Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика нового нехромосомного детерминанта [NSI+]дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика нового нехромосомного детерминанта [NSI+]дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

Нижников Антон Александрович

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО НЕХРОМОСОМНОГО ДЕТЕРМИНАНТА [ЛГСГ] ДРОЖЖЕЙ БАССНАИОМУСЕБ СЕЯЕУ1Б1АЕ

специальность: 03.02.07. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 ОКТ 2013

005534934

Санкт-Петербург 2013

005534934

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Университете на кафедре генетики и биотехнологии.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Галкин Алексей Петрович Кафедра генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского Государственного Университета, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук Тер-Аванесян Михаил Давидович Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, Москва

доктор биологических наук Сойдла Тыну Рихович Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова, Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится ^ 2013 г. в/^Часов на заседании

совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория { .

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 доктор биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прионами называют белки, способные в одинаковых физиологических условиях существовать в двух или более конформациях, из которых как минимум одна обладает инфекционными свойствами. Прионизация связана с формированием упорядоченных белковых полимеров (амилоидов), образующихся за счёт образования межмолекулярных бета-структур. Помимо инфекционных амилоидов (прионов), выявлен целый ряд неинфекционных амилоидов, вызывающих летальные заболевания человека. Первый из открытых прионов, PrPSc, является летальным патогеном человека и животных [Prusiner, 1982]. Наибольшее количество прионов идентифицировано у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. У этого организма известно как минимум восемь прионов: [AST], [URE3], [PIN*], [SWf], [<OCt], [MOT3\ [ttP+] и [.MOD*] [Wickner, 1994; Derkatch et al. 1997; Du et al. 2008; Patel et al. 2009; Alberti et al. 2009; Rogoza et al. 2010; Suzuki et al. 2012]. Открытие дрожжевых прионов изменило восприятие нуклеиновых кислот в качестве единственного носителя наследственной информации, что обуславливает фундаментальную значимость их исследования. Исторически одним из первых прионов дрожжей был выявлен [Р57] - прионная изоформа белка Sup35 [Chernoff et al.1993; Ter-Avanesyan et al. 1994; Wickner, 1994; Cox, 1965], выполняющего функцию фактора терминации трансляции [Zhouravleva et al. 1995; Frolova et al. 1994; Stanfield et al. 1995]. Прионизация Sup35 вызывает снижение эффективности терминации трансляции и нонсенс-супрессию - процесс считывания стоп-кодонов как значащих. В лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ был выявлен новый нехромосомный детерминант [AiST], также как и [PS/] вызывающий нонсенс-супрессию, но не являющийся прионной изоформой Sup35p. Характеристике этого детерминанта, а также комплекса генов и факторов, влияющих на его проявление, и посвящена эта диссертация. Исследование прионов дрожжей актуально не только с фундаментальной, но и прикладной точки зрения, поскольку S. cerevisiae являются удобным объектом для исследования молекулярных механизмов прионизации.

Степень разработанности проблемы. К настоящему времени описан ряд прионов дрожжей, разработаны теоретические модели прионизации, получены данные, демонстрирующие различия между прионами и неинфекционными амилоидами. Несмотря на крайне активное исследование прионов дрожжей S. cerevisiae, вполне очевидно, что выявленные к настоящему времени прионы составляют лишь малую часть от их общего числа, поскольку просто не существует подходов для идентификации прионов в масштабах всего протеома. Таким образом, характеристика новых прионов, а также поиск генов и факторов, влияющих на их проявление, имеет большое фундаментальное значение.

Цель и задачи исследования. Цель работы - характеристика нового нехромосомного детерминанта [AST] дрожжей S. cerevisiae и выявление генов, влияющих на его проявление.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Выявить этапы матричных процессов, в регуляции которых участвует нехромосомный детерминант [ЛОТ*].

2. Охарактеризовать проявления [MST], не связанные с нонсенс-супрессией.

3. Проанализировать прионные свойства детерминанта [АВ/1"].

4. Выявить гены, изменение уровня экспрессии которых влияет на проявление детерминанта [ЛОТ*].

5. Выявить гены, эффекты сверхэкспрессии которых сходны с проявлением [A3/].

Научная новизна диссертационной работы. В рамках работы впервые охарактеризованы прионные свойства нового нехромосомного детерминанта [NSÏ*] дрожжей S. cerevisiae. Показано влияние [Л57+] на эффективность терминации трансляции и вегетативный рост, а также участие этого детерминанта в регуляции количества мРНК некоторых генов. Выявлен ряд новых супрессоров нонсенс-мутаций: ABF1, GLN3, FKH2, МСМ1, МОТЗ, REB1 и VTS1. Впервые показано влияние приона [PIN*] на нонсенс-супрессию.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты обладают существенной фундаментальной значимостью, внося большой вклад в знание о генетических и эпигенетических регуляторах терминации трансляции у дрожжей. Также результаты работы могут иметь потенциальную прикладную значимость, так как целый ряд исследований последних лет показывают, что значительное количество наследственных заболеваний человека ассоциированы с преждевременными стоп-кодонами. Дрожжи S. cerevisiae являются одним из наиболее перспективных модельных объектов. Учитывая, что компоненты трасляционного аппарата обладают высокой эволюционной консервативностью у эукариот, выявление дрожжевых генов, влияющих на эффективность трансляции, может быть полезно для разработки подходов к терапии подобных болезней.

Результаты работы могут быть использованы при подготовке материалов лекций по курсам «Молекулярная генетика», «Частная генетика дрожжей», «Генетический контроль трансляции» и «Прионы», преподаваемым на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, а также аналогичных курсов в других университетах России.

Положения, выносимые на защиту. Детерминант [7V57*] обладает свойствами дрожжевого приона и имеет плейотропное фенотипическое проявление. Нонсенс-супрессия в штаммах [JVS/J связана с дефектами терминации трансляции и генами, кодирующими факторы терминации трансляции - SUP35 и SUP45. Детерминант [NSf] участвует в регуляции количества мРНК генов SUP45 и VTS1. Прион [PLV*] усиливает нонсенс-супрессию в штаммах [NSt]. Сверхэкспрессия гена VTS1 влияет на эффективность терминации трансляции. Гены ABF1, GLN3, FKH2, МСМ1, МОТЗ и REB1 являются многокопийными нонсенс-супрессорами у S. cerevisiae.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы имеют высокую степень достоверности, подтвержденную публикацией в 4 статьях в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисных сообщениях. Материалы диссертации были представлены на IV конференции европейского общества молекулярных биологов "The 4 EMBO meeting" (Ницца, Франция, 2012), XXV международной конференции по дрожжевой генетике и молекулярной биологии "XXV YGMB" (Олыптын, Польша, 2011), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, Россия, 2009), XVTI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2010), 14-16 международных конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010, 2011, 2012 и 2013), а также на научных семинарах лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах и состоит из Введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Выводы». Работа содержит 10 таблиц, 18 рисунков, список литературы из 301 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы S. cerevisiae и Е. coli В работе использован штамм Escherichia coli DH5a следующего генотипа: supE44 AlacU169 (<p80lacZAM15) hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-l relAl [Hanahan, 1985]. Генотипы основных штаммов S. cerevisiae перечислены в Таблице 1.

Таблица 1 - Основные штаммы S. cerevisiae, использованные в работе

Штамм Генотип Источник

1-1-Д931 [№>7Т] дериват штамма 1-Д931 Цапонина и др. 2005

1-1-1-Д931 [nsî]\pin] дериват штамма 1-1-Д931 8а1Шс1тоуа е1 а1. 2010

4-1-1-Д931 Дериват штамма 1-1-Д931, несущий плазмиду pL-Aß-Sup35MC вместо плазмиды pU-Aß-Sup35MC 8а1ЙсНпоуа й а1. 2010

1-4-1-1-Д931 [nsî]\piri"\ дериват штамма 4-1 -1 -Д931 5а1Штоуа й а1. 2010

1-Д933 МЛТа sup35A::H!S3 adel-14 his3 1еи2 lys2 игаЗ trpl-289 [pU-Aß-Sup35MC] [nsi][PIff] 5а1ГМтоуа « а1. 2010

2-2-1-1-Д931 МЛ Ta sup35&::HIS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 [pRS316-SUP35MC] [NST][PIN~} Получен в данной работе

2-4-1-1-Д931 [«.s-Г] \P!N¥\ дериват штамма 1-4-1-1-Д931 Получен в данной работе

5-1-4-1-1-Д931 [NSr][pin] дериват штамма 1-4-1-1-Д931 Получен в данной работе

1-2-2-1-1-Д931 MATa sup35A::HlS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 [NSr][PIlf] [pASB-2] Получен в данной работе

2-1-1-Д931 MA Tu sup35 A::HIS3 adel-14 his3 Ieu2 fys2 игаЗ trpl-289 [NSf}[PIlf} [pRS315-SUP35MC] Получен в данной работе

1-2-1-1-Д931 MATa sup35 A::H1S3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 \psï]\pin-] [pRS315-SUP35MC] Получен в данной работе

Д935 MATa!MATasip35A:SUP35PJ£U2/sip35A:SUP35PLEU2 his3/his3 adel-14/adel-14 trpl/Opl LYS2/tys2 ura3/ura3-52 laûMû-XmiNStWPSf] Получен в данной работе

1-4-2-1-1-Д931 MATa sup35A::HIS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 [Ы5Г\Р1ЬГ\ [pNR-AABFl] Получен в данной работе

1-5-2-1-1-Д931 MA Ta sup35A::HlS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 [iisf][P'"1 [pNR-AABFl] Получен в данной работе

18-3-2-1-1-Д931 MATa sup35A::HIS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 {nsíWpin} [pASB-2] Получен в данной работе

6-2-1-1-Д931 MATa sup35A::HlS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 vtslh::LEU2 [NSt\[PIN*] [pRS315-SUP35MC] Получен в данной работе

1-1-2-1-1-Д931 MATa sip35A-:HIS3' adel-14~ his3 leu2 lys2 um3 Hpl-289" [pASB-2] Получен в данной работе

1-2-1-1-Д931 MATa sup35 A::HIS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ trpl-289 [pRS315-SUP35MC] Получен в данной работе

12-Д953 MATa sup35A::HIS3 adel-14 his3 leu2 lys2 игаЗ rnqlAr.KanMX[pU-Aß-Sup35MC] [ЛГ.УГ][Р/ЛП Получен в данной работе

Примечание. Генотипы штаммов дрожжей охарактеризованы в соответствии со стандартной трехбуквенной номенклатурой [Захаров и др. 1984; Sherman et aL 1986]. Аллель adel-14 содержит нонсенс-мутацию UGA; trpi-289 - нонсенс-мутацию UAG; игаЗ-52 - инсерцию дрожжевого мобильного элемента Ту1 в кодирующую часть гена URA3; !еи2-3,112—двойные мутации в гене LEU2.

Плазмиды. Основные плазмиды, использованные в ходе настоящего исследования, перечислены в Таблице 2. Также в работе получены плазмвды серии pU-CUPl (pU-CUPl-DEFl ' PU-CUP1-NAB2, pU-CUPl-NAB3, pU-CUPl-NRPl и pU-CUPl-PIN3) предназначенные для сверхэкспрессии генов DEFI, NAB2, NAB3, NRP1 и PIN3 под контролем сильного индуцибельного промотора CUP1. Для сверхэкспрессии генов ABF1, IN04, REB1 SFP1 FKH2 МСМ1, МОТЗ, CYC8, GAL11, GLN3 и PGD1 была использована серия то 11 мпогокопийных плазмид pU-CUPl, маркированных URA3 и несущих соответствующие гены под кошролем сильного индуцибельного промотора CUP1 [Нижников и др. 2013].

Таблица 2 - Основные плазмиды, использованные в работе

Название Тип/маркер Промотор Белок Автор

pFL36 CENILEU2 Bonneaud et al. 1991

pRS315 CEN/LEU2 Sikorski and Hieter, 1989

pRS316 CEN/URA3 Sikorski and Hieter, 1989

pRS315-SUP35MC CEN/LEU2 P^WJ Sup35MC Любезно предоставлена проф. Ю.О. Черновым

pmCUPNMsGFP 2ц /URA3 Pcupi Sup35NM-GFP Serio et al. 1999

pRS316-SUP35MC С EN 1URA 3 PSUP3S Sup35MC Любезно предоставлена проф. Ю.О. Черновым

pYCH-U2 CENI URA 3 PsUP35 Sup35 Derkatch et al. 1997

pASB-2 CENILEU2 PsUP35 Sup35 Любезно предоставлена А.С. Борхсениусом

Pcupi-GFP(URA3) 2ц IURA3 P cup1 GFP Рубель и др. 2008

pL-Aß-Sup35MC 2ц ILEU2 P cup1 Aß-Sup35MC SaiFitdinova et al. 2010

pU-Aß-Sup35MC 2цÍURA3 P cup1 Aß-Sup35MC Цапонина и др. 2005

pNR-AABFl CEN/LEU2 PsUP3Siabf! Sup35 Любезно предоставлена Н.А. Рябинковой

pFL36-SUP45 CENILEU2 P sup45 Sup45 Получена в данной работе

pU-VTSl-GFP 2ц IURA3 P cup1 Vtsl-GFP Получена в данной работе

pT-VTSl 2ц /TRP1 P cup1 Vtsl Получена в данной работе

PCUPI-GFP(TRPI) 2ц ITRP1 P cupi GFP Рубель и др. 2008

PCUPI-GFP(TRPI) 2ц ITRP1 Pcupi GFP Рубель и др. 2008

pU-CUPl-VTSl 2ц /URA3 P cupi Vtsl Получена в данной работе

pLAN-VTS 1 -VTS1 CEN/LEU2 P|tsi Vtsl Получена в данной работе

Примечание. CEN-центромерная плазмида, 2 ц- многокопийная плазмида. Все плазмиды в таблице содержат ген устойчивости к ампициллину для селекции в Е. coli.

Генетические методы. В работе применяли стандартные методы дрожжевой генетики: методы селективных сред, отпечатков, посева истощающим штрихом, случайной выборки аскоспор и тетрадного анализа [Инге-Вечтомов, 1971, Захаров и др. 1984; Rose et al. 1990]. Детерминант [ЛКГ] элиминировали трехкратным пассированием на твердой среде YAPD с добавлением 5 мМ хлорида туанидина (ГГХ) "QIAGEN"(CIIIA). Потерю плазмид, содержащих маркер URA3, производили на селективной среде с добавлением 5-FOA [Kaiser et al. 1994]. Для оценки нонсенс-супрессии соответствующие штаммы методом отпечатков переносили на селективную среду без аденина или триптофана и анализировали рост на пятые сутки инкубации

в термостате [Chernoff et al. 2002]. Тип спаривания исследуемых штаммов определяли путем скрещивания с тестерными штаммами 2Г-П2345 (МАТа his5) и 78А-П2345 (MATa his5) (Таблица 1).

Модекулярно-бнологаческие методы. Трансформацию дрожжей проводили по стандартной методике [Rose et al. 1990] с добавлением 7 мкг ДНК-носителя для повышения эффективности. Трансформацию бактерий также осуществляли по стандартной методике [Inoue et al. 1990]. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli осуществляли при помощи метода щелочного лизиса [Sambrook et al. 1989]. Геномную ДНК из дрожжей выделяли по стандартному методу, с рядом модификаций [Kaiser et al. 1994]. Использовали стандартные генно-инженерные методы [Маниатис и др. 1984). Выделение тотальной РНК проводили с использованием реагента "Trizol" ("Invitrogene") согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора Super Script Ш ("Invitrogene") согласно протоколу производителя. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦРРВ) проводили в амплификаторе АНК-16 (ИАнП РАН). Для каждого эксперимента выделяли не менее пяти независимых проб тотальной мРНК. Анализ проводили при помощи метода 2Л4СТ [Livak and Schmittgen, 2001].

Выделение белка проводили по стандартным методикам [Newnam et al. 1999] или [Chernoff et al. 2002]. Белки разделяли при помощи SDS-гель-элекгрофореза в 10% полиакриламидном геле и переносили на PVDF-мембрану ("Amersham Biosciences", США). Выравнивание тотального белка проводили при помощи метода Бредфорд [Bradford, 1976], а также с помощью окрашивания геля кумасси R250. Для иммунодетекции использовали поликлональные антитела кролика против белка Sup35 [Chabelskaya et al. 2004] и моноклональные антитела кролика против белка Sup45 [Kiktev et al. 2009], а также моноклональные антитела мыши ЗА9 против GFP (Институт биоорганической химии РАН, РФ). Сравнение интенсивностей сигналов анализируемых белков проводили с помощью денситометрического анализа в программном обеспечении ImageJ 1.37а

Количественный анализ эффективности терминации трансляции проводили при помощи метода бицистронной люминесценции [по: Valouev et al. 2009] с использованием плазмид pDB691 (UGAC), pDB690 (CGAC), pDB720 (UAGC) и pDB721 (CAGC) [Keeling et al. 2006; Kallmeyer et al. 2006], любезно предоставленных М.Д. Тер-Аванесяном.

Флуоресцентная микроскопия. Флуоресцентный анализ агрегации белка Sup35NM-GFP проюдили при помощи микроскопа Leica DM6000B ("Leica Microsystems GmBH", Германия) с программным обеспечением "Leica QWin Standarf' версии 3.2.0. Для анализа флуоресценции использовали комплект "GFP" ("Leica Microsystems GmBH") с запирающим фильтром 515 нм и возбуждающим фильтром 480 нм.

Статистический анализ. Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнение выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проюдили при помощи пакета программного обеспечения "STATISTICA" версии 6.0. ("StatSoft Inc.", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ особенностей фенотипического проявления \NSt\. Детерминант [NSt] был выявлен как омнипотентный супрессор, имеющий фенотипическое проявление на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35 и продукции гибридного белка Ар-Sup35MC под контролем промотора CUP1 [Цапонина и др. 2005; Saifitdinova et al. 2010]. Мы провели детальный анализ особенностей нонсенс-супрессии, опосредованной [Ж/]. Увеличение экспрессии SUP35 в штамме 1-1-Д931 [ЛОТ*] за счет введения

Мы проанализировали влияние антибиотиков паромомицина и генетицина, снижающих эффективность трансляции, на нонсенс-супрессию в штаммах [NSt] 1-1-2-1-1-Д931 и [mi] 18-3-2-1-1-Д931, содержащих полноразмерный ген SUP35. Без добавления антибиотиков эти штаммы не отличаются по росту на селективной среде без аденина (Рисунок 2.А). Добавление в среду паромомицина в концентрации 100 мкМ и 50 мкМ генетицина приводит к сильной нонсенс-супрессии исключительно в штамме [NSt] (Рисунок 2.Б). В штамме [/иг"] данные концентрации антибиотиков супрессорных эффектов не вызывают (Рисунок 2.Б). То, что нонсенс-супрессия в штаммах [NSt] опосредована фактором терминации трансляции eRF3 (Sup35), а также возникает на фоне общих дефектов трансляции, навело нас на предположение, что [ЛКГ] может непосредственно влиять на эффективность терминации трансляции. Для проверки этой гипотезы мы использовали метод бицистронной люминесценции. Изогенные штаммы [AS/] и [rcsf] были трансформированы плазмидами pDB691 или pDB721 в опыте, а также pDB690 или pDB720 и использованы для проведения эксперимента. Полученные данные показали (Рисунок 2.Д ), что [AST] вызывает статистически достоверное увеличение частот прочтения стоп-кодонов UGA и UAG как значащих. Таким образом, детерминант [АКТ*] вызывает снижение эффективности терминации трансляции, и этот эффект может проявляться в виде омнипотентной нонсенс-супрессии при снижении эффективности работы Sup35 как фактора терминации трансляции или на фоне общих нарушений трансляции.

Дефекты терминации трансляции, которые вызывает [NSt], могут оказывать общее неблагоприятное воздействие на клетку. В связи с этим мы проанализировали влияние [АКТ] на вегетативный рост дрожжей. Для анализа этого эффекта мы проанализировали динамику роста штаммов 2-1-1-Д931 [АВТ] и 1-2-1-1-Д931 [nsi] (Рисунок 2.Е). В результате было установлено, что [NSt] вызывает подавление вегетативного роста вне зависимости от источника углерода. Во-вторых, штаммы [NSt] фактически перестают расти на среде MGly, едва достигая плотности в 0,5 ¿Da*)™. Дальнейшая инкубация этих штаммов в MGly до трех суток не приводит к увеличению плотности культуры. Таким образом, [NSt] обладает плейотропным фенотипическим проявлением, вызывая нонсенс-супрессию на фоне общих дефектов трансляции или снижения функциональной активности Sup35 как фактора терминации трансляции, а также общий дефект вегетативного роста [по: Nizhnikov et al 2012].

Характеристика прионных свойств \NSt], Исходя из того, что [АКТ] эффективно изгоняется ГТХ и на фоне деяеции HSP104, мы предположили, что этот детерминант может иметь прионную природу. Для дрожжевых прионов свойственен комплекс из трех особенностей: инфекционности, способности к спонтанному возникновению de novo и нехромосомного наследования 4:0 в мейозе, которые и анализировались в данном разделе. Одной из методик анализа цитоплазматической инфекционности прионов является белковая трансформация [Tanaka and Weissman, 2006]. Штаммы 1-Д933 [mï][Pïït] или 1-1-1-Д931 [nsï ][рш"] котрансформировали белковым лизатом, выделенным из штамма 4-1-1-Д931 [NSt][Pnt] и вектором pRS315. В качестве контроля трансформировали штаммы 1-Д933 и 1-1-1-Д931 белковым лизатом, выделенным го штамма 1-4-1-1-Д931 [nsî]\pm]. Полученные результаты приведены в Таблице 3. В опыте происходила передача фактора [NSt] с эффективностью 5-7%, в то время как в контрольных экспериментах не было отмечено возникновения ни одного [NSt] клона Эти данные позволяют констатировать, что фактор [ÎVS^] обладает цитоплазматической инфекционностью.

Способность к спонтанному возникновению de novo является одной из ключевых особенностей дрожжевых прионов, позволяющей отличить их от большинства других нехромосомных детерминантов [по: Wickner et al. 2007]. Для анализа способности [АКТ] к спонтанному возникновению de novo был использован штамм 24-1-1-Д931 [mi'^PIN], В результате, среди отобранных нами 88 клонов, проторофных по аденину, мы выявили 11 клонов, которые

стабильно наследовали ГПХ-зависимый супрессорный фенотип в ряду клеточных поколений, то есть клонов [AST1"] (Таблица 4). Этот результат показывает, что фактор [AS/*], как и известные дрожжевые прионы, обладает способностью к спонтанному возникновению de novo после элиминации.

Мы провели анализ наследования [AS/*] при помощи тетрадного анализа. Фактор [NSf] вызывает нонсенс-супрессию на фоне замещения нативного SUP35 ортшогом из Pichia methanolica (далее - SUP35P.m.). Путем скрещивания гаплоидных штаммов [ЖГ] и [nsi \ был получен диплоидный штамм Д935. Этот штамм содержал [NSf], что подтверждает доминантные свойства этого детерминанта. Данный штамм был использован для проведения тетрадного анализа. В тетрадах, которые образовали четыре жизнеспособные аскоспоры, наблюдалось соотношение 4[jVS/+]:0[/m;"] (Таблица 5). Таким образом, для фактора [NSI*], как и для известных дрожжевых прионов, характерно нехромосомное наследование 4:0 в мейозе. Этот факт, наряду с данными о цитоплазматической инфекционности и о спонтанном возникновении de novo, свидетельствует в пользу прионной природы фактора [ЖГ]. В целом, полученные данные позволяют рассматривать [ЛК/*] в качестве прионоподобного детерминанта S. cerevisiae.

Таблица 3 - Результаты белковой трансформации

Штамм-дон op белкового лизата Штамм-реципиент Номер экспериме нта Отобрано трансформантов Количество трансформантов ГNSf] Процент транофорившов гд«/1

4-1-1-Д931 [NSr][PlN*] 1-Д933 [nsr][PIN*} 1 100 5 5,0 ± 2,2

2 100 1 7,0 ±2,6

3 100 6 6,0 ± 2,4

1-4-1-1-Д931 [nsî]\piri~\ 1-Д933 [nsi][PIN*] 1 100 0 0 + 0,3

2 100 0 0 + 0,3

3 100 0 0 + 0,3

4-1-1-Д931 1-1-1Д931 4 100 5 5,0 ±2,2

[NSt\[PIht] [nsï\[pin~\ 5 100 6 6,0 ±2,4

1-4-1-1-Д931 1-1-1Д931 4 100 0 0 + 0,3

[nsî]\pin] [шГ][рш] 5 100 0 0 + 0,3

Таблица 4 - Анализ спонтанного возникновения [iVS/1] de novo

Штамм Количество Количество клонов, прототрофных по аденину

клеток в Нестабильные Митотически стабильные Всего

разведении в митозе Ревертанты [А5УЧ

2-4-1-1-Д931 [nsr][PIN*] 2*10" 2 1 0

2*103 7 12 3 88

2*10" 25 30 8

Таблица 5 - Анализ наследования фактора [AŒ/*]

Диплоидный штамм Количество тетрад Количество тетрад с соотношением [NSI*]: [/ш~]

4:0 3:1 2:2 1:3 0:4

[ЛОТ+] Д935 12 12 0 0 0 0

[nsf] Д936 14 0 0 0 0 14

Нзхчеиис вшнмо,|сйс1шш |ЛЛТ| с .цчсрчннаншм |/'/.\'1. Анализ штамма 12-Д953 /7*7/Д [ЛвГ] показал, что [ЛХГ] в дашюч штамме стабильно поддерживается и лечится на ГТХ, 1Ю нонсенс-супрессия. которую он вызывает, выражена слабее, чем в исходном штамме 1-1-Д931 [Л®П(Я/У] (Рисунок ЗЛ). Данный тффект мог бить вызван двумя причинами либо собственно дслсцисй гена ЯЛ'0/, либо утратой детерминанта [ЯЛУ], котсрый является приемной изоформой Кпц 1. Дпя решения лзниого вопроса нам было необходимо получить штамм ). В таком штамме белок присутствует, однако находится не в прнонной юоформе, что позваляст сделал, однозначный вывод о том, что ктияет на проявление [Л'5/"[ -утрата илн прнонизания Кпц 1. Мы ^трансформировали [тГ](р0>1 штамм 1-4-1-1-Д931 лнзатом [ЛЖГ)[Я/У] штамма 4-1-1-Д931 и плазмндой ршСХТОМ-СРР. Трансфс*ма1тж [ЛЯГ] отбирали на селективной среде без аленина. и. дта контроля. пассировали ш среде с П'Х. Белок 5к|р35КМ-ОКР агрегирует в штаммах (Я/У] и кахолггея в мономерном состоянии в штаммах [/ял) (ОсгкЛс!) с1 а1. 2001; Рисунок З.А). Опираясь на тгот факт, статус [/.гл ] полученных клопов устанавливали при помощи флуоресцентной микроскопии. В результате отбора таких клопов был получен [УХ/*][/лл ] штамм 5-1-4-1-1-Д931. Даюплй штамм харакпризовался сниженным, но хороню детектируемым уровнем нонсенс-супрессии (Рисунок З.А* Па следующем этапе работы мы провели более точную оценку уровня нонсенс-супрессии I штаммах 4-1-1-Д931 [Л5Г|[Я/У], 5-1-4-1-1-Д931 [ЛХГЦрт] и 1-4-1-1-Д931 [т, |[/>ш ] с помощью теста наразведение Полученные резу льтаты (Рисунок З.Б) позволяют констатировать, что зрноиный детермннаш [Я/У 1 усиливает нонсенс-супрессию. вызываемую [АКТ]: штамм [Л£У][/м> ] характеризуется промежуточным уровнем ноиоенс-сутфессии между штаммами [ЛЪТЦЯ/У] и [тГ\\рт\ (Рисунок З.Ь). Таким образом, детерминант [Я/У] яазястся агзосупресссром. усиливая нонсенс-супрессию в штаммах [А5/*].

Рисунок 3 - Анализ ншимин детерминант |Я/У| на проявление

фа к юра |AÍS/*]. А. Аиазиз ajpctaiinn бспса Sup35NM-GFP, а такке нонсенс-сутфсесии в in гаммах 4-1-1-Д931 [ЛЕХГЦЯ/У], 5-1-4-1-1-Д931 [ЛХЛЦми), 1Ч--1-Д931 (ш/][/«п ) и 12-Д953 mql Д (ЛОУ). Ноисенс-супрсссию анализировали на (слективнои срсле без ахнииа со 150 мк.М CíSOí Б. Оценка нонсенс-еупрсееии в мпаммах 4-1-1-Д931 [SSÍ ][Я/ЛГ], 5-1-4-1-1-Д931 (МЕГДО] и 1-4-1-1-Д931 [mr Приставлена серия лесятикретных ршаелеинй культур соответствующих ипаммов. выращенных н течете пяти суток в жилкой ое-ютмамой срал* 6m ;i.iu«(Hita оо 100 мкМ CuSO* Фоюгрпфия патучена через трос суток выращивания ипамхкн на полной срсле

Поиск I снов, свспужтнрссеин кпюных маскиоуе! фсишиинчсское щюшыение 1УУ/"|. Одним из зтапов характеристики (АЗУ] является поиск генов, свсрхзкспрсссня которых гю.иазяот фенотипнческое проявление данного прионоподобного летерминатта. Данный подход может позволить идентифицировать гены, продукты которых опосредуют фснотитшчсскос прояазенне (Л/5У] или участвуют в биогенезе этого детерминанта, а также

Д 4-М-Д831 i-l-4-1 1 -ДМ' Т-4-1-1-ДВ31 12 ДВ5Э

ДоГГХ

Поел* ГТХ

1 11 [NSrjtpíi»)

X

mm mm mm ът

пошалм. что сверхэкспрсссия NAB2, NAB i и »757. мша .м.с».с-супрессжо на сжюктнвной срелс 6« гению. ошяко омюпотснтную нонсеис<упрсссик>. свойственную [ЛлГ]. вызывает тонько сверх-экспрессия Г/5/. Мы провели аналот эффектов смркжлрсссин »757 при пометил шшмияы pU-CUPl-VTSl в штаммах 2-1-1-Д931 [AW] и 1-2-1-1-Д931 [шг ]. продуцирующих Sup35MC. Полученные данные покапывают. что скрхэиофссош VTS! в nrra\fxie 1-2-1-1-Д931 [ля] вызывает супрессию нонсснс-атлелей аА-1-14Х]ак и Ггр1-2ЩМ, а также гюлав.-.яет вегхчатшнын рост (Рисунок 6.Б). пропшм сходство с f.VST] [Нижииков и "др 2011; Nizhnikovet al. 2012).

üss ñ

sJ^'P П

VTSItk—* «-J

б -т»

ЖЖ H

azi.

H2l

. í l

i«sn

в

¿zim

утзпШШ

.ÜÜ

s > I" ж N ■ UGA

VtílGFP

е mm

|n») H

1 ir»'] pu-vrst-cp Ш Vt»ICFP

VTSlt

I «»грея»

U AG

GfP

• и » n н it •рем» (часов)

-КОНТрОЛк

V7SIÎ

Рисунок 6 Анализ эффектов сверхэкспрессии гена »757. А. Сверхжспресаи »75/ усиливает нонсснс-ч.тгфоссию » штамме 2-1-1-ДОЗ I [ЛЯП Ь. Свсрхткафессия »75/ «ивл нонсенс-супрессию и (Юдашкине вегстаговно«« роста на среде MG в шпмм I-2-1-1-ДОЗ I [««1 несущ«, атмнду pRS315-SUPÎSMC. Л С'верхжсрссс,« »75/ « вы,ывас, «.«неч^е«*™ в m гамме 1-2-I-I-D93I [mí] на фоне прол>*ции гюднорамерного SVP35, однако 1КШШШГГ poci на среде MG Г. Сровнен.«: роста штамма 1-2-М-Д931 со свсрхткспрессисй »757 и в «ялрмс. без сафюиспресси,. Знтсния ,.а кривых роста приведены со станяргаыми ошибками Д. СЬепюкяреост "'l,ü,CT ™ эффективное!., считывания СШ..-ШДО.ВЖ UGA H UAG как значащих Часоты

ГТ'J™-«"»™ м »««щих привела« со стандартными отклонениями К. Гибридный Гхх™ ^l-CIT np» ежрхлродукши. J(рнвевены дшнме ф>>орсенеш.юй микроскопии и

BecrqpH-ñ.io, гэ^тизации с ангшаими против GFP «11» - надоезиоч.и» фркщя. . оащочим (по Nchnikov et al 2012). '

Мы прелпатожили. что также, как и в случае [NSt], иансснс-супрсссня. на&тюдаемая на фоне свсрхэкспрсссии »75/. является следствием снижения эффективности термнишшн трансляции. Полученные при помощи метола бицистрошюй люминесценции ланные (Рисунок 6Д) показа™, «по при сверхтирсссии »757 дсйстветслыю наблюдается статистически достоверное повышение частоты считывания об«« проанал.гз.фова.пп« стоп-кодонов. что вполне объясняет наблюдаемое действие свсрхэкспрсссии irait, гаи на нсжсснс-супрессню

Бслок VtsI обогащен аспарагшюм и глутаминам. Такие белки, зачастую, обладают способностью к агрегации [Alberti et al. 2009]. Мы решили проверить способиостъ к агрегации VtsI. Для этого вами была получена плазмида pU-VTSl-GFP. позволяющая свсрхпродуцироеать химерный белок Vtsl-GFP под контролем промотора CUP1. Штамм 1-2-1-1-Д931 [«я] был трансформирован этой платмндой. а также платидой Pcvri-GFP(URA3) в качестве контроля. Также как и плазмида pU-CUPl-VTS эта плаэмнла вызывает ноисснс-супрессгао (Рисуиок 6.Е). Анализ трансформатор проведенный гфи помощи флуоресцешной микросколии, показал, что белок GFP в контрольных трансформатах находится в растворимой форме, формируя равномерное еяечетк: (Рисутюк 6.Е). В то же время, химерный белок Vtsl-GFP образует хорошо различимые флуоресцентные агрегаты (Рисутюк 6.Е). Анализ белка Vtsl-GFP при помощи дифференциального центрифугирования с последующей вестерн-блот гибридизацией показал, что этот белок выявляется в осадочной фракшт. в отличие от белка GFP, присутствующего лишь во фракции растворимого белка (Рисунок 6.Е).

Анализ эффектов делении гена VTSI показал, что она не оказывает влияния на вегетативный рост штамма (в качестве кемпроля были использованы цпаммы 2-1-1-Д931 (NST] и 1-2-1-1-Д931 [л»]), а также не вызывает злиминашио [jVS/*] (Рисунок 7.Б). Вместе с тем, после лечения штамма 6-2-1 -1-Д931 на ГГХ наблюдается слабый рост на селективной сраче без •Ленина (Рисутюк 7.Б). Таким обратом, деления VTSI не влияет на поддержание (A/STj, однако

Рие>и<ж 7 - Анализ эффекте свериктпрсссии и делении lina VTSI. А.

Сравнение относительных «атичоств мРМК VTSI в шгаымал [iVST] и [ля] при помощи ПЦРР11. Ь. Дсклви VTSI в штамме 6-2-М-Д931 не ■фннилиг к миммнации детерминанта (Л5/| (по: Nehnkovet al 2012).

Из полученных данных стала очевидна взаимосвязь межд>г генами >737, SUP35 и детерминантом [АКТ]. Мы сравнит относительные количества мРНК VTSI в июгеиных штаммах [iVST] [пи]. В результате были потучены данные, показывающие, что в штамме [AST] достоверно (р<0,01) повышено катичестао мРНК VTS1 (Рисунок 7А) приблизительно в 2.3 раза. Таким образом. VTSI является многокопийным омиипотентным супрессором, взаимодействующим на матекуляр(юм уровне с детерминантом [АКТ], но lie вовлеченным в его поддержание.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа продолжает исследование фундаментальной проблемы неодиозначности одного из основных процессов живой клетки - термннации трансляции. Знание об эпигенетических регуляторах нонсенс-супрессии расширено за счет обнаружения аллосулрсссорных свойств приона [PIN"]. Выявление целого ряда новых генетических супрессоров - гена VTS1, кодирующего РНК-связываюший белок, и шести генов, ABFI, GLN3, FKH2. MCMI, МОТЗ и REBI, кодирующих транскрипционные факторы, расширяет представление об участниках системы регуляции эффективности нонсенс-супрессии и термннации трансляции. Полученные результаты позволяют предполагать.

оказывает незначительное влияние на нонссис-супрессию.

V

О f

<

i

[_

■

[NSI-] [nsr]

g -АО» -Tip МО МО»

^sM U ■ ■ •ÜB ü ■ ■

suosaucl voul

8ч»м*»с|

Vdttl

ln»il|

что эта система имеет значительное количество тонких регуляторов, имеющих как эпигенетическую, так и генетическую природу и взаимодействующих между собой.

Центральное место в настоящем исследовании занимает характеристика детерминанта [AßT*] S. cerevisiae и генов, опосредующих его фенотипическое проявление. Показаны прионные свойства [ЛОТ*] (нехромосомное наследование, цитоплазматическая инфекционность и способность к спонтанному возникновению de novó), охарактеризованы особенности и механизмы нонсенс-супрессии, наблюдаемой при его возникновении. Установлено, что [JV571"] вызывает снижение эффективности терминации трансляции, уменьшая количество мРНК гена SUP45. Это вызывает фенотипически детектируемую нонсенс-супрессию на фоне общих дефектов трансляции или вариантов eRF3, обладающих сниженной функциональной активностью. Выявлено влияние [MST*] на вегетативный рост дрожжей. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что [MS/] является новым прионом дрожжей S. cerevisiae.

ВЫВОДЫ

1. Детерминант [NSf] обладает плейотропным фенотипическим проявлением, вызывая нонсенс-супрессию и подавление вегетативного роста.

2. [AS/4] вызывает фенотипически детектируемую нонсенс-супрессию на фоне общих дефектов трансляции или вариантов eRF3 со сниженной функциональной активностью.

3. [А®4] вызывает снижение эффективности терминации трансляции.

4. [AK/*] обладает основными свойствами дрожжевого приона.

5. Прионный детерминант [PIN*] усиливает нонсенс-супрессию в штаммах [АЖ/].

6. Ген VTS1 регулирует эффективность терминации трансляции, а фенотипические эффекты его сверхэкспрессии сходны с фенотипическими проявлениями [AWT*].

7. Детерминант [TVS/4] вовлечен в регуляцию количества мРНК у дрожжей S. cerevisiae, что показано на примере генов SUP45 и VTS1.

8. Нонсенс-супрессия в штаммах [АФТ4] является следствием снижения количества мРНК SUP45.

9. Сверхэкспрессия генов ABF1, GLN3, FKH2, МСМ1, МОТЗ и REB1, подобно детерминанту [AS/4], вызывает нонсенс-супрессию на фоне снижения функциональной активности eRF3.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1.Нижников A.A. Кондрашкина А.М., Антонец К.С., Галкин АП. Сверхэкспрессия генов, кодирующих аспарагин-тлутамин обогащенные транскрипционные факторы, вызывает нонсенс-супрессию у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. // Экологическая генетика. 2013Б. Т. 11. С. 49-58.

2. Nizhnikov A.A.. Magomedova Z.M., Rubel АА., Kondrashkina AM., Inge-Vechtomov S.G, Galkin A.P. [AST] determinant has a pleiotropic phenotypic manifestation that is modulated by SUP35, SUP45, and VTS1 genes. // Current Genetics. 2012. V. 58. P. 35-47.

3. Нижников АА. Магомедова 3.M., Сайфитдинова А.Ф., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Выявление генов, кодирующих потенциально амилоидогенные белки, участвующих в регуляции нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Экологическая генетика. 2011. Т. 9. С. 79-86.

4. Saifitdinova AF., Nizhnikov A.A.. Lada AG, Rubel A.A, Magomedova Z.M., Ignatova VV, Inge-Vechtomov S.G, Galkin A.P. [AST*]: a novel non-Mendelian nonsense suppressor determinant in Saccharomyces cerevisiae. // Current Genetics. 2010. V. 56. P. 467^178.

Тезисные сообщения:

5. Nizhnikov A.A.. Magomedova Z.M., Kondrashkina A.M., Galkin A.P. [NSI+] determinant affects readthrough of termination codons by reducing the SUP45 mRNA amounts. // The 4th EMBO meeting. 2012. Nice, 22-25 September. Book of abstracts. 2012. V 1. P. 97.

6. Nizhnikov A.A.. A.F. Saifitdinova, A.G Lada, Z.M Magomedova, A.A. Rubel, V. V. Ignatova, S.G Inge-Vechtomov, A.P. Galkin. [NSt] - a novel prion-like determinant in Saccharomyces cerevisiae. И The 25a Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Yeast. 2011. V. 28. Supplement 1. P. 132.

7. Нижников A.A.. Галкин А.П. Выявление нового прионоподобного детерминанта [АБА] дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, сборник тезисов. 21-27 июня 2009. Москва. Т. 2. С. 158.

8. Нижниюв A.A., Магомедова З.М. Геномный скрининг для выявления гена-детерминанта прионоподобного фактора [NS1*] дрожжей Sacchammyces cerevisiae. II Материалы XVII Международной конференции студентов, аспирантов и мсиодых ученых «Ломоносов». 2010. Т. 1.С. 89.

9. Нижниюв A.A.. Галкин А.П. Поиск генов, влияющих на фенотипичесюе проявление прионоподобного фактора [AÍST] Saccharomyces cerevisiae II Биология - наука XXI века: 14-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 19 - 23 апреля 2010 года. Сборник тезисов. 2010. Т. 2. С. 163.

10. Нижников A.A.. Галкин А.П. Демонстрация инфекционных свойств прионоподобного фактора [АКТ] при помощи белковой трансформации. // Биология - наука XXI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 19-23 апреля 2010 года. Сборник тезисов. 2010. Т. 2. С. 248.

11. Нижников A.A.. Лада АХ, Сайфитдинова А.Ф., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Фактор IPIN*] дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет на феногипическое проявление детерминанта [АКТ]. // Биология - наука XXI века: 15-я Пущинская международная шкэла-конференция молодых ученых. Пущино, 18-22 апреля 2011 года. Сборник тезисов. 2011. Т. 1.С. 22.

12. Нижников A.A.. Магомедова З.М., Рубель АЛ., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Феногипическое проявление детерминанта [NSt] дрожжей Sacchammyces cerevisiae опосредовано генами SUP35 и SUP45. // Биология - наука XXI века: 15-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 18-22 апреля 2011 года. Сборник тезисов. 2011. Т. 1. С. 23.

13. Кэндрашкина А.М., Галкин А.П., Нижников A.A. Нонсенс-супрессия в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae, несущих детерминант [NSI+], опосредована снижением количества мРНК гена SUP45. // Биология - наука XXI века: 16-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 16-21 апреля 2012 года Сборник тезисов. 2012. Т. 1.С. 116.

14. Нижников A.A.. Кондрашкина А.М., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Прионоподобный детерминант [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. // Биология - наука XXI века: 16-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 16-21 апреля 2012 года. Сборник тезисов. 2012. Т. 1. С. 86-87.

15. Кондрашкина А.М., Галкин А.П., Нижников A.A. Взаимосвязь генов SUP45 и VTS1 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. // Труды П Всероссийской конференции с международным участием «Биология будущего: традиции и новации», сборник тезисов. 2012. Т. 1. С. 150-151.

Подписано в печать 19.09.13 Формат 60х84'/]б Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 16/09 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нижников, Антон Александрович, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

П / О Л 4 7ЛЧ / ¿Л

НИЖНИКОВ Антон Александрович

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО НЕХРОМОСОМНОГО ДЕТЕРМИНАНТА ДРОЖЖЕЙ ЗАССНАЯОМУСЕЗ СЕЯЕУШАЕ

специальность: 03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Галкин Алексей Петрович

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................- 6 -

Глава 1. ПРИОНЫ ВЫСШИХ И НИЗШИХ ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)....................................................................................................- 10 -

1.1 Структурные особенности и биогенез прионов: проблема инфекционности ................................................................................................................................- 101.1.1 Особенности организации амилоидных белковых полимеров...................- 10 -

1.1.2 Функциональная и патогенная роль некоторых неинфекционных амилоидов...............................................................................................................- 12 -

1.1.3 Инфекционность и репликация прионов.....................................................- 15 -

1.2 Прионы высших организмов..........................................................................- 20 -

1.2.1 Прион млекопитающих РгР..........................................................................- 20 -

1.2.2 МАУ8: функциональный амилоид или новый прион человека?................- 25 -

1.2.3 Белок СРЕВ моллюска Ар1уз1а саИ/огтса демонстрирует прионные свойства в гетерологичной системе......................................................................................- 26 -

1.3 Прионы аскомицетов......................................................................................- 27 -

1.3.1 [Н^-б] - прионный детерминант Ройоърога атегта..................................- 27 -

1.3.2 Прионные детерминанты сегеушяе.........................................................- 28 -

1.3.2.1 Прионные детерминанты [Р^/-] и [1/ЯЕЗ], критерии дрожжевых прионов Р. Викнера...................................................................................................................- 28 -

1.3.2.2 Детерминант [Р/А^] и дрожжевые прионы, выявленные в связи с его изучением...............................................................................................................- 34 -

1.3.2.2.1 Идентификация [Р/А^].............................................................................- 34 -

1.3.2.2.2 Детерминант [5Ж/].................................................................................- 36 -

1.3.2.2.3 Детерминант [ОСТкак прионная изоформа белка Сус8....................- 36 -

1.3.2.2.4 Прионные свойства Ы(3-обогащенного домена белка Ме\у1.................- 37 -

1.3.2.2.5 Детерминант [МСЮ+]...............................................................................- 38 -

1.3.2.3 Прионный детерминант [МОТЗ+]: использование МС доменов белка 8ир35 для идентификации новых прионов......................................................................- 38 -

1.3.2.4 Прионный детерминант ...................................................................- 39 -

1.3.2.5 Прионные свойства компонентов ядерного порового комплекса 5. сегеушае: прионоподобный детерминант [МиР100+].........................................- 40 -

1.3.2.6 [/?] и [ОА1С] как пример инфекционных белковых детерминантов, не обладающих амилоидными свойствами...............................................................- 40 -

1.3.2.7 Возможная биологическая роль прионов: конфликт восприятия прионов как патогенов или адаптивных факторов.............................................................- 42 -

1.3.2.8 Поиски новых прионных детерминантов Басскаготусе5 сегеушае........- 45 -

1.3.2.8.1 Анализ аминокислотной композиции как инструмент предсказания прионных и амилоидных свойств белков.............................................................- 45 -

1.3.2.8.2 Экспериментальные способы поиска прионов......................................- 47 -

1.3.2.9 Наследственные факторы & сегеушае, для которых не установлен ген-

детерминант............................................................................................................- 49 -

1.3.2.9.1 Нехромосомный детерминант [Л^/]......................................................- 50 -

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................................- 53 -

2.1 Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования..................- 53 -

2.2 Плазмиды.........................................................................................................- 59 -

2.2.1 Описание плазмид, полученных в работе....................................................- 62 -

2.3 Генетические методы......................................................................................- 66 -

2.4 Молекулярно-биологические методы............................................................- 67 -

2.4.1 Белковая трансформация..............................................................................- 74 -

2.5 Флуоресцентная микроскопия........................................................................- 76 -

2.6 Статистический анализ...................................................................................- 76 -

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................- 77 -

3.1 Анализ особенностей фенотипического проявления [АФТ4"].........................- 77 -

3.1.1 Изучение зависимости нонсенс-супрессии в штаммах [М^] от первичной последовательности и уровня экспрессии гена 51]Р35........................................- 77 -

3.1.2 Изучение взаимосвязи нонсенс-супрессии в штаммах [/УЗУ*] и эффективности трансляции...................................................................................- 82 -

3.1.3 Анализ влияния [Л^/-] на вегетативный рост дрожжей..............................- 84 -

3.2 Характеристика прионных свойств [MS/].....................................................- 85 -

3.2.1 Демонстрация инфекционных свойств [MS/] при помощи белковой трансформации.......................................................................................................- 86 -

3.2.2 Изучение спонтанного возникновения [MS/] de novo.................................- 87 -

3.2.3 Исследование наследования детерминанта [MS/] при помощи тетрадного анализа....................................................................................................................- 88 -

3.3 Анализ взаимодействия [MS/] с генами, кодирующими ранее идентифицированные прионы дрожжей..............................................................- 90 -

3.3.1 Проверка влияния на [MS1/] делеции или сверхэкспрессии генов, кодирующих ранее идентифицированные прионы S. cerevisiae.........................- 90 -

3.3.2 Изучение взаимодействия [TVS/] с детерминантом [PIN*].........................- 92 -

3.4 Поиск генов, сверхэкспрессия которых маскирует фенотипическое проявление [NSf]......................................................................................................................- 94 -

3.4.1 Геномный скрининг в штамме [MS/]...........................................................- 94 -

3.4.2 Анализ влияния гена SUP45 на нонсенс-супрессию в штаммах [MS/].....- 95 -

3.4.3 Изучение эффектов сверхэкспрессии NQ-обогащенных транскрипционных факторов гена SUP45 в штаммах [nsi]..................................................................- 97 -

3.5 Выявление генов, сверхэкспрессия которых сходна по фенотипическому проявлению с [MS/].............................................................................................- 101 -

3.5.1 Геномный скрининг в штамме [nsi]...........................................................- 102 -

3.5.2 Изучение влияния на нонсенс-супрессию сверхэкспрессии или делеции генов, кодирующих NQ-обогащенные белки, выявленных в ходе скрининга .- 104 -

3.5.3 Анализ эффектов сверхэкспрессии и делеции гена VTS1.........................- 106 -

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................- 112 -

4.1 Детерминант [MS/] обладает свойствами дрожжевого приона...................- 112 -

4.2 Проявление нонсенс-супрессии в штаммах [MS/] зависит от генов, кодирующих факторы терминации трансляции.................................................- 1144.3 Влияние детерминанта [PIN*] на проявление [MS/] как пример взаимодействия между дрожжевыми прионами................................................-117-

4.4 Ген VTS1: новый многокопийный омнипотентный супрессор нонсенс-мутаций

у дрожжей S. cerevisiae........................................................................................-1194.5 Генетические и эпигенетические регуляторы нонсенс-супрессии у S. cerevisiae

...............................................................................................................................- 121 -

4.6 Дальнейшие перспективы исследования......................................................- 124 -

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................- 127-

ВЫВОДЫ............................................................................................................- 128 -

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................- 129 -

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................- 131 -

БЛАГОДАРНОСТИ...........................................................................................-155 -

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Прионами называют белки, способные в одинаковых физиологических условиях существовать в двух или более конформациях, из которых как минимум одна обладает инфекционными свойствами. Прионизация связана с формированием упорядоченных белковых полимеров (амилоидов), образующихся за счёт образования межмолекулярных бета-структур. Помимо инфекционных амилоидов (прионов), выявлен целый ряд неинфекционных амилоидов, вызывающих летальные заболевания человека. Первый из открытых прионов, PrPSc, является летальным патогеном человека и животных [Prusiner, 1982]. Наибольшее количество прионов идентифицировано у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. У этого организма известно как минимум восемь прионов: [PS/], [URE3], [PIN"], [SWf], [OCT*], [MOT3+], [ISP+] и [MOD+] [Wickner, 1994; Derkatch et al. 1997; Du et al. 2008; Patel et al. 2009; Alberti et al. 2009; Rogoza et al. 2010; Suzuki et al. 2012]. Открытие дрожжевых прионов изменило восприятие нуклеиновых кислот в качестве единственного носителя наследственной информации, что обуславливает фундаментальную значимость их исследования. Исторически одним из первых прионов дрожжей был выявлен [PiS/] - прионная изоформа белка Sup35 [Chernoff et all993; Ter-Avanesyan et al. 1994; Wickner, 1994; Cox, 1965], выполняющего функцию фактора терминации трансляции [Zhouravleva et al. 1995; Frolova et al. 1994; Stanfield et al. 1995]. Прионизация Sup35 вызывает снижение эффективности терминации трансляции и нонсенс-супрессию - процесс считывания стоп-кодонов как значащих. В лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ был выявлен новый нехромосомный детерминант [NSf], также как и [PSf] вызывающий нонсенс-супрессию, но не являющийся прионной изоформой Sup35p. Характеристике этого детерминанта, а также комплекса генов и факторов, влияющих на его проявление, и посвящена эта диссертация. Исследование прионов дрожжей актуально не только с фундаментальной, но и прикладной

точки зрения, поскольку сегеушае являются удобным объектом для исследования молекулярных механизмов прионизации.

Степень разработанности проблемы. К настоящему времени описан ряд прионов дрожжей, разработаны теоретические модели прионизации, получены данные, демонстрирующие различия между прионами и неинфекционными амилоидами. Несмотря на крайне активное исследование прионов дрожжей 5. сегеушае, вполне очевидно, что выявленные к настоящему времени прионы составляют лишь малую часть от их общего числа, поскольку просто не существует подходов для идентификации прионов в масштабах всего протеома. Таким образом, характеристика новых прионов, а также поиск генов и факторов, влияющих на их проявление, имеет большое фундаментальное значение.

Цель и задачи исследования. Цель работы - характеристика нового нехромосомного детерминанта [Ж?/-] дрожжей cerevisiae и выявление генов, влияющих на его проявление.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Выявить этапы матричных процессов, в регуляции которых участвует нехромосомный детерминант [Л^/-].

2. Охарактеризовать проявления [Л/ЗУ*], не связанные с нонсенс-супрессией.

3. Проанализировать прионные свойства детерминанта [Л^/-].

4. Выявить гены, изменение уровня экспрессии которых влияет на проявление детерминанта [ТУХ/1-].

5. Выявить гены, эффекты сверхэкспрессии которых сходны с проявлением [N81*].

Научная новизна диссертационной работы. В рамках работы впервые охарактеризованы прионные свойства нового нехромосомного детерминанта [N81*] дрожжей X. сегеУ1Я1ае. Показано влияние [N81*] на эффективность терминации трансляции и вегетативный рост, а также участие этого детерминанта в регуляции количества мРНК некоторых генов. Выявлен ряд новых супрессоров

нонсенс-мутаций: ABF1, GLN3, FKH2, МСМ1, MOT3, REB1 и VTSJ. Впервые показано влияние приона [PIN*] на нонсенс-супрессию.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты обладают существенной фундаментальной значимостью, внося большой вклад в знание о генетических и эпигенетических регуляторах терминации трансляции у дрожжей. Также результаты работы могут иметь потенциальную прикладную значимость, так как целый ряд исследований последних лет показывают, что значительное количество наследственных заболеваний человека ассоциированы с преждевременными стоп-кодонами. Дрожжи S. cerevisiae являются одним из наиболее перспективных модельных объектов. Учитывая, что компоненты трансляционного аппарата обладают высокой эволюционной консервативностью у эукариот, выявление дрожжевых генов, влияющих на эффективность трансляции, может быть полезно для разработки подходов к терапии подобных болезней.

Результаты работы могут быть использованы при подготовке материалов лекций по курсам «Молекулярная генетика», «Частная генетика дрожжей», «Генетический контроль трансляции» и «Прионы», преподаваемым на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, а также аналогичных курсов в других университетах России.

Положения, выносимые на защиту. Детерминант [MS/] обладает свойствами дрожжевого приона и имеет плейотропное фенотипическое проявление. Нонсенс-супрессия в штаммах [MS/] связана с дефектами терминации трансляции и генами, кодирующими факторы терминации трансляции - SUP35 и SUP45. Детерминант [MS/] участвует в регуляции количества мРНК генов SUP45 и VTS1. Прион [PIN ] усиливает нонсенс-супрессию в штаммах [MS/]. Сверхэкспрессия гена VTS1 влияет на эффективность терминации трансляции. Гены ABF1, GLN3, FKH2, МСМ1, МОТЗ и REB1 являются многокопийными нонсенс-супрессорами у S. cerevisiae.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы имеют высокую степень достоверности, подтвержденную публикацией в 4 статьях в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисных сообщениях. Материалы диссертации были представлены на IV конференции европейского общества молекулярных биологов "The 4th EMBO meeting" (Ницца, Франция, 2012), XXV международной конференции по дрожжевой генетике и молекулярной биологии "XXV YGMB" (Ольштын, Польша, 2011), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, Россия, 2009), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2010), 14-16 международных конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2010, 2011, 2012 и 2013), а также на научных семинарах лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах и состоит из Введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Выводы». Работа содержит 10 таблиц, 18 рисунков, список литературы из 301 наименования.

Глава 1. ПРИОНЫ ВЫСШИХ И НИЗШИХ ЭУКАРИОТ (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ)

Одним из наиболее важных результатов настоящего исследования является демонстрация прионных свойств детерминанта [iVST*]. В связи с этим, обзор литературы посвящен анализу данных, накопленных в настоящее время по теме прионов и белковой наследственности. Особое внимание уделено прионам дрожжей S. cerevisiae.

1Л Структурные особенности и биогенез прионов: проблема инфекционности

Прионами называют белки, способные в одинаковых физиологических условиях существовать в двух или более конформациях, из которых как минимум одна обладает инфекционными свойствами [по: Alberti et al. 2009]. Большинство известных прионов обладают двумя ключевыми свойствами: способностью к образованию амилоидных агрегатов и инфекционностью. Эти особенности и рассматриваются в данном подразделе. Также приводятся наиболее существенные, на наш взгляд, данные о неинфекционных амилоидах и о взаимодействии инфекционных и неинфекционных амилоидов.

1.1.1 Особенности организации амилоидных белковых полимеров

Амилоиды представляют собой упорядоченные белковые полимеры, которые образуются из мономеров одного и того же белка за счёт формирования межмолекулярных (3-складчатых структур.

В нефизиологических условиях (in vitro, при повышенных концентрациях) значительное количество белков обладает способностью к амилоидогенезу. Некоторые белки формируют амилоидные полимеры в физиологических условиях [по: Chiti and Dobson, 2006]. Фибрилла в таких агрегатах построена из нескольких

протофиламентов [Goldsbury et al. 2005]. Мономеры в составе протофиламентов соединены водородными связями между ß-слоями, которые ориентированы перпендикулярно латеральной оси протофиламента, образуя так называемую «кросс-ß» структуру [по: Serpell et al. 1997; по: Sunde et al. 1997].

По данным нескольких коллективов авторов фибриллы амилоида-ß могут формировать до 10 различных вариантов («полиморфов») [Lansbury et al. 1995; Benzinger et al. 1998] и обладать двух- или трехсторонней симметрией [Paravastu et al. 2008; Petkova et al. 2006]. Кроме того существуют амилоидные агрегаты, получившие название сферулитов. Это крупные (до нескольких микрометров) агрегаты, образованные радиально ориентированными фибриллами. Сферулиты в специфических условиях образует, например, инсулин [по: Krebs et al., 2009].

В настоящий момент достаточно детально изучена тонкая организация амилоидов Sup35, Ure2 и Rnql. Считается, что ß-структуры в таких агрегатах расположены планарно в виде серии слоев, причем ß-структуры каждого последующего слоя расположены параллельно и в регистре [по: Wickner et al. 2010; по: Tycko et al. 2013]. Такая организация агрегатов, по-видимому, свойственна целому ряду амилоидов.

По-видимому, иным строением обладают агрегаты прионного бел�