mutations / H.A. Lashuel, D. Hartley, B.M. Peter, T. Walz, P.T. Lansbury // Nature. 2002. - Vol. 418. - P. 291.

36. Le, W.D. Mutations in NR4A2 associated with familial Parkinson disease / W.D. Le, P. Xu, J. Jankovic, H. Jiang, S.H. Appel, R.G. Smith, D.K. Vassilatis // Nature Genetics. 2003. - Vol. 33. - P. 85-89.

37. Lewis, P.A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis / P.A. Lewis, E. Greggio, A. Beilina, S. Jain, A. Baker, M.R. Cookson // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - Vol. 357, Suppl. 3. - P. 668-671.

38. MacLeod, D. The familial Parkinsonism gene LRRK2 regulates neurite process morphology / D. MacLeod, J. Dowman, R. Hammond, T. Leete, K. Inoue, A. Abeliovich // Neuron. 2006. - Vol. 52. - P. 587-593.

39. Mann, V. Quantitation of mitochondrial DNA deletion in Parkinson's disease / V. Mann, J. Cooper, A. Schapira // FEBS. 1992. - Vol. 299. -P. 218-222.

40. Maraganore, D.M. Collaborative analysis of alpha-synuclein gene promoter variability and Parkinson's disease/ D.M. Maraganore, M. de Andrade, A. Elbaz, M.J. Farrer, ; J.P. Ioannidis, R. Kruger, W.A. Rocca, N. K.

41. Mclnerney-Leo, A. Genetic testing in Parkinson's disease / A. Mclnerney-Leo, D.W. Hadley, K. Gwinn-Hardy, J. Hardy // Mov. Disord. 2005. - Vol. 20, Suppl. l.-P. 1-10.

42. Moore, D.J. Association of DJ-1 and parkin mediated by pathogenic DJ-1 mutations and oxidative stress / D.J. Moore, L. Zhang, J. Troncoso, M. K. Lee, N. Hattori, Y. Mizuno, Т. M. Dawson, V. L. Dawson // Hum. Mol. Genet. 2005. - Vol. 14. - P. 71-84.

43. Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease / C. Paisan-Ruiz, S. Jain, E.W. Evans, W. Gilks, J.

44. Simon, M. van der Brug, A . de Munain, S. Aparicio, A. Gil, N. Khan // Neuron. 2004. - Vol. 44. - P. 595-600.

45. Roho, C.F. Homozygous PINK1 C-Terminus mutation causing early-onset parkinsonism / C.F. Roho, P. Montagna, G. Breedveld, P. Cortelli, B.A. Oostra, V. Bonifati // Ann. Neurol. 2004. - Vol. 56. - P. 427-431.

46. Sakaguchi-Nakashima, A. LRK-1, a C. elegans PARK8-related kinase, regulates axonal-dendritic polarity of SV proteins / A. Sakaguchi-Nakashima, J.Y. Meir, Y. Jin, K. Matsumoto, N. Hisamoto // Current Biology. 2007. -Vol. 17, Suppl. 7.-P. 592-598.

47. Savitt, J.M. Diagnosis and treatment of Parkinson's disease: molecules to medicine / J.M. Savitt, V.L. Dawson, T.M. Dawson // J. Clin. Invest. 2006. -Vol. 116.-P. 1744-1754.

48. Schapira, A. Nuclear and mitochondrial genetics in Parkinson's disease / Schapira A. //J. Med. Genet. 1995. - Vol. 32. - P. 411-414.

49. Scott, B. Gender differences in Parkinson's disease symptom profile / B. Scott, A. Borgman, H. Engler, B. Johnels, S.M. Aquilonius // Acta Neurologica Scandinavica. 2000. - Vol. 102, № 1. - P. 37-43.

50. Singleton A.B. What does PINK1 mean for Parkinson disease? / A. Singleton //Neurology. -2004. -Vol. 63.-P. 1350-1351.

51. Singleton A.B. Altered a-synuclein homeostasis causing Parkinson'z disease: the potential roles of dardarin // Trends in Neurosciences. 2005.-Vol.28. - P. 416-421.

52. Sveinbjornsdottir, S. Familial aggregation of Parkinson's disease in Iceland / S. Sveinbjornsdottir, A. Hicks, T. Jonsson // N. Engl. J. Med. 2000. - Vol. 343.-P. 1765-1770.

53. Tan, E.K. Variability and validity of polymorphism association studies in Parkinson's disease / E.K. Tan, M. Khajavi, J.I. Thoronby, S. Nagamitsu, J. Jankovic, T. Ashizawa // Neurology. 2000. - Vol. 55. - P.533-538.

54. Tanner, C.M. Parkinson disease in twins: An etiologic study / C.M. Tanner, R. Ottman, S.M. Goldman, J. Ellenberg, P. Chan, R. Mayeux, J.W. Langston // JAMA. 1999. - Vol. 281. - P. 341-346.

55. Vila, M. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease / M. Vila, S. Przedborski //Nature Medicine. 2004. - Vol. 10. - P. S58-S62.

56. West, A.B. Parkinson's disease associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity / A.B. West,р ^^

57. D.J. Moore, С. Choi, S.A. Andrabi, X. Li, D. Dikeman, S. Biskup, Z. Zhang, K- L. Lim, Y.L. Dawson, T.M. Dawson // Hum. Mol. Genet. 2007. - Vol.16, Suppl. 2.-P. 223-232.

58. Wirdefeldt, K. No evidence for heritability of Parkinson disease in Swedish twins/ K. Wirdefeldt, M. Gatz, M. Schalling, N.L. Pedersen // Neurology. -2004.-Vol. 63.-P. 305-311.

59. Wood, N.W. Genetic risk factors in Parkinson's disease / N.W. Wood // Ann. Neurol. 1998. - Vol. 44, Suppl. 1. - P. S58-S62.

60. Zhou, W. The oxidative state od DJ-1 regulates its chaperone activity toward alpha-synuclein / W. Zhou, M. Zhu, M.A. Wilson, G.A. Petsko, A.L. Fink // J. Mol. Biol. 2006. - Vol. 356. - P. 1036-1048.

61. Zhu, X. LRRK2 in Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies/ X. Zhu, A. Babar, S.L. Siedlak, Q.Yang, G. Ito, T. Iwatsubo, M.A. Smith, G.Perry, S.G. Chen // Molecular Neurodegeneration. 2006. - Vol. 1. - P.17.

62. Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology / A. Zimprich, S. Biskup, P. Leitner, M. Farrer , S. Lincoln, J. Kachergus, M. Hulihan, R. Uitti, D. Calne // Neuron. 2004. -Vol. 44. - P. 601-607.

63. Zintzaraz, E. Association of paraoxonase 1 gene polymorphisms with risk of Parkinson's disease: a meta-analysis/ E. Zintzaraz, G. Hadjigeorgiou //J. Hum. Genet. 2004. - Vol. 49. - P. 474-481.