Реакция микроглии и астроцитов мозга грызунов на хронический стресс различной модальности

Тишкина, Анна Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реакция микроглии и астроцитов мозга грызунов на хронический стресс различной модальности
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Реакция микроглии и астроцитов мозга грызунов на хронический стресс различной модальности"

На правах рукописи

Тишкина Анна Олеговна

Реакция микроглии и астроцитов мозга грызунов на хронический стресс различной модальности

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г * мар т

Москва, 2013

005051019

Работа выполнена в лаборатории функциональной биохимии нервной системы (заведующая лабораторией - доктор биологических наук, профессор Наталия Валерьевна Гуляева) Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН» (директор - доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Павел Милославович Балабан).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Наталия Валерьевна Гуляева. Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Вячеслав Альбертович Дубынин Доктор биологических наук Елена Владимировна Лосева.

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П. К. Анохина» РАМН

Защита состоится «27»_марта_ 2013 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 002.044.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН» по адресу: 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН».

Автореферат разослан «25»_февраля_ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор биологических наук

Виктор Николаевич Иерусалимский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Глия выполняет в ЦНС множество функций, направленных на поддержание стабильной работы нейронной сети. Одной из этих функций является организация внутренней иммунной системы мозга. При повреждениях, травмах, инфекции или нарушении гемато-энцефалического барьера активируются резидентные макрофаги нервной ткани - микроглия. Активация микроглии выражается в изменении паттерна экспрессии генов и соответствующих белков, что, в частности, приводит к увеличению уровня цитокинов (про- и противовоспалительных факторов) в ткани. Этот процесс принято называть нейровоспалением. На клеточном уровне основным маркером нейровоспаления является увеличение числа микроглиоцитов. Активированная микроглия начинает секретировать провоспалительные факторы (интерлейкин-6, интерлейкин-lß, TNFa). На определенной стадии нейровоспаления микроглиальные клетки становятся макрофагами и начинают секретировать, кроме перечисленных цитокинов, интерферон-у и оксид азота [Raivich et al., 1999].

При выраженной активации микроглии в процесс нейровоспаления включается также астроглия [Schubert et al., 2000]. Показано, что на астроцитах есть рецепторы цитокинов, и что астроглия может экспрессировать про- и противовоспалительные факторы [Bohn et al., 1994]. Нейровоспаление, как любой воспалительный процесс в организме, на первом этапе, несомненно, имеет адаптивную природу, выполняя защитные функции. Однако чрезмерная активация воспалительного процесса становится патологическим фактором. Действительно, нейровоспаление сопутствует начальным стадиям нейродегенеративных заболеваний и может вносить существенный вклад в процессы гибели нейронов [Gahtan & Overmier, 1999].

В большинстве работ, направленных на изучение нейровоспаления, исследуют этот процесс на этапе развившейся церебральной патологии. Однако большой

интерес представляет исследование нейровоспаления на начальном этапе развития патологии. Существует предположение, что повторяющиеся эпизоды нейровоспаления, эффекты которых суммируются в течение жизни, могут приводить к возникновению нейродегенерации и развитию заболеваний, часто сопровождающих старение, таких как болезни Альцгеймера или Паркинсона [Gahtan & Overmier, 1999]. Такие эпизоды нейровоспаления могут возникать в результате стрессов, вирусных или бактериальных инфекций. Активация иммунной системы организма приводит к увеличению уровня провоспалительных факторов в циркулирующей крови, проникновению их в мозг и, как следствие, к возникновению нейровоспалительных процессов. Поскольку активация иммунной системы стимулирует гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему [Turnbul & Rivier, 1999; Besedovsky & del Rey, 2000], предложено понятие «интероцептивный стресс», т.е. стресс, вызванный внутренним стимулом [Rinaman, 1999]. Показано, что экстероцептивный стресс (стресс, вызванный внешним стимулом) также может приводить к возникновению нейровоспаления [Braun et al., 2009; Tynan et al., 2010], опосредованного влиянием стресс-реализующей системы на иммунную систему организма в целом и мозга, в частности. Так, Dinkel с соавт. показали, что глюкокортикоиды в мозге не являются иммуносупрессорами, а, наоборот, оказывают провоспалительное действие [Dinkel et al., 2010]. Показана высокая чувствительность гиппокампа к глюкокортикоидам [Conrad, 2008], при этом хронический стресс вызывает селективное продолжительное возрастание уровня провоспалительных факторов в этой структуре [Пискунов, 2011].

нейродегенерации [.Jürgens & Johnson, 2012]. Таким образом, исследование последствий хронического стресса на структурно-функциональное состояние мозга может приблизить к пониманию причин развития нейродегенеративных заболеваний. Поскольку глиальные клетки, в первую очередь микроглия и астроциты, играют существенную роль в процессах нейровоспаления, важной частью этой работы является изучение их реакции на хронический стресс различной модальности.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение реакции микроглии и астроцитов мозга на хронический экстеро- и интероцептивный стресс.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать состояние микро- и астроглии в гиппокампе мозга крыс сразу и через месяц после хронического экстероцептивного (эмоционально-болевого) стресса

2. Исследовать состояние микро- и астроглии в структурах мозга мышей, после хронического интероцептивного стресса (введения бактериального липополисахарида), умеренного экстероцептивного стресса, а также их комбинированного воздействия.

3. Исследовать состояние микро- и астроглии в мозге мышей с нокаутом рецептора второго типа кортикотропин-рилизинг фактора после хронического интероцептивного и умеренного экстероцептивного стресса, а также их комбинированного воздействия.

Научная новизна

В работе впервые показано, что в результате хронического эмоционально-болевого стресса в гиппокампе крыс увеличивается число микроглиальных клеток, причем это увеличение сохраняется через месяц после окончания стрессирования.

Впервые показано, что после двухнедельного эмоционально-болевого стресса уменьшается GFAP-иммунореактивность астроцитов в поле САЗ гиппокампа, но

не в поле CAI гиппокампа или хилусе зубчатой фасции. При этом через месяц после окончания стрессирования GFAP-иммунореактивность астроцитов в поле САЗ гиппокампа возвращается к контрольному уровню.

В работе впервые продемонстрированы различия в развитии процесса нейровоспаления в ответ на разные виды стрессирования у мышей дикого типа и мышей, нокаутированных по рецептору кортикотропин-рилизинг фактора. После хронического интероцептивного стресса у мышей дикого типа число микро-глиальных клеток увеличивается в хилусе зубчатой фасции, а у нокаутированных мышей в поле САЗ; после умеренного экстероцептивного стресса у мышей дикого типа не наблюдается изменения числа микроглиальных клеток в гиппокампе, а у нокаутированных мышей их число увеличивается в поле САЗ. Учитывая, что увеличение числа микроглиальных клеток отражает развитие нейровоспаления, можно предположить, что нокаутирование гена рецептора CRFR2 изменяет чувствительность структур гиппокампа к провоспалительным факторам: хилус зубчатой фасции становится более устойчивым к хроническому интеро-цептивному стрессу, а поле САЗ - менее устойчивым. Впервые показано, что хронический интероцептивный стресс приводит к уменьшению иммунореактивности астроцитов в поле CAI гиппокампа мышей. При этом у мышей дикого типа оно наблюдается только в случае подкрепления хронического интероцептивного стресса умеренным экстероцептивным, а у нокаутированных мышей - наоборот, наблюдается только после хронического интероцептивного стресса.

Впервые показано, что реакция микроглии у грызунов не зависит от модальности стресса: увеличение числа микроглиальных клеток происходит в ответ как на экстеро-, так и на интероцептивный хронический стресс. В то же время изменения астроглии более специфичны к типу воздействия. Впервые выявлено, что реакция микроглии и астроцитов на хронический стресс, как правило, реципрокна.

Теоретическая и практическая значимость

В представленной работе было проведено сравнение эффектов стрессов двух принципиально различных типов, что позволило выявить общие черты в процессах нейровоспаления, вызванных разными (внутренними или внешними) стимулами. Выявлено, что пролиферация микроглии в гиппокампе мышей не является стресс-специфичной, но зависит от силы стрессора. При этом реакция астроцитов в мозге мышей на стресс может быть различной (как увеличение, так и уменьшение клеток), и зависит не только от силы стрессора, но и от модальности стресса. Таким образом, проведенное исследование существенно расширяет представление о цитоархитектонических изменениях ткани мозга в результате действия стрессогенных факторов и вносит важный вклад в понимание клеточных механизмов стресс-реактивности мозга и вызванного стрессом нарушения функционирования мозга.

Полученные данные о постстрессорных изменениях глии позволяют более полно понять механизмы развития и протекания процессов нейровоспаления, которые, как принято считать в настоящее время, являются одним из пусковых механизмов нейродегенерации. Знание механизмов развития нейровоспаления принципиально важно для понимания особенностей патогенеза и последующей разработки методов патогенетически обоснованной коррекции социально значимых нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и ДР-)-

Основные положения, выносимые на защиту

1. Хронический стресс различной модальности (экстеро- и интероцептивный) вызывает пролиферацию микроглии в гиппокампе грызунов.

2. Хронический стресс приводит к уменьшению ОРАР-иммунореактивности в гиппокампе грызунов или не влияет на нее. Эта реакция астроцитов зависит от типа стресса и от генетически предопределенного состояния гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Международном симпозиуме «Иммунная система мозга: нейрохимические и нейроэндокринные аспекты» (Ереван, 2010), XVII научной конференции «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), XIV Пущинской школе-конференции (Пущино, 2010), Международной школе COSTB30 «Клеточная нейропатология: in vitro модели» (Киев, 2010), на 7 и 8 Форумах FENS (Амстердам, 2010; Барселона, 2012), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010), Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2010), 8 Конгрессе IBRO (Флоренция, 2011), 23 Съезде ISN/ESN (Афины, 2011), конференции «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011), 2 молодежной школе БиоН (Нижний Новгород, 2011), 2 Всероссийской конференции «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2012).

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор данных литературы, главы результатов собственных иследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (19) и английском (82) языках. Диссертация изложена на 90 страницах, содержит 5 таблиц и 21 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа с животными. В работе использовано 155 самцов крыс линии Вистар и 29 мышей двух генетических линий: 12 дикого типа (C57BL/6, WT) и 17 нокаутированных по гену CRFR2 (КО). Животных содержали при свободном доступе к воде и пище. В виварии поддерживали искусственный световой режим (12:12). Протоколы экспериментов были одобрены этической комиссией ИВНД и НФ РАН.

Экстероцептивный стресс представлял собой комбинированное воздействие астенизирующего белого шума и неожидаемого электрокожного раздражения,

сопровождающего вспышки стробоскопа с вероятностью 0,5 [Hecht et al., 1977, Левшина с соавт., 1985]. Стрессирование осуществляли в течение 17 дней. За две недели до начала стрессирования, сразу после и через месяц после окончания стрессирования проводили батарею поведенческих тестов. Две группы животных подвергали хроническому эмоционально-болевому стрессу и декапитировали через день (ХЭС1, п=40) и через месяц (ХЭС2, п=12) после окончания стрессирования. Другие две группы группы интактных животных служили контролем: К1, п=25, и К2, п=8, и были декапитированы одновременно с группами ХЭС1 и ХЭС2 соответственно. За две недели до начала стрессирования проводили тесты «открытое поле», «темно-светлая камера» и «приподнятый крестообразный лабиринт» для рандомизации животных по группам. Сразу после и через месяц после окончания стрессирования повторно проводили эти тесты и тест «вынужденное плавание» для оценки психофизиологического состояния животных.

Интероцептивный стресс моделировали введением мышам WT и КО бактериального липополисахарида (ЛПС) из E.coli (Sigma, США) в дозе 0,5 мг/кг внутрибрюшинно каждые 48 часов, всего было произведено 10 инъекций. Умеренный экстероцептивный стресс реализовывали в результате последовательным проведением поведенческих тестов возрастающей стрессогенности: «темно-светлая камера», «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», «вынужденное плавание» и «подвешивание за хвост». Результаты этих тестов использовали для оценки эмоционального состояния животных (в т.ч. тревожности и депрессивности). Группы животных: ХИС, подвергнутые хроническому интероцептивному стрессу (n=3 WT, п=5 КО); УЭС, подвергнутые умеренному экстероцептивному стрессу (n=3 WT, п=3 КО); ХИС+УЭС, подвергнутые вначале хроническому интероцептивному, а затем умеренному экстероцептивному стрессу (n=3 WT, п=4 КО); К, контрольные,

получавшие дозу изотонического раствора (n=3 WT, п=5 КО) эквивалентного объема.

После окончания эксперимента мозг фиксировали, и изготавливали фронтальные срезы, которые окрашивали по методу Ниссля для гистологического анализа или иммуногистохимичски для количественного анализа глии. Для выявления микроглии использовали антитела к белку Iba-1 (Waco, Япония) или Isolectin В4 (Sigma, США), для выявления астроглии - антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (Dako, Дания). Оценку плотности иммуногистохимически окрашенных клеток проводили полуавтоматическим методом [Тишкина, 2009] по микрофотографиям, полученным с помощью микроскопа Leica DM6000 В, CCD-камеры Leica DFC310 FX и объектива 20х (цифровая апертура 0,5). На фиксированной площади подсчитывали число клеток, среднюю площадь клетки и иммунореактивность ткани (произведение числа клеток на среднюю площадь клетки).

Статистическую обработку проводили с помощью программного пакета Statistica 9.0 (StatSoft, США). Для анализа использовали тесты Краскела-Уоллеса, Манна-Уитни и Вилкоксона, отличия считали достоверными при р< 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнение реакции глии гипнокамна грызунов в ответ на стресс различной модальности

Гиппокамп — одна из наиболее чувствительных к стрессу структур мозга. Стресс приводит к изменению паттерна экспрессии синаптических белков, факторов транскрипции и ростовых факторов в гиппокампе [Alfonso et al., 2005]. Под действием стресса происходят морфологичкеские изменения нейронов (напр. ретракция дендритов пирамидных нейронов) [Conrad, 2008], изменяются долговременная потенциация [Kim et al., 2006] и процесс нейрогенеза [Dranovsky & Leonardo, 2012]. Эти изменения приводят к нарушению механизмов пластичности в гиппокампе и связанных с ними форм памяти [Howland, Wang, 2008].

Чувствительность этой структуры к стрессу связывают, в первую очередь, с взаимодействием глюкокортикоидов с их рецепторами, плотность которых в гиппокампе высока [Lupien & Lepage, 2001]. Поскольку нейровоспаление может возникать в ответ как на интеро-, так и на экстероцептивный стимул (при достаточной силе стрессора), представляло интерес сравнение этих двух модальностей стресса по степени индукции глиальной (нейровоспалительной) реакции. Сравнение эффектов стрессирующих факторов различной модальности затруднено тем, что гипоталамо-гипофизарно-адреналовая и иммунная системы вносят различный вклад в стресс-реакцию при разных типах стресса. Мы использовали хронический эмоционально-болевой стресс в качестве модели хронического экстероцептивного стресса (ХЭС) и хроническое введение липополисахарида (ЛПС) в качестве модели хронического интероцептивного стресса (ХИС). О степени воздействия стрессоров судили по изменениям в поведении стрессированных животных и по степени выраженности цитоархитектонических изменений.

Изменения глии при хроническом экстероцептивном стресс

Для использованной модели ранее было показано, что к концу второй недели стрессирования состояние крыс характеризуется измененным уровнем окислительного стресса в мозге и локального мозгового кровотока [Гуляева с соавт., 1988], при этом соотношение исследованных показателей соответствует стадии долгосрочной адаптации по Г. Селье [Селье, 1982]. При этом поведение стрессированных крыс практически не отличается от такового контрольной группы, указывая на адаптированность животных. Действительно, после двухнедельного стрессирования мы не наблюдали различий между группами К1 и ХЭС1 по показателям двигательной и исследовательской активности (рис. 1). Уровень тревожности и депрессивности, оцениваемый по показателям тестов «темно-светлая камера», «приподнятый крестообразный лабиринт» и «вынужденное плавание», также не различался между этими двумя группами.

150 100 50 0

число квадратов

число выглядывании

150 100 50 0

500 400 300 200 100 0

число стоек

число болюсов

Рис. 1. Поведение в тестах «открытое поле» (А, Б, Г) и «темно-светлая камера» (В): эффекты ХЭС (% от показателей контрольной группы).

Белые кружки:К1 (2), К2 (3); темные кружки: ХЭС1 (2), ХЭС2 (3).

Точки 1, 2 и 3 — до, через день и через месяц после ХЭС, соответственно.

* - р< 0.05 по сравнению с контролем, $ - р< 0.05 по сравнению с показателем до

стресса.

Достоверным эффектом хронического эмоционально-болевого воздействия было увеличение числа дефекационных болюсов в группе ХЭС1 по сравнению с этим показателем в группе К1. Это может свидетельствовать об изменении реактивности вегетативной нервной системы, тем более, что ранее на этой модели

хронического стресса были получены данные о соответствующих изменениях артериального давления и индекса Хильдебранта [Гуляева, 1989]. Было также выявлено умеренное ухудшение реакции угашения на знакомую обстановку в тесте «открытое поле»: у крыс группы К1 наблюдалось уменьшение числа пересеченных квадратов и числа стоек при повторном тестировании, в то время как в группе ХЭС1 число стоек осталось на том же уровне, что и до стрессирования (рис. 1).

' 0 ч > « 1 « г« ,

Г» 1 - '¿VI*. . > -и* - А ' 100 мкм

Рис. 2. Изменения цитоархитектоники гиппокампа после ХЭС.

Окрашивание по методу Ниссля. А, В: К1; Б, Г: ХЭС1. А, Б-СА1; В, Г-САЗ. Шкала - 100 мкм.

Хронический эмоционально-болевой стресс вызывал в гиппокампе значительное увеличение числа нейронов с измененным функциональным

состоянием, которое характеризовалось измененной (сморщенной) формой тела, более темным (ацидофильным) окрашиванием, иногда извитыми или утолщенными апикальными дендритами (рис. 2). При этом наблюдали небольшое, но достоверное уменьшение общего числа нейронов в группе ХЭС1 по сравнению с группой К1 в поле САЗ гиппокампа (около 7%) (рис. 3). Число глиальных клеток, нейроно-глиальный индекс и число сателлитных глиальных клеток не различались между группами ХЭС1 и К1. Кроме изменений клеток мозга, мы наблюдали также извитость и отечность сосудов, свидетельствующие об изменении их тонуса, а также расслоение между молекулярным и клеточным (пирамидным или гранулярным) слоями в поле САЗ и в хилусе зубчатой фасции.

Рис. 3. Доля нейронов с измененным функциональным состоянием в норме и после ХЭС.

Белые столбики - общее число нейронов, черные -число нейронов с

измененным функциональным состоянием. 1: К1; 2: ХЭС1. * - р< 0.05 по сравнению с показателем в контроле.

При окрашивании методом TUNEL, мы не обнаружили признаков апоптоза клеток мозга. Действительно, ранее было показано уменьшение активности каспазы-3 в гиппокампе крыс после двухнедельного экстероцептивного стресса [Айрапетянц с соавт., 2006], которое свидетельствует об отсутствии классических

СА1

САЗ

30 20 10

апоптотических процессов нейрональной гибели. Интересно, что на этой же модели ХЭС было показано уменьшение экспрессии мРНК белков, связанных с нейрональной пластичностью (белка нейрональной адгезии-1 и ламинина-1 (3) [Пискунов, 2011], что может быть дополнительным свидетельством нейродегенеративных изменений.

СА1

САЗ

300

200

100

І # і

и и

Рис. 4. Изменение числа микроглиальных (А) и астроглиальных (Б) клеток после ХЭС на следующие сутки и через месяц после окончания стрессирования (% от контроля).

1: ХЭС1; 2: ХЭС2. *- р < 0.05; # - р < 0.1 по сравнению с контролем.

Рис. 5. Реакция глии поля САЗ гиппокампа на ХЭС.

А, В: К1; Б, Г: ХЭС1. А, Б:микроглия (Iba-1-позитивные клетки); В, Г: астроциты (GFAP-позитивные клетки). Шкала - 50 мкм.

Наблюдаемые изменения нейронов сопровождались значительным увеличением числа микроглиальных клеток в гиппокампе (в полях CAI и САЗ гиппокампа и в хилусе зубчатой фасции) (рис. 4). На срезах мозга животных группы ХЭС1 окрашивание клеток микроглии было более интенсивным, сома клетки имела

больший размер, чем в группе К1. В мозге стрессированных животных были обнаружены очаги воспаления - скопления микроглиоцитов, возможно, в местах диапедеза. Астроцитарные изменения были выражены в меньшей степени, чем микроглиальные, однако СРАР-иммунореактивность поля САЗ была меньше в группе ХЭС1, чем в группе К1 (рис. 4, 5).

Ранее было показано, что использованная нами модель ХЭС характеризуется увеличением уровня интерлейкина-1р, фактора некроза опухоли-а и эритропоэтина в гиппокампе крыс [Пискунов, 2011]. Таким образом, наблюдаемое нами увеличение числа микроглиальных клеток в этой структуре подтверждает наличие воспалительных процессов в ткани мозга и указывает на микроглию как на потенциальный источник цитокинов.

Реакция глии на хронический интероцептивный, умеренный экстеро-цептивный стресс и их комбинированное действие у мышей дикого типа (Т¥7)

ХИС (хроническое введение ЛПС мышам) приводил к изменениям в поведении, вызывая уменьшение тревожности: мыши чаще выходили в центр в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт». Этот эффект не был связан с изменением двигательной активности (рис. 6А, 6В). Мы не наблюдали изменения реактивности вегетативной нервной системы, как это было отмечено при экстероцептивном стрессе.

Качественное гистологическое исследование срезов мозга, окрашенных по Нисслю, не выявило существенных морфологических изменений нейронов. Число измененных нейронов в группе ХИС не превышало этого показателя в группе К. По-видимому, ХИС не приводил и к столь сильным изменениям локального мозгового кровотока, как экстероцептивный стресс: не были отмечены перикапиллярные отеки, свидетельствующие об изменении тонуса сосудов.

Увеличение числа микроглиоцитов после ХИС было заметно уже при качественном иммуногистохимическом анализе некоторых структур мозга, например, хилуса зубчатой фасции гиппокампа (рис. 7). Количественный

иммуногистохимический анализ подтвердил увеличение иммунореактивности микроглии в этой структуре. При этом мы не наблюдали изменения иммунореактивности астроцитов (рис. 8А).

Рис. 6. Изменения поведения мышей после ХИС (% от К \¥Т).

A, Б, тест «открытое поле»: 1 - пройденное расстояние, 2 - число выходов в центр.

B, Г, тест «приподнятый крестообразный лабиринт»: 1 - время в открытых рукавах, 2 - время в центре. Белые столбики: К; черные столбики: ХИС. * - р< 0,05, # - р < 0,10 по сравнению с К, $ - р < 0,05 по сравнению с показателем у \УГ.

Умеренный экстероцептивный стресс (УЭС, проведение батареи поведенческих тестов увеличивающейся стрессогенности) не приводил к изменению иммунореактивности ни микроглии, ни астроцитов (рис. 8В).

А ШйШШ ■ V _ Б -> . , »

4 ' ■ 'Ш «у S* - % j ' '' г л' -4 V

jtö*:* * .v : ~ ■ '"Тк., г 50 (и км

Рис. 7. Реакция микроглии в хилусе зубчатой фасции на ХИС.

А: К, Б: ХИС. Иммуногисто-химическое окрашивание с использованием антител к белку Iba-1. Шкапа - 50 мкм.

400 300 200 100 0

250 200 150 100 50 0

А WT

СА1 САЗ DG

г ко

СА1 САЗ DG

250 200 150 100 50 0

Б WT

СА1

200 150 100 -50 0

САЗ

250 д ко i

СА1 САЗ DG

250 200 150 100 50 0

250 200 150 100 50 О

В WT

СА1 Е КО

САЗ *

СА1 САЗ DG

Рис. 8. Изменение микроглии (белые столбики) и астроглии (заштрихованные столбики) после различных стрессорных воздействий (% от К >УТ).

А, Г: ХИС; Б, Д: УЭС; В, Е: ХИС+УЭС.

А, Б, В: \УГ; Г, Д, Е: КО. * - р < 0.05, # - р < 0.1 по сравнению с К \УГ.

Комбинированное действие хронического введения ЛПС и УЭС сопровождалось увеличением иммунореактивности микроглии (в хилусе зубчатой фасции) и уменьшением иммунореактивности астроцитов (в поле гиппокампа CAI) (рис. 8Д).

Хронический стресс как экстеро-, так и интероцептивный приводил к увеличению числа микроглиоцитов в гиппокампе. При этом при стрессе обеих модальностей реакция астроцитов была выражена слабее, чем реакция микроглии (табл. 1).

2. Отдаленный эффект ХЭС на глию гиппокампа крыс

Для исследования отдаленного эффекта ХЭС крыс после окончания стрессирования оставляли на месяц в домашних клетках. Через месяц после окончания стрессирования поведение крыс группы ХЭС2 не отличалось от поведения крыс группы К2 (рис. 1). При качественном анализе цитоархитектоники гиппокампа крыс группы ХЭС2 было обнаружено лишь незначительное число нейронов с патологическими изменениями, не отличающееся от этого показателя в группе К2. Количественный иммуногистохимический анализ показал, что Iba-1-иммунореактивность микроглии в группе ХЭС2 оставалась повышенной по сравнению с группой К2 во всех трех исследованных областях гиппокампа, но только на уровне тенденции (рис. 4). В соответствии с этим фактом, уровни интерлейкина-ip и фактора некроза опухоли-a также были повышены в гиппокампе крыс группы ХЭС2 по сравнению с уровнями этих факторов в группе К2. Уровень эритропоэтина на этом сроке не различался между этими двумя группами [Пискунов, 2011]. GFAP-иммунореактивность астроцитов во всех трех областях гиппокампа в группе ХЭС2 не отличалась от этого показателя в группе К2.

Таким образом, через месяц после окончания стрессирования значительно снизилось число темных нейронов и исчезли изменения астроцитарной глии,

которые наблюдали сразу после окончания стрессирования. При этом оставались повышенными число микроглиальных клеток (на уровне тенденции) и уровень цитокинов (интерлейкина-1Р и фактора некроза опухоли-а), что позволяет предположить наличие нейровоспаления и через месяц после окончания стрессирования (табл. 2).

Табл. 1. Реакция глии гиппокампа на стрессирующие воздействия различной модальности.

Табл. 2. Реакция глии гиппокампа на хронический экстероцептивный стресс через сутки и через месяц после окончания стрессирования.

Тип стресса Микроглия Астроглия

ХЭС Т CAI, САЗ, dg і САЗ

ХИС Tdg -

УЭС - -

ХИС+УЭС |dg 1 CAI

Группа Микроглия Астроглия

ХЭС1 t CAI, САЗ, DG і САЗ

ХЭС2 1 CAI, САЗ, DG (р<0.10) -

3. Влияние нокаута CRFR2 на реакцию глии в ответ на ХИС, УЭС и их комбинированное действие

Кортикотропин-рилизинг фактор является важным участником стресс-реакции. Показано, что у мышей с нокаутом гена рецептора второго типа кортикотропин-рилизинг фактора (CRFR2) после стрессирующего воздействия более резко увеличивается и дольше держится повышенным уровень адренокортикотропного гормона в крови [Bale & Vale, 2004]. Однако при отсутствии стрессоров нокаутированные мыши мало отличаются от мышей дикого типа. Так, например, по показателям поведения мы обнаружили немногие различия между мышами дикого типа (WT) и нокаутированными (КО): в тесте «открытое поле» мыши КО делали больше стоек, а в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» больше времени проводили в центре и меньше в закрытых рукавах, чем мыши WT.

Рецептор CRFR2 обнаружен в гиппокампе (поля CAI и САЗ), латеральном септуме, базолатеральном и медиальном ядрах миндалины, паравентрикулярном ядре и ядре ложа конечной полоски [Joels & Вагат, 2009]. Был проведен иммуногистохимический анализ всех этих структур. Учитывая, что эти структуры являются частью лимбической системы мозга, представляло интерес проследить вовлечение эмоциогенных структур в ответ на интероцептивный стресс, изначально не имеющий эмоциогенной составляющей. Количественный иммуногистохимический анализ не выявил базальных различий по числу микроглиальных и астроцитарных клеток в этих структурах у мышей с разными генотипами. Однако влияние различий на генетическом уровне между мышами WT и КО проявилось при предъявлении стрессора. Например, у мышей КО значительно слабее было выражено изменение поведения после хронического введения ЛПС, чем у мышей WT. В тесте «открытое поле» не было выявлено достоверных различий между группами ХИС КО и К КО; в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» наблюдали только тенденцию к увеличению времени пребывания в закрытых рукавах. Единственным достоверным отличием поведения мышей КО после хронического введения ЛПС было увеличение амплитуды раскачивания в тесте «подвешивание за хвост». У мышей КО мы не выявили такого уменьшения тревожности после хронического введения ЛПС, какое наблюдали у мышей WT (рис. 6Б, 6Г).

Если по показателям поведения реакция нокаутированных мышей на ХИС была выражена слабее, то по гистологическим показателям, наоборот, клеточные изменения были выражены ярче у мышей КО, чем у мышей WT (рис. 8). Так, у мышей КО после хронического введения ЛПС мы наблюдали изменения не только по числу микроглиальных клеток, но и по числу астроцитов (рис. 8Б). Число микроглиальных клеток у мышей КО статистически достоверно увеличилось в поле САЗ гиппокампа, базомедиальном ядре миндалины и в энторинальной коре, а средняя площадь клетки - в вентролатеральном ядре септума. Число астроцитов и

средняя площадь клетки статистически достоверно уменьшились в поле гиппокампа CAI, а в медиальном септуме число GFАР-позитивных клеток увеличилось.

После УЭС мы наблюдали увеличение числа микроглиальных клеток у мышей КО в поле гиппокампа САЗ (рис. 8Г). При этом у мышей WT в ответ на это воздействие не было отмечено никакой глиальной реакции, т.е. глия мышей КО оказалась более стресс-реактивной в ответ и на этот вид стресса (Рис. 8В-Г). Как указано выше, у мышей с нокаутом CRFR2 наработка пиковой концентрации адренокортикотропного гормона в плазме крови происходит быстрее, и его повышенная концентрация держится дольше, чем у мышей дикого типа. Возможно, с этим связан тот факт, что в ответ на УЭС мы наблюдали активацию микроглии в гиппокампе у мышей КО, но не у мышей WT, т.к. активация микроглии связана с уровнем глюкокортикоидов в плазме крови. Хроническое введение ЛПС также вызывало у мышей WT активацию только микроглии, а у мышей КО кроме того и астроцитарные изменения, т.е. один и тот же интероцептивный стресс вызывал более выраженные цитоархитектонические перестройки у мышей с более активной реализацией стресс-реакции.

В ответ на комбинированное действие хронического введения ЛПС и умеренного экстероцептивного стресса у мышей КО увеличивалось число микроглиоцитов в поле САЗ гиппокампа и не изменялась GFAP-иммунореактивность астроцитов (рис. 8Е). В то же время у мышей WT именно этот тип воздействия вызывал наибольшую активацию как микро-, так и астроглии (табл. 3).

Таким образом, мыши КО с потенциированной системой стресс-реализации реагируют на стресс иначе, чем мыши дикого типа, несмотря на то, что базальные показатели у этих двух типов мышей значительно не различаются. Изменение реакции на стресс выражены и на уровне поведения, и на уровне глиальной реакции.

Табл. 3. Сравнение реакции глии в ответ на стресс различной модальности у мышей дикого типа и мышей с измененной стресс-реакцией. \УТ - мыши дикого типа, КО - мыши с нокаутом СКЬ К2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашем эксперименте все воздействия, кроме УЭС, приводили к увеличению микроглии в исследованных областях мозга. По-видимому, хронический стресс с большой вероятностью вызывает активацию микроглии в гиппокампе грызунов, вне зависимости от модальности (экстеро- или интероцептивный). Не всегда активации микроглии сопутствуют астроцитарные изменения: мы наблюдали изменения астроцитов только в ответ на экстероцептивный стресс у крыс и на комбинированное действие хронического интероцептивного и умеренного экстероцептивного стресса у мышей. Хронический интероцептивный стресс сам по себе вызывал реакцию астроцитов только у нокаутированных по рецептору второго типа кортикотропин-рилизинг фактора мышей, т.е. у животных с измененной стресс-реакцией. Таким образом, реакция астроцитов в гиппокампе при хроническом стрессе разной модальности зависит от типа стресса и от генетически предопределенного состояния гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.

Принимая во внимание все вышесказанное, можно заключить, что пролиферация микроглии является более общим, не специфичным относительно типа хронического стресса процессом. В то же время изменения астроглии в ответ на хронический стресс являются более гибкой и специфической компонентой глиальной реакции. Проявление реакции астроглии зависит от многих факторов, в частности, от силы стрессора и состояния гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.

Микроглии Астроглня

\УТ КО \УТ ко

хис | САЗ - | СА1

УЭС - | САЗ - -

ХИС+УЭС | САЗ | СА1 -

ВЫВОДЫ

1. Хронический (двухнедельный) экстероцептивный стресс у крыс вызывает умеренное уменьшение реакции угашения на знакомую обстановку.

2. Хронический экстероцептивный стресс вызывает увеличение числа нейронов с измененным функциональным состоянием, сопровождающееся увеличением числа микроглиоцитов (в полях CAI и САЗ гиппокампа и в хилусе зубчатой фасции) и уменьшением иммунореактивности астроцитов (в поле САЗ гиппокампа).

3. Через месяц после окончания стрессирования число микроглиоцитов уменьшается, а GFAP-иммунореактивность астроцитов в поле САЗ гиппокампа возвращается к контрольному уровню.

4. Хронический интероцептивный стресс (введение бактериального липополисахарида) приводит к уменьшению тревожности мышей линии C57BL/6 (дикий тип) и сопровождается увеличением числа микроглиоцитов в хилусе зубчатой фасции. Умеренный экстероцептивный стресс (батарея поведенческих тестов с возрастающей стрессогенностью) не приводит к глиальным изменениям в мозге мышей, а комбинированное действие хронического интероцептивного и умеренного экстероцептивного стресса вызывает увеличение иммунореактивности микроглии в хилусе зубчатой фасции и уменьшение иммунореактивности астроцитов в поле CAI гиппокампа.

5. Нокаутирование гена рецептора второго типа кортикотропин-рилизинг фактора (CRFR2) изменяет развитие нейровоспаления. У нокаутированных мышей хронический интероцептивный стресс вызывает увеличение числа микроглиоцитов в поле САЗ гиппокампа и уменьшение числа астроцитов в поле CAI гиппокампа. Умеренный экстероцептивный стресс и комбинированное действие хронического интероцептивного и умеренного экстероцептивного стресса приводят к увеличению числа микроглии в поле САЗ гиппокампа.

6. У грызунов увеличение числа микроглиальных клеток происходит в ответ как на экстеро-, так и на интероцептивный хронический стресс, при этом изменения астроглии более специфичны к типу воздействия. Реакция микроглии и астроцитов на хронический стресс, как правило, реципрокна.

Список опубликованных по теме диссертации статей:

1. Тишкина А.О., Метод автоматического количественного анализа микрофотографий срезов мозга, Нейрохимия, 2009, т.26, №4, стр.341-347 (TishkinaA.O., A Method of Automated Quantitative Analysis of Brain Slices Microphotographs, Neurochemical Journal, 2009, V3, №4, PP309-313).

2. Тишкина A.O., Левшина И.П., Лазарева H.A., Пасикова Н.В., Степаничев М.Ю., Айрапетянц М.Г., Гуляева Н.В., Хронический стресс вызывает неапоптотическую гибель нейронов в гиппокампе крыс, Доклады Академии Наук, 2009, т.428, №1, стр.130-134.

3. Tishkina A, Rukhlenko A, Stepanichev М, Levshina I, Pasikova N, Onufriev M, Moiseeva Y, Piskunov A, Gulyaeva N., Region-specific changes in activities of cell death-related proteases and nitric oxide metabolism in rat brain in a chronic unpredictable stress model, Metab Brain Dis., 2012, V27, №4, PP431-441.

По теме работы опубликовано 12 тезисов (6 на английском языке).

Работа поддержана грантами РФФИ 08-04-90013-Бел_а, 10-04-90049-Бел_а, 12-04-31575-мол а.

Список использованных сокращений:

CAI и САЗ - поля гиппокампа

DG - хилус зубчатой фасции

GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок

CRFR2 - рецептор второго типа кортикотропин-рилизинг фактора

КО - мыши, с нокаутированным геном CRFR2

WT - мыши дикого типа (C57BL/6)

ЛПС - липополисахарид

ХИС — хронический интероцептивный стресс

ХЭС - хронический экстероцептивный стресс

УЭС - умеренный экстероцептивный стресс

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тишкина, Анна Олеговна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 612.8

04201358633

Тишкина Анна Олеговна

РЕАКЦИЯ МИКРОГЛИИ И АСТРОЦИТОВ МОЗГА ГРЫЗУНОВ НА ХРОНИЧЕСКИЙ СТРЕСС РАЗЛИЧНОЙ

МОДАЛЬНОСТИ

Специальность 03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Н.В. Гуляева

Москва 2013

Оглавление

Список сокращений 4

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Строение и происхождение микроглиальных клеток 13

1.2. Строение и основные функции астроцитов 16

1.3. Реакция микро- и астроглии на стресс 22

1.4. Взаимодействие микро- и астроглии при стрессе 26 Глава 2. Материалы и методы 33

2.1. Содержание животных 3 3

2.2. Модель экстероцептивного стресса 33

2.3. Модель интероцептивного стресса 36

2.4. Исследование поведения 37

2.4.1. Тест «открытое поле» 3 7

2.4.2. Тест «тесно-светлая камера» 38

2.4.3. Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» 38

2.4.4. Тест «вынужденное павание» 38

2.4.5. Тест «подвешивание за хвост» 39

2.4.6. Измерение активности мышей 40

2.5. Фиксация ткани мозга и изготовление срезов 40

2.5.1. Изготовление парафиновых срезов мозга 40

2.5.2. Изготовление «плавающих» срезов мозга 40

2.6. Гистологический анализ цитоархитектоники ткани мозга 40

2.7. Окрашивание срезов для гистологического анализа микроглиоцитов 41

2.8. Окрашивание срезов для гистологического анализа астроглиоцитов 43

2.9. Подсчет клеток глии полуавтоматическим методом 44

2.10. Статистическая обработка результатов 48

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 49

3.1. Сравнение реакции глии гиппокампа грызунов в ответ на хронический стресс различной модальности 49

3.1.1. Изменения поведения в ответ на хронический экстероцептивный стресс 50

3.1.2. Изменения поведения в ответ на хронический интероцептивный стресс 55

3.1.3. Реакция глии на хронический экстероцептивный стресс

3.1.4. Реакция глии на хронический интрецептивный и умеренный экстероцептивный стресс, а также на их комбинированное действие 62

3.2. Отдаленные эффекты хронического экстероцептивного стресса

3.2.1. Отдаленный эффект хронического экстероцептивного стресса на уровне поведения 67

3.2.2. Отдаленный эффект хронического экстероцептивного стресса на цитоархитектонику 69

3.3. Влияние нокаута гена рецептора второго типа кортикотропин-рилизинг фактора (СКРЯ2) на реакцию глии в ответ на хронический интероцептивный стресс, умеренный экстероцептивный стресс и их комбинированное действие 72 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 79 ВЫВОДЫ 80 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 82

Список сокращений

ОБ АР - глиальный фибриллярный кислый белок

СЯРЯ2 - рецептор второго типа кортикотропин-рилизинг фактора

КО - мыши, с нокаутированным геном 01^112

WT - мыши дикого типа (С57ВЬ/6)

ГГАС - гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система

ГК - глюкокортикоиды

ГКР - глюкокортикоидные рецепторы

ГФКБ - глиальный фибриллярный кислый белок

КРФ - кортикотропин-рилизинг фактор

МКР - минералкортикоидные рецепторы

ОИ - область интереса

ЛПС - липополисахарид

УЭС - умеренный экстероцептивный стресс

ХИС - хронический интероцептивный стресс

ХЭС - хронический экстероцептивный стресс

Введение

Глия выполняет в ЦНС множество функций, направленных на поддержание стабильной работы нейронной сети. Одной из этих функций является организация внутренней иммунной системы мозга. При повреждениях, травмах, инфекции или нарушении гемато-энцефалического барьера активируются резидентные макрофаги нервной ткани - микроглия. Активация микроглии выражается в изменении паттерна экспрессии генов и соответствующих белков, что, в частности, приводит к увеличению уровня цитокинов (про- и противовоспалительных факторов) в ткани. Этот процесс принято называть нейровоспалением. На клеточном уровне основным маркером нейровоспаления является увеличение числа микроглиоцитов. Активированная микроглия начинает секретировать провоспалительные факторы (интерлейкин-6, интерлейкин-lß, TNF а). На определенной стадии нейровоспаления микроглиальные клетки становятся макрофагами и начинают секретировать, кроме перечисленных цитокинов, интерферон-у и оксид азота [Raivich, 1999].

При выраженной активации микроглии в процесс нейровоспаления включается также астроглия [Schubert, 2000]. Показано, что на астроцитах есть рецепторы цитокинов, и что астроглия может экспрессировать про- и противовоспалительные факторы [Bohn, 1994]. Нейровоспаление, как любой воспалительный процесс в организме, на первом этапе, несомненно, имеет адаптивную природу, выполняя защитные функции. Однако чрезмерная активация воспалительного процесса становится патологическим фактором. Действительно, нейровоспаление сопутствует начальным стадиям нейродегенеративных заболеваний и может вносить существенный вклад в процессы гибели нейронов [Gahtan, 1999].

В большинстве работ, направленных на изучение нейровоспаления, исследуют этот процесс на этапе развившейся церебральной патологии. Однако большой интерес представляет исследование нейровоспаления на начальном этапе развития патологии. Существует предположение, что повторяющиеся эпизоды нейровоспаления, эффекты которых суммируются в течение жизни, могут приводить к возникновению нейродегенерации и развитию заболеваний, часто сопровождающих старение, таких как болезни Альцгеймера или Паркинсона [Gahtan, 1999]. Такие эпизоды нейровоспаления могут возникать в результате стрессов, вирусных или бактериальных инфекций. Активация иммунной системы организма приводит к увеличению уровня провоспалительных факторов в циркулирующей крови, проникновению их в мозг и, как следствие, к возникновению нейровоспалительных процессов. Поскольку активация иммунной системы стимулирует гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему [Turnbul, 1999; Besedovsky, 2000], предложено понятие «интероцептивный стресс», т.е. стресс, вызванный внутренним стимулом [Rinaman, 1999]. Показано, что экстероцептивный стресс (стресс, вызванный внешним стимулом) также может приводить к возникновению нейровоспаления [Braun, 2009; Tynan, 2010], опосредованного влиянием стресс-реализующей системы на иммунную систему организма в целом и мозга, в частности. Так, Dinkel с соавт. показали, что глюкокортикоиды в мозге не являются иммуносупрессорами, а, наоборот, оказывают провоспалительное действие [Dinkel, 2010]. Показана высокая чувствительность гиппокампа к глюкокортикоидам [Conrad, 2008], при этом хронический стресс вызывает селективное продолжительное возрастание уровня провоспалительных факторов в этой структуре [Пискунов, 2011].

Рецепторы к глюкокортикоидам экспрессируются на астроцитах [Maureletal., 2000], которые чувствительны к изменению уровня глюкокортикоидов в крови. Их число может изменяться в ответ на стресс [Unemara, 2012]. Принимая во внимание, что с возрастом реактивность гипоталамо-гипофизарно-адреналовой и иммунной систем мозга усиливается, хроническое воздействие стрессов различной модальности (экстеро- или интероцептивных) со временем может приводить к нейродегенерации [Jürgens, 2012]. Таким образом, исследование последствий хронического стресса на структурно-функциональное состояние мозга может приблизить к пониманию причин развития нейродегенеративных заболеваний. Поскольку глиальные клетки, в первую очередь микроглия и астроциты, играют существенную роль в процессах нейровоспаления, важной частью этой работы является изучение их реакции на хронический стресс различной модальности.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

3. Исследовать состояние микро- и астроглии в мозге мышей с нокаутом рецептора второго типа кортикотропин-рилизинг фактора

после хронического интероцептивного и умеренного экстероцептивного стресса, а также их комбинированного действия.

Научная новизна

Впервые показано, что после двухнедельного эмоционально-болевого стресса уменьшается иммунореактивность астроцитов в поле САЗ гиппокампа, но не в поле CAI гиппокампа или хилусе зубчатой фасции. При этом через месяц после окончания стрессирования иммунореактивность астроцитов в поле САЗ гиппокампа возвращается к контрольному уровню.

В работе впервые продемонстрированы различия в развитии процесса нейровоспаления в ответ на разные виды стрессирования у мышей дикого типа и мышей, нокаутированных по рецептору кортикотропин-рилизинг фактора. После хронического интероцептивного стресса у мышей дикого типа число микроглиальных клеток увеличивается в хилусе зубчатой фасции, а у нокаутированных мышей в поле САЗ; после умеренного экстероцептивного стресса у мышей дикого типа не наблюдается изменения числа микроглиальных клеток в гиппокампе, а у нокаутированных мышей их число увеличивается в поле САЗ. Учитывая, что увеличение числа микроглиальных клеток отражает развитие нейровоспаления, можно предположить, что нокаутирование гена рецептора CRFR2 изменяет чувствительность структур гиппокампа к провоспалительным факторам: хилус зубчатой фасции становится более устойчивым к хроническому интероцептивному стрессу, а поле САЗ - менее устойчивым. Впервые показано, что

хронический интероцептивный стресс приводит к уменьшению иммунореактивности астроцитов в поле CAI гиппокампа мышей. При этом у мышей дикого типа оно наблюдается только в случае подкрепления хронического интероцептивного стресса умеренным экстероцептивным, а у нокаутированных мышей - наоборот, наблюдается только после хронического интероцептивного стресса.

Теоретическая и практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту

2. Хронический стресс приводит к уменьшению GFAP-иммунореактивности в гиппокампе грызунов или не влияет на нее. Эта реакция астроцитов зависит от типа стресса и от генетически предопределенного состояния гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Международном симпозиуме «Иммунная система мозга: нейрохимические и нейроэндокринные аспекты» (Ереван, 2010), XVII научной конференции «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), XIV Пущинской школе-конференции (Пущино, 2010), Международной школе COST В30 «Клеточная нейропатология: in vitro модели» (Киев, 2010), на 7 и 8 Форумах FENS (Амстердам, 2010; Барселона, 2012), XXI Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга, 2010), Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2010), 8 Конгрессе IBRO (Флоренция, 2011), 23 Съезде ISN/ESN (Афины, 2011),

конференции «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011), 2 молодежной школе БиоН (Нижний Новгород, 2011), 2 Всероссийской конференции «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2012).

Глава 1. Обзор литературы

Адаптация к стрессу является жизненно важной функцией живого организма. Одной из классификаций стресса является его деление на острый и хронический. К острому стрессу относят однократное предъявление стрессирующего стимула, кратковременное действие стрессирующего фактора. Реакция на острый стресс представляет собой реализацию жестких, генетически детерминированных, программ и не предполагает долговременных изменений в организме. В отличие от острого стресса, приспособление к хроническому стрессу требует от организма определенных структурных перестроек [Меерсон, 1993], направленных на изменение внутреннего равновесия - гомеостаза -на новое равновесное состояние, называемое аллостазом. Новое равновесное состояние организма должно соответствовать требованиям, предъявляемым организму в условиях хронического стресса. Мозг является координирующим центром, управляющим нервными и гуморальными сигналами, направленными на поддержание гомеостаза или на установление нового равновесного состояния. При этом мозг находится под воздействием стрессирующих факторов, вследствие чего также претерпевает структурные и биохимические изменения в условиях хронического стресса. Так, например, гиппокамп является частью лимбической системы и участвует в так называемом лимбико-гипоталамо-гипофизарном управлении стресс-реакцией [Peters, 2011], но при этом гиппокамп сам подвержен повреждающему действию глюкокортикоидов [Sapolsky, 1986]. В условиях стресса нагрузка на определенные структуры мозга возрастает, что связано с увеличением нейрональной активности. При этом изменяются нейромедиаторный и ионный балансы и увеличивается потребность в энергетическом

обеспечении этих структур (потребность в глюкозе и кислороде). К этому добавляется увеличение уровня стероидных гормонов и цитокинов в крови, которые, проходя гемато-энцефалический барьер, способны изменять паттерн экспрессии генов и влиять тем самым на работу клеток нервной системы. Функции поддержания нейрональной сети в рабочем состоянии принадлежат глии [Ройтбак, 1993]. Именно эти клетки нервной системы регулируют локальный мозговой кровоток, ионный и нейромедиаторный гомеостаз межклеточной среды, ответственны за проницаемость гемато-энцефалического барьера и устранение чужеродных для нервной ткани агентов. Эти функции распределены между различными типами глиальных клеток: микроглией, астро- и олигодендроцитами. В норме и при патологии существуют определенные межклеточные сигналы, посредством которых эти клетки координируют свою работу [Schubert, 2000]. Существует предположение, что в условиях стресса возникают нарушения этой координации, которые впоследствии могут приводить к патологии. Данный обзор литературы направлен на рассмотрение современных исследований функционирования микроглии и астроцитов, а также их взаимодействия в норме и в условиях стресса.

1.1. Строение и происхождение микроглиальных клеток

Микроглия представлена мелкими отростчатыми клетками с очень плотной цитоплазмой. В норме клетки микроглии составляют 10-20% от всей популяции глии. У взрослых особей резидентные клетки микроглии медленно обновляются и сохраняют способность к пролиферации, т.е. в состоянии покоя популяция микроглии может существовать, поддерживая себя самостоятельно и не нуждаясь в предшественниках извне. На

данный момент существует несколько различных теорий происхож�

Информация о работе

Тишкина, Анна Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Реакция микроглии и астроцитов мозга грызунов на хронический стресс различной модальности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы