Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Аксенова, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

АКСЕНОВА Анна Юрьевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ПОДДЕРЖАНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ПРИОНОПОДОБНОГО ДЕТЕРМИНАНТА [/SP+], У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического научно-исследовательского института СПбГУ и на кафедре биохимии и молекулярной биологии Автономного Университета г. Барселоны (ЧАВ), Испания.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук Людмила Николаевна Миронова

профессор, доктор биологических наук Борис Васильевич Симаров

кандидат биологических наук Елена Викторовна Самбук

Ведущее учреждение:

Институт экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ

Защита диссертации состоится 2006 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан " 13 " ил^Ы? 2006 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

9lОООД

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Биосинтез белка (трансляция) - сложнейший процесс, в ходе которого последовательность нуклеотидов мРНК, в соответствии с правилами генетического кода транслируется в белковую молекулу. Точность считывания триплетов является условием реализации генетической информации, однако, она не абсолютна. Исходя из принципа поливариантности матричных процессов (Инге-Вечтомов, 1969), определенный уровень неточности при считывании триплетного кода является характерным свойством белоксинтезирующего аппарата. Нарушения в работе компонентов аппарата трансляции могут дополнительно влиять на уровень ошибок трансляции, приводя к снижению или повышению ее точности.

Наиболее простой моделью для изучения точности трансляции является изучение супрессии нонсенс-мутаций, приводящих к преждевременному появлению стоп-кодона в открытой рамке считывания. Такие изменения в точности трансляции могут быть обнаружены на фенотипическом уровне, так как считывание стоп-кодонов как значащих, восстанавливает прерванный мутацией синтез белка. Более чем 40-летняя история изучения нонсенс-супрессии у дрожжей S. cerevisiae показала, что возможность и эффективность считывания стоп-кодонов как значащих у этого объекта контролируется факторами генетической и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на точность трансляции изолированы в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы терминации и элонгации трансляции.

К факторам, влияющим на точность трансляции на эпигенетическом уровне у дрожжей относят наследственные детерминанты белковой природы -прионы. Наиболее изученный прион дрожжей - [PS/*] является продуктом прионного превращения белка Sup35, фактора терминации трансляции eRF3 (Wickner, 1994). В присутствии [PST*] повышается эффективность считывания стоп-кодонов как значащих за счет снижения количества растворимого Sup35 (Paushkin et al., 1996). Другой прион - [/V7V*], необходимый для индукции [PSt] de novo, может возникать в результате прионизации И различных белков (Derkatch et al., 2001).

Еще одним эпигенетическим фактором, влияющим на считывание стоп-кодонов, является детерминант [/5/>+], который был идентифицирован в лаборатории физиологической генетики при изучении свойств мутаций в гене SUP35. [/57>+] проявляется как антисупрессор по отношению к мутациям sup35-25 и sup35-10, обладает рядом свойств, характерных для дрожжевых прионов, и способен излечиваться при воздействии универсального антиприонного агента, хлорида гуанидина (GuHCl).

Природа детерминанта [ZS'/,+] пока не известна. Для выяснения молекулярных механизмов, от которых зависит существование [ZS/>+], необходимо, прежде всего, выявить гены, влияющие на фенотипическое проявление и поддержание этого детерминанта, и установить роль этих генов в опосредованной детерминантом [7У/>+] регуляции точности тр

№&е*ИОНЛЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 2(Н^акт ¥6?

Целью исследования явилось дальнейшее изучение механизмов эпигенетической регуляции точности трансляции у дрожжей на примере детерминанта .

В ходе работы решались следующие задачи: (1) поиск и идентификация генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [75Р+]; (2) выяснение роли этих генов в регуляции точности трансляции; (3) дальнейшее исследование свойств детерминанта [ISP*].

Научная новизна исследования. Получены данные, проливающие дополнительный свет на механизмы контроля точности трансляции у дрожжей S. cerevisiae и природу эпигенетического детерминанта [ISP+], На модели, позволяющей изучать вклад факторов генетической и эпигенетической природы в возможность и эффективность прочтения стоп-кодонов как значащих, мы показали зависимость нонсенс-супрессии от активности Ser/Thr фосфатазы Z-типа Ppzl и ее регуляторной субъединицы - белка На13. Мы обнаружили, что изменение в уровнях экспрессии генов PPZ1 и HAL3 имеет противоположные эффекты на точность трансляции. При этом ген HAL3 является ключевым геном, от уровня экспрессии которого зависит фенотипическое проявление детерминанта и способность [/&Р+]

излечиваться при воздействии GuHCl. Представлены данные, свидетельствующие о том, что влияние белка На13 на проявление и свойства [ISP+] опосредовано, в основном, его взаимодействием с фосфатазой Ppzl. Показано, что [/ST**] и [isp ] штаммы содержат разное количество белка На13. В соответствии с этими данными высказана гипотеза о том, что [/&Р+]-статус клеток определяется количеством белка На13, которое поддерживается на определенном уровне эпигенетически. Кроме того, мы обнаружили, что штаммы, у которых был обнаружен детерминант помимо мутаций в

гене SUP35 несут критические мутации в гене SUP45, существенные для проявления [/5/'+]. Мы также показали, что эффективность элиминации приона [PST*], при воздействии GuHCl, зависит от гена HAL3.

Практическая ценность. Изучение механизмов генетической и эпигенетической регуляции точности трансляции имеет важное прикладное значение. Оно может способствовать разработке методов лечения ряда заболеваний человека, связанных с нарушениями трансляции. Кроме того, исследования свойств дрожжевых прионоподобных детерминантов позволяет разрабатывать удобные модели, которые могут быть использованы для создания методов диагностики и лечения прионных заболеваний млекопитающих.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II и III съездах ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2004), на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 1-м съезде Общества Клеточной Биологии (Санкт-Петербург, 2003), на 2-й конференции МОГиС "Актуальные проблемы генетики" (Москва, 2003), на XX, XXI и XXII международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Прага, Чехия

2001; Гетебург, Швеция 2003; Братислава, Словакия 2005), на конференции Europhosphatases 2005 (Кэмбридж, Великобритания 2005), на конференции Prion Biology (Хинкстон, Великобритания 2005). Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 152 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 224 наименований. Работа содержит 6 таблиц и 36 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы. В работе использованы следующие штаммы дрожжей сегеущ'ае:

2В-П3982 МАТа adel-l4hs7-l tys2-X7thr4-Bl5un6Aku2-l

10-2В-П3982 МАТа ade!-l4hs7-I ty;2-87thr4-B15игаЗЛЫ2-1 sup35-lO[ISP~} и[ир"]

4В-П4482 МАТа adel-l4hs7-l fys2-87thr4-B15ura3á !еи2-1 metí i-AI sup35-25[ISP*] и[кр]

а16-4В-П4482 MATa ade¡-14hs7-¡ fc2-87thr4-B15 игаЗЛ ku2-l metl3-Al cyh2-l sup35-25 |W>1 и \isp~\

25-25-2В-П3982 MATa<xlel-14hs7-lfyú-87th-4-B¡5im3Aleu2-lsip35-25[fiP'l и[«р'1

1A-D1628 MATa adel-14 fys2 ura3-52 trpI-289 ku2-3,112hs3 SUP45. .HIS3 (pRS316SUP451

Примечание: штаммы, содержащие антисупрессорный детерминант [ВР^Х здесь и далее в работе обозначается как [КР*], а их нонсенс-супрессорнью прощводные, полученные при воздействии GuHCL, как [ир~]

Плазмиды и библиотеки генов, использованные в работе. Геномная библиотека дрожжей S cerevisiae, сконструированая на основе вектора YCp50 (Rose et al., 1987), получена из АТСС (http://www.atcc.org). Плазмида pSUl получена путем встраивания Xbal-PstI фрагмента, содержащего ген SUP45, плазмиды pEMBLyex4-SUP45 в вектор pRS315. Плазмида pGRS45 получена из плазмиды pSUl и несет фланговые участки гена SUP45. В работе использованы мультикопийные (на основе векторов pRS426, YEplacl81, YEplacl95) и центромерные (на основе векторов pRS316, YCplaclll, YCp33) плазмиды, несущие различные аллели генов HAL3 и PPZ1, описанные ранее (Clotet et al., 1999; Muñoz et al., 2004) или сконструированные в ходе работы. В работе использованы плазмиды, несущие аллели гена TEF5 (De Nadal et al., 2001).

Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986) и стандартные среды: YAPD, полную синтетическую среду SMM, а также селективные среды не содержащие отдельных компонентов среды SMM. Для тестирования супрессии UGA -мутации lys2-87 использовали среду SMM-Lys, для тестирования супрессии UAA-мутации his7-l - среду SMM-His. Элиминацию детерминантов [/5/>+] и [PS/Ч проводили путем пересева штаммов на среде YAPD, содержащей GuHCI в концентрациях 3-5мМ. Рестрикционный анализ, гель-электорофорез, выделение плазмидной ДНК, ПЦР, секвенирование ДНК и трансформацию дрожжей проводили в соответствии со стандартными методиками (Sanger а. Coulson, 1975; Sambrook et al., 1989; Gietz et al., 1992). Для клонирования аллелей гена SUP45, находящихся в хромосоме, использовали метод "спасения аллели" (Гловер, 1988). Штаммы, несущие делеции генов HAL3, PPZ1 и PPZ2, были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием

олигонуклеотидов (Wach et al., 1994; Goldstein a. McCusker, 1999; Storici et al., 2001). Спонтанные и индуцированные частоты потери детерминанта [/■S7>+] были оценены при помощи флуктуационного теста с использованием метода упорядоченного посева (Khromov-Borisov et. al., 2002), для обработки данных использовали метод максимального правдоподобия MSS (Roshe a. Foster, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выявление генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [ZSP+].

Мутации в гене SUP35, кодирующем фактор терминации трансляции eRF3, приводят к нарушению точности трансляции; в их присутствии повышается уровень считывания всех трех типов стоп-кодонов как значащих. Идентифицированный в нашей лаборатории нехромосомный эпигенетический детерминант [/5Р+] практически полностью нейтрализует эффект мутаций sup35-25 и sup35-10, восстанавливая нарушенную точность трансляции. Антисупрессорный эффект [/Si5*] регистрируется при фенотипическом анализе проявления нонсенс-мутаций his7-l(UAA) и lys2-87(UGA). После обработки штаммов, несущих детерминант [ISP+], GuHCl происходит элиминация [ZS'/)+] и восстанавливается супрессия нонсенс-мутаций his7-l и lys2-87, характерная для мутантов sup35-25 и sup35-10.

Для идентификации генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание [/<S7>+], мы провели поиск последовательностей, представленных в центромерной дрожжевой библиотеке, внесение которых в штамм [/ЗР*] приводит (1) к появлению супрессии нонсенс-мутаций his7-l и lys2-87 или (2) индуцирует потерю [ISP+\, что проявляется как повышение частоты образования колоний вторичного роста на средах без гистидина и без лизина. В первом случае мы ожидали выявить гены, увеличение копийности которых (даже незначительное), влияет на проявление [/5Р+], а также выявить возможные криптические мутации, необходимые для проявления [/ST5*]. Во втором случае - гены, которые влияют на поддержание [ZSP+] и индуцируют его потерю.

В результате анализа ~80 000 трансформантов штамма 4В-П4482 [ZSP+] библиотекой генов, было выявлено 6 плазмид, трансформация которыми изменяла фенотип этого штамма с несупрессорного на супрессорный при тестировании роста на селективных средах без гистидина или без лизина. Среди этих плазмид оказались три идентичные плазмиды, несущие ген LYS2, которые были исключены из анализа, поскольку прототрофность по лизину у трансформантов этими плазмидами обусловлена комплементацией мутации lys2-87 аллелью дикого типа. Три другие плазмиды также несли идентичные фрагменты хромосомной ДНК и приводили к появлению супрессии обеих нонсенс-мутаций, his7-l и lys2-87, которая исчезала после потери плазмид. Мы показали, что за модификацию фенотипического проявления [/SP+] в этом случае ответственен ген SUP45, находящийся в этих плазмидах.

YCpSO-165 YCp50 _(HAL3)__(котроль)_

""НИН—

1.0&П&-5 3,56x10-7

Рисунок 1. Плазмида YCp50-165, несущая ген HAL3, повышает частоту потери [/57**] на два порядка по сравнению с контролем. Цифры под штрихами, являются частотами потери [/5/>+], определенными в каждом случае с помощью флуктуационного теста

результате скрининга центромерной библиотеки генов, мы идентифицировали два гена, влияющих на проявление и поддержание [iS'/>+] - это гены SUP45 и HAL3.

2. Штаммы [УЖР*] несут криптические мутации в гене SUP45, влияющие на фенотипическое проявление [/Si^].

Тот факт, что фенотипическое проявление [ISP+] модифицируется при внесении копии гена SUP45 на центромерной плазмиде, мог свидетельствовать о двух возможностях: (1) нуклеотидная последовательность аллели гена SUP45 из штаммов [/SP4] отличается от представленной в библиотеке генов, и это играет существенную роль в установлении фенотипического проявления |7S7>+]; (2) появление нонсенс-супрессии в штамме [ISP+] обусловлено увеличением копийности гена SUP45. Секвенирование хромосомной аллели SUP45 из штамма 4В-П4482 показало, что она отличается от аллели дикого типа SUP45 одной значащей нуклеотидной заменой (G1199T), приводящей к замещению глицина на валин в положении 400 белка eRFl. Идентичные результаты были получены при секвенировании аллели SUP45 из другого штамма - 25-25-2В-П4482. Таким образом, мутанты sup35-25, несут

дополнительную мутацию в гене SUP45, обозначенную как sup45-400. При этом влияние гена SUP45 на проявление [ISP+] не связано с увеличением копийности гена SUP45. Это было показано при трансформации штаммов [75Р+] плазмидой, несущей аллель sup45-400. У таких трансформантов не наблюдалось появление нонсенс-супрессии, в отличие от ситуации, имеющей место при трансформации плазмидой pSUl, несущей аллель дикого типа SUP45 (рисунок 2). Таким образом, аллель sup45-400 участвует в детерминации антисупрессорного фенотипа штаммов [ISP+] и ее проявление компенсируется аллелью дикого типа. Поскольку детерминант [/5Р+] обнаружен в штаммах, несущих мутации sup35-25 и sup35-

Помимо этого при скрининге геномной библиотеки была выявлена плазмида, повышающая потерю детерминанта [/5/>+] на два порядка (рисунок 1). Оказалось, что этот эффект обусловлен присутствием дополнительной копии гена НАЬЗ, находящегося в этой плазмиде. Таким образом, в

«-П4482

Iisn

4В-П44Х2 kv)

pCRS45-*np45-4M

Рисунок 2. Трансформация штамма 4В-П4482 [/£/**] плазмидой pSUl приводит к супрессии нонсенс-мутаций his7-l и Iys2-S7, которая не наблюдается при трансформации плазмидой pGRS45-sup45-400. Плазмида pGRS45 использована в качестве негативного контроля Штамм 4В-П4482 \tsp] [pGRS45] представлен в качестве контроля, иллюстрирующего рост штамма [«р'] на синтетических средах без лизина и без гистидина.

10, представляло интерес исследование структуры аллели гена SUP45 из мутанта sup35-10. Секвенирование последовательности гена SUP45 из штамма 10-2В-П3982 показало, что эта аллель также отличается от аллели дикого типа одной значащей нуклеотидной заменой (С224Т), приводящей к замене треонина на изолейцин в положении 75 белка eRFl. Однако трансформация штамма 10-2В-П3982 [ISP+] плазмидой, несущей аллель дикого типа гена SUP45, не приводила к супрессии мутаций his7-l и lys2-87. Этот результат можно объяснить тем, что мутация sup45-75 доминантна по отношению к аллели дикого типа, в отличие от sup45-400. Возможна и другая интерпретация - мутация sup45-75 не нужна для детерминации антисупрессорного фенотипа [/№*].

Более подробное исследование свойств мутаций sup45-400 и sup45-75 при введении их в штамм 1A-D1628, показало, что они не имеют собственного нонсенс-супрессорного проявления. Таким образом, несмотря на то, что эти мутации затрагивают важные в функциональном отношении участки молекулы eRFl: С-концевой участок белка, находящийся в непосредственной близости от сайта связывания с белком eRF3 (sup45-400) и участок N-домена, вовлеченный во взаимодействие со стоп-кодоном (sup45-75), эти мутации отличаются по своим свойствам от типичных мутаций по гену SUP45. Важно отметить также и то, что мутация, приводящая к замене Thr75Ile в положении 75 белка Sup45p уже была изолирована ранее как внутригенный антисупрессор.

Обобщая эти данные, можно резюмировать, что детерминация фенотипа [/5Р+] оказалась более сложной, чем это предполагалось изначально. Присутствие дополнительных мутаций sup45, по крайней мере у мутантов sup35-25, является необходимым условием формирования антисупрессорных свойств детерминанта [7S'/>+].

3. Фенотипическое проявление и стабильность детерминанта [ISP*]

Дальнейшее исследование влияния гена HAL3 на детерминант [7<£Р+]

показало, что

сверхэкспрессия этого гена оказывает сильный нонсенс-супрессорный эффект в отношении мутации lys2-87 (рисунок 3), который, тем не менее, не связан с элиминацией [/SP*], так как проявление восстанавливалось после потери

плазмид, несущих ген HAL3. Мы проанализировали влияние сверхэкспрессии гена HAL3 на фенотип штамма 2В-П3982, несущего аллели дикого типа генов SUP35 и SUP45. Отсутствие нонсенс-супрессии в этом случае позволило

зависят от уровня экспрессии гена НАЬЗ.

Рисунок 3. Сверхэкспрессия гена НАЬЗ вызывает нонсенс-супрессорный эффект в (■Ш*1'] штаммах. Фенотип трасформантов [1БР+] и [цр] -производных штамма 4В-П4482

плазмидами УЕр1ас181-НА1.3 (мультикопийная плазмида, несущая ген НАЬЗ) и УЕр1ас181 (контроль).

[/SP1

[юр-]

SMM-Lys-Leu;

заключить, что эффект сверхэкспрессии гена HAL3 в штаммах [/ST'*] обусловлен его аллосупрессорным эффектом в отношении мутации sup35-25, за счет чего и исчезает фенотипическое проявление [75Р+].

Таким образом, механизм влияния уровня экспрессии гена HAL3 на детерминант [7S'/>+] нуждался в дальнейшем исследовании.

4. Сверхэкспрессия гена PPZ1 оказывает антисупрессорный эффект в штаммах [isp'\, опосредованный каталитической функцией фосфатазы Ppzl.

Ген HAL3 кодирует негативную регуляторную субъединицу Ser/Thr фосфатаз Z-типа, представленных у дрожжей S. cerevisiae двумя белками -Ppzl и Ppz2. Фосфатазы Ppz регулируют ответ клетки на солевой стресс, также они вовлечены в регуляцию клеточного цикла и в поддержание целостности клеточной стенки (Arino, 2002). Однако во всех случаях функции фосфатазы Рисунок 4. Эффект Ppzl более существенны, сверхэкспрессии гена PPZ1 противоположен эффекту сверхэкспрессии гена HAL3. Фенотип трансформантов [ISP*] и [isp~] -производных штамма 4В-П4482

мультикопийными плазмндамн YEplacl95-HAL3, YEplacl95-PPZl и

контрольной плазмидой YEplacl95.

Учитывая эти данные, мы исследовали влияние сверхэкспрессии гена PPZ1 на фенотип штаммов [75Р+] и [isp]. Было обнаружено, что сверхэкспрессия гена PPZ1 оказывает противоположный гену HAL3 эффект на точность трансляции и приводит к антисупрессии в штаммах [isp~] (рисунок 4). Существенно, что эффект сверхэкспрессии гена PPZ1 обусловлен каталитической функцией кодируемой им фосфатазы, поскольку сверхэкспрессия мутантной аллели ppzlR451L, кодирующей каталитически

неактивный белок, не

Рисунок 5. Сверхэкспрессия мутантной аллели ppzlR451L не вызывает антисупрессорного эффекта в отличие от сверхэкспрессии аллели гена PPZ1 дикого типа. Фенотип трансформантов штамма 4В-П4482 [«р"] мультикопийными

плазмидами YEplacl95-PPZl, YEplacl95-R451L и контрольной плазмидой YEpIacl95.

чем функции Ррг2. Недавно показано, что фосфатазы Ррг могут контролировать уровень фосфорилирования фактора элонгации

трансляции еЕБШа и оказывать влияние на точность трансляции (Юе Ыаёа! е/а/., 2001).

SMM-Lyt-Ura

приводила к

антисупрессорному эффекту (рисунок 5). Таким образом, сверхпродукция фосфатазы Ррг1 повышает точность трансляции, приводя в штаммах [/$/?'] к эффекту, аналогичному присутствию детерминанта [75/>+].

5. Делеция гена НАЬЗ обладает антисупрессорным эффектом по отношению к мутации 5ир35-25 в штаммах [к/Г].

Поскольку На13 ингибирует активность Ррг1, то можно ожидать, что в отсутствие своего ингибитора фосфатаза Ррг\ будет конститутивно активна. Из этого следует, что делеция гена НАЬЗ должна оказывать эффект, аналогичный сверхэкспрессии гена РР21 - а именно, приводить к антисупрессии мутации Бир35-25. Именно это и было обнаружено в [ир ] штаммах, несущих делецию гена НАЬЗ. Кроме того, эффект делеции НАЬЗ проявляется даже в штаммах [/37,+], так как у них не наблюдается спонтанная потеря [/Я/1*].

6. Делеция гена РРг1 в \1БР*\ штаммах приводит к слабому супрессорному эффекту.

Если эффекты сверхэкспрессии и делеции гена НАЬЗ опосредованы изменением активности фосфатазы Ррг1, то можно ожидать, что последствия полной инактивации этой фосфатазы должны иметь такой же эффект как сверхэкспрессия гена НАЬЗ. Однако оказалось, что делеция гена РР21 в штаммах [/&Р+] имеет слабо выраженный нонсенс-супрессорный эффект (рисунок 6). Из этого следует, что Ррг1 является не единственной мишенью, через которую опосредованы эффекты На13 на точность трансляции. Об этом свидетельствует также наличие слабого нонсенс-супрессорного эффекта при сверхэкспрессии НАЬЗ в штаммах несущих делецию ррг!А (не

представлено). Наиболее вероятным кандидатом, который, помимо Ррг1, может опосредовать влияние На13 на точность трансляции, является фосфатаза Ррт2. Эта фосфатаза структурно сходна с Ррг1 и, как считается, дублирует многие из функций Ррг1. Тем не менее, делеция гена РР22 в штаммах [/&Р+] не имеет нонсенс-супрессорного эффекта (рисунок 6), что указывает на то, что фосфатаза Ррг2 не участвует в контроле точности трансляции.

Мы изучили также эффект делеции обоих генов PPZ1 и PPZ2 и показали, что эффективность нонсенс-супрессии у штаммов ppzlAppz2A слабее, чем обнаруженная у штамма ppzlA (рисунок 6). Однако, точная оценка их фенотипа была осложнена из-за сниженной жизнеспособности штаммов, несущих делецию обоих генов PPZ (рисунок 7). Ранее такой эффект делеции обоих генов PPZ на жизнеспособность показан не был, однако было показано, что гены PPZ являются существенными для роста при повышенной и пониженной температуре (Lee et al., 1993; Posas et al., 1995; Yenush et al., 2002).

Рисунок 6. Фенотип производных штамма 4В-П4482 [/£/**]> несущих делеции генов РРХ1 и РРг2. Одновременная делеция генов РРХ1 и РР22 вызывает очень слабый нонсенс-супрессорный эффект, оценка которого осложнена ввиду ослабленной жизнеспособности штаммов ррг1Лррг2Л и [«р"] производные штамма 4В-П4482, несущего

аллели дикого типа генов РР21 и РР22 представлены в качестве контролей

Рост штаммов на пятый день при 26°С

ppzIA [/SP+]

[/SPf

>pz2ü |/SP»]

tpz ГЛдаг2Д llSPt]

Рисунок 7. Деления обоих генов РРг снижает жизнеспособность штаммов. Рост ррг1А, ррг2А и ррг1Аррг2А производных штамма 4В-П4482 [/57>] на среде УРЭ на Зй день.

Вероятно, сочетание мутаций зир35-25 и Бир45-400 и детерминанта [/£Р+] создает условия, при которых функции фосфатаз Ррг становятся жизненно-важными даже при пермиссивной температуре.

Результаты изложенные выше, свидетельствуют, что влияние На13р на точность трансляции отчасти опосредовано фосфатазой Ррг1 и, отчасти, какой-то другой мишенью.

7. Аллосупрессорный эффект сверхпродукции белка На13 опосредован его взаимодействием с Ррг1 и ингибированием каталитической активности этой фосфатазы.

Для того чтобы определить относительный вклад взаимодействия между белками На13 и Ррг1 в регуляцию точности трансляции и проявление детерминанта [/ЗР*], мы проанализировали эффект сверхэкспрессии аллелей гена НАЬЗ, кодирующих мутантные белки, у которых снижена способность связываться с Ррг1 и ингибировать активность этой фосфатазы, в двух штаммах а16-4В-П4482 [75Р+] и 4,ЗдхЗ-а16-4В-П4482 [/5Р+] (Иа13А). При использовании обоих штаммов нами были получены идентичные результаты, свидетельствующие о том, что аллосупрессорным эффектом обладают аллели, продукты которых не утратили полностью способности связываться с Ррг1 и ингибировать активность этой фосфатазы (рисунок 8А).

SMM-Leu-Lys

Рисунок 8. Фенотип трансформантов штамма а16-4В-П4482 [МТ^] (А) и (f'sp'l (Б) мультикопнйнымн конструкциями, несущими различные аллели гена НАЬЗ. Мутации Y313D, N4661 и I480F умеренно, V390G, I446K и W452G сильно снижают способность На13 связываться с Ppzl Мутации V462A и N478D не влияют на способность На13 связываться с Ppzl, однако снижают его способность ингибировать активность этой фосфатазы Мутация E460G приводит к полной неспособности ингибировать активность Ppzl (Muñoz et al, 2004) Мультикопийные плазмиды YEp!acl81 и YEplacl81-HAL3wt были использованы в качестве контроля

Исключением из этого, однако, является обнаружение способности аллели V390G вызывать аллосупрессию, хотя показано, что эта аллель

существенно снижает способность На13 ингибировать Ppzl (Muñoz et al., 2004). Этот факт, тем не менее, согласуется с опубликованными ранее данными, где показано, что эта аллель при сверхэкспрессии ведет себя почти как аллель дикого типа (Munoz et al., 2004).

В этом же эксперименте, при использовании штаммов а!6-4В-П4482 [ZSP+] и [ир*], был оценен эффект влияния на точность трансляции мутантной аллели Н378А. Эта аллель находится в другом функциональном домене На13, чем остальные мутации, которые влияют на взаимодействие На13 с Ppzl. Она затрагивает некоторые функции белка На13, которые являются жизненно-важными на фоне делеции гена VHS3 (Munoz et al, 2004). Ген VHS3 является близким паралогом HAL3 и его продукт, подобно На13, может ингибировать активность Ppzl in vitro, однако, показано, что он имеет и ряд функций, не связанных с регулированием активности Ppzl (Ruiz et al., 2004). Сверхэкспрессия аллели Н378А в [75Р+] штамме не имела эффекта, однако, в [isp'] производном, в отличие от других использованных аллелей, приводила к антисупрессии (рисунок 8Б). Эти результаты свидетельствуют о том, что мутации, находящиеся в разных функциональных доменах На13, имеют различный эффект на точность трансляции. Более того, белок (белки) на взаимодействие с которым(и) влияет замена Н378А, по-видимому, является искомой мишенью На13, опосредующей его эффекты на точность трансляции, в дополнение к основной - Ppzl.

8. Делеция гена SAL6 не влияет на супрессию нонсенс-мутаций в штаммах [/S/*f] н [isp'].

Данные по сверхэкспрессии мутантных аллелей hal3 свидетельствуют о том, что дополнительная мишень На13 должна быть достаточно близка по структуре к Ppzl. Фосфатазы Ppzl и Ppz2 относятся к высококонсервативному семейству фосфатаз РР1, прототипом которого является фосфатаза Glc7. К этому семейству у дрожжей принадлежит также и фосфатаза Ppql, вовлеченная в контроль точности трансляции: делеция гена SAL6, кодирующего фосфатазу Ppql, приводит к аллосупрессорному эффекту в штаммах, несущих трансляционные нонсенс-супрессоры (Song a. Liebman 1987; Vincent et al., 1994). Исследовав эффект делеции гена SAL6 в штаммах а16-4В-П4482 [ISP*] и [isp'], мы не обнаружили никаких фенотипических изменений, что говорит о том, что фосфатаза Ppql не влияет на точность трансляции в данном случае и, по-видимому, никак не связана с На13-опосредованными эффектами на проявление [75/>+].

9. Сверхэкспрессия фактора элонгации трансляции eEFIBa, приводит к антисупрессии мутации sup3S-2S в штаммах [isp"].

Фактор элонгации трансляции eEFIBa является членом семейства факторов обмена GDP на GTP и участвует в регенерации фактора eEFIA, связанного с GTP, тем самым стимулируя элонгацию трансляции. У дрожжей фактор eEFIBa кодируется геном TEF5, в котором получены мутации, повышающие точность трансляции (Сагг-Schmid et al., 1999). Фосфопротеин eEFIBa является одной из мишеней действия фосфатаз Ppz. Делеция генов

PPZ, также как и сверхэкспрессия гена HAL3, приводит к повышению пула eEFIBa, фосфорилированного по аминокислотному остатку серина в положении 86 (De Nadal et al., 2001).

Я 5 Очевидно, что эффекты комплекса

Hal3-Ppzl на фенотип [75Р+] и штаммов могут быть опосредованы изменениями в уровне фосфорилирования eEFIBa и, следовательно, связаны с общей sMM-His-uraj регуляцией элонгации трансляции.

Рисунок 9. Сверхэкспрессия Подтверждением этого предположения мутаитиой аллели Jef5S86A имеет является то что сверхпродукция антисупрессорный эффект в [tsp\ _ „ .

штамме. Фенотип трансформантов мутантнОГО белка Tef5S86A, В котором штамма 4В-П4482 [isp~] аминокислотный остаток Ser86 заменен на

нефосфорилируемый аланин, приводит к антисупрессорному эффекту в [isp~] штаммах (рисунок 9). Обнаружение при сверхэкспрессии аллели дикого типа гена TEF5 эффекта, аналогичного сверхэкспрессии мутантной аллели (см. рис. 9) не опровергает это утверждение, так как при сверхпродукции фактор eEFIBa может находится преимущественно в нефосфорилированной форме.

10. [/ЖР1"] и [/.y/?] штаммы содержат разное количество белка На13.

Мы показали, что фенотип штаммов [ZS/'+] и [/s/f] зависит от уровня экспрессии гена HAL3, от активности фосфатазы Ppzl и, в конечном счете, по-видимому, от уровня фосфорилирования фактора eEFIBa. Можно предположить, что [7SP+]-статус штаммов определяется неким механизмом, который регулирует активность и(или) взаимодействие белков Hal3-Ppzl. Тогда у (7S7>+] и [йр] штаммов должны быть обнаружены различия в активности этих белков или различное количество На13 или Ppzl.

В данной работе проведен анализ количества белка На13 с помощью иммуноблоттинга и показано, что [/S/>+] и [isp ] штаммы различаются по содержанию белка На13, количество которого больше в [/sp ] штаммах, чем в [7£Р+] (рисунок 10). Основываясь на этих данных, мы высказали гипотезу, что [7iS7>+] -статус определяется количеством белка На13, поддержание которого на разном уровне у [/SF1"] и [isp ] штаммов регулируется неким эпигенетическим механизмом. Вполне вероятно, что этим механизмом может оказаться классический прионный механизм, обуславливающий прионизацию белка (белков), регулирующего экспрессию гена HAL3 на транскрипционном или посттранскрипционном уровне. Наряду с этим объяснением, можно предложить и другое: что фенотип [7S/>+] не имеет классической прионной детерминации и модифицируется под действием GuHCl, который индуцирует увеличение количества белка На13 и, соответственно, приводит к появлению штаммов [is/>"].

Рнсунок 10. Штаммы [ISF*\ содержат меньшее количество белка На13 по сравнению со штаммами \isp~].

Количество белка На13 у и [isp~] производных штамма 4В-П4482 определено с помощью Вестерн-гибридизации с поликлональными антителами на На13 Результат Вестерн-гибридизации с антителами на актин представлен в качестве контроля.

10. Делеция гена HAL3 приводит к гиперчувствительности штаммов к GuHCl и блокирует способность детерминанта [/5/>f] элиминироваться под действием этого агента.

Различие между штаммами [ISP+] и [is/)"] в количестве белка На13, помимо влияния на точность трансляции, имеет и другие последствия. Мы обнаружили, что рост [7SP+] штаммов, по сравнению с [юр*], ингибирован на средах, содержащих GuHCl в концентрации 5мМ и более. При этом штаммы hal3A также проявляют более высокую чувствительность к GuHCl, чем штаммы несущие аллель дикого типа HAL3 (рисунок 11). Большая чувствительность штаммов [7SP+] к GuHCl может быть поэтому объяснена более низким, по сравнению с [isp], содержанием НаВ.

Эти факты указывают на то, что излечивание при воздействии GuHCl может быть зависимо от гена HAL3, который является важным детерминантом солеустойчивости (Ferrando et al., 1995). Действительно, мы показали, что штаммы /га/ЗД [ISP+] неспособны приобретать фенотип [ир"] при воздействии GuHCl, причем это обусловлено сохранением в них детерминанта [/5Р+]. Последнее было подтверждено при скрещивании этих штаммов со штаммом HAL3wt [isp"]. Фенотип таких гибридов был несупрессорным, т.е. [/5Р+].

Чувствительность штаммов [7SP+] к GuHCl и способность изменять фенотип с несупрессорного на супрессорный связана с регуляторными функциями НаВ по отношению к Ppzl. Это было выявлено при трансформации hal3A [ISP*] штамма плазмидами, несущими различные аллели гена HAL3, описанные в разделе 7 (см. также рисунок 8). Так, трансформанты аллелями N4661, I446K, W452G, V462A, N478D и E460G демонстрировали повышенную чувствительность к действию GuHCl, как и штаммы hal3A, и не приобретали нонсенс-супрессорного фенотипа после пассирования на среде с GuHCl. Можно предположить, что увеличение количества белка НаВ, происходящее в результате воздействия GuHCl, и последствия этого увеличения для активности Ppzl, являются факторами, обуславливающим возможность элиминации [7SP+] и детерминирующим нонсенс-супрессорный фенотип штаммов [«/?'].

Выявленное отличие в чувствительности штаммов [75Р+] и [is/?*] к GuHCl является существенным фактом, поскольку может означать, что в

IISPf] [isp.]

4mM 5mM emM

YAPD ала GuHCl GuHCl

Рисунок 11. Штаммы несущие делению гена НАЬЗ имеют чувствительный к виНС! фенотип. На рисунке также видна разница между и

[»/>"] производными штамма 4В-П4482, несущими интактный ген НАЬЗ.

действительности GuHCl индуцирует не потерю [75/>+], а селекцию клеток [isp"\, случайно утративших этот детерминант. Тем не менее излечивающий эффект GuHCl в отношении детерминанта [75Р+] был показан нами во флуктуационном тесте. Оказалось, что в присутствии GuHCl частота потери [ISP+] повышена по сравнению с частотой его спонтанной потери в -40 раз. Таким образом, механизм превращения штаммов [75,/>+] в штаммы [«/?"] под воздействием GuHCl связан не только с селекцией спонтанно возникающих [ир'] клеток, содержащих большее количество белка На13.

11. Штаммы \isp'\ более устойчивы, по сравнению со штаммами [ISP*], к аминогликозидным антибиотикам и хлориду лития.

Как отмечалось выше, комплекс Hal3-Ppzl является одним из основных регуляторных звеньев ответа клетки на солевой стресс. Известно также, что делеция гена PPZ1 приводит к возникновению устойчивости штаммов к солям лития, натрия, аминогликозидным антибиотикам, а также к ряду токсических соединений, таких как спермин и тетраметиламоний (Arino, 2002). Обсуждается возможность того, что некоторые из этих эффектов обусловлены изменениями в значениях мембранного потенциала, что влияет на транспорт перечисленных соединений внутрь клетки. Если штаммы [75Р+] и [/'sp'] различаются по активности фосфатазы Ppzl, то логично предположить что они должны демонстрировать различную устойчивость к солям лития, а также к агентам, которые могут проникать внутрь клетки за счет мембранного потенциала. Мы подтвердили это предположение при анализе роста [757>+] и [/5/?"] штаммов в присутствии хлорида лития и аминогликозидных

антибиотиков. Как видно из рисунка 12, штаммы [isp] являются более устойчивыми к действию этих соединений, что подтверждает вывод о том, что в [isp] штаммах активность фосфатазы Ppzl ниже, чем в штаммах [7&Р+]. Таким образом, различия в [ТЖР^-статусе штаммов, помимо различий в уровне точности трансляции, обуславливают ряд плейотропных эффектов, связанных с поддержанием ионного гомеостаза и физиологическим состоянием клетки.

12. Делеция гена HAL3 снижает эффективность излечивания хлоридом гуанидина фактора [PS/*].

На сегодняшний день ключевым детерминантом, опосредующим излечивание [T'.ST*] хлоридом гуанидина, считается шаперон Hspl04. Активность этого шаперона необходима для поддержания [PSt]\ GuHCl ингибирует АТФазную активность Hspl04, вследствие чего и происходит элиминация [7'57+]. Поддержание детерминанта [ISP+] не зависит от функций

G418 (мкг/мл) - 20 30

НудгоВ(мкг/мл) - 60 80

LiCI (mM) - 40 80

[КР1 ['5Р"1

Рисунок 12. Штаммы [«/)"] более устойчивы, по сравнению со штаммами к действию

аминогликозидных антибиотиков генетицина (С418), гигромицина (Ь^гоВ) и иС1. Представлен рост [75Р+] и [/у/] производных штамма 4В-П4482 на серии сред, приготовленных на основе УАРО.

шаперона Hspl04 (Volkov et al., 2002) и как мы показали в данной работе, излечивание [/S/>+] при воздействии GuHCl зависит от белка На13. Мы рассмотрели возможность того, что элиминация [ASV^] под действием GuHCl также может быть На13-зависимой и исследовали эффект делеции гена HAL3 на излечиваемость [PSt] в штамме GT81-1D, полученном в работе Chernoff et al., 1999. Оказалось, что элиминация [PS/*] при воздействии GuHCl у такого штамма существенно замедлена (рисунок 13).

Таким образом, На13 представляет собой еще одну мишень, которая опосредует действие GuHCl на дрожжевые прионы. Механизм, посредством которого делеция гена HAL3 может препятствовать эффективной элиминации [PS/"] при действии GuHCl пока не выяснен. Тем не менее, можно Рисунок 13. Делеция гена HAL3 предполагать, что происходящее при препятствует эффективной элиминации воздействии GuHCl увеличение фактора I PSt] при воздействии GuHCl. количества белка На13 влияет на агрегацию Sup35, прионной формой которого является фактор [PS/*]. Это может быть обусловлено изменениями в уровне фосфорилирования каких-либо белков, необходимых для поддержания [М.Г] или самого белка Sup35.

Заключение. Какова молекулярная природа детерминанта [/ST**] и механизм, за счет которого в присутствии [ISP+\ происходит восстановление точности трансляции у мутантов по гену SUP351 Как мы показали, комбинация определенных мутаций sup35 и sup45 является существенной для установления антисупрессорного фенотипа штаммов [ISP+]. На этом фоне важным компонентом, который может определять [/5'Р+]-статус штаммов является количество белка На13, т.к. штаммы [ISP*] и [isp"\ различаются по количеству белка На13. Можно полагать, что за существование ответственен некий эпигенетический механизм, позволяющий регулировать количество белка На13 и поддерживать его на определенном уровне. Как уже обсуждалось выше, этим механизмом может являться классический прионный механизм. С другой стороны, изменения [/^Р+]-статуса штаммов могут происходить и в результате специфического действия GuHCl, не связанного с элиминацией прионной формы какого-либо белка. Важнейшим вопросом, который вытекает из такого предположения, является вопрос о механизме, посредством которого может поддерживаться состояние [isp"\ в ряду митотических поколений. Вне зависимости от того, какое из этих предположений верно, механизм излечивания детерминанта [ISP+] представляется как GuHCl-опосредованное увеличение количества белка На13, приводящее к усилению нарушения терминации трансляции в результате аллосупрессорного (по отношению к мутациям sup35) эффекта. Мы показали, что действие На13 опосредовано, в основном, каталитической функцией фосфатазы Ppzl и в конечном счете, оно может быть обусловлено изменением

в уровне фосфорилнрования фактора элонгации трансляции eEFIBa. Таким образом, обнаруженные нами эффекты, по-видимому, отражают взаимодействия между компонентами систем терминации и элонгации трансляции у дрожжей.

ВЫВОДЫ.

1. Скрининг дрожжевой центромерной библиотеки генов показал, что поддержание и проявление антисупрессорного нехромосомного детерминанта [ZSP+] зависит от генов SUP45 и HAL3.

2. Показано, что проявление детерминанта зависит от аллелеспецифичного взаимодействия мутаций sup35 и sup45.

3. Показано, что эффект гена HAL3 зависит от его дозы. В низкокопийном состоянии он индуцирует потерю в мультикопийном состоянии -усиливает нарушение терминации трансляции за счет аллосупрессорного эффекта по отношению к мутации sup35. Делеция гена HAL3 в [ир"] штаммах приводит к антисупрессии.

4. Показано, что влияние HAL3 на точность трансляции опосредовано, в основном, его взаимодействием с фосфатазой Ppzl. Зависимость точности трансляции от взаимодействия белков На13 и Ppzl показана впервые.

5. Получены данные, свидетельствующие о существовании дополнительной мишени На13, взаимодействие с которой влияет на точность трансляции.

6. Показано, что делеция гена SAL6, кодирующего фосфатазу Ppql, вовлеченную в контроль точности трансляции, не влияет на фенотип [75Р+] и [up] штаммов.

7. Получены данные, косвенно свидетельствующие в пользу того, что точность трансляции у дрожжей зависит от уровня фосфорилнрования фактора элонгации трансляции eEFIBa, регулируемого комплексом Hal3-Ppzl.

8. Показано, что [75/>+] и [isp~] штаммы содержат разное количество белка На13 и предложена гипотеза, согласно которой различный уровень белка На13 в [ISP+] и [isp"\ штаммах поддерживается эпигенетически, а излечивание [7£Р+] является следствием индуцированного GuHCl увеличения количества белка На13.

9. Показано, что делеция гена HAL3 приводит к чувствительности к GuHCl и блокирует излечивание [/ST**] GuHCl. Чувствительность к действию GuHCl проявляют и штаммы, несущие мутантные аллели hal3, кодирующие белки, не способные взаимодействовать с фосфатазой Ppzl или ингибировать ее активность.

10. Показано, что [/SP*] штаммы более чувствительны, по сравнению с [isp~] штаммами, к действию GuHCl, а также к действию высоких концентраций LiCl и к аминогликозидным антибиотикам, что, по-видимому, обусловлено более низким количеством белка На13 у этих штаммов.

11. Получены данные, свидетельствующие о том, что элиминация приона [PSf ] при воздействии GuHCl также зависит от белка На13.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Volkov КV, Aksenova A.Yu., Soom MJ, Osipov KV, Svitin AV, Kurischko C, Shkundina I S , Ter Avanesyan M D, Inge-Vechtomov S G , Mironova L N Novel Non-Mendelian Determinant Involved in the Control of Translation Accuracy in Saccharomyces cerevisiae H Genetics 2002. V. 160. P. 25-36

2 Аксенова А.Ю., Волков K.B , Озил М., Терентьев Я Ю , Миронова Л Н Характеристика f прионоподобного детерминанта дрожжей, проявляющего антисупрессорный эффект по отношению к мутантным аллелям гена SUP35 // Тезисы докл II Съезда ВОГиС Санкт-Петербург. 2000. С. 86.

3. Volkov К V, Aksenova A.Yu., Soom М J., Osipov K.V., Svitin A.V, Shkundina I.S., Inge-Vechtomov S G, Mironova L N. The third prion-like determinant involved in the control of translation accuracy in Saccharomyces cerevisiae'' // Abstracts of the XXth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Prague, 2001 Yeast V. 18 P 70.

4 Аксенова А.Ю, Волков К В., Свитин А В., Миронова Л Н , Шкундина И С. Новые свойства прионоподобного детерминанта дрожжей [ISP*], участвующего в регуляции точности трансляции // III съезд Биохимического общества Санкт-Петербург. 26 июня - 1 июля 2002 С. 3

5. Волков К В , Аксенова А.Ю., Свитин А В , Миронова Л Н Прионный контроль точности трансляции у дрожжей' антисупрессорный прионоподобный детерминант [/SP*] // Материалы 2й конференции МОГиС "Актуальные проблемы генетики", Москва. 20-21 февраля 2003. С. 68.

6 Aksenova A.Yu., Volkov К V, Svitin А V , Mironova L N The use of centromeric gene library for identification of genes responsible for the [/S7>+] prion-like determinant maintenance // XXI International conference on yeast genetics and molecular biology, Gothenburg, Sweden 7-12 of July 2003 Yeast V. 20. P. 291.

7. Volkov К V , Aksenova A.Yu., Rodionova S A, Mironova L N Search for the prion-like

determinant host gene using the yeast insertion library // XXI International conference on yeast genetics and molecular biology, Gothenburg, Sweden July 7-12 2003 Yeast V 20 P 299

8 Волков К В , Родионова С А , Аксенова А.Ю., Миронова Л Н Идентификация гена SFP1 в качестве гена, контролирующего поддержание прионоподобного детерминанта дрожжей [й'/>+] // 1-й съезд Общества Клеточной Биологии Санкт-Петербург. 14-16 октября 2003. Цитология, Т. 48 С 857-858

9 Миронова Л Н , Волков К В , Аксенова А.Ю., Осипов К В , Свитин А В Эпигенетический (прионный) контроль проявления мутаций в генах SUP35 и SUP45 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Л Тезисы III съезда ВОГиС. Москва 2004. Т 2. С 216

10 Волков К В , Аксенова А.Ю., Родионова С.А, Гиль Ю П, Рогоза Т.М , Бурдаева Я В., Миронова ЛН Характеристика генетической системы, контролирующей поддержание и проявление дрожжевого приона [/SP*] // Тезисы III съезда ВОГиС. Москва, 2004 Т 1 С. 354.

11. Aksenova A.Yu., Munoz I, Volkov K.V., Arino J., Mironova L.N. Manifestation and propagation of prion-like antisuppressor determinant [/5/>+] in Saccharomyces cerevisiae depend on SIS2 gene functions. XXIIth YGM Conference, Bratislava, Slovak Republic. 7-12 of August 2005. Yeast. V. 22. P 124

12 Rovinskii N S , Aksenova A.Yu., Mironova L.N Manifestation of the prion like determinant [/5/>+] depends on mutations in SUP45 gene // XXIIth YGM Conference, Bratislava, Slovak Republic 712 of August 2005. Yeast. V. 22. P.125. '

13 Aksenova A.Yu., Munoz I, Volkov К V., Arino J, Mironova LN. The SIS2 gene affects manifestation and propagation of yeast prion-like determinants // Joint Cold Spring Harbor Laboratory/Welcome Trust Conference "Prion Biology", Hinxton, UK 7-11 of September 2005, P i 72.

14 Aksenova A.Yu., Munoz I, Volkov К V, Anno J, Mironova LN Ppzl-related and unrelated functions of SIS2 gene in manifestation and propagation of the prion-like antisuppressor determinant [AST*] of Saccharomyces cerevisiae // FMBO Confcrence/FFBS Workshop Furophosphatases 2005, Churchill College. Cambridge 10-14 of July 2005 P 95

t 1

I I

ДСЮС(У

1«Ь79 ^1 16 7 9

Подписано в печать 04.05.06 Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аксенова, Анна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ОБЕСПЕЧЕНИИ ТОЧНОСТИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ.

1.1. Характеристика процесса трансляции и типы ошибок, возникающих в ходе трансляции.

1.2. Генетический контроль точности трансляции. Факторы, влияющие на считывание стоп кодонов.

1.2.1. Роль мутантных и естественных нонсенс-супрессорных тРНК в считывании стоп-кодонов.

1.2.2. Роль факторов терминации в распознавании стоп-кодонов.

1.2.3. Роль рРНК и рибосомных белков в поддержании точности трансляции.

1.2.4. Роль факторов элонгации трансляции в поддержании точности трансляции.

1.2.5. Роль компонентов системы деградации?содержащих нонсенс-мутации мРНК?в поддержании точности трансляции.

1.2.6. Роль белка РаЫ в поддержании точности трансляции.

1.2.7. Влияние тоннельного белка рибосомы Rpl39 и связанных с рибосомой шаперонов на точность трансляции.

1.2.8. Роль белков цитоскелета в регуляции точности трансляции. Новые функции факторов терминации трансляции.

1.2.9. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодонов.

1.3. Эпигенетический контроль точности трансляции.

1.3.1. Фактор [.PSf ] и его влияние на точность трансляции.

Молекулярно-генетический и биохимический анализ свойств агрегатов белка Sup35.

1.3.2. Белок-белковые взаимодействия Sup35 - влияние на поддержание и свойства фактора

1.3.3. Взаимодействие фактора [Р57+] с другими прионами.

1.3.4. Эпигенетический детерминант [/5!Р+], вовлеченный в контроль точности трансляции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Трансляция последовательности триплетов мРНК в последовательность аминокислот в белке, осуществляемая в соответствии с правилами генетического кода, является важнейшим этапом реализации генетической информации. Точность считывания триплетов - необходимое условие этого процесса, однако, известно, что она не абсолютна. Исходя из принципа поливариантности матричных процессов, сформулированного С.Г. Инге-Вечтомовым почти 40 лет назад (Инге-Вечтомов, 1969), определенный уровень неточности и неоднозначности при считывании триплетного кода является характерным свойством белоксинтезирующего аппарата. Нарушения в работе компонентов аппарата трансляции могут дополнительно влиять на уровень возникновения ошибок трансляции, приводя к снижению ее точности или, наоборот, повышению.

Более чем 40-летняя история изучения нонсенс-супрессии у дрожжей S. cerevisiae показала, что возможность и эффективность считывания стоп-кодонов как значащих у этого объекта контролируется факторами генетической и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на считывание стоп-кодонов, было изолировано в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы терминации и элонгации трансляции. К факторам, влияющим на считывание стоп-кодонов на эпигенетическом уровне^относят наследственные детерминанты белковой природы - прионы. Наиболее изученный прион дрожжей является продуктом прионного превращения белка Sup35, фактора терминации трансляции eRF3 (см.

Wickner et al., 1999). В присутствии [PS/*] повышается эффективность считывания стоп-кодонов как значащих за счет снижения количества растворимого белка Sup35 (Paushkin et al., 1996). Другой прион - [PIN*] также косвенно вовлечен в контроль точности трансляции, поскольку необходим для индукции [PiST*] de novo (Derkatch et al., 1997). Показано, что [PIN*] может появляться в клетке в результате прионизации 11 различных белков (Derkatch et al., 2001). Один из этих белков - иге2ргявляется структурным белком еще одного приона дрожжей - [URE3], который участвует в контроле метаболизма азота (см. Wickner et al., 1999).

На точность трансляции влияют также некоторые нехромосомные эпигенетические детерминанты, природа которых пока не известна. Один из них, детерминант [/<£Р+], был идентифицирован в лаборатории физиологической генетики при изучении свойств мутаций sup35: он практически полностью нейтрализует эффект мутаций sup35-10 и sup35-25, восстанавливая нарушенную точность трансляции (Волков, 2000). [75Р+] обладает рядом свойств, характерных для дрожжевых прионов,и способен излечиваться при воздействии универсального антиприонного агента, хлорида гуанидина (GuHCl). Тем не менее, прямых доказательств того, что [/ЯР4] может являться еще одним прионом дрожжей пока не получено.

Данная работа посвящена дальнейшему изучению механизмов эпигенетической регуляции точности трансляции у дрожжей на примере детерминанта [/iSP+].

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Аксенова, Анна Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Скрининг дрожжевой центромерной библиотеки генов показал, что поддержание и проявление антисупрессорного нехромосомного детерминанта [ISP+] зависит от генов SUP45 и HAL3.

2. Показано, что проявление детерминанта [ISP+] зависит от аллелеспецифичного взаимодействия мутаций sup35 и sup45.

3. Показано, что эффект гена HAL3 зависит от его дозы. В низкокопийном состоянии он индуцирует потерю [ISP+], в мультикопийном состоянии -усиливает нарушение терминации трансляции за счет аллосупрессорного эффекта по отношению к мутации sup35. Делеция гена HAL3 в [isp'] штаммах приводит к антисупрессии.

6. Показано, что делеция гена SAL6, кодирующего фосфатазу Ppql, вовлеченную в контроль точности трансляции, не влияет на фенотип [ZS'/>+] и [isp'] штаммов.

7. Получены данные, косвенно свидетельствующие в пользу того, что точность трансляции у дрожжей зависит от уровня фосфорилирования фактора элонгации трансляции eEFlBa, регулируемого комплексом Hal3-Ppzl.

8. Показано, что [/SP*] и [isp'] штаммы содержат разное количество белка На13 и предложена гипотеза, согласно которой различный уровень белка На13 в [/SP*] и [isp'] штаммах поддерживается эпигенетически, а излечивание [ZST^] является следствием индуцированного GuHCl увеличения количества белка На13.

9. Показано, что делеция гена HAL3 приводит к чувствительности к GuHCl и блокирует излечивание [/<SP+] GuHCI. Чувствительность к действию GuHCI проявляют и штаммы, несущие мутантные аллели hal3, кодирующие белки, не способные взаимодействовать с фосфатазой Ppzl или ингибировать ее активность.

10. Показано, что [/<SP+] штаммы более чувствительны, по сравнению с [isp'] штаммами, к действию GuHCI, а также к действию высоких концентраций LiCl и к аминогликозидным антибиотикам, что, по-видимому, обусловлено более низким количеством белка На13 у этих штаммов.

11. Получены данные, свидетельствующие о том, что элиминация приона [PS/*] при воздействии GuHCI также зависит от белка На13.

1.4. Заключение

Как обсуждалось выше, точность трансляции находится под сложным генетическим и эпигенетическим контролем. Кроме того, точность трансляции зависит и от воздействия факторов окружающей среды, таких как температура, антибиотики (в частности аминогликозидные антибиотики), повышенные или пониженные концентрации определенных катионов.

В настоящее время достигнут определенный прогресс в изучении точности трансляции на прокариотических моделях и у низших эукариот. Однако, многие механизмы, обеспечивающие оптимальную точность трансляции в различных условиях до сих пор мало или практически полностью не изучены. Особенный интерес представляют механизмы позволяющие регулировать точность синтеза белка на эпигенетическом уровне, поскольку они могут лежать в основе модификационной изменчивости.

В связи с этим, перспективными представляются исследования направленные на изучение свойств признаков неменделевской природы, связанных с регуляцией точности трансляции. Один из таких детерминантов [/£Р+], как уже отмечалось выше, проявляется как антисупрессор по отношению к мутациям sup35. Ряд свойств [/«SP4] свидетельствует, что он может быть еще одним прионом дрожжей, однако прямых доказательств этого нет. Для того, чтобы выяснить молекулярную природу [ZS!P+], необходимо, в первую очередь, идентифицировать гены, влияющие на фенотипическое проявление и поддержание этого детерминанта.

Целью данного исследования явилось дальнейшее изучение механизмов эпигенетической регуляции точности трансляции у дрожжей на примере детерминанта [/57>+].

В задачи работы входил поиск и идентификация генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [/5!Р+]; выяснение роли этих генов в регуляции точности трансляции; дальнейшее исследование свойств детерминанта [/57>+].

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы

В работе, в основном, использовали штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий (ПГЛ), а также сегреганты диплоидов - продуктов гибридизации штаммов ПГЛ со штаммами, полученными из других лабораторий. Генотипы штаммов приведены в таблице 1.

В работе использовали штаммы Echerichia coli XL 1-Blue и DH5a (Sambrook et al., 1989).

2.2. Плазмиды и библиотеки генов

В работе использована геномная библиотека дрожжей S. cerevisiae приобретенная в American Type Culture Collection (http://www.atcc.org). Она создана на основе центромерного вектора УСр50 (рисунок 1) и содержит фрагменты геномной ДНК дрожжей размером около 10 т.п.н. (Rose et al., 1987).

Рисунок 1. Физическая карта плазмиды YCp50.

АРГ - ген устойчивости к ампициллину; ТСГ- ген устойчивости к тетрациклину; CEN4 -участок дрожжевой центромеры; ARS1 - дрожжевой ориджин репликации; URA3 -дрожжевой ген URA3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аксенова, Анна Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Андрианова В.М., Миронова Л.Н., Инге-Вечтомов С.Г.полудоминантной супрессорной мутацией // Вестник ЛГУ. 1973. Сер. 9. Вып. 2. С. 130-135.

2. Борхсениус А.С., Инге-Вечтомов С.Г. О роли генов SUP35 и в контроле клеточного цикла дрожжей-сахаромицетов // Доклады РАН. 1997. Т. 353. С. 553-556.

3. Волков К.В., Ильмов Е.А., Инге-Вечтомов С.Г., Миронова Л.Н. Свойства мутантного фактора Р57. прионоподобного элемента дрожжей // Доклады РАН. 1997. Т. 357. С. 123-125.

4. Волков К.В. Новый прионоподобный детерминант дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вовлеченный в контроль трансляции: Диссертация на соискание уч. степ, кандидата биол. наук. СПб., 2000. 125 с.

5. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. Биометрия. Л.: Изд.ЛГУ, 1982. 264 с.

6. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука., 1984. 143с.

7. Инге-Вечтомов С.Г. Точность реализации генетической информации // Вестник АН СССР. 1969. Т. 8. С. 25 30.

8. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. // Генетика. 1970. Т. 6. С. 103-115.

9. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супрессоры у дрожжей//Генетика. 1970. Т.6.№11. С. 103-115. 10. Клонирование ДНК. Методы. // под ред. Гловера М: Мир. 1988. 538 р.

10. Температурочувствительностьдрожжей,обусловленная

11. Миронова J1.H., Тер-Аванесян М.Д. Циклогексимидзависимые мутанты у дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Генетика. 1983. Т. 19. С. 1925-1933.

12. Миронова JT.H. Генетический и эпигенетический контроль считывания стоп-кодонов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae: Диссертация на соискание уч. степ. Доктора биол. наук. СПб., 2002. 240 с.

13. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Генетический контроль синтеза белка. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та., 1988. 295с.

14. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975.296 с.

15. Alksne L.E., Anthony R.A., Liebman S.W., Warner J.R. An accuracy center in the ribosome conserved over 2 billion years // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V.90.P. 9538-9541.

16. Amrani N., Ganesan R., Kervestin S., Mangus D.A., Ghosh S., Jacobson A. A faux 3-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay //Nature. 2004. V.432. P. 112-118.

17. Anand M., Chakraburtty K., Marton M.J., Hinnebusch A.G., Kinzy T.G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3 // J Biol Chem. 2003. V.278. P. 6985-6991.

18. Andersen G.R., Pedersen L., Valente L., Chatterjee I., Kinzy T.G., Kjeldgaard M., Nyborg J. Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in the yeast elongation factor complex eEFlA:eEFlBalpha // Mol Cell. 2000. V.6. P. 1261-1266.

19. Andersen G.R., Nyborg J. Structural studies of eukaryotic elongation factors // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2001. V.66. P. 425-437.

20. Andersen G.R., Nissen P., Nyborg J. Elongation factors in protein biosynthesis // Trends Biochem Sci. 2003. V.28. P. 434-441.

21. Anthony R.A., Liebman S.W. Alterations in ribosomal protein RPS28 can diversely affect translational accuracy in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. 1995. V.140.P. 1247-1258.

22. Arino J. Novel protein phosphatases in yeast // Eur J Biochem. 2002. V.269. P. 1072-1077.

23. Arkov A.L., Freistroffer D.V., Ehrenberg M., Murgola E.J. Mutations in RNAs of both ribosomal subunits cause defects in translation termination // Embo J. 1998. V.17. P. 1507-1514.

24. Baker K.E., Parker R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression // Curr Opin Cell Biol. 2004. V.16. P. 293-299.

25. Beier H., Grimm M. Misreading of termination codons in eukaryotes by natural nonsense suppressor tRNAs // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. P. 4767-4782.

26. Belgrader P., Cheng J., Maquat L.E. Evidence to implicate translation by ribosomes in the mechanism by which nonsense codons reduce the nuclear level of human triosephosphate isomerase mRNA // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V.90. P. 482-486.

27. Berezikov E., Guryev V., Van De Belt J., Wienholds E., Plasterk R.H., Cuppen E. Phylogenetic shadowing and computational identification of human microRNA genes // Cell. 2005. V.120. P. 21-24.

28. Bertram G., Bell H.A., Ritchie D.W., Fullerton G., Stansfield I. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition // Rna. 2000. V.6. P. 1236-1247.

29. Bonetti В., Fu L., Moon J., Bedwell D.M. The efficiency of translation termination is determined by a synergistic interplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae II J Mol Biol. 1995. V.251.P. 334-345.

30. Borchsenius A.S., Tchourikova A.A., Inge-Vechtomov S.G. Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae И Curr Genet. 2000. V.37. P. 285-291.

31. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976. V.72. P. 248-254.

32. Breining P., Piepersberg W. Yeast omnipotent suppressor SUP1 (SUP45): nucleotide sequence of the wildtype and a mutant gene // Nucleic Acids Res. 1986. V. 11. P. 5187-5197.

33. Buckingham R.H. Codon context and protein synthesis: enhancements of the genetic code // Biochimie. 1994. V.76. P. 351-354.

34. Buckingham R.H., Grentzmann G., Kisselev L. Polypeptide chain release factors //Mol Microbiol. 1997. V.24. P. 449-456.

35. Carr-Schmid A., Valente L., Loik V.I., Williams Т., Starita L.M., Kinzy T.G. Mutations in elongation factor lbeta, a guanine nucleotide exchange factor, enhance translational fidelity // Mol Cell Biol. 1999b. V.19. P. 5257-5266.

36. Chacinska A., Szczesniak В., Kochneva-Pervukhova N.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Boguta M. Ssbl chaperone is a PSf. prion-curing factor // Curr Genet. 2001. V.39. P. 62-67.

37. Chavatte L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., Favre A. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome // Embo J. 2002. V.21. P. 5302-5311.

38. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr Genet. 1993. V.24. P. 268-270.

39. Chernoff Y.O., Vincent A., Liebman S.W. Mutations in eukaryotic 18S ribosomal RNA affect translational fidelity and resistance to aminoglycoside antibiotics // Embo J. 1994. V.13. P. 906-913.

40. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono В., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PSf. // Science. 1995. V.268. P. 880-884.

41. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PSf. prion // Mol Cell Biol. 1999. V.19. P. 81038112.

42. Clotet J., Posas F., De Nadal E., Arino J. The NH2-terminal extension of protein phosphatase PPZ1 has an essential functional role // J Biol Chem. 1996. V.271.P. 26349-26355.

43. Clotet J., Gari E., Aldea M., Arino J. The yeast ser/thr phosphatases Sit4 and Ppzl play opposite roles in regulation of the cell cycle // Mol Cell Biol. 1999. V.19. P. 2408-2415.

44. Condeelis J. Elongation factor 1 alpha, translation and the cytoskeleton // Trends Biochem Sci. 1995. V.20. P. 169-170.

45. Cox B.S. Psi, a cytoplasmic supperssor of supersuppressors in yeast // Heredity. 1965. V. 20. P. 505-521.

46. Cox B. S. Allosuppressors in yeast // Genet. Res. 1977. V. 30. P. 187-205.

47. Cox B.S., Tuite M.F., Mundy C.J. Reversion from suppression to nonsuppression in SUQ5 PS/. strains of yeast: the classificaion of mutations // Genetics. 1980. V.95. P.589-609.

48. Culbertson M.R., Leeds P.F. Looking at mRNA decay pathways through the window of molecular evolution // Curr Opin Genet Dev. 2003. V.13. P. 207214.

49. Culbertson M.R., Neeno-Eckwall E. Transcript selection and the recruitment of mRNA decay factors for NMD in Saccharomyces cerevisiae II Rna. 2005. V.ll.P. 1333-1339.

50. Czaplinski K., Majlesi N., Banerjee Т., Peltz S.W. Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency // Rna. 2000. V.6. P. 730-743.

51. De Nadal E., Fadden R.P., Ruiz A., Haystead Т., Arino J. A role for the Ppz Ser/Thr protein phosphatases in the regulation of translation elongation factor IB alpha// J Biol Chem. 2001. V.276. P. 14829-14834.

52. De Pace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion//Cell. 1998. V.93.P. 1241-1252.

53. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of PS/. prion factors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. V.144. P. 1375-1386.

54. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PS7*. prion in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1997. V.147. P. 507-519.

55. Derkatch I.L., Bradley M.E., Liebman S.W. Overexpression of the SUP45 gene encoding a Sup35p-binding protein inhibits the induction of the de novo appearance of the PSI*. prion I I Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V.95. P. 2400-2405.

56. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of PSI*. and [PIN*]: a two-prion system in yeast? // Embo J. 2000. V.19. P. 1942-1952.

57. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of PIN*. II Cell. 2001. V.106. P. 171182.

58. Doel S.M., Mccready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2-mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. 1994. V.137. P. 659-670.

59. Dong H., Kurland C.G. Ribosome mutants with altered accuracy translate with reduced processivity // J Mol Biol. 1995. V.248. P. 551-561.

60. Dube P., Wieske M., Stark H., Schatz M., Stahl J., Zemlin F., Lutsch G., Van Heel M. The 80S rat liver ribosome at 25 A resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution // Structure. 1998. V.6. P. 389-399.

61. Edelman I., Culbertson M.R. Exceptional codon recognition by the glutamine tRNAs in Saccharomyces cerevisiae II Embo J. 1991. V. 10. P. 1481-1491.

62. Eggertsson G., Soil D. Transfer ribonucleic acid-mediated suppression of termination codons in Escherichia coli II Microbiol Rev. 1988. V.52. P. 354374.

63. Espinosa-Ruiz A., Belles J.M., Serrano R., Culianez-Macia F.A. Arabidopsis thaliana AtHAL3: a flavoprotein related to salt and osmotic tolerance and plant growth // Plant J. 1999. V.20. P. 529-539.

64. Ferrando A., Kron S.J., Rios G., Fink G.R., Serrano R. Regulation of cation transport in Saccharomyces cerevisiae by the salt tolerance gene HAL3 II Mol Cell Biol. 1995. V.15. P. 5470-5481.

65. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F. The elimination of the yeast PST. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation // Mol Microbiol. 2001. V.40. P. 1357-1369.

66. Frolova L., Seit-Nebi A., Kisselev L. Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl // Rna. 2002. V.8.P. 129-136.

67. Gallie D.R. A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation // Gene. 1998. V.216.P. 1-11.

68. Gautschi M., Mun A., Ross S., Rospert S. A functional chaperone triad on the yeast ribosome // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V.99. P. 4209-4214.

69. Gietz R.D., Sugino A. New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites // Gene. 1988. V.74. P. 527-534.

70. Gietz D., St Jean A., Woods R.A., Schiestl R.H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells //Nucleic Acids Res. 1992. V.20. P. 1425.

71. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PST*., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae // Cell. 1997. V.89. P. 811-819.

72. Goldstein A.L., Mccusker J.H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1999. V.15. P. 15411553.

73. Gozalbo D., Hohmann S. Nonsense suppressors partially revert the decrease of the mRNA level of a nonsense mutant allele in yeast // Curr Genet. 1990. V.17. P. 77-79.

74. Hatfield D.L., Smith D.W., Lee B.J., Worland P.J., Oroszlan S. Structure and function of suppressor tRNAs in higher eukaryotes // Crit Rev Biochem Mol Biol. 1990. V.25.P. 71-96.

75. He F., Li X., Spatrick P., Casillo R., Dong S., Jacobson A. Genome-wide analysis of mRNAs regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mRNA decay pathways in yeast // Mol Cell. 2003. V.12. P. 1439-1452.

76. Hiraga K., Suzuki K., Tsuchiya E., Miyakawa T. Cloning and characterization of the elongation factor EF-1 beta homologue of Saccharomyces cerevisiae. EF-1 beta is essential for growth // FEBS Lett. 1993. V.316. P. 165-169.

77. Hirokawa G., Demeshkina N., Iwakura N., Kaji H., Kaji A. The ribosome-recycling step: consensus or controversy? // Trends Biochem Sci. 2006. V.31. P. 143-149.

78. Hirsh D. Tryptophan transfer RNA as the UGA suppressor // J Mol Biol. 1971. V.58. P. 439-458.

79. Hosoda N., Kobayashi Т., Uchida N., Funakoshi Y., Kikuchi Y., Hoshino S., Katada T. Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation // J Biol Chem. 2003. V.278. P. 38287-38291.

80. Hughes D. Mutant forms of tufA and tufB independently suppress nonsense mutations // J Mol Biol. 1987. V. 197. P. 611 -615.

81. Hughes D., Atkins J.F., Thompson S. Mutants of elongation factor Tu promote ribosomal frameshifting and nonsense readthrough // Embo J. 1987. V.6. P. 4235-4239.

82. Inge-Vechtomov S.G., Ilmov E.A., Mironova L.N., Tikchomirova V.L., Volkov K.V., Zadorsky S.P. Yeast approach to protein "prionization": SUP35-P.S7*. system // In: Prions and Brain Diseases in Animals and Humans. 1998. Plenum Press. N.Y. P. 99-109.

83. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., Philippe M. Eukaryotic release factors (eRFs) history // Biol Cell. 2003. V.95. P. 195-209.

84. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V.96. P. 23-28.

85. Ito K., Ebihara K., Uno M., Nakamura Y. Conserved motifs in prokaryotic and eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. P. 5443-5448.

86. Ito K., Ebihara K., Nakamura Y. The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast // Rna. 1998. V.4. P. 958-972.

87. Jacobson A., Peltz S.W. Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells // Annu Rev Biochem. 1996. V.65. P. 693739.

88. Janssen G.M., Maessen G.D., Amons R., Moller W. Phosphorylation of elongation factor 1 p by an endogenous kinase affects its catalytic nucleotide exchange activity//J Biol Chem. 1988. V.263. P. 11063-11066.

89. Janssen G.M., Moller W. Kinetic studies on the role of elongation factors 1 beta and 1 gamma in protein synthesis // J Biol Chem. 1988. V.263. P. 17731778.

90. Jones G.W., Song Y., Masison D.C. Deletion of the Hsp70 chaperone gene SSB causes hypersensitivity to guanidine toxicity and curing of the PSf. prion by increasing guanidine uptake in yeast // Mol Genet Genomics. 2003. V.269. P. 304-311.

91. Jung G., Masison D.C. Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions // Curr Microbiol. 2001. V.43. P. 7-10.

92. Kahvejian A., Roy G., Sonenberg N. The mRNA closed-loop model: the function of PABP and PABP-interacting proteins in mRNA translation // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2001. V.66. P. 293-300.

93. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1994. 234 p.

94. Kandl K.A., Munshi R., Ortiz P.A., Andersen G.R., Kinzy T.G., Adams A.E. Identification of a role for actin in translational fidelity in yeast // Mol Genet Genomics. 2002. V.268. P. 10-18.

95. Kawakami К., Nakamura Y. Autogenous suppression of an opal mutation in the gene encoding peptide chain release factor 2 // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V.87. P. 8432-8436.

96. Keeling K.M., Lanier J., Du M., Salas-Marco J., Gao L., Kaenjak-Angeletti A., Bedwell D.M. Leaky termination at premature stop codons antagonizes nonsense-mediated mRNA decay in S. cerevisiae II Rna. 2004. V.10. P. 691703.

97. Khromov-Borisov, N.N., Saffi, J., Henriques, J.A.P. Perfect order plating: principle and applications // Technical Tips Online 2002. V. 1. P. T02638

98. Kikuchi Y., Shimatake H., Kikuchi A. A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain//Embo J. 1988. V.7. P. 1175-1182.

99. Kim S.Y., Craig E.A. Broad sensitivity of Saccharomyces cerevisiae lacking ribosome-associated chaperone ssb or zuol to cations, including aminoglycosides // Eukaryot Cell. 2005. V.4. P. 82-89.

100. King C.Y., Tittmann P., Gross H., Gebert R., Aebi M., Wuthrich K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V.94. P. 6618-6622.

101. Kinzy T.G., Ripmaster T.L., Woolford J.L., Jr. Multiple genes encode the translation elongation factor EF-1 gamma in Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Res. 1994. V.22. P. 2703-2707.

102. Kisselev L.L., Buckingham R.H. Translational termination comes of age // Trends Biochem Sci. 2000. V.25. P. 561-566.

103. Klaholz В .P., Pape Т., Zavialov A.V., Myasnikov A.G., Orlova E.V., Vestergaard В., Ehrenberg M., Van Heel M. Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2 // Nature. 2003. V.421. P. 90-94.

104. Klaholz B.P., Myasnikov A.G., Van Heel M. Visualization of release factor 3 on the ribosome during termination of protein synthesis // Nature. 2004. V.427. P. 862-865.

105. Kobayashi Т., Funakoshi Y., Hoshino S., Katada T. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay //J Biol Chem. 2004. V.279. P. 45693-45700.

106. Kong C., Ito K., Walsh M.A., Wada M., Liu Y., Kumar S„ Barford D., Nakamura Y., Song H. Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe II Mol Cell. 2004. V.14. P. 233-245.

107. Kopelowitz J., Натре C., Goldman R., Reches M., Engelberg-Kulka H. Influence of codon context on UGA suppression and readthrough // J Mol Biol. 1992. V.225.P. 261-269.

108. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. Yeast PS/1". prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 // J Biol Chem. 2003. V.278. P. 49636-49643.

109. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1988. V.66. P. 45-54.

110. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions //Cell. 1998. V.94. P. 13-16.

111. Kushnirov V.V., Kryndushkin D.S., Boguta M., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Chaperones that cure yeast artificial PS1/. and their prion-spe'cific effects // Curr Biol. 2000. V.10. P. 1443-1446.

112. Lewis B.P., Burge C.B., Bartel D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. 2005. V.120. P. 15-20.

113. Liang H., Wong J.Y., Bao Q., Cavalcanti A.R., Landweber L.F. Decoding the decoding region: analysis of eukaryotic release factor (eRFl) stop codon-binding residues // J Mol Evol. 2005. V.60. P. 337-344.

114. Liebman S.W., Sherman F. Inhibition of growth by amber suppressors in yeast // Genetics. 1976. V.82. P. 233-249.

115. Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast // Nature. 1999. V.400. P. 573-576.

116. Liu R., Liebman S.W. A translational fidelity mutation in the universally conserved sarcin/ricin domain of 25S yeast ribosomal RNA // Rna. 1996. V.2. P. 254-263.

117. Maderazo A.B., He F., Mangus D.A., Jacobson A. Upflp control of nonsense mRNA translation is regulated by Nmd2p and Upf3p // Mol Cell Biol. 2000. V.20.P. 4591-4603.

118. Madrid R., Gomez M.J., Ramos J., Rodriguez-Navarro A. Ectopic potassium uptake in trkl trk2 mutants of Saccharomyces cerevisiae correlates with a highly hyperpolarized membrane potential // J Biol Chem. 1998. V.273. P. 14838-14844.

119. Marintchev A., Wagner G. Translation initiation: structures, mechanisms and evolution // Q Rev Biophys. 2004. V.37. P. 197-284.

120. Matsumoto S., Mizoguchi Т., Oizumi N., Tsuruga M., Shinozaki K., Taira H., Ejiri S. Analysis of phosphorylation of wheat elongation factor 1 p and P' by casein kinase II // Biosci Biotechnol Biochem. 1993. V.57. P. 1740-1742.

121. McReady S.J., Cox B.S. Antisuppressors in yeast // Mol.Gen.Genet. 1973 V.124. P.305-320.

122. Merkulova T.I., Frolova L.Y., Lazar M., Camonis J., Kisselev L.L. C-terminal domains of human translation termination factors eRF 1 and eRF3 mediate their in vivo interaction // FEBS Lett. 1999. V.443. P. 41-47.

123. Michelitsch M.D., Weissman J.S. A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V.97. P. 11910-11915.

124. Mironova L.N., Provorov N.A., Ter-Avanesyan M.D., Inge-Vechtomov S.G., Smirnov V.N., Surguchov A.P. The effect of paromomycin on the expression of ribosomal suppressors in yeast // Curr. Genet. 1982 V. 5. P. 149-152.

125. Mironova L.N., Samsonova M.G., Zhouravleva G.A., Kulikov V.N., Soom M.J. Reversions to respiratory competence of omnipotent sup45 suppressor mutants may be caused by secondary sup45 mutations. // Curr Genet. 1995. V. 27, P. 195-200.

126. Moffat J.G., Tate W.P. A single proteolytic cleavage in release factor 2 stabilizes ribosome binding and abolishes peptidyl-tRNA hydrolysis activity // J Biol Chem. 1994. V.269. P. 18899-18903.

127. Munoz I., Ruiz A., Marquina M., Barcelo A., Albert A., Arino J. Functional characterization of the yeast Ppzl phosphatase inhibitory subunit Hal3: a mutagenesis study //J Biol Chem. 2004. V.279. P. 42619-42627.

128. Murgola E.J. tRNA, suppression, and the code // Annu Rev Genet. 1985. V.19. P. 57-80.

129. Na S., Perlin D.S., Seto-Young D., Wang G., Haber J.E. Characterization of yeast plasma membrane H(+)-ATPase mutant pmal-A135V and its revertants //J Biol Chem. 1993. V.268. P. 11792-11797.

130. Namy O., Hatin I., Rousset J.P. Impact of the six nucleotides downstream of the stop codon on translation termination // EMBO Rep. 2001. V.2. P. 787-793.

131. Namy O., Hatin I., Stahl G., Liu H., Barnay S., Bidou L., Rousset J.P. Gene overexpression as a tool for identifying new trans-acting factors involved in translation termination in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2002. V.161. P. 585-594.

132. Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Lindquist S.L., Chernoff Y.O. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing // Mol Cell Biol. 1999. V.19. P. 1325-1333.

133. Nilsson J., Nissen P. Elongation factors on the ribosome // Curr Opin Struct Biol. 2005. V.15.P. 349-354.

134. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F., Nyborg J. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog // Science. 1995. V.270. P. 1464-1472.

135. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis // Science. 2000. V.289. P. 920930.

136. Osherovich L.Z., Weissman J.S. Multiple Gln/Asn-rich prion domains confer susceptibility to induction of the yeast PS/. prion // Cell. 2001. V.106. P. 183-194.

137. Panopoulos P., Dresios J., Synetos D. Biochemical evidence of translational infidelity and decreased peptidyltransferase activity by a sarcin/ricin domain mutation of yeast 25S rRNA // Nucleic Acids Res. 2004. V.32. P. 5398-5408.

138. Pape Т., Wintermeyer W., Rodnina M. Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome // Embo J. 1999. V.18. P. 3800-3807.

139. Parent S.A., Fenimore C.M., Bostian K.A. Vector systems for the expression, analysis and cloning of DNA sequences in S. cerevisiae II Yeast. 1985. V.l. P. 83-138.

140. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. V.273. P. 622-626.

141. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like PS/. determinant is mediated by oligomerization of the St/P^-encoded polypeptide chain release factor // Embo J. 1996. V.15. P. 3127-3134.

142. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation // Mol Cell Biol. 1997a. V.17. P. 2798-2805.

143. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science. 1997b. V.277. P. 381-383.

144. Peltz S.W., Brown A.H., Jacobson A. mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on at least three cis-acting sequence elements and one trans-acting factor // Genes Dev. 1993. V.7. P. 1737-1754.

145. Perlin D.S., Brown C.L., Haber J.E. Membrane potential defect in hygromycin B-resistant pmal mutants of Saccharomyces cerevisiae II J Biol Chem. 1988. V.263.P. 18118-18122.

146. Peters H.I., Chang Y.W., Traugh J.A. Phosphorylation of elongation factor 1 (EF-1) by protein kinase С stimulates GDP/GTP-exchange activity // Eur J Biochem. 1995. V.234. P. 550-556.

147. Petersen C.P., Bordeleau M.E., Pelletier J., Sharp P.A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells // Mol Cell. 2006. V.21. P. 533542.

148. Phillips-Jones M.K., Hill L.S., Atkinson J., Martin R. Context effects on misreading and suppression at UAG codons in human cells // Mol Cell Biol. 1995. V.15.P. 6593-6600.

149. Posas F., Camps M., Arino J. The Ppz protein phosphatases are important determinants of salt tolerance in yeast cells // J Biol Chem. 1995. V.270. P. 13036-13041.

150. Rajkowitsch L., Vilela C., Berthelot K., Ramirez C.V., Mccarthy J.E. Reinitiation and recycling are distinct processes occurring downstream of translation termination in yeast // J Mol Biol. 2004. V.335. P. 71-85.

151. Rakwalska M., Rospert S. The ribosome-bound chaperones RAC and Ssbl/2p are required for accurate translation in Saccharomyces cerevisiae // Mol Cell Biol. 2004. V.24. P. 9186-9197.

152. Ramakrishnan V. Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. V.108.P. 557-572.

153. Roberts B.T., Wickner R.B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation // Genes Dev. 2003. V.17. P. 2083-2087.

154. Roberts B.T., Wickner R.B. A new kind of prion: a modified protein necessary for its own modification // Cell Cycle. 2004. V.3. P. 100-103.

155. Rosche W.A., Foster P.L. Determining mutation rates in bacterial populations //Methods. 2000. V.20. P. 4-17.

156. Rose M.D., Novick P., Thomas J.H., Botstein D., Fink G.R. A Saccharomyces cerevisiae genomic plasmid bank based on a centromere-containing shuttle vector//Gene. 1987. V.60. P. 237-243.

157. Rospert S. Ribosome function: governing the fate of a nascent polypeptide // Curr Biol. 2004. V.14. P. R386-388.

158. Rospert S., Rakwalska M., Dubaquie Y. Polypeptide chain termination and stop codon readthrough on eukaryotic ribosomes // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2005. P.

159. Salas-Marco J., Bedwell D.M. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination // Mol Cell Biol. 2004. V.24. P. 7769-7778.

160. Salnikova A.B., Kryndushkin D.S., Smirnov V.N., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids // J Biol Chem. 2005. V.280. P. 8808-8812.

161. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 723 p.

162. Sandbaken M.G., Culbertson M.R. Mutations in elongation factor EF-1 alpha affect the frequency of frameshifting and amino acid misincorporation in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1988. V.120. P. 923-934.

163. Sherman F., Fink, G.R. Hincks, J.B. Methods in yeast genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1986. 367p.

164. Shkundina I.S., Kushnirov V.V., Tuite M.F., Ter-Avanesyan M.D. The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast Sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants // Genetics. 2006. V.172. P. 827-835.

165. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1989. V.122. P. 19-27.

166. Smith M.W., Meskauskas A., Wang P., Sergiev P.V., Dinman J.D. Saturation mutagenesis of 5S rRNA in Saccharomyces cerevisiae II Mol Cell Biol. 2001. V.21.P. 8264-8275.

167. Song J.M., Liebman S.W. Allosuppressors that enhance the efficiency of omnipotent suppressors in Saccharomyces cerevisiae I I Genetics. 1987. V.l 15. P. 451-460.

168. Spahn C.M., Beckmann R., Eswar N., Penczek P.A., Sali A., Blobel G., Frank J. Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae—iRNA-ribosome and subunit-subunit interactions // Cell. 2001. V.l07. P. 373-386.

169. Storici F., Lewis L.K., Resnick M.A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides//Nat Biotechnol. 2001. V.19. P. 773-776.

170. Tanaka M., Chien P., Naber N., Cooke R., Weissman J.S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences // Nature. 2004. V.428. P. 323-328.

171. Tapio S., Kurland C.G. Mutant EF-Tu increases missense error in vitro // Mol Gen Genet. 1986. V.205. P. 186-188.

172. Ter-Avanesyan M.D., Zimmermann J., Inge-Vechtomov S.G., Sudarikov A.B., Smirnov V.N., Surguchov A.P. Ribosomal recessive suppressors cause a respiratory deficiency in yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet. 1982. V.185. P. 319-323.

173. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from PiST*. to \psi] in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1981. V.98. P.691-711.

174. Uchida N., Hoshino S., Imataka H., Sonenberg N., Katada T. A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-dependent translation // J Biol Chem. 2002. V.277. P. 5028650292.

175. Uptain S.M., Lindquist S. Prions as protein-based genetic elements // Annu Rev Microbiol. 2002. V.56. P. 703-741.

176. Urakov V.N., Valouev I.A., Lewitin E.I., Paushkin S.V., Kosorukov V.S., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae II BMC Mol Biol. 2001. V.2. P. 9.

177. Uritani M., Miyazaki M. Role of yeast peptide elongation factor 3 (EF-3) at the AA-tRNA binding step //J Biochem (Tokyo). 1988. V.104. P. 118-126.

178. Valencia-Sanchez M.A., Liu J., Hannon G.J., Parker R. Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs // Genes Dev. 2006. V.20. P. 515-524.

179. Valente L., Kinzy T.G. Yeast as a sensor of factors affecting the accuracy of protein synthesis // Cell Mol Life Sci. 2003. V.60. P. 2115-2130.

180. Valouev I.A., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation // Cell Motil Cytoskeleton. 2002. V.52. P. 161-173.

181. Velichutina I.V., Dresios J., Hong J.Y., Li C., Mankin A., Synetos D., Liebman S.W. Mutations in helix 27 of the yeast Saccharomyces cerevisiae 18S rRNA affect the function of the decoding center of the ribosome // Rna. 2000. V.6. P. 1174-1184.

182. Velichutina I.V., Hong J.Y., Mesecar A.D., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic interaction between yeast Saccharomyces cerevisiae release factors and the decoding region of 18 S rRNA // J Mol Biol. 2001. V.305. P. 715-727.

183. Venturi G.M., Bloecher A., Williams-Hart Т., Tatchell K. Genetic interactions between GLC7, PPZ1 and PPZ2 in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2000. V.155.P. 69-83.

184. Vijgenboom E., Vink Т., Kraal В., Bosch L. Mutants of the elongation factor EF-Tu, a new class of nonsense suppressors // Embo J. 1985. V.4. P. 10491052.

185. Vincent A., Newnam G., Liebman S.W. The yeast translational allosuppressor, SAL6: a new member of the PPl-like phosphatase family with a long serine-rich N-terminal extension // Genetics. 1994. V.138. P. 597-608.

186. Wach A., Brachat A., Pohlmann R., Philippsen P. New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1994. V.10. P. 1793-1808.

187. Wakem L.P., Sherman F. Isolation and characterization of omnipotent suppressors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. II Genetics. 1990. V. 124, P. 515-522.

188. Wang W., Czaplinski K., Rao Y., Peltz S.W. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts // Embo J. 2001. V.20. P. 880-890.

189. Wegrzyn R.D., Bapat K., Newnam G.P., Zink A.D., Chernoff Y.O. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast // Mol Cell Biol. 2001. V.21. P. 4656-4669.

190. Wells S.E., Hillner P.E., Vale R.D., Sachs A.B. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors // Mol Cell. 1998. V.2. P. 135-140.

191. Wickner R.B. URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae // Science. 1994. V.264. P. 566-569.

192. Wickner R.B., Taylor K.L., Edskes H.K., Maddelein M.L., Moriyama H., Roberts B.T. Prions in Saccharomyces and Podospora spp:. protein-based inheritance // Microbiol Mol Biol Rev. 1999. V.63. P. 844-861, table of contents.

193. Wickner R.B., Edskes H.K., Roberts B.T., Pierce M., Baxa U. Prions of yeast as epigenetic phenomena: high protein "copy number" inducing protein "silencing" //Adv Genet. 2002. V.46. P. 485-525.

194. Wintermeyer W., Peske F., Beringer M., Gromadski K.B., Savelsbergh A., Rodnina M.V. Mechanisms of elongation on the ribosome: dynamics of a macromolecular machine // Biochem Soc Trans. 2004. V.32. P. 733-737.

195. Xie X., Lu J., Kulbokas E.J., Golub T.R., Mootha V., Lindblad-Toh K., Lander E.S., Kellis M. Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 31 UTRs by comparison of several mammals // Nature. 2005. V.434. P. 338-345.

196. Yenush L., Mulet J.M., Arino J., Serrano R. The Ppz protein phosphatases are key regulators of K+ and pH homeostasis: implications for salt tolerance, cell wall integrity and cell cycle progression // Embo J. 2002. V.21. P. 920-929.

197. Yenush L., Merchan S., Holmes J., Serrano R. pH-Responsive, posttranslational regulation of the Trkl potassium transporter by the type 1-related Ppzl phosphatase // Mol Cell Biol. 2005. V.25. P. 8683-8692.

198. Young C.S., Cox B.S. Extrachromosomal elements in a super-suppression system of yeast. II. Relations with other extrachromosomal elements // Heredity. 1972. V.28. P.189-199.

199. Zerfass K., Beier H. Pseudouridine in the anticodon G psi A of plant cytoplasmic tRNATyr is required for UAG and UAA suppression in the TMV-specific context //Nucleic Acids Res. 1992a. V.20. P. 5911-5918.

200. Zerfass K., Beier H. The leaky UGA termination codon of tobacco rattle virus RNA is suppressed by tobacco chloroplast and cytoplasmic tRNAsTrp with CmCA anticodon//Embo J. 1992b. V.ll. P. 4167-4173.

201. Zuk D., Belk J.P., Jacobson A. Temperature-sensitive mutations in the Saccharomyces cerevisiae MRT4, GRC5, SLA2 and THS1 genes result in defects in mRNA turnover // Genetics. 1999. V.153. P. 35-47.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Аксенова, Анна Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы