Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм нейротоксичности β-Амилоида

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм нейротоксичности β-Амилоида"

На правах рукописи

Абрамов Андрей Юрьевич

Механизм нейротоксичности р-Амилоида

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой стспепи доктора биологических наук

2 4 ИЮЛ

Пущине 2014

005550884

005550884

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учереждении науки Институт биофизики клетки Российской академии наук н в Университетском коледже Лондона.

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учереждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации.

доктор биологических наук. Федеральное государственное бюджетное учережденне науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, заведующий лабораторией экспериментальной нейробиодогии.

Авдонин Павел Владимирович доктор биологических наук, профессор. Федеральное государственное бюджетное учереждение науки Институт биологии развития им. Н.КЛСольцова Российской Академии наук, заведующий лаборатории физиологии рецепторов и сигнальных систем

Хаспекоа Леонид Георгиевич доктор биологических наук, отдел исследований мозга,

Федерального государственного бюджетного учереждении «Научного центра неврологии» Российской академии медицинских наук, заведующий лаборатории экспериментальной нейроцитологии

Научный консультант Зинченко Валерий Петрович

Официальные опоненти

Годухин Олег Викторович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биа.тогиии.ч.А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова ,

Защита диссертации состоится «16» октября 2014 года в 14 ч. 00 мин

На заседании Диссертационного совета Д 00.038.01 Федерального государственного бюджетного учереждения науки Института биофизики клетки Российской академий наук по адресу:

142290, г. Пущина Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Путинского научного центра РАН г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

Автореферат разослан « /о» ири^ 2014 года

$

Ученый секретарь Диссертационного товега

/ ), ^ /V"

Кандидат биологических наук / ¡/< /Л- ,./СмолихинаТатьяна Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Болезнь Альцгеймера является наиболее распространенной формой слабоумия, ведущая к полной деградации личности с последующей гибелью. Учитывая возрастание процента престарелых людей, ожидается дальнейший рост этого заболевания, и к 2050 году число больных может увеличиться в три раза (Spires, Hyman, 2005). В связи с этим данное заболевание рассматривается как одна из наиболее серьезных проблем современной медицины.

Знание этиологии этого заболевания достаточно лимитированно, хоть и к настоящему времени, очевидно, что болезнь вызывается комбинацией влияния окружающей среды и генетических факторов. Надежды на лечение пациентов в ближайшем будущем методами генной медицины достаточно призрачны, т.к. из огромного количества мутаций в наследственных формах болезни Альцгеймера меньше одного процента достоверно могут вызывать заболевание (Welsh, Selkoe, 2004). В связи с этим огромный интерес представляют работы по изучению механизма возникновения этого заболевания с целью поиска новых лекарственных препаратов для лечения и профилактики болезни.

Болезнь Альцгеймера характеризуется образованием старческих (сенильных) бляшек, основным компонентом которых является р-амилоид (РА) -полипептид, состоящий из 39-43 аминокислот. Предположение о том, что нейротоксичность РА является основной причиной гибели клеток в центральной нервной системе (ЦНС) совершенно справедливо было подвержено серьезной критике в последние годы. Но независимо от того, является ли агрегация рА в мозгу триггером, запускающим механизм болезни Альцгеймера, или следствием этого заболевания, изучение этого пептида, обладающего высокой нейротоксичностью и присутствуещего в ЦНС в высокой концентрации является обязательным для понимания механизмов нейродегенерации как при болезни Альцгеймера, так и для ряда других заболеваний.

РА в нормальном состоянии растворим и не токсичен; агрегация его с ионами тяжелых металлов значительно меняет свойства полипептида и делает его нейротоксичным (Faller et al., 2014).

Одним из факторов, вызывающих гибель клетки, является свободнорадикальное окисление биологических молекул. Определенные формы агрегированного ßA могут либо самостоятельно производить активные формы кислорода (АФК), либо воздействовать на клеточные системы производства свободных радикалов (Varadarajan et al., 2000). Однако неясным остается вопрос, -какой из внутриклеточных источников производства АФК активируется; более того, неясно, какой тип клеток коры головного мозга и гиппокампа (нейроны, астроциты или клетки микроглии), производит свободные радикалы при действии амилоида.

Взаимосвязь и взаимодействие между клетками различного типа в ЦНС -тонкий и хорошо сбалансированный процесс, осуществляемый при помощи различных медиаторов и посредников. Нарушение этого гомеостаза может приводить к функциональным нарушениям и даже гибели клеток. Так, воспалительные процессы приводят к пролиферации микроглии, стимулируя продукцию свободных радикалов, секрецию различных факторов, что зачастую губительно для нейронов (McDonald et al., 1997; Biber et al., 2014).

Большинство нейротоксинов оказывают свое патологическое действие через дисбаланс кальциевой сигнализации (Ходоров, 2000; Gleichmann, Mattson, 2011). Поддержание гомеостаза кальция при стимуляции клеток биологически активными веществами - сбалансированный процесс, в котором принимают участие многочисленные Са2+-транспортирующие системы, расположенные в различных органеллах клетки. Кроме того, известно, что биологический эффект в ответ на внешний стимул определяется типом клеток и их функциональным состоянием, и в ряде случаев может иметь противоположный характер.

Митохондрии находятся на стыке практически всех жизненно важных функций клетки; они включают в себя метаболические процессы, участвуют в кальциевой сигнализации, продукции АФК и запуске механизма клеточной смерти (Duchen, 2004; Burchell et al., 2011). Любое изменение функций митохондрий практически мгновенно сказывается на жизнедеятельности клеток. Поэтому ни одно детальное изучение физиологического или патологического механизма не может быть проведено без исследования митохондрий.

Цель и задачи работы. В связи с вышесказаннным, целью настоящей работы явилось изучение на различных клеточных моделях (первичных монокультурах кортикальных и гиппокампальных астроцитов и микроглии, первичной со-культуры гиппокампальных и кортикальных нейронов и глии, гиппокампальных эксплантальных срезах) механизма гибели нейронов при действии ßA и участие в этом процессе внутриклеточного кальция, митохондрий, активных форм кислорода и антиоксидантной системы клеток. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

. с помощью флуоресцентных кальциевых зондов - Fura-2AM и Fluo-4 AM -методом анализа изображения изучить действие различных форм ß-амилоида на состояние цитозольного Са2+ в клетке . методом ингибиторного анализа выявить структуры, ответственные за

перераспределение кальция в клетке при ее стимуляции ßA . изучить действие ßA на содержание внутриклеточного антиоксиданта

глутатиона восстановленного; . исследовать действие ßA на митохондриальный трансмембранный потенциал, используя катионный флуоресцентный зонд родамин 123 (Rhl23); . при помощи различных зондов (DCF и DHE) проверить влияние ßA на

производство АФК в нейронах, астроцитах и клетках микроглии. . При помощи ингибиторного анализа и использования клеток, полученных из мозга трансгенных животных, определить источник производства свободных радикалов и механизм его стимуляции; . Используя ингибиторы изученных нами процессов при действии ßA, используя зонды на живые и мертвые клетки - Hoechst33342 и иодид пропидиума, определить их вклад в нейротоксичность ßA;

Научная новизна. Впервые, используя метод анализа флуоресцентного изображения, показано избирательное действие ßA на кальциевый гомеостаз астроцитов, но не нейронов в первичных со-культурах нейронов и глии, полученных из гиппокампа и коры головного мозга крыс и мышей, эксплантальных срезах

гиппокампа. Проведен детальный анализ рА-индуцированного кальциевого сигнала в астроцитах. Обнаружено, что изменение внутриклеточной концентрации ионов кальция не обусловленно какой либо специальной рецепцией из внутриклеточных кальциевых депо, а связано с встраиванием полипептида в плазматическую мембрану астроцитов и клеток микроглии.

При помощи флуоресцентного зонда РПНрш впервые показана разница в уровне холестерина в плазмаллеме гиппокампальных и кортикальных нейронов и астроцитов. Изменение концентрации холестерина в мембране нейронов и астроцитов при помощи ингибиторов и статинов показало, что для встраивания рА в биологические мембраны необходим холестерин.

В настоящей работе обнаружена способность рА вызывать различные формы митохондриальной деполяризации гиппокампальных и кортикальных астроцитов. Впервые на уровне целостной клетки показано быстрое и полное, циклоспорин А-зависимое изменение митохондриального потенциала при действии РА.

При помощи специфических зондов для измерения активных форм кислорода дикарбофлуоресциина и дигидроэтидиума показано РА - индуцированное производство свободных радикалов в НАДФН оксидазе.

Впервые обнаружена способность АФК произведенных в НАДФН оксидазе астроцитов вызывать изменения в митохондриальном трансмембранном потенциале посредством активации фермента ПАРП и потребления НАД, а также за счет индукции открытия митохондриальной поры.

Обнаружено и, при помощи Вестерн блот анализа и метода иммунофлуоресценции, достоверно подтверждено наличие фермента НАДФН оксидазы в гиппокампальных и кортикальных астроцитах. Произведен анализ механизма стимуляции и регуляции этого фермента в астроцитах, клетках микроглии и клетках линии ВУ2 различными активаторами, включая рА. Впервые показано участие фермента НАДФН оксидазы астроцитов в рА-индуцированной гибели нейронов.

Впервые обнаружено межклеточное взаимодействие, когда 0-амилоид индуцированный кальциевый сигнал и изменения в митохондриальном мембранном

потенциале в одном типе клеток (астроциты) может приводить к гибели другого (нейроны).

Научно-ппактическая значимость. В настоящее время активно ведется поиск как фармакологических, так и иных способов лечения и предупреждения болезни Альцгеймера. Данные, полученные в данной работе, по влиянию рА на кальциевый сигнал, митохондриальный мембранный потенциал, уровень основного антиоксиданта центральной нервной системмы глутатиона, а также данные о влиянии полипептида на продукцию АФК в астроцитах и микроглии смогут позволить существенно расширить имеющиеся представления о возможных путях остановки гибели нейронов и дегенеративных процессов в головном мозге при болезни Альцгеймера.

Обнаружение НАДФН оксидазы и анализ механизма ее активации в различных клетках также может позволить предотвращать патологическое воздействие АФК в ЦНС, не подавляя при этом иммунитет.

Кроме того, обнаруженная в данной работе способность рА индуцировать открытие митохондриальной РТР и активацию НАДФН оксидазы может быть использовано в дальнейших их исследованиях.

Связь темы исследования с планом научных работ. Работа была финансирована грантом Королевского Научного общества Великобритании, Международным грантом организации The Wellcome Trust (Великобритания) и трехлетним проектным грантом этой же организации, а так же однолетним грантом CRDC.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных съездах общества биофизиков (2003 - Сан-Антонио, США; 2004-Балтимор, США; 2005 - Лонгбич, США; 2010 - Сан Франциско, США; 2013 -Филадельфия, США), конференциях Британского физиологического общества (2002, 2006, 2012 года -Лондон, Эдинбург, Великобритания), Европейском конгрессе физиологов (2003, Ницца, Франция), 2 Международном конгрессе нейрорегенерации (2004, Рио-де-Жанейро, Бразилия), Гордоновской исследовательской конференции «Свободные радикалы» (2005, Вентура, США), Международной научной конференции «Рецепция и внутриклоточная

сигнализация» (2005, Пущино, Россия), Съезде Европейского общества нейрохимиков (2005, Инсбрук, Австрия), Глиальном конгрессе (2013, Берлин, Германия), на конференции Британского биохимического общества «Роль астроцитов в нейродегенерации» (Лондон, 2014). По материалам диссертации были проведены научные семинары в отделении физиологии Университетского колледжа Лондона (2005, Великобритания), отделении физиологии Кембриджского университета (2005, Великобритания), отделении физиологии и биофизики Калгарийского университета (2006, Канада), мигохондриальном центре университета Ньюкастла (2007, Великобритания), в институте ИНСЕРМ (2008, Ницца, Франция), в университете Далхауси (2011, Галифакс, Канада), в Имперском колледже Лондона (2007,2013, Лондон, Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИIIX ОБСУЖДЕНИЕ

Ионы кальция, благодаря своей универсальной роли во внутриклеточных процессах, всегда вызывают интерес при исследовании какого-либо физиологического или патологического явления. Не является исключением и иследование механизма нейротоксичности Р-амилоида. Анализ литературы показал, что теме влияния рА на кальциевый гомеостаз клеток посвящено достаточно большое количество публикаций. Для данного пептида продемонстрирована способность активировать различные, в том числе и Са2+ -каналы (Blanchard et al., 1997; Ueda et al., 1997; Rovira et al., 2002), показано изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах при длительном воздействии (Mattson, Chan, 2001). При этом большое количество публикаций представляло совершенно противоположную информацию - как, например, о понижении [Ca2t]c в астроцитах; другие авторы, напротив, писали о ее тотальном увеличении (Stix, Reiser, 1998; Meske et al., 1998). Более того, ни в одном из исследований на момент начала нашей работы не было показано достоверное увеличение уровня цитозольного кальция и детального анализа этого процесса. Учитывая все это, наша первая серия экспериментов была посвящена изучению влияния нейротоксичных форм р-амилоида - рА 1-42 и его короткого участка РА 25-35 на кальциевый гомеостаз гиппокампальных и кортикальных нейронов и находящихся с ними в совместной культуре астроцитов.

Влияние рА на 1Са2*]с гиппокампалъных и кортикальных нейронов и астроцитов.

Добавка 100нМ-10 мкМ р-амилоида (РА) 1-42 (полный пептид), или фрагмента с 25-35 аминокислотной последовательностью (1-50 мкМ) не меняла базального уровня кальция [Са2+]с в гиппокампальных нейронах во время всего (до б часов) периода наблюдения (п=456 клеток). Согласно данным, представленным на рисунке 1 А, нейроны не только не меняют [Са2+]с при действии РА, но и после 30-40 минут сохраняют способность к полновесному ответу на 100 мкМ глутамата, что может служить как идентификацией нейронов, так и подтверждением их жизнеспособности при действии данных пептидов. Более того, присутствие рА 142 или 25-35 не меняло амплитуду кальциевого ответа на глутамат или деполяризацию плазмаллеммы, вызванную 50 мМ КС1, для последнего значения составляли 726+89 нМ (п=59) в контроле и 759±97 нМ (п=96 нейронов) у РА-преинкубированных гиппокампальных нейронов.

В тех же экспериментах, в той-же культуре клеток, как полный пептид 1-42, так и короткий отрезок РА 25-35 вызывали рост [Са2+]с в астроцитах (рисунок 1Аа, Б и В), находящихся в со-культуре с нейронами. Используемый как контроль обратный пептид 35-25 не вызывал подобного эффекта ни в одном из типов клеток (п=135). рА-индуцированный кальциевый сигнал в кортикальных и гиппокампальных астроцитах начинался после приблизительно 5-15 минутной задержки и имел различие, как по величине, так и по частоте сигнала. В целом, РА-индуцированные изменения в [Са2+]с можно, разделить на три категории: 1) низкоамплитудные (100-200 нМ) кальциевые колебания; 2) одиночные кальциевые пики (1-2 мкМ); 3) высокий подъем [Са2+]с, переходящий в плато, обычно приводящее к гибели клетки. Следует отметить, что все три типа сигнала сохранялись после отмывки РА в течении последующих 6 часов наблюдения.

Кортикальные нейроны, так же как и гиппокампальные, черезвычайно чувствительны к токсическому действию р-амилоида. В связи с этим, мы повторили данные эксперименты, используя чистую первичную культуру кортикальных астроцитов. рА 1-42 (п=231) и 2535 (п=126) обладали аналогичной

Гиппокампальные нейроны

ЮОмкМ глутамата 50 мкМ РД 25-35_

Гиппокампальные астроциты ■ _50цМ рА 25-35_

О 10 20 30 40 50 Время(мин)

0 10 20 30 40 Время(мин)

Рисунок 2. Р-Амилоид увеличивает 1Са2+]с в гиппокампальных астроцитах но не в нейронах.

А-показано изменение [Са2+]с в нейронах (а) и астроцитах (б) при действии 50 мкМ (ЗА 25-35. Нейроны были идентифицировании добавлением ЮОмкМ глутамата в конце эксперимента. Типичные ответы на (ЗА, взятые из А(а) показаны в Б. На флуоресцентных снимках (В) показан ответ гиппокампальной со-кулиуры, загруженной Р1ио-4 на рА. Нейроны помеченны буквами н на первом изображении.

активностью на [Са2+]с астроцитах, и опять не изменяли внутриклеточную концентрацию кальция в нейронах. Одними из наиболее близких к физиологическим условиям можно считать экперименты, выполнение на эксплантальном срезе гиппокампа. (ЗА в данном эксперименте также не обладал

способностью повышать [Са2+]с в нейронах во всем диапазоне используемых концентраций (1-50 мкМ для РА25-35 и 100 нМ-10 мкМ рА 1-42). Ответ астроцитов на РА в данном экперименте был полностью сопоставим с эффектом этого пептида на культуральные кортикальные или гиппокампальные астроциты. Таким образом, рА 1-42 или 25-35 вызывает изменения [Са2+]с в кортикальных и гиппокампальных астроцитах, но не в нейронах в тех же культурах. Для выявления причин, приводящих к возникновению кальциевого сигнала такого типа и его селективность к определенному типу клеток, мы, в нашей следующей серии экспериментов изучали источник поступления ионов Са2+ в цитозоль астроцитов. /ЗА-индуцированный сигнал в астроцитах и его зависимость от внутри- и внеклеточных Са2+-дено

Самым простым способом изучить влияние внешнего Са2+ на различного рода изменения [Са2+]с является опыт в безкальциевой среде. В наших экспериментах, представленных на рисунке 2 А, мы не наблюдали какого-либо возрастания [Са2+]с кортикальных или гиппокампальных астроцитов (п=231 клеток) в среде, не содержащей кальций (но содержащей 0,5 мМ ЭГТА). Более того, если после 10-20 минутной инкубации клеток в безкальциевой среде с 50 мкМ РА 25-35 (рисунок 2 В) промыть клетки стандартным кальций-содержащим буфером, то наблюдается высокий рост [Са2+]с в астроцитах (п=69 клеток). Интересно отметить, что в находящихся в той же ячейке нейронах эффекта не наблюдалось (п=64). Как и в предыдущих экспериментах, дополнительной идентификацией нейронов служит высокоамплитудный кальциевий ответ на добавку 100 мкМ глутамата. Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что первичной причиной возрастания [Са2+]с в астроцитах служит вход внеклеточного Са2+. Следует также отметить тот факт, что кальциевый сигнал в астроцитах наблюдался уже после отмывки рА 25-35, что предполагает, что для активации рА нет необходимости в ионах Са2+ как также и то, что он интегрирует в плазмалемму и (или) внутрь клетки. Однако столь высокое изменение [Са2+]с не могло не спровоцировать вторичного, в данном случае, выхода Са2+ из внутриклеточных компартментов. Подтверждением данного предположения служат представленные на рисунке 2 В данные экспериментов, в которых астроциты (п=164) с РА- индуцированным

сигналом были промыты безкальцневым буффером. После типичного для астроцитов резкого повышения [Са2+]с в ответ на отсутствие внешнего кальция (обусловленного присутствием кальциевого рецептора), в клетках продолжаются

Са -колебания

угасающие

0Са3*(500 мкМ ЭГТА)

50 мкМ РА 25-35

Время(мин)

В

50 мкМ РА 25-3^

0 10 20 30 40 50 Время (мин)

(500 мкМ ЭГТА) 1,2 мМ Са2*

50 мкМ рА 25-35 ^

нейроны

0 10 20 30 40

Время (мин)

Рисунок 2. Зависимость рА-индуцированных изменений [Са2*]с астроцитов от внеклеточной концентрации Са2+. А - отсутствие кальциевого сигнала в кортикальных астроцитах в ответ на РА в безкальциевой среде. Б- отсутствие РА-стимулированных изменений в [Са2+]с гиппокампальных нейронов и астроцитов в среде без Са2+ и возникновение кальциевого сигнала в ответ на добавление Са2+, в астроцитах, но не в нейронах. В-постепенное уменьшение [Са2+]с РА -стимулированных кортикальных астроцитов после отмывки Са2+ из ячейки.

течении 5-10 минут. Таким образом, рА-индуцированный вход внешнего кальция может стимулировать выход Са2+ из ЭР.

Вход внешнего Са2+ в астроциты может служить триггером для выхода ионов кальция из внутриклеточных кальциевых депо через активацию

фосфолипазы С с последующей мобилизацией инозитолтрифосфата (IP3). Более того, для колебательного типа кальциевого сигнала, возникающего в астроцитах в ответ на разного рода стимуляторы (Peuchen et al., 1996; Holmstrom et al., 2013), включая механическое воздействие (Charles et al., 1991) показан именно такой механизм. Однако, согласно нашим данным, ингибитор фосфолипазы С - 5 мкМ U73122 не изменял pA-индуцированного кальциевого сигнала в астроцитах (п=89 клеток). Ингибитор IP3-зависимого Са2+ выхода - 40 мкМ 2-АРВ также не менял эффект РА на [Са2+]с астроцитов. Таким образом, неожиданно для нас, IP3 не влияет на формирование кальциевого сигнала в кортикальных и гиппокампальных астроцитах в ответ на нейротоксин.

Для того, чтобы полностью исключить возможную роль ЭР в генерации pA-индуцированного провышения [Са2+]с в астроцитах, мы использовали специфический ингибитор Са2+-АТФазы ЭР 1 мкМ талсигаргин. Инкубация клеток с данным ингибитором приводила к полному опустошению кальциевого депо в ЭР, о чем свидельствует отсутствие ответа на 100 мкМ АТФ. Добавление к этим клеткам РА, после характерной задержки, вызывало изменения в [Са2+]с астроцитов, которые практически не отличались от контрольных. Средние значения роста [Са2+]с в клетках с преинкубацией с тапсигаргином составляли 390±54 нМ, тогда как в контрольных астроцитах 456±57 нМ (п=301, р>0,05). Таким образом, мы достаточно достоверно можем утверждать, что Са2+-депо ЭР не играет значительной роли в РА индуцированном кальциевом сигнале.

Таким образом, кальциевый сигнал в астроцитах при действии РА обусловлен поступлением его из внеклеточного пространства по либо специфическим для астроцитам каналам, либо по каналам, сформированным данным пептидом на плазматической мембране клеток.

Пути рЛ-чндуцироеанного входа внешнего С а2* Согласно ряду авторов (Ueda et al., 1997; Не et al., 2001), pA может индуцировать кальциевый сигнал в нейронах, стимулируя открытие потенциал чувствительных кальциевых каналов. Несмотря на то, что на астроцитах этот механизм маловероятен, ввиду отсутствия кальциевоего эффекта на деполяризацию плазмалеммы 150 мМ KCI (что предполагает отсутствие экспресии этих каналов в

данном типе клеток). Мы, тем не менее, провели эксперименты с использованием ингибитора потенциал-чувствительных каналов 1мкМ нифидипина. Инкубация со-культуры нейронов и астроцитов с нифидипином не меняла ни форму, ни амплитуду pA-стимурлированного (1-42 или 25-35) кальциевого сигнала в астроцитах коры или гиппокампальных астроцитах (п=56 клеток), но при этом нейрональный ответ на 150 мМ КС1 был полностью блокирован.

pA-индуцированные изменения [Са2+]с астроцитов оставались практически неизменными при действии как ингибиторов ионотропных, так и метаботропных глутаматных рецепторов. Отсутствие влияния ряда соединений -20 мкМ CNQX (п=98), 10 мкМ МК-801 (п=69) или 50 мкМ (S)-MCPG (п=178) на РА-индуцированный кальциевый сигнал в астроцитах свидетельсвуют о том, что данный сигнал не зависит от выхода глутамата.

Селективность рА к индуцированию кальциевого сигнала в

г' 2+

астроцитах, а не в нейронах, предположило влияние данного пептида на La транспортеры, которые присутствуют в одном типе клеток и отсутствуют в другом. Им может быть емкостной Са2+ вход (Pizzo et al., 2001), механизм которого отсутствует в нейронах. Однако блокада данного Са2+-переносчика ионами La3+ (1 мкМ) не влияла на величину и форму РА 1-42 или 25-35 кальциевого ответа (п=67 клеток).

Используя ингибиторный анализ, мы исследовали действие рА на основные переносчики в нейронах и астроцитах и, не обнаружив видимого влияния на них, мы вынуждены были проверить показанную ранее способность РА формировать каналы в искусственных и биологических мембранах (Arispe et al., 1993; Kawahara et al., 1997; Lin et ai., 2001). Для этого типа каналов была покано два типа блокаторов - Конго Красный и ионы Zn2+(Arispe et al., 1996; Kagan et al., 2002). Ввиду невозможности применения Конго Красного в экспериментах флуоресцентной микроскопии, мы исспользовали ZnCl2, хоть и отдавали себе отчет в том, что использование данного катиона может влиять на достаточно большое количество процессов, как в нейронах, так и в астроцитах. Мы обнаружили, что инкубация гиппокампальных или кортикальных астроцитов (п=253) в среде с милимолярной концентрацией Zn2+ полностью предотвращало

действие РА на [Са2+]с астроцитов. Однако следует отметить, что данный эффект не наблюдался при концентрации ионов цинка ниже 1 мМ и даже высокие концентрации '¿п2* не останавливали действия рА в случаях, когда данный ион был добавлен после того, как начались рА-индуцированные изменения [Са2+]с (п=121). Это предполагает то, что ионы Хп2+ не блокируют каналы, а скорее препятствуют их образованию.

Клиохинол (сНоцшпоГ), хелатор ионов тяжелых металлов, и в частности Си2+, ¿п2+ и Ре3+, препятствует агрегации рА и даже способен заново растворять агрегированную форму. Для него получены данные о его положительном действии на мышей- моделей болезни Альцгеймера и к настоящему времени получены данные о позитивном воздействии на пациентов (СЬегпу й а1., 2001; Ме1оу, 2002). В наших экспериментах, инкубация клеток с данным соединением в концентрации 500нМ-2мкМ полностью предотвращала действие РА на [Са2+]с в кортикальных и гиппокампальных астроцитах (п=207 клеток). Суммируя вышесказанное, РА обладает способностью индуцировать кальциевый сигнал в гиппокампальных и кортикальных астроцитах, но не нейронах, за счет встраивания агрегированного пептида в плазматическую мембрану. Образованная пора (или канал) способна к закрытию и открытию, о чем говорят Са2+- колебания и эксперименты марганцевого тушения флуоресценции Л]га-2. Учитывая это, возник вопрос о ионной селективности этого канала на плазмалемме астроцитов.

Зависимость рА-индуцированного кальциевого сигнала в астроцитах от агрегации и длины пептидной цепочки.

Под агрегацией амилоида обычно подразумевается образование р-фибрил, которым и приписываются токсические свойства. Наши эксперименты подтверждают это, однако, для более мелких олигомеров показана не меньшая, а зачастую и большая активность и нейротоксичность. Для более точной проверки зависимости активности пептида от его конформации, нами, в сотрудничестве с Кембриджским университетом (лаборатории проф. Добсона и Кленермана, которые любезно предоставили мономерные и олигомерные пептиды), была проведена серия

экспериментов по сравнительной характеристике олигомерных и мономерных пептидов РА 1-40 и РА1-42.

500 нМ рА 1-42 мономер

А

и. 08

Время (мин) 500 нМ рА1-42 олигомер

2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75

Время (мин)

25 0

500нМ

50нМ

ИЯ1 35нМ

ШШ 15нМ

НЕ! ЮнМ

ми 5нМ

500 нМ рА 1-40 мономер

Время (мин) 500 нМ рА1-40 олигомер

Время (мин)

Рисунок 3. Способность мономерных и олигомерных рА1-40 и РА 1-42 изменять [Са2+]с астроцитов. 500 нМ мономерного рА 1-42 (А) и (ЗА 1-40 (Б) не меняют [Са2+]с в кортикальных астроцитах. Та же концентрация олигомерного РА 1-42 (В) и РА 1-40 (Г) индуцировала кальциевый сигнал в астроцитах. Д- Процент астроцитов с изменениями [Са2+]с в ответ на различные концентрации РА. Для каждого значения представлены средние значения 4-5 экспериментов. ** р<0,001; *р<0,05

Мономерные пептиды рА 1-40 и рА 1-42 во всем спектре используемых концентраций (5нМ -ЮмкМ) не вызывали каких либо значимых изменений [Са2+]с кортикальных и астроцитов (рис. ЗА, Б, Д). Добавление олигомерных пептидов РА1-40 и РА 1-42, напротив, вызвало массивный рост [Са2+]с в астроцитах, но вновь, не в

нейронах (рис. 3 В, Г). Очень важно, что рА индуцированный кальциевый сигнал в астроцитах, (но не в нейронах) наблюдался в очень низких концентрациях (рис. ЗД) - 195 пМ олигомеров рА. Величина [Са2+]с изменений в ответ на олигомерные пептиды не зависила от их концентрации (так, 195 пМ олигомера рА 1-42 индуцировал 0,62±0,07 Гига-2 отношения флуоресценции 340/380 нм в сравнении с величинами, вызванными 500 нМ того-же олигомера - 0.67±0.06). При этом уменьшение концентрации олигомеров значительно уменьшало процент астроцитов с рА-индуцированным кальциевым сигналом (рис. 3 Д). Следует отметить, что эффекты низких концентраций олигомеров (195пМ - 19, 5нМ; п=7 экспериментов), также как и высоких концентраций, блокировались в безкальциевой среде. Таким образом, олигомерные пептиды РА 1-42 и РА 1-40 могут вызывать кальциевый сигнал всего лишь одним из 500 олигомеров, что может быть достаточно для фомирования ионного канала или поры (Ыагауап е1 а1., 2014). Зависимость рА-индуцированиого С а2*-сигнала от концентрации холестерина в нлазмалелше нейронов и астроцитов

Несомненно, большой вопрос вызывает отсутствие кальциевого сигнала в гиппокампальных и кортикальных нейронах в ответ на РА. Из представленных выше экспериментов следует, что способность РА повышать [Са2+]с в астроцитах не обусловлена специфическим действием на какие-либо каналы или рецепторы, а образованием данным пептидом собственных каналов путем встраивания в мембрану. Однако в связи с этим возникает вопрос- чем вызвана данная специфичность? Одним из вероятных ответов может служить образование комплекса РА со специфическим мембранным белком астроцитов. Но это выглядит маловероятным, учитывая его высокую способность формировать каналы на искуственных мембранах (Агаре е! а1., 1993; Ко«ап е[ а1., 2002).

Изменить концентрацию холестерина в мембранах клеток можно при помощи циклодекстрина (уменьшение - см. К'еиГеМ е1 а1., 1996) или увеличить добавлением водорастворимого холестерина в среду (Апэре, ОоЬ, 2002). Кратковременная инкубация (1-6 часов) гиппокампальных нейронов и астроцитов с МЦД приводила к блокаде РА- стимулированных изменений [Са2+]с в нейронах и в астроцитах.

Для того, чтобы измерить концентрации холестерина в мембранах гиппокампальных астроцитов и нейронов при действии различных концентраций и различного времени инкубации с МЦД, мы использовали соединение филлипин (fillipin), который, связываясь с холистерином, флуоресциирует при возбуждении ультрафиолетом (Norman et al„ 1972; Drabikowski et al., 1973). Из данных, представленных на рисунке 4А и Д, очевидно, что содержание холестерина в мембранах астроцитов превосходит его концентрацию в нейронах (в 1,96 раз, р<0,05). Согласно рисунку 4 Б, 1 мМ МЦД действительно понижает интенсивность флуоресценции филлипина в гиппокампальных нейронах и астроцитах, но лишь в первые часы инкубации (1-6 часов, уровень холестерина в мембраннах астроцитов и нейронов понижался в 1,99±0,14 и 2,1±0,19 раза соответственно, р<0,01 для обоих типов клеток, п=5 экспериментов). Дальнейшая (12-24 часов) инкубация приводила к повышению уровня холестерина в клетках (интенсивность флуоресценции филлипина возрастала в 1,63±0,15 (р<0,05) раза у нейронов и в 1,47±0,11 раза у астроцитов). Таким образом, сопоставляя эти данные с показанными нами выше данными по кальциевой сигнализации, понижение концетрации холестерина 1-6 часовой инкубацией клеток с 1мМ МЦД предотвращало ßA-индуцированный кальциевый сигнал в гиппокампальных астроцитах и нейронах, повышение содержания холестерина (12-24 часовая инкубация с МЦД) приводило к возникновению изменений [Са2+]с нейронов при действии ßA. Полученные нами данные, подтверждают зависимость способности ßA изменять проводимость плазматической мембраны, однако эффект прямо противоположен тому, что был показан Ариспе и Дох на клеточных линиях. В связи с этим, мы провели дополнительные эксперименты по изучению влияния уровня холестерина в мембранах на ßA-индуцированный кальциевый сигнал в первичных астроцитах и нейронах мозга крыс. Предварительная инкубация первичной гиппокампальной со-культуры нейронов и астроцитов с водорастворимым холестерином (0,5 мМ, 6 часов) значительно повышала его содержание в мембранах клеток (флуоресценция зонда филлипин (fillipin) при этом возрастала в 2,3±0,31 раза; р<0,001, Рисунок 4 Б). Это приводило к тому, что

гиппокампальные нейроны начинали демонстрировать Са +-сигнал в ответ на 50 мкМ рА 25-35 (п=89, рисунок 4 В), при этом следует отметить, что ответ на

А к

10 2 30 40 Вр^мя (мин)

Рисунок 4. Уровень холестерина в мембранах гиппокампальных нейронов и астроцитов и его влияние на (ЗА-индуцированный Са2+-сигнал..В А показана разница в интенсивности флуоресценции зонда РПНрт в астроцитах и нейронах. В Б представлена зависимость концентрации холестерина (флуоресценция ИШрш) в гиппокампальных нейронах и астроцитах от времени инкубации клеток с 1 мМ МЦД. В и Г - Изменения [Са2+]с гиппокампальных нейронах, обработанных 0,5 мМ водорастворимого холестерина (В) или гиппокампальной со-культуры инкубированной с ИПИрт в ответ на 5 мкМ амилоида 1-42

амилоид

в холестерин-обработанных астроцитах был полновесным и амплитуда и частота кальциевого сигнала в этих клетках была сопоставима с контрольными.

Уменьшить уровень холестерина в мембранах можно обработав их веществом, которое мы использовали для регистрации его уровня - филлипином

(йШрт). Преинкубадия первичной кортикальной культуры клеток в течении 20 мин с 20 мкг/мл филлипина предотвращала ответ на РА в течении 25 мин, после чего как астроциты (п=86), так и нейроны (п=56 клеток) начинали стремительно повышать уровень флуоресценции Р1ио-4 с дальнейшим разрушением клеток и потери красителя. Тот же эксперимент, повторенный с меньшей концентрацией филлипина - 2,5 мкг/мл показал, что понижение уровня холестерина может предотвратить рА-индуцированный кальциевый сигнал (рисунок 20Г) как в гиппокампальных нейронах (п=71), так и в астроцитах (п=91).

Таким образом, отсутствие рА-индуцированного кальциевого сигнала в нейронах может быть объяснено особенностями композиции их плазматических мембран, и в особенности низким содержанием холестерина в мембранах этих клеток. Но в виду того, что в физиологических концентрациях холестерина нейроны не демонстрируют изменения [Са2+]с в ответ на РА, мы продолжили изучение механизма, в котором стимулированный амилоидом кальциевый сигнал в астроцитах может приводить к гибели нейронов. Влияние /?-амилоида на Лц/т

В большинстве на сегодняшний день принятых моделях механизма клеточной смерти важное место отводится митохондриям. Измерение митохондриального трансмембранного потенциала (Дут) позволяет зарегистрировать практически любое изменение в функции данной органеллы, -среди которых изменение активности дыхательной цепи, активность транспортных белков, целоостность внутренней мембраны. В описанных ниже экспериментах мы использовали флуоресцентный зонд Шюс1атт123 для регистрации изменений Дч/т при действии РА.

Согласно данным представленным на рисунке 5 А, добавление 1-5 мкМ РА 1-42 или его короткого участка 5-50 мкМ РА 25-35 к первичной культуре гиппокампальных нейронов после 3-10 минут инкубации приводило к деполяризации внутренней митохондриальной мембраны астроцитов (п=510), в тоже время нейроны (п=298). находящиеся в той же со-культуре не проявляли никаких изменений в А\ут. Добавленный для идентификации нейронов 300 мкМ глутамат приводил к типичной для нейронов митохондриальной деполяризации (Уе^ип е1 а1., 1999). Однако, неожиданно для нас, добавка глутамата привела к восстановлению Д\|/т астроцитов нарушенного рА, демонстрируя тем самым полностью противоположное действие двух типов клеток в одной первичной культуре. РА 1-42 или 25-35 индуцировал изменения в Дут у 95,2±1,3%

кортикальных астроцитов в моно-культуре или у астроцитов в со-культуре

',6+2,1% гиппокампальных с нейронами.

РА 1-42 РССР

10 15 20 25 30 35 40 Время (мин)

10 15 20 25 30 35 40 Время (мин)

Рисунок 5. рА вызывает изменения митохондриального потенциала в астродитах но не в нейронах. Потенциал измерен при помощи ИЫ23, повышению флуоресцинции соответствует понижение ДЧ'т. На рисунке А показано действие 50 мкМ РА 25-35 на гиппокампальные нейроны (черная линия) и астроциты (серая линия), флуоресценция нормализована от 0 (потенциал в покое) и 100% (1 мкМ РССР). В Б.В.Г показан эффект 5 мкМ рА 1-42 на кортикальные астроциты, одновременное изменрение митохондриального потенциала и внутриклеточной концентрации Са2~ одиночных клеток продемонстрирован в Г.

Изменения в Д\|/т астроцитов по форме и по величине сигнала можно разделить на 3 типа: ¡.медленное увеличение флуоресценции ЯЫ23 переходящее в плато; 2. резкая пикообразная митохондриальная деполяризация с последующим восстановлением базального уровня; 3.резкая пикообразная необратимая митохондриальная деполяризация сопровождающаяся полным выходом ЛЬ 123 из

митохондрий. Основные типы действия (ЗА на митохондриальный потенциал кортикальных или гиппокампальных нейронов представленны на рисунке 5 Б, В, Г.

Как продемонстрированно нами выше, рА-индуцированный кальциевый сигнал в астроцитах обусловлен его поступлением из внеклеточного пространства. Используя это свойство, были проведены эксперименты по одновременному измерению [Са2+]с и Ач'т в безкапьциевой среде. В данных условиях 5мкМ рА1-42 не менял [Са2+]с гиппокампальных и кортикальных астроцитов, но вызывал медленное увеличение 11Ы23-флуоресценции (п=231). Промывка клеток стандартным раствором вызывала резкий всплеск концентрации кальция, что в свою очередь стимулировало быструю потерю митохондриального потенциала астроцитов. Таким образом, медленная митохондриапьная деполяризация не зависит от [Са2+]с, в тоже время быстрая пикообразная митохондриальная деполяризация зависит от индуцированного рА кальциевого сигнала.

Способность дыхательных субстратов предотвращать действие Д4 на

митохондрии

Согласно данным, представленным на рисунке 5А, добавление глутамата приводила к восстановлению медленной митохондриапьной деполяризации в астроцитах (от 64,1±13,7% до 4,9±3,2% флуоресценции Щ1123, п=108). Эта активность глутамата не зависела от присутствия 50 мкМ (8)-МСОР (п=178) или 15 мкМ МК-801 (п=97), ингибиторов метаботропных и ионотропных глутаматных рецепторов соответственно. Это предполагает, что в данной ситуации глутамат действует не как нейротрансмитер, а как метаболический субстрат. Миллимолярная концентрация пирувата+мапата (5мМ каждого) также способствовала восстановлению митохондриального потенциала при действии 50 мкМ РА25-35 (с 64,1±13,7% до 6,1+2,8%, п=78). Основные субстраты для митохондриальных комплексов I и II - 1мМ глутамата, 10 мМ мет-сукцината добавленные в начале эксперимента увеличивают базальный потенциал на митохондриальной мембране и значительно уменьшали рА-индуцированную митохондриальную деполяризацию (средние значения ЯЫ23 сигнала уменьшались от 64,1+13,7% в контроле до 7,12±2,34 для глутамата и 18,6±4,17% для мет-сукцината) кортикальных или гиппокампальных астроцитов. Полученные данные позволяют предположить, что РА не приводит к повреждению элементов дыхательной цепи, так как митохондриальный потенциал может быть восстановлен субстратами комплексов 1 и 2. Таким образом, рА-индуцируемые изменения Дут обусловлены кальциевым сигналом (пикообразная деполяризация) и метаболическим эффектом (медленная деполяризация). Инкубация клеток с митохондриальными субстратами (в безкальциевой среде приводила к полному отсутствию РА на Д\|/т.

Роль циклоспорин-чувствительной поры в действии /ЗА на митохондрии.

Глубокая (в некоторых случаях полная) пикообразная (временами колебательная) деполяризация митохондриальной мембраны наблюдаемая в гиппокампальных и кортикальных асгроцитах при действии (ЗА не была показана ранее ни для одного другого соединения. Мы предположили, что столь быстрая потеря потенциала может быть вызвана либо открытием митохондриальной мега поры (циклоспорин А-чувствительной поры, шРТР) либо непосредственным образованием поры пептидом рА, как в случае плазматической мембраны данных клеток (Lin et al., 2001). 30 минутная инкубация астроцитов с 0,5 мкМ циклоспорина А, классическим ингибитором открытия митохондриальной поры, перед экспериментом с 50 мкМ РА 25-35 не приводила к полной блокаде действия пептида на Д*[/т, но это полностью ингибировала резкую пикообразную необратимую митохондриальную деполяризацию. Основной общепринятый на сегодня механизм открытия тРТР включает в себе кальциевую перегрузку в матриксе митохондрий и окслительный стресс. И наших экспериментах, в которых мы предварительно инкубировали кортикальные или гиппокампальные астроциты с комбинацией 0,5мкМ ЦсА и антиоксидантов 500мкМ TEMPO с 250 Е/мл каталазой (п=107) полностью подавляла действие рА на Д>[/т. Таким образом, действие рА на митохондрии астроцитов обусловлено окислительным стрессом и кальциевым сигналом. Это также подтверждает другой эксперимент, в безкальциевой среде с антиоксидантами TEMPO и катапаза. Эта комбинация полностью блокировала действие рА на митохондриальный потенциал гиппокампальных астроцитов (п=67). Более достоверно можно судить об вовлеченности какого либо участника внутриклеточного процесса в случае использования культуры клеток полученных из трансгенных животных. В наших экспериментах, у нас была возможность использовать первичную культуру гиппокампальных нейронов и астроцитов из контрольных мышей и трансгенных циклофилин Д нокаутированных мышей, которые были любезно предоставлены лабораторией профессора Д.Йелона (Институт Кардиологии Университетского колледжа Лондона). Ранее для этой линии была показана способность ингибировать процессы, которые приписываются mPTP (Baines et al., 2005). Согласно полученным данным, добавка 50 мкМ РА 25-35 к циклофилин Д -/-гиппокампальной сокультуре после 5-15 минутной задержки индуцировало полновесный кальциевый сигнал в астроцитах (п=165). Анализ изменений в Rhl23 флуоресценции в этом эксперименте показал, что в этих клетках отсутствует глубокая и полная пикообразная деполяризация, но все астроциты сохранили медленную митохондриальную деполяризацию. Таким образом, пикообразная деполяризация при действии рА является открытием циклоспорин А чувствительной митохондриальной поры, а не непосредственным встраиванием пептида в мембрану органеллы.

Эффект /ЗА на продукцию АКФ

Для того, чтобы напрямую исследовать влияние рА на образование свободных радикалов, нами был использован флуоресцентный зонд ОСИ. 50мкМ РА 25-35 или 2,5 мкМ рА 1-42 вызывали резкое увеличение скорости сигнала ОСР до 3,19±0,1 относительных единиц флуоресценции в минуту как в гиппокампальных, так и в кортикальных астроцитах (п=88, рис. 6А). Интересно

отметить

факт,

отличие от индуцированного рА

8„

12CL D

Ж 0Ca2t

Ж 1,5

F 5мкМ ßA 1 -42

¿Ш 105

Г5 мкМ РА 1-42

ш-1 100 мГ

ä3 8'

В

О 5

Г

10 15 20 25 30 35 40

Время (мин)

10 15 20 25

Время (мин)

д

с 120

ъ

рА 1-42JIA 1-42 рА 1-42 рА 1-42 + OCa2' + DPI апоцинин

0,5мкМ DPI

5мкМ ßA 1 -42

10 15 20 25 30

Время (мин) 5 мкМ ßA 1-42

0t ОСа2* - »AEBSF

4 6 8 10 12 Время (мин)

Рисунок 6 . ßA-инцуцированное увеличение продукции свободных радикалов зависит от [ Са2+]с и активности НАДФН оксидазы. А -Г - гиппокампальные астроциты загружены зондом DCF, Д- скорость производства АФК было измерена при помощи DHE. Ингибиторы НАДФН оксидазы 0,5 мкМ DPI (В,Г), 1 мМ апоцинин (Г) и 20 мкМ AEBSF (Д) были использованы с 20 мин преинкубацией

кальциевого сигнала или митохондриальной деполяризации, где эффект наблюдался после 3-10 минутной задержки, индукция скорости образования свободных радикалов наблюдалась практически следом за добавкой (ЗА. Скорость увеличения DCF флуоресценции индуцированной РА была значительно (р<0,001) ниже в клетках с безкальциевой средой (от 3,19±0,1 Ед/мин в контроле по сравнению 1,18+0,11 Ед/мин в среде без кальция, п=101, рис.6 А,Г)- Способность РА индуцировать продукцию свободных радикалов в астроцитах полностью подавлялась 0,5мкМ DPI (от 3,19+0,1 Ед/мин в контроле до 0,61+0,14 Ед/мин, п=114; р<0,001; рис.6 В), что указывает на то, что РА активирует НАДФН оксидазу. Эта активация, по видимому, происходит в два этапа - первый, кальций независимый, и второй, индуцируемый кальциевым сигналом. Как было показано ранее для клеток микроглии (Coraci et al., 2002), рА может активировать НАДФН оксидазу путем взаимодействия фибрилярного пептида с рецептором CD36. Однако в наших экспериментах (рисунки не приводятся), 30 минутная инкубация кортикальных (п=54) и гиппокампальных (п=40) астроцитов с антителами к CD36 -5 мкг/мл FA6-152 не меняла скорости рА- индуцированной продукции свободных радикалов, что предполагает какой-либо другой механизм активации данного фермента при действии РА.

Согласно данным, представленным на рисунке 6 Д, 5 мкМ РА1-42 значительно (р<0,05) увеличивают скорость роста флуоресценции HEt в гиппокампальных астроцитах (п=99). Так же как и в экспериментах с DCF, р-амилоид-стимулированная продукция свободных радикалов была зависима от наличия ионов Са3+ в среде (п=67) и ингибитора НАДФН оксидазы - 20мкМ AEBSF (п=64).

Объяснением РА-индуцированной митохондриальной деполяризации показанной в предыдущей главе, учитывая ингибирование этого процесса DPI и аппоцинином может быть производство АФК этим ферментом.

Таким образом, при помощи различных флуоресцентных зондов и трех различных ингибиторов НАДФН оксидазы (учитывая результаты по исспользованию 1мМ аппоцинина, данные по которому представлены на рисунке 6 Г) показана способность РА25-35 и полного пептида рА 1-42 увеличивать продукцию свободнорадикальных форм кислорода в кортикальных и гиппокампальных астроцитах.

Активация ПАРП при действии РА

Продукция АФК НАФН оксидазой стимулирует медленную деполяризацию. Для выяснения этого механизма, мы померили флуоресценцию НАДН - субстрата митохондриального комплекса I (Chance, 1977). Добавка 5 мкМ РА1-42 к первичной культуре нейронов и астроцитов, после 5 мин задержки,

вызывала значительное и прогресивное уменьшение НАДН флуоресценции астроцитов (32±2,1% за 20 мин; п=110). Протонофор 1мкМ FCCP максимально стимулирует митохондриальное дыхание и максимпьно уменьшал НАДН в митохондриях. В данном случае эффект FCCP был минимальный (7,1 ±0,63 % по сравнению с контрольными 44,5±4,1%, п=56) предполагая, что НАДН либо окислен, либо потреблен. Последовательное ингибирование дыхания цианистым натрием (1 мМ NaCN), который предотвращает окисление НАДН комплексом I, приводило к повышению автофлуоресценции до максимальных значений. Такая последовательная добавка FCCP и NaCN позволяет оценить митохондриальный уровень НАДН и отделить его от НАД(Ф)Н. Добавка 1мМ глутамата, который был способен защитить Дум от действия рА, увеличивала уровень НАДН на 12,1±0,7% и значительно уменьшала эффект 5 мкМ РА1-42 (только на 14,5±0,9%, п=99 сравнивая с 32±2,1%; р<0.05).

Ядерный фермент ПАРП (поли(АДФ-рибоза) полимераза), который востанавливает поврежденное свободнорадикльным окислением ДНК, потребляет НАД+ и может вызывать митохондриапьную деполяризацию за счет нехватки субстратов дыхания (Du et al., 2003; Abramov, Duchen, 2008). 20 минутная инкубация кортикальной культуры астроцитов с ингибитором ПАРП -20 мкМ DPQ или 1 мМ аминобензамина (п=59 астроцитов) значительно ингибировала понижение НАДН индуцированное 5 мкМ РА 1-42.

Показаные нами выше результаты предполагают, что прогресивная митохондриальная деполяризация вызвана недостатком субстратов, так как Д*|»м может быть защищен пируватом, метил-сукцинатом или ТМПД/аскорбатом. Инкубация кортикальных нейронов и астроцитов с ингибиторами ПАРП 20 мкМ DPQ (20 мин) или 1мМ 3-АВ (10 мин) не только сокращает рА-индуцируемое уменьшение НАДН, но так же защищала клетки от медленой митохондриальной деполяризации. Интересно, что ингибиторы ПАРП так же были эффективны в предотвращении падения Дум стимулированую активацией НАДФН оксидазы добавкой 1 мкг/мл РМА.

Столь высокая активность производства АФК не могла не повлиять на состояние внутриклеточной антиоксидантной системы. Учитывая, что основным антиоксидантом в клетках мозга является глутатион восстановленный, наша следующая серия экспериментов была посвящена выяснению влияния рА на уровень GSH гиппокампальных нейронов и астроцитов.

Действие /34 на [GSHJ в астроцитах и нейронах.

Внутриклеточную концентрацию глутатиона восстановленного ([GSH]), измеряли с помощью специфического флуоресцентного зонда МСВ (Keelan et al., 2001). Как полный пептид рА 1-42, так и участок 25-35, в наших

экспериментах после 24 часовой инкубации значительно уменьшали [GSH] кортикальных (на 54,7±4,9%, п=789 клеток, р<0.005) астроцитов в моно-культуре и гиппокампальных астроцитах в со-культуре (на 44,32±4,9%, п=831 клетка, р<0,005), что согласуется с ранее опубликованными данными полученным при использовании других методов регистрации GSH (Casley et al., 2002а; Muller et al., 1997; White et al., 1999).

В отличии от экспериментов по измерению [Ca 2+]с и Дут, в которых ßA не оказывал действия на нейроны, 24 часовая инкубация гиппокампальных нейронов с 1-5 мкМ ßAl-42 или 10-50мкМ ßA25-35 значительно (р<0,001) снижала внутриклеточную концентрацию глутатиона восстановленного в этих клетках (на 33,5+6,3%, п=345 клеток). Учитывая то, что астроциты поставляют нейронам как субстраты для синтеза, так и сам глутатион (Sagara et al„ 1993), в данном случае более закономерно предположить не прямое действие ßA на сшггез глутатиона в нейронах, а то что этот результат обусловлен понижением [GSH] в астрощгтах.

Согласно полученным данным, инкубация клеток с ßA 1-42 или ßA 25-35 в безкальциевой среде, которая приводила к полной блокаде ßA-индуцированного кальциевого сигнала, практически полностью подавляла способность ßA уменьшать [GSH] как в гиппокампальных или кортикальных астроцитах, так и в гиппокампальных нейронах. Таким образом, ßA индуцированный кальциевый сигнал в астроцитах приводит к значительному понижение уровня [GSH] не только в астроцитах, но и в нейронах, в которых кальциевый сигнал не наблюдался. Нами было высказано предположение о том, что ßA- индуцированный сигнал в астроцитах приводит к недостатку субстратов для синтеза GSH в нейронах. Для проверки данного предположения мы провели эксеримент, в котором клетки были проинкубированны в течении 6 часов с 1 мМ у-глутамил цистеином (у-ГЦ) после чего был добавлен ßA 1-42 (5мкМ) для последующих 24 часов инкубации. Эта процедура значительно предотвращала уменьшение GSH в нейронах (п=224 нейрона).

Следует отметить, что показанная нами выше способность ßA редуцировать внутриклеточный уровень глутатиона восстановленного, практически полностью блокировалась инкубацией клеток в среде с DPI (п=127 нейронов и п=198 астроцитов, р<0,05 для двух видов клеток). Сам DPI не имел никакого влияния на базальный уровень [GSH] в астроцитах и нейронах. Таким образом, показанное нами уменьшение [GSH] при действии ßA, по-видимому, не обусловленно прямым влиянием пептида на продукцию глутатиона, а судя по всему вызванно гиперпродукцией свободных радикалов при активации НАДФН оксидазы, а так же нарушением метаболизма глутатиона в связи с высоким цитозольным кальцием и митохондриальным дисбалансом. Именно нарушение в

обмене предшественниками глутатиона и им самим между астроцитами и нейронами может быть объяснена связь между рА-индуцированным кальциевым сигналом и митохондриальной деполяризацией в астроцитах и гибели нейронов.

Как мы показали в приведенных выше экспериментах, РА приводит к значительному понижению уровня глутатиона восстановленного, что уже является частичным показателем окислительного стресса происходящего в клетке. Другим доказательством этого может быть активация ПАРП, так как этот фермент служит для востановления окисленого ДНК ядра. Перекисное окисление липидов - один из признаков окислительного стресса, сам по себе запускающий механизм клеточной смерти. Для измерения действия рА на скорость перекисного окисления в астроцитах и нейронах мы использовали флуоресцентный индикатор ВСЮ1РУ11 (591/561). Добавка 5 мкМ рА1-42 приводит к значительному увеличению скорости продукции перикисного окисления липидов как в астроцитах (на 230±14%;), так и нейронах (на 185±11%; п=38нейронов). Для изучения источника этого окислительного стресса, мы обработали клетки ингибитором НАДФН оксидазы 0,5 мкМ ОР1 (20 мин). Это приводило к полной блокаде эффекта рА1-42 на скорость продукции перикисного окисления липидов в астроцитах (п=49) и нейронах (п=46). Таким образом, РА индуцирует перикисное окисление липидов в астроцитах и соседних с неми нейронах за счет активации НАДФН в астроцитах.

Токсичность )ЗА в свете его действия на кальциевый сигнал, митохондриальный потенциал п НАДФН оксидазу. Ввиду того, что РА в показанных нами выше экспериментах вызывал драматические изменения в кальциевом гомеостазе астроцитов, митохондриальной мембранном потенциале, продукции активных форм кислорода и антиоксидантной защите клеток, естественно возникал вопрос, сколь велик вклад обнаруженных нами процессов в механизм гибели клеток мозга индуцируемой данным пептидом.

Для исследования токсичности рА на нейроны и астроциты мы исспользовали зонды иодид пропидия (Р1) и НоесЬз133342 позволяющие видеть и подсчитать как живые, так и мертвые клетки. Инкубация первичной гиппокампальной со-культуры астроцитов и нейронов в течениии 24 часов с 50 мкМ рА 25-35 вызывала клеточную смерть у 49,8±8,5% нейронов (п=13 экспериментов) и в меньшей степени в астроцитах (23,2±4,2%, рис.7). Предварительная инкубация клеток и наличие в среде 1 мкМ клиохинола приводит к препятствованию агрегации пептида, и как показано выше, блокирует РА-индуцируемый кальциевый сигнал. В данном случае, клиохинол значительно (более чем на 50 %) уменьшал количесво мертвых клеток (21,2+6.8% мертвых нейронов, р<0,05 и 15,2+3,2% астроцитов, п=5 экспериментов; рисунок 7 А). Но в данном случае, клиохинол делает амилоид просто неактивным что касается любого клеточного процесса. Но, инкубация клеток с 50 мкМ РА 25-35 в

безкапьциевой среде значительно (р<0,001) уменьшала гибельное воздействие нейротоксина (в гиппокампальных нейронах количество мертвых клеток уменьшалась до 16, 45±4,1%; п= 6 экспериментов, в астроцитах этот показатель падал до 17,5%, р>0,05). Это означает, что рА-индуцируемый кальциевый сигнал а астоцитах ответственем за гибель не только этих клеток, но и находящехся в со-культуре нейронов, в которых этот сигнал не наблюдался.

Гиппокампальные нейроны

О 60

с; 50

£

-О

CQ 40

® Е 30

20

10

0

И

Hl стандартная среда ■I Среда без Са2+

| 30

с; 25

Ъ

н 20

CL

S

13

10

5

0J

Конроль ßA 25-35 ßA 35-2$А 25-35+клиох

Гиппокампальные астроциты

Контроль ßA 25-35 ßA 35- ßA 25-35+клиохинол

Гиппокампальные нейроны

Контроль Глут ЦсА DPI

(ßA) TEMPO/ TEMPO/ каталаза каталаза

у-Глут Цис

Гиппокампальные астроциты

Контроль Глут (РА)

TEMPO/ каталаза

ЦсА DPI TEMPO/ каталаза

у—Глут Цис

Рисунок 7. ßA-индуцируемая клеточная смерть культивируемых нейронов и астроцитов. Эффект 24 часовой инкубации 50 мкМ ßA 25-35 или 5мкМ ßA 1-42 на жизнеспособность ко-культуры клеток (10-20 дней). Количество мертвых клеток было посчитано благодаря их окрашиванию иодитом пропидия. Живые клетки были прокрашены Hoechst 33342. 1 мкМ клиохинола, 0,5 мМ ТЕМРО+ 200 Ед/мл калалазы, 1 мкМ циклоспорина А, 0,5 мкМ DPI, 1мМ у-ГлутЦис были добавлены за 10 мин до ßA и находились в среде в течении 24 часов.

Следует заметить, что ни присутствие или отсутствие Са2+ в среде в контрольных экспериментах практически не меняла количество мертвых клеток (рисунок 7 А). То же отсутствие эффекта наблюдалось в экспериментах, в которых использовался пептид РА 35-25 (50 мкМ, рисунок 7А).

Вклад событий находящихся в одной цепи с кальциевым сигналом -pA-индуцируемая митохондриальная деполяризация и производство АФК так же влияли на выживаемость нейронов и астроцитов. Так, интересно отметить, что два нейротоксичных соединения - глутамат и РА не усиливали своего действия на нейроны когда были добавлены вместе, а в астроцитах эта комбинация и вовсе приводила к уменьшению процента мертвых клеток (до 12,7+2,9%, р<0,05; Рис.7 Б-В). Этот эффект, по-видимому, обусловлен способностью восстанавливать митохондриальный потенциал у астроцитов.

Использование антиоксидантов - TEMPO и каталазы очень эффективно предотвращало гибель как астроцитов, так и нейронов при действии РА (количество мертвых нейронов падало до 24,5±4,6%, р<0,05; для астроцитов этот показатель снижался до 16,4±2,1%, р<0.05). Но наиболее действенно РА токсичность предотвращалась использованием комбинацией антиоксидантов (TEMPO и каталаза) и ингибитора РТР 0,5 мкМ ЦсА (до 13,7±2,9% в случае нейронов и 7,3±0,9% у астроцитов, р<0,001 для обоих типов клеток, п=4). Не только антиоксиданты, но и ингибирование источника гиперпродукции свободных радикалов - НАДФН оксидазы 0,5 мкМ DPI уменьшала количество мертвых клеток (до 19,9±4,3% нейронов и 12,4+1,1% астроцитов, р<0,05 для обоих типов клетов, п=5). При этом следует отметить, что данное соединение было менее эффективно чем антиоксиданты, что, по-видимому, объясняется собственной токсичностью DPI.

Огромное значение в жизнеспособности клеток глутатиона восстановленного, подтверждают эксперименты с использованием предшественника глутатиона восстановленного - 1 мМ у-глутамил цистеина (у-ГЦ). Клеточные культуры были преинкубированны с у-ГЦ в течении 6 часов, после чего к клеткам для следующих 24 часов был добавлен рА. Эта обработка значительно уменьшало количество погибших нейронов (от 40,1±8,5% до 20,4±3.2%, р<0,05, п=4 эксперимента), и в астроцитах (от 15,4±4,2% в контроле до 7,1±1,3%, р<0,05, п=4 экспериментов, рисунок 7 В-Г).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многообразие эффектов РА на функциональные параметры клеток показал существенную и удивительно повторяющуюся селективность полипептида вызывать изменения кальциевого гомеостаза, митохондриального мембранного потенциала, продукции активных форм кислорода в астроцитах, а не нейронах. При этом амилоид в гораздо большей степени вызывает гибель нейронов. Эта селективность не обусловлена ни спецификой определенно культивируемых клеток, так как наблюдалась в культурах различного типа и возраста, и на более физиологических срезах гиппокампа. Именно безуспешной попыткой обнаружить рА-индуцированный кальциевый сигнал в нейронах, по-видимому, может служить достаточно скудное количество литературы на эту тему, при огромном количестве публикаций на тему данного нейротоксина.

При всей неожиданности полученных нами результатов, они достаточно четко выстраиваются в последовательность событий, приводящих к гибели нейронов. Как показали эксперименты по определению токсичности рА, гибель нейронов зависит от кальциевого сигнала астроцитов, от продукции АФК и уровня глутатиона в тех же клетках, а так же от состояния митохондриального потенциала. А так как первичным из всех этих процессов в астроцитах является рА-индуцированное изменение внутриклеточной концентрации ионов кальция, по видимому, именно встраивание рА в мембрану астроцитов и индуцирование кальциевого сигнала является тем триггером, который лежит в основе рА нейротоксичности.

В связи с этим, хочется отметить разницу в селективности рА каналов на исскуственных мембранах (полученными в лаборатории Ариспе - Ашре е! а1., 1993; 1996) и в наших экспериментах на астроцитах. Обнаруженная нами на астроцитах высокая избирательность к Са2+ подразумевает участие иных катионов и протонов в механизме токсичности только как вторичных - в ответ на изменение [Са2+]с.

Другой отличающейся особенностью рА-индуцированного кальциевого сигнала является его форма. Она зачастую напоминает классические кальциевые колебания в астроцитах, которые обусловлены выходом ионов Са2+ из

внутриклеточных Са2+-депо, но в данном случае это эффект открытия и закрытия канала на плазмаллеме. Характерная для РА форма кальциевого сигнала наблюдается и в другом типе клеток - первичных клетках микроглии и ВУ2, а также в нейронах с высоким холестерином. Это говорит о том, что регуляция открытия и закрытия этих каналов на плазматической мембране в большей степени определена природой рА, чем спецификой клеток.

Полученные данные о влиянии уровня холестерина в мембранах клеток на рА-стимулированный кальциевый сигнал расходятся с данными, полученными на липосомах другими авторами (Агаре, ОоЬ, 2002). Но тут следует отметить, что в этой работе впервые представленны данные по измерению уровня мембранного холестерина в живых нейронах и астроцитах. Повышение уровня холестерина в плазмалемме нейронов может приводить к возникновению совершенно другого механизма рА нейротоксичности - прямым действием нейротоксина на нейроны. Но как показали наши эксперименты, более предпочтительным механизмом токсичности является сигнал опосредованный через астроциты, т.к. при нормальных условиях даже после 24 часового воздействия рА кальциевого сигнала в гиппокампальных и кортикальных нейронах не наблюдается.

Изменения в [Са2+]с гиппокампальных и кортикальных астроцитах совместно с продукцией свободных радикалов приводит к открытию митохондриальной РТР в астроцитах. Пикообразное изменение флуоресценции КЫ23 в наших экспериментах не обусловлено образованием амилоидных каналов на внутренней мембране митохондрий, по - видимому, либо по причине слабой проницаемости рА внутрь клетки, либо за счет низкой концентрации холестерина в мембранах этой органеллы, либо по сумме этих причин. Доказательством этому может служить практически полная блокада рА-индуцируемой пикообразной митохондриальной деполяризации в клетках, полученных из циклофилин Д трансгенных мышей и при использовании ЦсА. Полученные нами данные являются очень интересными для изучения митохондриальной РТР на уровне целой клетки. Во-первых, наши эксперименты показывают, что открытие поры может быть как кратковременным (пикообразный сигнал КЬ123 с последующим восстановлением), так и с полной потерей к восстановлению Лцгт . Во вторых, для

открытия поры необходимо наличие высокого [Са2+]с и АФК, т.к. в отсутствии одного из этих двух факторов (эксперименты в безкальциевой среде и с антиоксидантами) предотвращают открытие митохондриальной мегапоры. При этом особо следует отметить тот факт, что ингибиторы НАДФН оксидазы -DPI и апоцинин полностью блокировали открытие поры при полновесном кальциевом сигнале.

Интересно, что медленная ßA-индуцированная митохондриальная деполяризация обусловленная продукцией свободных радикалов сама по своей природе так же привносит свой вклад в цитотоксичность, т.к. митохондриальные субстраты, приводящие к восстановлению Ац/т , но не изменяющие продукцию АФК в НАДФН оксидазе, снижали процент гибели нейронов, и в большей степени астроцитов. По-видимому, это обусловленно тем, что даже медленная деполяризация при длительном воздействии может приводить к серьезному дисбалансу функций митохондрий, приводящему как к изменению энергетики клетки, за счет потребления НАД ферментом ПАРП, так и изменению цикла трипептида глугатиона (Dringen, Hirrilingen, 2003) и, как следствие, к клеточной гибели.

Обнаруженная нами при помощи зонда МСВ способность ßA значительно уменьшать уровень глутатиона в астроцитах и нейронах, пожалуй, является ключевым во взаимодействии этих клеток в механизме нейротоксичности. Но, если понижение концентрации глугатиона в астроцитах вызвано продукцией АФК в этих клетках и дисбалансом митохондрий (что подтверждают наши эксперименты с использованием ингибиторов НАДФН оксидазы и митохондриальных субстратов), то в нейронах это вызвано продукцией АФК в соседних клетках (микроглия, астроциты) и значительным уменьшением поступления субстратов для синтеза глугатиона из астроцитов (подтверждением могут служить эксперименты с использованием предшественников глугатиона). Концентрация глугатиона в астроцитах значительно выше, чем в нейронах, как в контроле, так и при действии ßA, и астроциты «подпитывают» нейроны предшественниками синтеза трипептида глугатиона (Keelan et al., 2001; Dringen, Hirrilingen, 2003). Значительное понижение уровня GSH в астроцитах при действии ßA, по-видимому, заставляет эти клетки

производить глутатион из предшественников, при нормальных условиях предназначавшиеся для нейронов.

При действии рА клетки микроглии и астроциты производят АФК. Как показано в наших экспериментах, это обусловлено их продукцией в НАДФН оксидазе. И если для клеток микроглии активация может быть как кальций-зависимой, так и опосредованной через рецептор С036 на плазматической мембране, то для астроцитов продукция АФК напрямую зависила от уровня [Са2+]с. Зависимость этого процесса от наличия ингибиторов НАДФН оксидазы и кальция поставило ряд вопросов, среди которых было определение экспрессии этого фермента в кортикальных и гиппокампальных астроцитах, определение его изоформы и механизма стимуляции. Результаты, полученные при помощи Вестерн блот анализа и иммунофлуоресценции подтвердили наличие НАДФН оксидазы в этих клетках. Более того, наличие §р91р1юх субъединицы и отсутствие стимуляции продукции АФК в §р91р1шх -нокаутированных астроцитах в ответ на стимул, позволяют предполагать, что данный фермент относится к N0X2 изоформе. Эта форма НАДФН оксидазы считается не Са2+-активируемой, однако в наших экспериментах она производила АФК в ответ на кальциевые ионофоры, хотя этот эффект может не иметь ничего общего с активацией Са2+-связывающих участков непосредственно на оксидазе (как это показано для N0X5), не через активацию РКС (т.к. в наших экспериментах не блокировалось ингибиторами гиспидином и стауроспорином), а опосредованно воздействием на кальций связывающие белки.

Обнаруженная нами для активации продукции АФК в НАДФН оксидазы астроцитов и микроглии путем компенсации заряда на мембране (для астроцитов это протонофор и градиент рН, для микроглии - открытие хлорного канала) также может играть роль при активации клеток РА.

По видимому, рА активирует продукцию АФК в НАДФН оксидазы за счет индукции кальциевой сигнализации, т.к. она не наблюдается в безкальциевой среде. Другим возможным механизмом могут быть Са2+-индуцируемые изменения во внутриклеточном рН, что и запускает продукцию АФК в этом ферменте.

Суммируя вышеописанные процессы: встраивание РА в плазматическую мембрану астроцитов приводит к изменениям [Са2+]с. Это в свою очередь

стимулирует продукцию АФК в НАДФН оксидазе. АФК и кальциевый сигнал производят деполяризацию Ац/т. АФК и дисбаланс митохондрий приводят к уменьшению уровня антиоксиданта глутатиона. АФК произведенные в астроцитах и микроглии, а также уменьшение синтеза глутатиона в нейронах в виду недостатка поступаемых из астроцитов субстратов, воздействуют на нейроны приводя их к гибели.

Данная работа показывает не только зависимость жизнедеятельности клеток от многих факторов, но и демонстрирует достаточно тонкий механизм гибели клеток, который может быть заблокирован в любом из участков.

ОСНОВНЫЕ выводы

1. Установлено, что полные пептиды РА 1-42 и 1-40, атак же короткие участки рА 25-35, 25-40 и 1-28 увеличивают [Са2+]с в кортикальных и гиппокампальных астроцитах, микроглии, но не в нейронах.

2. Обнаружено, что встраивание РА в клеточ!гую мембрану требует наличия мембранного холестерина. Уменьшение уровня холестерина приводит к предотвращению рА-индуцированных изменений [Са2+]с в астроцитах.

3. Показано наличие НАДФН оксидазы в кортикальных и гиппокампальных астроцитах и то, что рА вызывает продукцию АФК в этом ферменте.

4. рА вызывает митохондриальпую деполяризацию в астроцитах за счет продукции АФК в НАДФН оксидазе и высокоамплитудному кальциевому сигналу.

5. Показаны основные активаторы НАДФН оксидазы первичных гиппокампальных и кортикальных астроцитов: форболовый эфир, ионы кальция, изменение внутриклеточного рН.

6. Установление, что рА способен вызывать окислительный стресс в астроцитах и нейронах, что показано как понижение внутриклеточного уровня глутатиона, восстановленного в гиппокампальных и кортикальных астроцитах и нейронах и повышение скорости периокисного окисления липидов.

7. Показана активация фермента ПАРП при действии РА за счет АФК. Это приводит к потреблению НАД+ и изменению уровня НАДН. Уменьшение

субстрата НАДН приводит к ингибированию митохондрий

8. Обнаружено, что РА -индуцированная гибель нейронов зависит от кальциевого сигнала, величины митохондриального потенциала и скорости продукции АФК в соседних астроцитах.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Abramov A.Y. Canevari L., Duchen M.R. Changes in [Ca2+]c and glutathione in astrocytes as theprimary mechanism of amyloid neurotoxicity. 2003 Journal of Neuroscience 23 (12): 50885095

2. Abramov A.Y. Canevari L., Duchen M.R. Amyloid р-peptides induce mitochondrial dysfunction and oxidative stress in astrocytes and death of neurons through activation of NADPH oxidase. 2004 Journal of Neuroscience 24(2):565-75

3. Canevari L., Abramov A.Y. Duchen M.D. Toxicity of amyloid p peptide: tales of calcium, mitochondria and oxidative stress. 2004 Journal of Neurochemical Research. 29(3):637-50

4. Abramov A.Y. Canevari L., Duchen M.R. Calcium signals induced by amyloid P peptide and their consequences in neurons and astrocytes in culture. 2004 Biochemica et Biophysica Acta. 1742(l-3):81-87.

5. Abramov AY, Jacobson J, Wientjes F, Hothersall J, Canevari L, Duchen MR. Expression and modulation of an NADPH oxidase in mammalian astrocytes. 2005 Journal of Neuroscience. 25(40):9176-9184.

6. Abramov AY, Duchen MR. The role of an astrocytic NADPH oxidase in the neurotoxicity of amyloid beta peptides. 2005 Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 360(1464):2309-2314.

7. Abramov AY, Fraley C, Diao CT, Wihkfein R, Colicos MA, Duchen MR, French RJ, Pavlov EV. Targeted polyphosphotase expression alters mitochondrial metabolism and inhibits calcium-dependent cell death. 2007 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 104 18091-18096.

8. Burchell VS, Gandhi S, Deas E, Wood NW, Abramov AY, Plun-Favreau H. Targeting mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disease: Part I. Expert Opin Ther Targets. 2010 Apr;14(4):369-85.

9. Burchell VS, Gandhi S, Deas E, Wood NW, Abramov AY, Plun-Favreau H. Targeting mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disease: Part II. Expert Opin Ther Targets.

2010 May;14(5):497-511

10. Abramov AY, Smulders-Srinivasan TK, Kirby DM, Acin-Perez R, Enriquez JA, Lightowlers RN, Duchen MR, Turnbull DM. Mechanism of neurodegeneration of neurons with mitochondrial DNA mutations. Brain. 2010 Mar;133(Pt 3): 797-807.

11. Abramov AY, Ionov M, Pavlov E, Duchen MR. Membrane cholesterol content plays a key role in the neurotoxicity of p-amyloid: implications for Alzheimer's Disease. Aging Cell.

2011 Aug;10(4):595-603.

12. Abramov AY, Duchen MR. Measurements of threshold of mitochondrial permeability transition pore opening in intact and permeabilized cells by flash photolysis of caged calcium. Methods Mol Biol. 2011;793:299-309.

13. Ionov M, Burchell V, Klajnert B, Bryszewska M, Abramov AY. Mechanism of neuroprotection of melatonin against beta-amyloid neurotoxicity. Neuroscience. 2011 180: 229-237.

14. Абрамов А.Ю., Касымов В, Зинченко В.П. Р-Амилоид активирует синтез оксида азота в гиппокампальных астроцитах и гибель нейронов. Биологические мембраны. 2008 25 (1): 11-17

15. Duberley KE, Abramov AY, Chalasani A, Heales SJ, Rahman S, Hargreaves IP. Human neuronal coenzyme Q(10) deficiency results in global loss of mitochondrial respiratory chain activity, increased mitochondrial oxidative stress and reversal of ATP synthase activity: implications for pathogenesis and treatment. J Inherit Metab Dis. 2013 Jan;36(l):63-73.

16. Abeti R, Abramov AY', Duchen MR*, p-amyloid activates Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) causing astrocytic metabolic failure and neuronal death. Brain. 2011 Jun;134(Pt 6): 1658-72.

17. Gandhi S, Abramov AY. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2012;2012:428010.

18. Cremades N, Cohen SIA, Deas E, Abramov AY, Chen AY.Orte A, Sandal M, Clarke RW, Dunne P, Aprile FA, Bertoncini CW, Wood NW, Knowles TPJ, Dobson CM, Klenerman D. Direct Observation of the Interconversion of Normal and Toxic Forms of a-Synuclein. Cell 2012 25;149(5):1048-59.

19. Kamynina AV, HolmstrOm KM, Koroev DO, Volpina OM, Abramov AY. Acetylcholine and antibodies against the acetylcholine receptor protect neurons and astrocytes against beta-amyloid toxicity. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Jan 23 45, 899-907.

20. Suwanjang W, Abramov AY, Govitrapong P, Chetsawang B. Melatonin attenuates dexamethasone toxicity-induced oxidative stress, calpain and caspase activation in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. J Steroid Biochem Mol Biol. 2013 May 17;138C:116-122.

21. 72. Duberley KE, Heales SJ, Abramov AY, Chalasani A, Land JM, Rahman S, Hargreaves IP. Effect of Coenzyme Q10 supplementation on mitochondrial electron transport chain activity and mitochondrial oxidative stress in Coenzyme Q10 deficient human neuronal cells. Int J Biochem Cell Biol. 2014 May;50:60-3.

22. Bobkova NV, Medvinskaya N1, Kamynina AV, Aleksandrova IY, Nesterova IV, Samokhin AN, Koroev DO, Filatova MP, Nekrasov PV, Abramov AY, Leonov SV, Volpina OM. Immunization with either prion protein fragment 95-123 or the fragment-specific antibodies rescue memory loss and neurodegenerative phenotype of neurons in olfactory bulbectomized mice. Neurobiol Learn Mem. 2014 Jan;107:50-64.

23. Kamynina AV, Filatova MP, Koroev DO, Abramov AYu, Vol'pina OM. Antibodies to synthetic fragment 95-123 of the prion protein protect neurons and astrocytes from beta-amyloid toxicity. 1. Bioorg Khim. 2013 Mar-Apr;39(2):131-40. Russian.

24. Bartolome F, Wu HC, Burchell VS, Preza E, Wray S, Mahoney CJ, Fox NC, Calvo A, Canosa A, Moglia C, Mandrioli J, Chio A, Orrell RW, Houlden H, Hardy J, Abramov AY*, Plun-Favreau H. Pathogenic VCP mutations induce mitochondrial uncoupling and reduced ATP levels. Neuron. 2013 Apr 10;78(l):57-64.

25. Narayan P, HolmstrOm KM, Kim DH, Whitcomb DJ, Wilson MR, St George-Hyslop P, Wood NW, Dobson CM, Cho K, Abramov AY, Klenerman D. Rare Individual Amyloid-P Oligomers Act on Astrocytes to Initiate Neuronal Damage. Biochemistry. 2014 Apr 22;53(15):2442-53.

Подписано в печать:

18.06.2014

Заказ № 10077 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» И11Н 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru