Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фосфатаза PPZ1P и эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Фосфатаза PPZ1P и эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
Иванов Максим Сергеевич
ФОСФАТАЗА РР21Р И ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОНСЕНС-СУПРЕССИИ У ДРОЖЖЕЙ &4ССНАВ-ОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ
Специальность 03.00.15- генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
- 3 0К1
¿низ
Санкт-Петербург 2009
Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.
Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук
Людмила Николаевна Миронова
Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук
Михаил Давидович Тер-Аванесян
кандидат биологических наук Ольга Всеволодовна Невзглядова
Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский
институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН
Защита диссертации состоится 43« г/ 2009 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета
Автореферат разослан СУ 2009 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д.212.232.12 кандидат биологических наук
Л. А. Мамон
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Считывание триплетов мРНК аппаратом белкового синтеза в соответствии с генетическим кодом - основополагающее свойство живой клетки, обеспечивающее ее стабильное функционирование. Как и другие матричные процессы, трансляция характеризуется некоторым уровнем неточного считывания, в результате которого может происходить переосмысление значащих триплетов, считывание стоп-кодонов как значащих, сдвиг рамки считывания. В соответствии с принципом поливариантности матричных процессов, способность к прочтению одного и того же триплета более чем одним способом является неотъемлемым свойством белок-синтезирующей системы клетки (Инге-Вечтомов, 1969).
Наиболее простой моделью для изучения генетического контроля точности трансляции является изучение супрессии понсенс-мутаций, приводящих к появлению преждевременного стоп-кодона в открытой рамке считывания. Такие изменения в точности трансляции могут быть обнаружены на фенотипическом уровне, так как считывание сгоп-кодонов как значащих восстанавливает синтез полноразмерного белка, прерванный нонсенс-мутацией. Увеличение или уменьшение эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов может быть вызвано факторами как генетической, так и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на эффективность нонсенс-супрессии, изолированы в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы элонгации и терминации трансляции (см. Valente a. Kinzy, 2003). Хорошо изученным примером эпигенетического фактора, приводящего к усилению нонсенс-супрессии, является дрожжевой прион [PSt] - продукт прионного превращения фактора терминации eRF3 (Sup35p) (Сох, 1965; Wickner et al, 1995).
Многие белки, прямо или косвенно участвующие в трансляции, являются фосфобелками, и их функциональная активность регулируется специфическими киназами и фосфатазами. Для некоторых из этих белков показано, что уровень их фосфорилированности оказывает влияние на процесс трансляции. Например, фосфорилирование а-субъединицы фактора инициации трансляции IF-2 киназой Gcn2p снижает эффективность инициации трансляции в ответ на некоторые стрессовые условия (Hinnebusch, 1993). Фосфорилирование белков PO, Р1 и Р2, входящих в состав "стебля" рибосомы, оказывает влияние на трансляцию некоторых мРНК (Zambrano et al., 1997). Фосфорилирование белка UpOp оказывает влияние на функционирование системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (Wang et al., 2006). Таким образом, изменение уровня экспрессии определенных киназ и фосфатаз может влиять на работу аппарата трансляции.
Действительно, показано, что в генетический контроль трансляции у дрожжей вовлечены гомологичные фосфатазы Ppzlp и Ppqlp. Делеция гена
PPQ1 приводит к аллосупрессии, а сверхэкспрессия - к антисупрессии на фоне различных нонсенс-супрессорных факторов (Vincent et al., 1994). Деления гена PPZ1 приводит к увеличению частоты считывания стоп-кодонов как значащих в 3-4 раза (de Nadal et al., 2001). Роль фосфатазы PPZ1 в регуляции эффективности нонсенс-супрессии была также подтверждена в нашей лаборатории в ходе исследования антисупрессорного прионоподобного детерминанта [/£Р+]. Было показано, что изменение уровня экспрессии гена PPZ1 (а также гена HAL3, кодирующего негативную регуляторную субъединицу Ppzlp) влияет на проявление детерминанта [ISP+] (Aksenova et al., 2007). Кроме того, было показано, что сверхэкспрессия и делеция генов HAL3 и PPZ1 влияют на эффективность нонсенс-супрессии и в [ísp"] штаммах. Эти данные подтверждают участие белкового комплекса Hal3/Ppzlp в контроле считывания стоп-кодонов.
Однако механизмы влияния этой и других фосфатаз на считывание стоп-кодонов в настоящее время практически не изучены. В частности, неизвестны белки-мишени фосфатазной активности Ppzlp и Ppqlp, участвующие в трансляции.
В связи с этим целью исследования явилось изучение связи между фосфатазой Ppzlp и эффективностью нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В ходе работы решались следующие задачи: (1) изучение влияния фосфатазы Ppzlp на проявление нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45; (2) изучение влияния фосфатазы Ppzlp и ее регуляторной субъединицы На13р на проявление фактора [PS/^]; (3) выяснение роли гомологичной фосфатазы Ppz2p в генетическом контроле считывания стоп-кодонов; (4) поиск белков-мишеней фосфатазы Ppzlp, опосредующих влияние этой фосфатазы на считывание стоп-кодонов.
Научная новизна исследования. Получены дополнительные данные, проливающие свет на механизмы влияния фосфатазы Ppzlp на эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов. Показана зависимость проявления некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [PS/"] от уровня экспрессии гена PPZ1. Также мы показали, что проявление фактора [PS/1-] зависит и от уровня экспрессии гена PPZ2, кодирующего фосфатазу Ppz2p. При этом влияние гена HAL3 на проявление фактора [PST*] обусловлено ингибированием фосфатазной активности как Ppzlp, так и Ppz2p. Получены данные, свидетельствующие о том, что дефосфорилирование фактора элонгации EFIBa (Tef5p) фосфатазой Ppzlp играет минорную роль в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1. В соответствии с этими данными высказана гипотеза о том, что влияние Ppzlp на эффективность нонсенс-супрессии опосредовано дефосфорилированием как минимум двух фосфобелков, участвующих в трансляции - EFIBa и какого-то другого белка, в настоящее время остающегося
неизвестным. В связи с этим были проверены предположения о возможной роли ряда фосфобелков, связанных с трансляцией, в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1: (1) фактора терминации eRFl (Sup45p); (2) белков Upflp и Upf2p, участвующих в нонсенс-зависимой деградации мРНК; (3) белка Slalp; и (4) шаперонов Ssblp и Ssb2p. Показано, что эти белки не являются мишенами фосфатазной активности Ppzlp. Тем не менее, показано, что двойная делеция генов SSB1 и SSB2 блокирует аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии мутантной аллели ppzl-R451L, кодирующей каталитически неактивный белок Ppzlp. На основании этих данных высказано предположение о том, что фосфатаза Ppzlp может оказывать влияние на функционирование аппарата трансляции за счет взаимодействия с шаперонами Ssblp и Ssb2p, причем это взаимодействие на связано с фосфатазной активностью Ppzlp.
Практическая ценность. В настоящее время известно значительное количество наследственных заболеваний человека, обусловленных нарушениями в работе трансляционного аппарата клетки (синдром Уолкотта-Раллисона, лейкоэнцефалопатия, хроническая миелоидная лейкемия и др.) (см. Calkhoven et al., 2002). Кроме того, показано, что дерегуляция экспрессии факторов инициации трансляции играет важную роль в процессе онкотрансформации клетки (см. Stoneley а. Willis, 2003). Поэтому изучение механизмов регуляции точности трансляции может способствовать разработке методов лечения этих заболеваний, связанных с нарушениями трансляции.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на конференции EuroPhosphatases 2007 (Авейро, Португалия 2007), на 12-ом Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008) и на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Работа изложена на 152 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (210 наименований). Работа содержит 7 таблиц и 30 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.
Таблица 1. Штаммы, использованные в работе
Название Генотип Происхождение
1А-Д1628 MATa adel-14 his3 lys2 ura3-52 trpl-2891еи2-3,112 SUP45::HIS3 [pRS316-SUP451 Moskalenko et al, 2003
21А-Д863 MATa ade 1-14 his7-l lys2-90 ura3-52 trpl-289 leu2-3,112 SUP3S::TRP1 [pFL38S] Задорский и др., 2003
5V-H19 МАТа ade 1-14 his7-l lys2-90 ura3-52 trpl-2891еи2-3,112 SUP35::TRP1 fpFL38Sl Ter-Avanesyan et al., 1994
22V-H63 MATa ade2-l karl lysl his3 игаЗ leu2 cyhR SUQ5 SUP35.-.-TRP1 [pRS316-SUP35] Shkundina et al., 2006
Плазмиды. Плазмиды pRS315-TEF5 и pRS315-TEF5-S86A получены при клонировании ПЦР-продуктов, содержащих аллель дикого типа TEF5 либо мутантную аллель tef5-T622C, в вектор pRS315 по сайту рестрикции BamHI. Центромерные плазмиды, несущие мутантные аллели sup45 и sup35, описаны ранее (Moskalenko et al, 2003; Москаленко и др., 2004; Volkov et al., 2002; Chabelskaya et al., 2004). Использованные мутации sup35 и sup45 приведены в таблице 2. Также в работе использовали мультикопийную плазмиду YEpIacl95 (Gietz a. Sugino, 1988) и ее производные YEplacl95-HAL3, YEplacl95-PPZl и YEplac 195-PPZ1-R451L (Clotet et al, 1996). Центромерные плазмиды pDB902 и pDB858, несущие мутантные аллели sup45-S421/432A и sup45-S421/432D, а также исходный вектор pDB800 описаны ранее (Kallmeyer et al., 2006). Для получения делеций генов использовали плазмиды pFA6 (Wach et al, 1994) и pAG32 (Goldstein a. McCusker, 1999).
Таблица 2. Мутации sup45 и sup35, использованные в работе
sup45-101 796G—>T (UAA) Moskalenko et al., 2003
sup45-103 62T—>C (21 Leu—>Ser) Москаленко и др., 2004
sup45-104 848T—>A (UAA) Moskalenko et al., 2003
sup4S-105 1153G—*T (UAA) Moskalenko et al., 2003
sup45-107 950T—>G (UGA) Moskalenko et al, 2003
sup4S-lll 193C—>T (65Arg—<Cys) Москаленко и др., 2004
sup45-115 206C—>T (70Ser—>Phe) Москаленко и др., 2004
sup45-ll6 185G—(62Arg—»Thr) Москаленко и др., 2004
sup35-10 1083G—>A (363Asp—>Asn) Volkov et al., 2002
sup35-25 1113C-»T(378Thr—lie) Volkov et al, 2002
sup35-203 214C—»T (UAG) Chabelskaya et al, 2004
sup35-218 541G—>T(UAA) Chabelskaya et al, 2004
sup35-240 166C—>T (UAA) Chabelskaya et al, 2004
sup35-244 586G—>T(UAG) Chabelskaya et al., 2004
sup35-260 724C—>T (UAG) Chabelskaya et al, 2004
Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986) и стандартные среды: YAPD, полную синтетическую среду SMM, а также селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SMM. Кроме того, использовали среды на основе YAPD, содержащие гигромицин Б (HygB) либо генетицин (G418), а также среду на основе SMM, содержащую 5-фтороротовую кислоту.
Качественную оценку эффективности нонсенс-супрессии осуществляли визуально по росту штаммов на средах SMM-Ade (в случае супрессии adel-14 и ade2-l), SMM-His (his7-l) и SMM-Trp (trpl-289). Для этого производили
упорядоченный посев суспензии дрожжевых клеток (в серии последовательных разведений в 3 раза) на соответствующую селективную среду (см. Hampsey, 1997). Использование последовательных разведений повышало разрешающую способность метода и позволяло регистрировать даже незначительные отличия в эффективности нонсенс-супрессии.
ПЦР, рестрикционный анализ, выделение геномной и плазмидной ДНК, трансформацию дрожжей и E.coli, гель-электрофорез ДНК, иммуноблоттинг проводили в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al, 1994; Gietz et al., 1992; Inoue et al., 1990). Электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) осуществляли по модифицированной методике (Kushnirov et al., 2006). Получение мутантной аллели tef5-T622C проводили методом Overlap Extension PCR (Pont-Kingdon, 2003). Делеции генов TEF5, SUP45, SLA1, SSB1, SSB2, UPF1, UPF2, HAL3, PPZ1 и PPZ2 были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (Wach et al., 1994; Goldstein a. McCusker, 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сверхпродукция Ppzlp влияет на проявление некоторых мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [,Р£7+].
Мутации в генах SUP35 и SUP4S, кодирующих факторы терминации трансляции eRF3 и eRFl, соответственно, приводят к нарушению точности трансляции; в их присутствии повышается уровень считывания стоп-кодонов как значащих. Эпигенетический фактор [PS/*'] представляет собой продукт прионного превращения Sup35p; в его присутствии уменьшается доля мономеров Sup35p, участвующих в терминации трансляции, что также приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии.
Ранее влияние сверхэкспрессии гена PPZI на уровень нонсенс-супрессии было показано в штамме, несущем нонсенс-мутацию sup35-25, а также критическую мутацию sup45-400 (Aksenova et al., 2007). Поэтому было необходимо выяснить, являются ли эффекты PPZI специфичными по отношению к этим мутациям, или они могут проявляться и на фоне других нонсенс-супрессорных факторов.
В первую очередь мы проанализировали влияние сверхэкспрессии PPZ1 на проявление 8-ми различных мутаций в гене SUP45 в отсутствие мутаций sup35. Использованные мутантные аллели snp45 различаются по молекулярной природе (среди них есть как миссенс-, так и нонсенс-мутации) (см. таблицу 2). а также по эффективности нонсенс-супрессии (рисунок 1).
У штамма 1А-Д1628, несущего делецию хромосомной копии гена SUP45 и плазмиду с геном SUP45, методом плазмидного шафлинга заменяли эту компенсирующую плазмиду на плазмиды, содержащие мутантные аллели sup45. Далее этих трансформантов дополнительно трансформировали
плазмидами YEplacl95-PPZl и YEplacl95-PPZl-R451L, несущими аллель дикого типа PPZ1 и мутантную аллель ppzl-R451L, а также контрольной плазмидой YEplacl95. Мутация ppzl-R451L полностью блокирует каталитическую активность Ppzlp (de Nadal et al., 2001).
SMM-Trp
© 1 . С , ;v -
m ииа mm
■ А Ш ф щ
W w 9 ф Щ Щ' # *
19 Ш ш ■
Рисунок 1. Производные штамма 1А-Д1628, несущие различные мутации $ир45 на плазмиде, различаются по эффективности нонсенс-супрессии. Символом обозначена аллель дикого типа 811Р45, номерами 101 -116 обозначены мутации зир45-101 - зир45-116. На этом и последующих рисунках символом вММ обозначена синтетическая питательная среда, обеспечивающая рост используемого штамма и поддержание плазмид, 8ММ-Ас1е - среда на основе БММ, не содержащая аденина, вММ-Тгр - не содержащая триптофана.
Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PPZ1 ослабляет супрессорный эффект пяти из восьми проанализированных мутаций (sup45-101, -104, -111, -115 и -116). В то же время сверхэкспрессия ppzl-R451L усиливает супрессорный эффект этих пяти мутаций. В то же время сверхэкспрессия PPZ1 и ppzl-R451L существенно (по крайней мере, в пределах разрешающей способности метода) не изменяет проявление трех других мутаций (sup45-103, -105 и -107) (рисунок 2). Таким образом, проявление мутаций sup45 может зависеть от уровня экспрессии фосфатазы Ppzlp.
«ММ SMM-Adc__SMM-Trp
:В
© №11 pptl-R-ISll. V 1 шШИШШ ЯИННВЕЯ
Б
Рисунок 2. Антисупрессорный эффект РРХ1 и аллосупрессорный эфффект ррг1-Я451Ь проявляются на фоне 5ир45-116 (А), но не на фоне зир45-105 (Б). На этом и последующих рисунках символом 0 обозначен контрольный вектор УЕр1ас195, РР21 - плазмида УЕр1ас195-РР21 ,ррг1-Я45И - плазмида УЕрЫсШ-РРгЫШН..
Далее мы проанализировали влияние сверхэкспрессии гена PPZ1 на
проявление пяти нонсенс-мутаций, а также двух миссенс-мутаций в гене sup35 (см. таблицу 2). Экспрессия всех использованных мутантных аллелей sup35 приводит к выраженной нонсенс-супрессии (Chabelskaya et al., 2004). Как и в предыдущем эксперименте, у штаммов, содержащих делецию хромосомной копии гена SUP35 и плазмиду, компенсирующую летальный эффект делеции, методом плазмидного шафлинга заменяли компенсирующие плазмиды на плазмиды, несущие мутантные аллели sup35. Далее полученные штаммы дополнительно трансформировали мультикопийными плазмидами, несущими аллели гена PPZ1. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PPZ1 и ppzl-R451L не влияет на проявление всех пяти нонсенс-мутаций sup35, а также обеих миссенс-мутаций sup35-10 и sup35-25 (данные не представлены).
Вместе с тем, необходимо отметить, что ранее антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 был показан в штамме, несущем одну из проанализированных мутаций - sup35-25 (Aksenova et al., 2007). Однако, этот штамм содержал криптическую мутацию sup45-400. Поэтому можно предположить, что для проявления эффектов PPZ1 на фоне мутаций sup35 могут быть необходимы мутации sup45. С другой стороны, проявление эффектов PPZ1 может зависеть от эффективности нонсенс-супрессии, обуславливаемой мутациями sup35.
Для проверки этих предположений мы проанализировали проявление сверхэкспрессии PPZ1 и ppzl-R451L в штамме 21А-Д863 на фоне "укороченных" аллелей sup35-]0C и sup35-25C, кодирующих только С-терминальный домен Sup35p. Ранее было показано, что эти аллели характеризуются как минимум в два раза меньшей эффективностью нонсенс-супрессии по сравнению с полноразмерными аллелями sup35-10 и sup35-25 (Volkov et al., 2007). Мы обнаружили, что антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppzl-R451L, действительно, наблюдаются на фоне "укороченных" аллелей sup35-10C и sup35-25C (рисунок 3). Таким образом, эффекты сверхпродукции Ppzlp могут проявляться на фоне мутантных аллелей sup35 в отсутствии дополнительных мутаций sup45. При этом проявление эффектов PPZ1 зависит от уровня нонсенс-супрессии, обусловленной мутантными аллелями sup35.
0 S.MM О SMM-Adi. SMM-Hh SMM-Lvs ЬШШй
PPZ1 m
ppzl-R451L о .•V^^VJ-V'»
sup3S-25C
Рисунок 3. Антисупрессорный эффект РР21 и аллосупрессорный эффектррг1-Я4511 наблюдаются на фоне "укороченной" мутантной аллели $ир35-25С. Символом 8ММ-Н1$ обозначена среда на основе БММ, не содержащая гистидина, вММ-ЬуБ - не содержащая лизина.
Являются ли мутации зир35 и зир45 необходимым условием для проявления эффектов сверхпродукции Ррг1р, или же эти эффекты могут проявляться при снижении эффективности терминации трансляции, обусловленной другими причинами? Для ответа на этот вопрос мы проверили возможный эффект сверхэкспрессии РР21 и ррг!-Я45И в штамме 5У-Н19 не содержащем мутаций $ир35 и вир45. Антисупрессорный эффект РР21 и аллосупрессорный эффект мутантной аллели ррг!-Я451Ь проявляются на фоне нонсенс-супрессии, обусловленной фактором [/>5/+] (рисунок 4). Таким образом, проявление эффектов РР21 может наблюдаться и в отсутствии мутаций зир35 или зир45. Это говорит о том, что эффекты РР21 проявляются на фоне нонсенс-супрессии, которая может быть обусловлена факторами различной природы.
Рисунок 4. Сверхэкспрессия PPZ1 приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия ppzl-R451L - к аллосупрессии по отношению к фактору [PSP] в штамме 5V-H19.
Изменение фенотипического проявления фактора [PSf] при сверхэкспрессии PPZ1 может быть связано с зависимостью прионного превращения Sup35p от фосфатазной активности Ppzlp. Для проверки этого предположения мы проанализировали количество Sup35p, находящегося в мономерной фракции, по сравнению с количеством тотального белка Sup35p в штаммах [Р5/ ] на фоне сверхэкспрессии PPZ1 и ppzl-R45IL. Мы обнаружили, что распределение Sup35p между полимерной и мономерной фракциями не изменяется при сверхэкспрессии аллелей гена PPZ1 (данные не представлены). Таким образом, сверхпродукция Ppzlp не влияет на прионное превращение белка Sup35p. Эти данные косвенно свидетельствуют об отсутствии непосредственного взаимодействия между фосфатазой Ppzlp и фактором терминации eRF3.
2. Сверхэкспрессия и делеция HAL3 влияют на проявление фактора
\psr\.
На предыдущем этапе работы мы показали, что сверхпродукция Ppzlp влияет на проявление некоторых мутаций sup35 и sup45, а также фактора [PST]. Известно, что белок На13р является негативной регуляторной субъединицей фосфатазы Ppzlp (de Nadal et al., 1998). В таком случае следует ожидать, что
изменение уровня экспрессии НАЬЗ может влиять на уровень нонсенс-супрессии за счет изменения фосфатазной активности Ррг1р. Для проверки этого предположения мы проанализировали эффекты делеции и сверхэкспрессии гена НАЬЗ в штамме 5У-Н19 [Р8Г]. Мы показали, что делеция НАЬЗ приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия НАЬЗ - наоборот, к аллосупрессии по отношению к фактору [,Р.5УГ] (рисунок 5). Таким образом, проявление фактора [/^7 ] зависит от уровня экспрессии гена НАЬЗ.
Рисунок 5. Деления НАЬЗ (А) приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия НАЬЗ (Б) -к аллосупрессии в штамме 5V-H19 [PS/4]. Символом wt обозначен исходный штамм 5V-Н19 [PS/"], hal3A - штамм 5V-H19-hal3A [PS/4'], НАЬЗ - плазмида YEplac 195-HAL3.
3. Сверхэкспрессия НАЬЗ проявляется на фоне делеции PPZ1, но не двойной делеции PPZ1 и PPZ2.
Поскольку На13р является негативным регулятором Ppzlp (de Nadal et al, 2001), то можно предположить, что аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии НАЬЗ обусловлен снижением фосфатазной активности Ppzlp. В таком случае следует ожидать, что проявление сверхэкспрессии НАЬЗ будет блокировано в штамме, несущем делецию PPZ1. Для проверки этого предположения мы получили делецию гена PPZI в штамме 5V-H19 [PSÍ]. Как и следовало ожидать, эффект делеции PPZ1 противоположен эффекту сверхэкспрессии этого гена, т.е. он проявлятся как аллосупрессия по отношению к [P¿7+] (рисунок 6). Далее штамм 5V-H19-ppzlA [PSÍ ] трансформировали мультикопийной плазмидой YEplac 195-HAL3, несущей гена НАЬЗ. Как оказалось, аллосупрессорный эффект сверхпродукции На13р проявляется на фоне делеции гена PPZ1 (рисунок 7). Следовательно, влияние НАЬЗ на эффективность нонсенс-супрессии не может быть объяснено только ингибированием Ppzlp. Скорее всего, в этом процессе участвуют и другие белки, связанные с трансляцией.
Наиболее вероятным кандидатом на роль такого белка является фосфатаза Ppz2p. Показано, что На13р и Ppz2p взаимодействуют in vivo (Tarassov et al., 2008). Кроме того, Ppzlp и Ppz2p высокогомологичны, поэтому можно предположить, что На13р является общей регуляторной субъединицей как
Ррг1р, так и Ррг2р. В таком случае аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии НАЬЗ должен быть блокирован на фоне двойной делении РР21 и РР22, но не на фоне одиночной делении РР22.
Для проверки этого предположения мы получили делецию РР22, а также двойную делецию РР21 и РР22 в штамме 5У-Н19 [Р5/1"]. Мы показали, что делеция РР22 приводит к аллосупрессии по отношению к [Р$/~]; таким образом, фосфатаза Ррг2р также участвует в контроле эффективности нонсенс-супрессии (см. рисунок 6).
Рисунок 6. Делеция генов РР21 и РР22 приводит к аллосупрессии по отношению к фактору [РЗ/*]. Символом М обозначен исходный штамм 5У-Н19 [РЗТ*], символами рр11Л, ррг2А и ppzl/2A - его производные, несущие делении РР21, РР22 и двойную делецию этих генов, соответственно.
Далее штаммы с этими делениями трансформировали плазмидой УЕр1ас195-НАЬЗ. Мы обнаружили, что аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии НАЬЗ проявляется на фоне делеции РР22\ в то же время этот эффект полностью блокирован на фоне двойной делеции РР21 и РР22 (см. рисунок 7).
ХММ 8ММ-Айе Рисунок 7. Аллосупрессорный
рр-лл И или й © т Ф ш 1;> эффект сверхэкспрессии НАЬЗ проявляется на фоне одиночных делеции РР21 и РР22, но не на фоне двойной делеции этих генов.
ppz2.il 0 НА13 0 1 ф % э § ^ • фф
рргШЛ НАЬЗ у © © Ф ё
Таким образом, На13р является негативной регуляторной субъединицей и для Ррг1р, и для Ррг2р; влияние НАЬЗ на эффективность нонсенс-супрессии обусловлено ингибированием каталитической активности обеих этих фосфатаз.
4. Роль фактора элонгации EFIBa в проявлении эффектов Ppzlp.
Антисупреееорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 связан с усилением фосфатазной активности Ppzlp, поскольку антисупрессия не наблюдается при сверхэкспрессии мутантной аллели ppzl-R451L, кодирующей каталитически неактивный Ppzlp. Очевидно, таким образом, что Ppzlp дефосфорилирует какой-то фофобелок, связанный с трансляцией. Этот белок в настоящее время неизвестен. A priori наиболее вероятным кандидатом на роль такого белка является фактор элонгации трансляции EFIBa. В гене TEF5, кодирующем EFIBa, изолирован ряд мутаций, приводящих к антисупрессии (Carr-Schmid et al., 1999). Кроме того, показано, что EFIBa является мишенью фосфатазной активности Ppzlp и дефосфорилируется по остатку серина в положении 86. Мутация tef5-T622C, приводящая к замене серина на аланин, полностью блокирует фосфорилирование EFIBa in vivo (de Nadal et al., 2001). Если EFIBa действительно опосредует антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1, то этот эффект должен быть блокирован в штамме [PSI*], несущем эту мутантную аллель.
Для проверки этого предположения мы получили делецию гена TEF5 в штамме 5V-H19 [PSt], содержащем центромерную плазмиду с мутантной аллелью tef5-T622C. В качестве контроля использовали изогенный штамм, экспрессирующий аллель дикого типа TEF5 с плазмиды. Фенотип этих штаммов свидетельствует о том, что tef5-T622C приводит к слабовыраженной антисупрессии по отношению к фактору [PS7+] (рисунок 8). Следовательно, уровень фосфорилированности EFIBa по остатку Ser86 действительно влияет на эффективность нонсенс-супрессии, причем дефосфорилированное состояние EFIBa ведет к антисупрессии. Эти данные подтверждают предположение о том, что антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1, по крайней мере частично, опосредован дефосфорилированием EFIBa.
Рисунок 8. Мутация 1е/5-Т622С приводит к антисупрессии на фоне [Р57+]. Символом ТЕР5н>1 обозначен исходный штамм 5У-Н19 [Р5/4], ¡е/5-Т622С- штамм 5У-Н19-1е£5Д [ДХГ], несущий плазмиду с аллелью Т622С.
Далее штамм, экспрессирующий мутантную аллель Хе]'5-Т622С, трансформировали плазмидами, несущими аллели PPZ1 иррг1-Я451Ь. Фенотип трансформантов свидетельствует о том, что антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ррг1-К451Ь проявляются на фоне 1е/5-Т622С (рисунок 9). Это говорит о том, что ЕР1Ва является не единственной мишенью, опосредующей связь Ррг1р с трансляцией. По-видимому, проявление сверхпродукции Ррг1р также зависит от какого-то другого фосфобелка,
связанного с трансляцией.
SMM SMM-Ade
tef5-T622C
Рисунок 9. Эффекты Р?2\ и ррг1-К45Н по отношению к фактору [Р5Г] проявляются на фоне мутации (е/5-Т622С.
5. Поиск других белков-мишеней Ppzlp.
Мы показали, что EFIBa играет минорную роль в проявлении эффекта сверхэкспрессии PPZ1. Поэтому мы рассмотрели ряд других фосфобелков, связанных с трансляцией, в качестве возможных мишеней Ppzlp. В их числе:
1. Фактор терминации трансляции eRFl (Sup45p) - играет ключевую роль в считывании стоп-кодонов. Он фосфорилируется in vivo по Ser421 и Ser432 (Kallmeyer et al, 2006); фосфатаза, дефосфорилирующая Sup45p, в настоящее время неизвестна. Роль фосфорилирования Sup45p в клетке также не изучена.
2. Белки Upflp (Nam7p) и Upf2p (Nmd2p) - необходимы для работы системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (NMD). Кроме того, эти белки взаимодействуют in vivo с факторами терминации трансляции eRFl и eRF3 (Czaplinski et al., 1998; Wang et al, 2001). Таким образом, эти белки тесно связаны с аппаратом трансляции и могут оказывать влияние на эффективность нонсенс-супрессии за счет как контроля активности системы NMD, так и регуляции считывания стоп-кодонов как значащих. Также известно, что Upflp и Upf2p являются фосфобелками, причем фосфорилирование Upf2p необходимо для работы системы NMD (Wang et al, 2006). Фосфатаза, контролирующая уровень фосфорилированности Upf2p, в настоящее время неизвестна.
3. фосфобелок Slalp - взаимодействует in vivo как с Ppzlp (Venturi et al, 2000), так и с фактором терминации eRF3 (Bailleul et al, 1999). Делеция SLAl приводит к повышению чувствительности к некоторым ингибиторам трансляции (Bailleul et al, 1999).
Для проверки возможной роли перечисленных фосфобелков в проявлении эффектов Ppzlp мы проанализировали проявление сверхэкспрессии PPZ1 и ppzl-R451L в производных штамма 5V-H19 на фоне:
а) Мутантной аллели sup45-S421/432A в штамме [PS/"], приводящей к заменам фосфорилируемых остатков серина в положениях 421 и 432 на аланин и вследствие этого кодирующей Sup45p, находящийся в конститутивно дефосфорилированном состоянии;
б) Одиночных делеций UPF1 и UPF2, а также двойной делеции этих
генов в штаммах [psi];
в) Делеции SLA1 в штамме [PS/*].
Во всех этих экспериментах мы наблюдали проявление антисупрессорного эффекта PPZ1 и аллосупрессорного эффекта ppzl-R451L (данные не представлены). Таким образом, белки Sup45p, Upfl/2p и Slalp не участвуют в проявлении эффектов сверхпродукции Ppzlp (или их роль несущественна). Кроме того, проведенные эксперименты позволили также сделать следующие выводы:
1) Экспрессия мутантной аллели sup45-S421/432A не приводит к видимому изменению уровня нонсенс-супрессии в штамме [PST];
2) Эффекты сверхпродукции Ppzlp не связаны с изменением эффективности нонсенс-зависимой деградации мРНК;
3) Делеция гена SLA1 приводит к аллосупрессии по отношению к фактору [PSÍ].
6. Роль Ssblp и Ssb2p в проявлении аллосупрессорного эффекта ppzl-R451L.
Шапероны Ssblp и Ssb2p также мотут рассматриваться в качестве кандидатов на роль белков, участвующих в проявлении эффектов сверхпродукции Ppzlp. Гены SSBI и SSB2 идентичны на 99%, поэтому Ssblp и Ssb2p выполняют в клетке одни и те же функции. В отношении Ssblp было показано, что он взаимодействует in vivo как с Ppzlp (Arino, 2002), так и с фактором терминации eRF3 (Allen et al., 2005). Кроме того, уровень экспрессии Ssblp влияет на эффективность нонсенс-супрессии (Rakwalska a. Rospert, 2004; Hatin et al., 2007).
Мы получили одиночные делеции SSB1 и SSB2, а также двойную делецию этих генов в штамме 5V-H19 [РбУ^]. Двойная делеция SSB1 и SSB2 приводит к аллосупрессии по отношению к [PSt\, в то время как одиночные делеции не оказывают видимого влияния на фенотип штамма; эти данные свидетельствуют о перекрывании функций белков Ssblp и Ssb2p в регуляции эффективности нонсенс-супрессии. Далее штаммы с делециями трансформировали плазмидами, несущими аллели гена PPZ1. Антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 проявляется во всех проанализированных штаммах (рисунок 10). Следовательно, Ssblp и Ssb2p не принимают участия в проявлении сверхэкспрессии аллели дикого типа PPZ1.
Тем не менее, аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии ppzl-R451L проявляется на фоне одиночных делеций SSB1 или SSB2, но не на фоне двойной делеции этих генов. Таким образом, для проявления мутантной аллели ppzl-R451L необходимо наличие хотя бы одного из белков Ssb.
Эти данные позволяют предположить, что антисупрессорный эффект аллели дикого типа PPZ1 и аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppzl-R451L обусловлены различными механизмами. Механизм, обеспечивающий
проявление мугантной аллели ррг1-Я451Ь, зависит от экспрессии генов 8$В! и 5552, в то время как проявление аллели дикого типа РР21 ЗэЬ-независимо.
Рисунок 10. Аллосупрессорный эффектррг1-К45И по отношению к [Я5/1"] проявляется в исходном штамме 5У-Н19 (обозначен как 5$В1/2уе(), но не в штамме ЭУ-Н^-ввЬШД (обозначен как яэЫЯА).
Ssb-зависимый аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppzl-R451L может быть объяснен следующим образом:
Мы показали, что двойная делеция SSB1 и SSB2 в штамме [PSI*] приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии. Иными словами, уменьшение количества молекул Ssblp и Ssb2p, взаимодействующих с компонентами аппарата трансляции, имеет нонсенс-супрессорный эффект. По-видимому, при сверхпродукции каталитически неактивной формы Ppzlp возрастает доля молекул Ssblp и Ssb2p, взаимодействующих in vivo с Ppzlp, что приводит к снижению пула молекул этих шаперонов, взаимодействующих с рибосомой и с факторами терминации трансляции и, следовательно, к нонсенс-супрессии (рисунок 11).
°ч
/
/¡рГккШГТ] /
Фосфатазная активность Í
Взаи моде ист вне in vivo с Ssbl/2p t
Фосфатазная активность
Взаимодействие in vivo с Ssbl/2p t
Дефосфорилироваиие Пул функционального Дефосфорилироваиие Пул функционального белка-мишени ? ' Ssbl/2p [ белка-мишени Ssbi/2p I
АНТИСУПРЕССИЯ
Алл о супрессии
Антисупрессия
АЛЛОСУПРЕССИЯ
Рисунок XI. Влияние Ррг1р на эффективность нонсенс-супрессии может быть обусловлено двумя различными механизмами.
В таком случае, при сверхэкспрессии аллели дикого типа PPZ1 можно предположить, что аллосупрессорный эффект, обусловленный взаимодействием между Ppzlp и белками Ssb, маскируется более сильным антисупрессорным эффектом, обусловленным увеличением фосфатазной активности Ppzlp (см. рисунок 11). Эта фосфатаза дефосфорилирует как минимум два белка: фактор элонгации EFIBa, а также какой-то другой белок, в настоящее время остающийся неизвестным.
ВЫВОДЫ
1) Эффективность нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями в генах SUP35 и SUP45, а также дрожжевым прионом [PSI*], зависит от активности фосфатазы Ppzlp;
2) Сверхпродукция каталитически активной формы Ppzlp обладает антисупрессорным эффектом, а сверхпродукция мутантного белка, лишенного фосфатазной активности, проявляет аллосупрессорный эффект;
3) Показано, что родственная Ppzlp фосфатаза Ppz2p также вовлечена в детерминацию эффективности нонсенс-супрессии; при этом ее активность регулируется общей с Ppzl регуляторной субъединицей На13р;
4) Модификация фенотипического проявления фактора [PS Г] в зависимости от активности Ppzlp не связана с влиянием этой фосфатазы на прионное превращение белка Sup35p;
5) Уровень фосфорилированности фактора элонгации трансляции EFIBa влияет на фенотипическое проявление фактора [PSt] (хотя и в незначительной степени), но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и мутантной формы фосфатазы Ppzlp;
6) Эффективность нонсенс-супрессии в штамме [PiT^J не зависит от уровня фосфорилированности фактора термипации eRFl;
7) Влияние фосфатазы Ppzlp на эффективность нонсенс-супрессии не связано с активностью компонентов системы нонсенс-зависимой деградации мРНК;
8) Делеция гена SLA1 характеризуется аллосупрессорный эффектом по отношению к фактору [PST], но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и каталитически неактивной форм Ppzlp;
9) Аллосупрессорный эффект каталитически неактивной формы Ppzlp по отношению к фактору [PSt] может быть объяснен ее взаимодействием с шаперонами Ssblp и Ssb2p.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1) Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Родионова С.А., Иванов М.С., Волков К.В., Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного прионоподобного детерминанта [/£Р+] у дрожжей, с помощью инсерционной библиотеки генов // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. №3. С. 1-8.
2) Иванов М.С., Аксенова А.Ю., Бурдаева Я.В., Радченко Э.А., Миронова Л.Н. Сверхэкспрессия гена PPZ1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет на эффективность нонсенс-супрессии // Генетика. 2008. Т. 44. № 2. С. 177-184.
3) Rogoza Т., Goginashvili A., Ivanov М., Mironova L. Nonsense Suppression Efficiency is Yeasts Depends on the Level of SFP1 Expression. CSHL Meeting on Translational Control (Cold Spring Harbor, USA, September 3-7, 2008) - Book of Abstracts, P. 277.
4) Ivanov M.S., Radchenko E.A., Mironova L.N. Phosphatase Ppzlp influences the efficiency of nonsense suppression by pathways distinct from the dephosphorylation of the elongation factor EFlBa in yeast Saccharomyces cerevisiae. 12A International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15, 2008) - Book of Abstracts, P. 145.
5) Ivanov M.S., Aksenova A.Yu., Radchenko E.A. and Mironova L.N. The level of Ser/Thr phosphatase Ppzlp influences the manifestation of certain mutations in SUP35 and SUP45 genes as well as [PST*] prion in Saccharomyces cerevisiae. EuroPhosphatases 2007 "Protein Phosphatases in Health and Disease" (Aveiro, Portugal, July 24-28,2007) - Book of Abstracts, P. 183.
6) Ivanov M.S., Aksenova A.Yu., Mironova L.N. Influence of Ser/Thr phosphatase Ppzlp on manifestation and propagation of [PST] prion in Saccharomyces cerevisiae I/ III International Young Scientists Conference (Odesa, Ukraine, May 15-18,2007) - Book of Abstracts, P. 192.
Подписано в печать 10.09.2009г.
Тираж 100 экз. Отпечатано в РПФ «Ларс-принт» Тел.: 363-12-44
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Максим Сергеевич
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль генетических и эпигенетических факторов в регуляции эффективности нонсенс-супрессии у эукариот.
1.1. Характеристика процесса трансляции у эукариот и типы ошибок, возникающих в ходе трансляции.
1.2. Генетический контроль точности трансляции. Факторы, влияющие на считывание стоп кодонов.
1.2.1. Роль мутантных и естественных нонсенс-супрессорных тРНК в считывании стоп-кодонов.
1.2.2. Роль факторов терминации в распознавании стоп-кодонов
1.2.2.1. Характеристика факторов терминации трансляции eRF 1 и eRF3.
1.2.2.2. Эффекты мутаций в генах, кодирующих eRF3 и eRFl
1.2.2.3. Взаимодействие факторов терминации с другими белками.
1.2.3. Роль рРНК и рибосомных белков в поддержании точности трансляции.
1.2.4. Роль факторов элонгации в контроле точности трансляции.
1.2.5. Роль компонентов системы NMD в регуляции уровня нонсенс-супрессии.
1.2.6. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодонов.
1.3. Эпигенетический контроль точности трансляции.
1.3.1. Прионное превращение белков.
1.3.2. Фактор [Р57+] и его влияние на считывание стоп-кодонов.
1.4. Роль фосфорилирования в контроле точности трансляции.
1.4.1. Фосфатазы дрожжей-сахаромицетов.
1.4.2. Фосфатаза Ppzlp и ее роль в контроле эффективности нонсенс-супрессии.
1.4.3. Влияние фосфатазы Ppqlp на уровень нонсенс-супрессии
Введение Диссертация по биологии, на тему "Фосфатаза PPZ1P и эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"
Считывание триплетов мРНК аппаратом белкового синтеза в соответствии с генетическим кодом — основополагающее свойство живой клетки, обеспечивающее ее стабильное функционирование. Как и другие матричные процессы, трансляция характеризуется некоторым уровнем неточного считывания, в результате которого может происходить переосмысление значащих триплетов, считывание стоп-кодонов как значащих, сдвиг рамки считывания. В соответствии с принципом поливариантности матричных процессов, способность к прочтению одного и того же триплета более чем одним способом является неотъемлемым свойством белок-синтезирующей системы клетки (Инге-Вечтомов, 1969).
Одним из возможных следствий поливариантности трансляции может быть гетерогенность синтезированных полипептидов. В этом случае говорят о неоднозначности трансляции. Неоднозначность трансляции может проявляться практически на всех этапах этого процесса, однако наиболее показательна с этой точки зрения терминация трансляции.
Как известно, в большинстве белок-синтезирующих систем в качестве сигналов терминации трансляции используются триплеты UAA, UAG и UGA, называемые также стоп-кодонами (нонсенс-кодонами). При мутационном возникновении стоп-кодона в кодирующей части гена должно происходить преждевременное прекращение синтеза соответствующего полипептида. Вместе с тем, проявление нонсенс-мутаций может быть нейтрализовано различными способами, так или иначе приводящими к считыванию стоп-кодона, возникшего в результате мутации. Это явление получило название нонсенс-супрессии.
Нонсенс-супрессия является классической моделью для изучения молекулярных механизмов, регулирующих считывание стоп-кодонов как значащих (Инге-Вечтомов et al., 1971; Инге Вечтомов, 1976). Увеличение или уменьшение эффективности нонсенс-супрессии может быть связано с нарушениями в работе как тРНК и белковых компонентов аппарата элонгации и терминации трансляции, так и компонентов системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (NMD).
Кроме того, на эффективность считывания стоп-кодонов, по крайней мере, у низших эукариот, могут влиять и факторы эпигенетической природы. Хорошо известным примером такого рода является фактор [P.ST] дрожжей-сахаромицетов — наследственный детерминант белковой природы, или прион, представляющий собой функционально неактивный конформационный изомер фактора терминации трансляции eRF3, кодируемого геном SUP35. Переход активной формы фактора терминации eRF3 в неактивную, прионную, способствует считыванию стоп-кодонов как значащих, поэтому штаммы [PST] проявляют нонсенс-супрессорный фенотип.
В нашей лаборатории идентифицирован новый эпигенетический детерминант дрожжей [ZSP+]. Фактор [ZSP+] также влияет на считывание стоп-кодонов, однако в отличие от [Р571"] он проявляется как антисупрессор по отношению к некоторым мутациям sup35 (причем для проявления антисупрессорного эффекта [ZSP"1"] необходимо наличие криптических мутаций sup45). Ряд фактов (обратимое излечивание на среде, содержащей хлорид гуанидина, неменделевское наследование при тетрадном анализе, возможность передачи при цитодукции) указывает на то, что детерминант [/.SP*], возможно, также является прионом.
В ходе поиска генов, оказывающих влияние на индукцию, поддержание либо проявление [ZSP+], был проведен скрининг трех геномных библиотек - 1) экспрессионной библиотеки на основе вектора pRS316, содержащего индуцируемый промотор GAL1\ 2) дизрупционной библиотеки на основе дрожжевого минитранспозона тТпЗ, и 3) библиотеки на основе центромерного вектора Ycp50.
Каждый из этих подходов позволил выявить по несколько генов, поразному влияющих на свойства [7£Р+] (,SUP45, HAL3, UPFJ, UPF2, SFP1, APD1, HSP150, RPS24A). В частности, ген SFP1, идентифицированный при скрининге инсерционной библиотеки и кодирующий транскрипционный фактор Sfplp, по всей видимости, является структурным геном [7&Р*]. Делеция этого гена приводит к необратимой потере [/SP+], сверхэкспрессия — к индукции [75Р+] с высокой частотой (Rogoza et al., 2008). При использовании гибридных конструкций, в которых ген SFP1 слит с геном, кодирующим белок GPF, было показано наличие агрегатов Sfplp в штаммах [7£Р+] in vivo. Таким образом, белок Sfplp, по-видимому, способен к прионной конверсии, и переход Sfplp в неактивную конформацию обуславливает антисупрессорный эффект [75!Р+].
В результате скрининга центромерной библиотеки были изолированы гены SUP45 и HAL3. Аллель дикого типа гена SUP45 при низкокопийной экспрессии приводит к изменению фенотипа штамма [7£Р+] с Sup" на Sup+. Роль гена SUP45 в проявлении [ZST^] связана с тем, что использовавшиеся штаммы, как выяснилось, содержат криптические мутации sup45 (sup45-400 в штамме, несущем аллель sup35-25, и sup45-75 в штамме, несущем аллель sup35-10). Эти мутации sup45 не имеют собственного фенотипического проявления, но при этом необходимы для проявления антисупрессорного эффекта [7£Р+] в штаммах, несущих мутации sup35-10 или sup35-25. В связи с этим при трансформации центромерной плазмидой, несущей аллель дикого типа SUP45, происходит фенотипическая маскировка антисупрессорного эффекта [7SP+] (Аксенова и др., 2006).
Отправной точкой» для настоящего исследования послужили факты, полученные при изучении эффектов сверхэкспрессии второго гена, выявленного при скрининге центромерного банка — HAL3. Было показано, что HAL3 при низкокопийной экспрессии увеличивает частоту спонтанной потери [75Р+]. Далее было показано, что сверхэкспрессия HAL3 приводит к изменению фенотипа штамма [7&Р+] с несупрессорного (Sup') на супрессорный (Sup+), а у штамма [«/?"], имеющего фенотип Sup+, эффективность супрессии усиливается.
Делеция гена HAL3 приводит к изменению фенотипа штамма [isp~] с Sup+ на Sup"; в штамме [ISP+], несущем делецию HAL3, антисупрессия проявляется более четко, чем в штамме без делеции. Важно отметить также, что в штамме [ZS75+] количество белка На13р значительно снижено по сравнению с его [isp~] производным. Это указывает на то, что На13р каким-то образом опосредует фенотипическое проявление [/<S"P+] ( Aksenova et al., 2007).
Известно, что белок На13р является негативной регуляторной субъединицей фосфатазы Ppzlp (de Nadal et al., 1998). Поэтому были изучены и эффекты сверхэкспрессии/делеции гена PPZ1. Как и следовало ожидать, эти эффекты противоположны эффектам HAL3: сверхэкспрессия PPZ1 проявляет антисупрессорный эффект в штамме [/£/>"], несущем мутацию sup35-25, а делеция гена PPZ1 изменяет фенотип штамма [ISP+] с Sup" на Sup+. При этом антисупрессия, наблюдаемая при сверхэкспрессии PPZ1 в штамме [isp~], связана с увеличением фосфатазной активности Ppzlp, поскольку этот эффект не наблюдается при сверхэкспрессии мутантной аллели ppzl-R451L, кодирующей каталитически неактивный белок.
Наше внимание обратил на себя тот факт, что эффекты сверхэкспрессии и делеции HAL3 и PPZ1 проявляются не только в штамме [/SP*], но и в штамме [isp~]. Из этого следовало, что белковый комплекс Hal3/Ppzlp участвует не только в контроле проявления прионного детерминанта [/5!Р+], но и в контроле эффективности нонсенс-супрессии.
В настоящее время участие фосфатаз в генетическом контроле трансляции практически не изучено. В связи с этим целью работы явилось изучение связи между функцией фосфатазы Ppzlp и процессом трансляции, на модели нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи- работы:
1) Изучение влияния фосфатазы Ppzlp на проявление нонсенс-супрессорных мутаций в генах SUP35 и SUP45;
2) Изучение влияния фосфатазы Ppzlp и ее регуляторной субъединицы
На13р на проявление фактора [Р&Г];
3) Выяснение роли фосфатазы Ppz2p в генетическом контроле считывания стоп-кодонов;
4) Поиск белков-мишеней фосфатазы Ppzlp, опосредующих влияние этой фосфатазы на эффективность нонсенс-супрессии.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Иванов, Максим Сергеевич
ВЫВОДЫ
1) Эффективность нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями в генах SUP35 и SUP45, а также дрожжевым прионом [PS!/*], зависит от активности фосфатазы Ppzlp;
2) Сверхпродукция каталитически активной формы Ppzlp обладает антисупрессорным эффектом, а сверхпродукция мутантного белка, лишенного фосфатазной активности, проявляет аллосупрессорный эффект;
3) Показано, что родственная Ppzlp фосфатаза Ppz2p также вовлечена в детерминацию эффективности нонсенс-супрессии; при этом ее активность регулируется общей с Ppzlp регуляторной субъединицей На13р;
4) Модификация фенотипического проявления фактора [Р57+] в зависимости от активности Ppzlp не связана с влиянием этой фосфатазы на прионное превращение белка Sup35p;
5) Уровень фосфорилированности фактора элонгации трансляции EFlBa влияет на фенотипическое проявление фактора [PST*], хотя и в незначительной степени, но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и мутантной формы фосфатазы Ppzlp;
6) Эффективность нонсенс-супрессии в штамме [PS74"] не зависит от уровня фосфорилированности фактора терминации eRFl;
7) Влияние фосфатазы Ppzlp на эффективность нонсенс-супрессии не связано с активностью компонентов системы нонсенс-зависимой деградации мРНК;
8) Делеция гена SLA1 характеризуется аллосупрессорным эффектом по отношению к фактору [Р£7+], но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и каталитически неактивной форм Ppzlp;
9) Аллосупрессорный эффект каталитически неактивной формы Ppzlp по отношению к фактору [Р£Г] может быть объяснен ее взаимодействием с шаперонами Ssblp и Ssb2p.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, мы проанализировали эффекты сверхэкспрессии гена PPZ1 и мутантной аллели ppzl-R451L на фоне ряда мутаций sup35 и sup45, а также фактора [PSF]. Полученные данные свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия PPZ1 приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия ppzl-R451L - к аллосупрессии по отношению к некоторым мутантным аллелям sup45 и sup45, а также к фактору [Р£Г]. Было показано, что в проявлении эффектов сверхпродукции Ppzlp важную роль играет уровень нонсенс-супрессии в штамме, обусловленный мутациями в генах, кодирующих факторы терминации трансляции. В используемой нами системе оценки эффективности нонсенс-супрессии эффекты сверхэкспрессии PPZ1 и ppzl-R451L могут быть зафиксированы только на фоне умеренного нонсенс-супрессорного фенотипа штамма. Кроме того, было показано, что аллелеспецифичность эффектов PPZ1 и ppzl-R451L в отношении мутаций sup45 не может быть объяснена только зависимостью от уровня нонсенс-супрессии в штамме.
Дальнейшее изучение роль белкового комплекса Hal3/Ppzlp в контроле эффективности нонсенс-супрессии позволили показать, что На13р является негативной регуляторной субъединицей не только фосфатазы Ppzlp, но и гомологичной ей фосфатазы Ppz2p. Также было впервые показано, что фосфатаза Ppz2p может оказывать влияние на уровень нонсенс-супрессии, хотя роль Ppz2p в регуляции супрессии менее значима, чем роль Ppzlp.
Далее мы проверили предположения о возможном участии ряда фосфобелков, взаимодействующих с аппаратом трансляции, в проявлении эффектов сверхпродукции Ppzlp. Было показано, что дефосфорилирование фактора элонгации трансляции EFlBa лишь частично опосредует антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1. Таким образом, Ppzlp дефосфорилирует также и какой-то другой белок, участвующий в контроле эффективности нонсенс-супрессии. Было показано, что фосфобелки Sup45p, Upflp, Upf2, Slalp, Ssblp и Ssb2p не являются мишенями фосфатазной активности Ppzlp, опосредующими влияние сверхпродукции Ppzlp на уровень нонсенс-супрессии. Тем не менее, белки Ssblp и Ssb2p все же принимают участие в проявлении эффектов сверхпродукции Ppzlp, поскольку делеция SSB1 и SSB2 блокирует аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии ppzl-R451L. На основании этих данных было высказано предположение о том, что фосфатаза Ppzlp может оказывать влияние на функционирование аппарата трансляции не только за счет дефосфорилирования EFlBa и какого-то другого, в настоящее время неизвестного фосфобелка, но также и за счет взаимодействия in vivo с шаперонами Ssblp и Ssb2p, причем это взаимодействие на связано с фосфатазной активностью Ppzlp.
Безусловно, изучение роли фосфатазы Ppzlp в контроле эффективности нонсенс-супрессии требует дальнейших исследований. Наиболее важной задачей является поиск белка-мишени Ppzlp, опосредующего EFlBa-независимую составляющую антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1. Не исключено, что этот в настоящее время неизвестный фосфобелок также принимает участие в проявлении описанного ранее антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии гена PPQ1, кодирующего фосфатазу Ppqlp, гомологичную Ppzlp.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Максим Сергеевич, Санкт-Петербург
1. Андрианова В.М., Миронова Л.Н., Инге-Вечтомов С.Г. Температурочувствительность дрожжей, обусловленная полудоминантной супрессорной мутацией // Вестник ЛГУ. 1973. Т. 2. С. 130-135.
2. Борхсениус А.С., Инге-Вечтомов С.Г. О роли генов SUP35 и SUP45 в контроле клеточного цикла дрожжей-сахаромицетов // Доклады РАН. 1997. Т. 353. С. 553-556.
3. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов // Л.: Наука. 1984. 143 с.
4. Инге Вечтомов С.Г. Принцип поливариантности матричных процессов //Исследования по генетике. 1976. Т. 7. С. 3-54.
5. Инге-Вечтомов С.Г. Реверсии к прототрофности у дрожжей, нуждающихся в аденине // Вестник ЛГУ. 1964. Т. 9. С. 112-117.
6. Инге-Вечтомов С.Г. Точность реализации генетической информации // Вестник АН СССР. 1969. Т. 8. С. 25-30.
7. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей//Генетика. 1970. Т. 6. С. 103-115.
8. Инге-Вечтомов С.Г., Кожин С. А., Симаров Б.В., Сойдла Т.Р. Неоднозначность действия гена // Исследования по генетике. 1971. Т. 4. С. 13-35.
9. Миронова Л.Н., Тер-Аванесян М.Д. Циклогексимидзависимые мутанты у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика. 1983. Т. 19. С. 1925-1933.
10. Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Генетический контроль синтеза белка // Изд-во Ленингр. ун-та. 1988. 295 с.
11. Шабельская С.В. Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiae 11 Автореферат канд. дисс., Санкт-Петербург, 2005.
12. Aksenova A., Munoz I., Volkov К., Arino J., Mironova L. The Hal3-Ppzl dependent regulation of nonsense suppression efficiency in yeast and its influence on manifestation of the yeast prion-like determinant ISP+. // Genes Cells. 2007. V. 12. P. 435-445.
13. Alberti S., Halfmann R., King O., Kapila A., Lindquist S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenicproteins // Cell. 2009. V. 137. P. 146-158.
14. Alkalaeva E.Z., Pisarev A.V., Frolova L.Y., Kisselev L.L. and Pestova T.V. In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3 // Cell. 2006. V. 125. P. 1125-1136.
15. Amrani N., Ganesan R., Kervestin S., Mangus D.A., Ghosh S., Jacobson A. A faux З'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay // Nature. 2004. V. 432. P. 112-118.
16. Andersen G.R., Nyborg J. Structural studies of eukaryotic elongation factors // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2001. V. 66. P. 425-437.
17. Andersen G.R., Nissen P., Nyborg J. Elongation factors in protein biosynthesis //Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. P. 434-441.
18. Arino J. Novel protein phosphatases in yeast // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 1072-1077.
19. Baker K.E., Parker R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. V. 16. P. 293299.
20. Barford D. Molecular mechanisms of the protein serine/threonine phosphatases // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21. P. 407-412.
21. Beier H., Grimm M. Misreading of termination codons in eukaryotes by natural nonsense suppressor tRNAs // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P.4767-4782.
22. Bertram G., Bell H.A., Ritchie D.W., Fullerton G., Stansfield I. Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition // RNA. 2000. V. 6. P. 1236-1247.
23. Bertram G., Innes S., Minella O., Richardson J., Stansfield I. Endless possibilities: translation termination and stop codon recognition // Microbiology. 2001. V. 147. P. 255-269.
24. Bonetti В., Fu L., Moon J., Bedwell D.M. The efficiency of translation termination is determined by a synergistic interplay between upstream and downstream sequences in Saccharomyces cerevisiae II J. Mol. Biol. 1995. V. 251. P. 334-345.
25. Borchsenius A.S., Tchourikova A.A., Inge-Vechtomov S.G. Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 2000. V. 37. P. 285-291.
26. Bou G., Remacha M., Ballesta J.P. Ribosomal stalk protein phosphorylating activities in Saccharomyces cerevisiae II Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 375. P. 83-89.
27. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
28. Breining P., Piepersberg W. Yeast omnipotent supressor supl {sup45)\ nucleotide sequence of the wildtype and a mutant gene // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 5187-5197.
29. Carr-Schmid A., Valente L., Loik V.I., Williams Т., Starita L.M., Kinzy T.G. Mutations in elongation factor lbeta, a guanine nucleotide exchange factor, enhance translational fidelity //Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 5257-5266.
30. Chabelskaya S., Gryzina V., Moskalenko S., Le Goff C., Zhouravleva G. Inactivation of NMD increases viability of sup45 nonsense mutants in
31. Saccharomyces cerevisiae II BMC Mol. Biol. 2007. V. 8. P. 71.
32. Chabelskaya S., Kiktev D., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiae are non-lethal // Mol. Genet. Genomics. 2004. V. 272. P. 297307.
33. Chacinska A., Szczesniak В., Kochneva-Pervukhova N.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Boguta M. Ssbl chaperone is a PSI+. prion-curing factor I I Curr. Genet. 2001. V. 39. P. 62-67.
34. Chernoff'Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de novo appearance of PSI-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1993. V. 24. P. 268-270.
35. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono В., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor PSI+. II Science. 1995. V. 268. P. 880-884.
36. Chernoff Y.O., Newnam G.P., Kumar J., Allen K., Zink A.D. Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone Ssb in formation, stability, and toxicity of the Р&Г. prion // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 8103-8112.
37. Clotet J., Posas F., de Nadal E., Arino J. The NH2-terminal extension of protein phosphatase Ppzl has an essential functional role // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 26349-26355.
38. Cohen P. The structure and regulation of protein phosphatases // Annu. Rev. Biochem. 1989. V. 58. P. 453-508. •
39. Condeelis J. Elongation factor 1 alpha, translation and the cytoskeleton // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 169-170.
40. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. The protein product of the Het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 9773-9778.
41. Cox B. Psi, a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast // Heredity. 1965. V. 20. P. 505-521.
42. Cox B. Allosuppressors in yeast // Genet. Res. 1977. V. 30. P. 187-202.
43. Cox B.S. A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and other psi phenomena // Heredity. 1971. V. 26. P. 211-232.
44. Cox B.S., Tuite M.F., McLaughlin C.S. The .PSI+. factor of yeast: a problem in inheritance //Yeast. 1988. V. 4. P. 159-178.
45. Cui Y., Hagan K.W., Zhang S., Peltz S.W. Identification and characterization of genes that are required for the accelerated degradation of mRNAs containing a premature translational termination codon // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 423-436.
46. Cyert M.S., Thorner J. Putting it on and taking it off: phosphoprotein phosphatase involvement in cell cycle regulation // Cell. 1989. V. 57. P. 891-893.
47. Czaplinski K., Majlesi N., Banerjee Т., Peltz S.W. Mttl is a Upf 1-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency // RNA. 2000. V. 6. P. 730-743.
48. Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of РЖ+. // Cell. 2001. V. 106. P. 171182.
49. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of PSI+. and [i№]: a two-prion system in yeast? // EMBO J. 2000. V. 19. P. 1942-1952.
50. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the P57+. prion in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1997. V. 147. P. 507-519.
51. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov V.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Genesis and variability of /\S7+. prion factors in Saccharomyces cerevisiae И Genetics. 1996. V. 144. P. 1375-1386.
52. Di Como С .J., Bose R., Arndt K.T. Overexpression of SIS2, which contains an extremely acidic region, increases the expression of SWI4, CLN1 and CLN2 in SIT4 mutants // Genetics. 1995. V. 139. P. 95-107.
53. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2 mutation which eliminates the PST. factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. 1994. V. 137. P. 659-670.
54. Dong H., Kurland C.G. Ribosome mutants with altered accuracy translatewith reduced processivity // J. Mol. Biol. 1995. V. 248. P. 551-561.
55. Du Z., Park K., Yu H., Fan Q., Li L. Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Saccharomyces cerevisiae II Nat. Genet. 2008. V. 40. P. 460-465.
56. Edelman I., Culbertson M.R. Exceptional codon recognition by the glutamine tRNAs in Saccharomyces cerevisiae II EMBO J. 1991. V. 10. P. 1481-1491.
57. Eggertsson G., Soil D. Transfer ribonucleic acid-mediated suppression of termination codons in Escherichia coli II Microbiol. Rev. 1988. V. 52. P. 354-374.
58. Eurwilaichitr L., Graves F.M., Stansfield I., Tuite M.F. The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 1999. V. 32. P. 485-496.
59. Ferrando A., Kron S.J., Rios G., Fink G.R., Serrano R. Regulation of cation transport in Saccharomyces cerevisiae by the salt tolerance gene HAL3 II Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 5470-5481.
60. Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F. The elimination of the yeast P57+. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation // Mol. Microbiol. 2001. V. 40. P. 1357-1369.
61. Firoozan M., Grant C.M., Duarte J.A., Tuite M.F. Quantitation ofreadthrough of termination codons in yeast using a novel gene fusion assay//Yeast. 1991. V. 7. P. 173-183.
62. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRfl-and ribosome-dependent guanosine triphosphatase // RNA. 1996. V. 2. P. 334-341.
63. Gautschi M., Mun A., Ross S., Rospert S. A functional chaperone triad on the yeast ribosome // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. V. 99. P. 42094214.
64. Gietz D., St Jean A., Woods R.A., Schiestl R.H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 1425.
65. Gietz R.D., Sugino A. New yeast -Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites // Gene. 1988. V. 74. P. 527-534.
66. Glover J.R., Kowal A.S., Schirmer E.C., Patino M.M., Liu J.J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PST., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae // Cell. 1997. V. 89. P. 811-819.
67. Goldstein A.L., McCusker J.H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae I I Yeast. 1999. V.15. P. 1541-1553.
68. Gonzalez C.I., Bhattacharya A., Wang W., Peltz S.W. Nonsense-mediated mRNA decay in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 2001. V. 274. P. 15-25.
69. Grewal S.I.S., Jia S. Heterochromatin revisited // Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. P. 35-46.
70. Griffith J.S. Self-replication and scrapie // Nature. 1967. V. 215. P. 10431044.
71. Harger J.W., Dinman J.D. Evidence against a direct role for the Upf proteins in frameshifting or nonsense codon readthrough // RNA. 2004. V. 10. P. 1721-1729.
72. Harrison P.M., Gerstein M. A method to assess compositional bias in biological sequences and its application to prion-like glutamine/asparagine-rich domains in eukaryotic proteomes // Genome Biol. 2003. V. 4. P. R40.
73. Hatfield D.L., Smith D.W., Lee B.J., Worland P.J., Oroszlan S. Structure and function of suppressor tRNAs in higher eukaryotes // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1990. V. 25. P. 71-96.
74. Hatin I., Fabret C., Namy O., Decatur W.A., Rousset J. Fine-tuning of translation termination efficiency in Saccharomyces cerevisiae involves two factors in close proximity to the exit tunnel of the ribosome // Genetics. 2007. V. 177. P. 1527-1537.
75. Hershey J.W. Protein phosphorylation controls translation rates // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 20823-20826.
76. Hershey J.W., Asano K., Naranda Т., Vornlocher H.P., Hanachi P., Merrick W.C. Conservation and diversity in the structure of translation initiation factor eIF3 from humans and yeast // Biochimie. 1996. V. 78. P. 903-907.
77. Hiraga K., Suzuki K., Tsuchiya E., Miyakawa T. Cloning and characterization of the elongation factor EF-Г beta homologue of Saccharomyces cerevisiae. EF-1 beta is essential for growth // FEBS Lett. 1993. V. 316. P. 165-169.
78. Hirokawa G., Demeshkina N., Iwakura N., Kaji H., Kaji A. The ribosome-recycling step: consensus or controversy? // Trends Biochem. Sci. 2006. V. 31. P. 143-149.
79. Hosoda N., Kobayashi Т., Uchida N., Funakoshi Y., Kikuchi Y., Hoshino S., Katada T. Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 38287-38291.
80. Hughes V., Miiller A., Stark M.J., Cohen P.T. Both isoforms of protein phosphatase Z are essential for the maintenance of cell size and integrity in Saccharomyces cerevisiae in response to osmotic stress // Eur. J. Biochem. 1993. V. 216. P. 269-279.
81. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., Philippe M. Eukaryotic release factors (eRFs) history // Biol. Cell. 2003. V. 95. P. 195-209.
82. Ingebritsen T.S., Cohen P. Protein phosphatases: properties and role in cellular regulation // Science. 1983. V. 221. P. 331-338.
83. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V. 96. P. 23-28.
84. Ito K., Ebihara K., Uno M., Nakamura Y. Conserved motifs in prokaryoticand eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 5443-5448.
85. Ito К., Uno M., Nakamura Y. Single amino acid substitution in prokaryote polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three stop codons // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 8165-8169.
86. Janssen G.M., Moller W. Kinetic studies on the role of elongation factors 1 beta and 1 gamma in protein synthesis // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1773-1778. •
87. Jung G., Masison D.C. Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo\ a possible explanation for its effect in curing yeast prions // Curr. Microbiol. 2001. V. 43. P. 7-10.
88. Kahvejian A., Roy G, Sonenberg N. The mRNA closed-loop model: the function of PABP and PABP-interacting proteins in mRNA translation // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2001. V. 66. P. 293-300.
89. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1994. V. . P. 234 p.
90. Kandl K.A., Munshi R., Ortiz P.A., Andersen G.R., Kinzy T.G., Adams A.E.M: Identification of a role for actin in translational fidelity in yeast // Mol. Genet Genomics. 2002. V. 268. P. 10-18.
91. Kawakami K., Nakamura Y. Autogenous suppression of an opal mutation in the gene encoding peptide chain release factor 2 // Proc. Natl. Acad. Sci.
92. U.S.A. 1990. V. 87. P. 8432-8436.
93. Kikuchi Y., Shimatake H., Kikuchi A. A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain//EMBO J. 1988. V. 7. P. 1175-1182.
94. King C.Y., Tittmann P., Gross H., Gebert R., Aebi M., Wtithrich K. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 6618-6622.
95. Kinzy T.G., Ripmaster T.L., Woolford J.L.J. Multiple genes encode the translation elongation factor EF-1 gamma in Saccharomyces cerevisiae И Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 2703-2707.
96. Kobayashi Т., Funakoshi Y., Hoshino S., Katada T. The GTP-binding release factor eRF3 as a key mediator coupling translation termination to mRNA decay // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 45693-45700.
97. Kodama H., Ito K., Nakamura Y. The role of N-terminal domain of translational release factor eRF3 for the control of functionality and stability in S. cerevisiae И Genes Cells. 2007. V. 12. P. 639-650.
98. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. Yeast P57+. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 49636-49643.
99. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions // Cell. 1998. V. 94. P. 13-16.
100. Kushnirov V.V., Alexandrov I.M., Mitkevich O.V., Shkundina I.S., Ter-Avanesyan M.D. Purification and analysis of prion and amyloid aggregates //Methods. 2006. V. 39. P. 50-55.
101. Kushnirov V.V., Kryndushkin D.S., Boguta M., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Chaperones that cure yeast artificial J\S7+. and their prion-specific effects // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 1443-1446.
102. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae И Gene. 1988. V. 66. P. 45-54.
103. Le Goff X., Philippe M., Jean-Jean O. Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 3164-3172.
104. Lee B.S., Culbertson M.R. Identification of an additional gene required for eukaryotic nonsense mRNA turnover // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 10354-10358.
105. Lee K.S., Hines L.K., Levin D.E. A pair of functionally redundant yeast genes {PPZ1 and PPZ2) encoding type 1-related protein phosphatases function within the Plccl-mediated pathway // Mol. Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 5843-5853.
106. Leeds P., Peltz S.W., Jacobson A., Culbertson M.R. The product of theyeast UPF1 gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a tpremature translational termination codon // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 2303-2314.
107. Liebman S.W., Sherman R Extrachromosomal PSF. determinant suppresses nonsense mutations in yeast // J. Bacteriol. 1979. V. 139. P. 1068-1071.
108. Liu R., Liebman S.W. A translational fidelity mutation in the universally conserved sarcin/ricin domain of 25S yeast ribosomal RNA // RNA. 1996. V. 2. P. 254-263.
109. Maderazo A.B., He R, Mangus D.A., Jacobson A. Upflp control of nonsense mRNA translation is regulated by Nmd2p and Upf3p // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 4591-4603.
110. Mangus D.A., Evans M.C., Jacobson A. PolyA-binding proteins: multifunctional scaffolds for the post-transcriptional control of gene expression // Genome Biol. 2003. V. 4. P. 223.
111. Marintchev A., Wagner G. Translation initiation: structures, mechanisms and evolution // Q. Rev. Biophys. 2004. V. 37. P. 197-284.
112. Merkulova T.I., Frolova L.Y., Lazar M., Camonis J., Kisselev L.L. C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction // FEBS Lett. 1999. V. 443. P. 41-47.
113. Mermoud J.E., Cohen P., Lamond' A.I. Ser/Thr-specific protein phosphatases are required for both catalytic steps of pre-mRNA splicing // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5263-5269.
114. Michelitsch M.D., Weissman J.S. A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. V. 97. P. 11910-11915.
115. Morris K.V. Role of RNA in the regulation of gene expression // Nutr. Rev. 2008. V. 66 Suppl 1. P. S31-2.
116. Moskalenko S.E., Chabelskaya S.V., Inge-Vechtomov S.G., Philippe M., Zhouravleva G.A. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae II BMC Mol. Biol. 2003. V. 4. P. 2.
117. Muramatsu Т., Heckmann K., Kitanaka C., Kuchino Y. Molecular mechanism of stop codon recognition by eRFl: a wobble hypothesis for peptide anticodons // FEBS Lett. 2001. V. 488. P. 105-109.
118. Nakamura Y., Ito K., Ehrenberg M. Mimicry grasps reality in translation termination // Cell. 2000. V. 101. P. 349-352.
119. Namy O., Duchateau-Nguyen G., Rousset J. Translational readthrough of the PDE2 stop codon modulates camp levels in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 641-652.
120. Naqvi A.R., Islam M.N., Choudhury N.R., Haq Q.M.R. The fascinating world of RNA interference //Int. J. Biol. Sci. 2009. V. 5. P. 97-117.
121. Nemecek J., Nakayashiki Т., Wickner R.B. A prion of yeast metacaspase homolog (Mcalp) detected by a genetic screen // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009. V. 106. P. 1892-1896.
122. Nilsson J., Nissen P. Elongation factors on the ribosome // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. V. 15. P. 349-354.
123. Panopoulos P., Dresios J., Synetos D. Biochemical evidence of translational infidelity and decreased peptidyltransferase activity by a sarcin/ricin domain mutation of yeast 25S rRNA // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 5398-5408.
124. Pape Т., Wintermeyer W., Rodnina M. Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome // EMBO J. 1999. V. 18. P. 3800-3807.
125. Patel В., Gavin-Smyth J., Liebman S. The yeast global transcriptional co-repressor protein Cyc8 can propagate as a prion // Nat. Cell Biol. 2009. V. 11. P. 344-349.
126. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast // Science. 1996. V. 273. P. 622-626.
127. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein // Science. 1997. V. 277. P. 381-383.
128. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 2798-2805.
129. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like PSP. determinant is mediated by oligomerization of the S'f/PiJ-encoded polypeptide chain release factor // EMBO J. 1996. V. 15. P. 3127-3134.
130. Peltz S.W., Brown A.H., Jacobson A. mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on at least three cis-acting sequence elements and one trans-acting factor // Genes Dev. 1993. V. 7. P. 1737-1754.
131. Pont-Kingdon G. Creation of chimeric junctions, deletions, and insertions by PCR//Methods Mol. Biol. 2003. V. 226. P. 511-516.
132. Posas F., Camps M., Arino J. The Ppz protein phosphatases are important determinants of salt tolerance in yeast cells // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 13036-13041.
133. Posas F., Casamayor A., Arino J. The Ppz protein phosphatases are involved in the maintenance of osmotic stability of yeast cells // FEBS Lett. 1993. V. 318. P. 282-286.
134. Posas F., Casamayor A., Morral N., Arino J. Molecular cloning and analysis of a yeast protein phosphatase with an unusual amino-terminal region // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 11734-11740.
135. Prusiner S.B. Prions // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 1336313383.
136. Prusiner S.B. Inherited prion diseases // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 4611-4614.
137. Prusiner S.B., Scott M.R. Genetics of prions //Annu. Rev. Genet. 1997. V. 31. P. 139-175.
138. Rajkowitsch L., Vilela C., Berthelot K., Ramirez C.V., McCarthy J.E.G. Reinitiation and recycling are distinct processes occurring downstream of translation termination in yeast // J. Mol. Biol. 2004. V. 335. P. 71-85.
139. Rakwalska M., Rospert S. The ribosome-bound chaperones RAC and
140. Ssbl/2p are required for accurate translation in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 9186-9197.
141. Rodriguez-Gabriel M.A., Remacha M., Ballesta J.P. Phosphorylation of ribosomal protein pO is not essential for ribosome function but can affect translation//Biochemistry. 1998. V. 37. P. 16620-16626.
142. Rogoza Т., Goginashvili A., Viktorovskaya O., Volkov K., Mironova L. The SFP1 gene is a likely candidate to a role of structural gene encoding the prion-like determinant 7XP+. // XII International Congress on Yeasts, Kyiv, Ukraine. 2008. V. . P. 148.
143. Rospert S., Rakwalska M., Dubaquie Y. Polypeptide chain termination and stop codon readthrough on eukaryotic ribosomes // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2005. V. 155. P. 1-30.
144. Salas-Marco J., Bedwell D.M. GTP hydrolysis by eRF3 facilitates stop codon decoding during eukaryotic translation termination // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 7769-7778.
145. Salas-Marco J., Fan-Minogue H., Kallmeyer A.K., Klobutcher L.A., Farabaugh P. J., Bedwell D.M. Distinct paths to stop codon reassignment by the variant-code organisms Tetrahymena and Euplotes II Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. P. 438-447.
146. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual //New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press. 1989. V. . P. 723 p.
147. Samsonova M.G., Inge-Vechtomov S.G., Taylor P. Structure comparison and evolutionary relations between elongation factors EF-Tu (EF-1 alpha) and Sup2 proteins II Genetica. 1991. V. 85. P. 35-44.
148. Sandbaken M.G., Culbertson M.R. Mutations in elongation factor EF-1 alpha affect the frequency of frameshifting and amino acid misincorporation in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1988. V. 120. P. 923-934.
149. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier // Cell. 2000. V. 100. P. 277-288.
150. Schirmaier F., Philippsen P. Identification of two genes coding for the translation elongation factor EF-1 alpha of S. cerevisiae II EMBO J. 1984. V. 3. P. 3311-3315.
151. Seit-Nebi A., Frolova L., Kisselev L. Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl // EMBO Rep. 2002. V. 3. P. 881-886.
152. Sha K. A mechanistic view of genomic imprinting // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2008. V. 9. P. 197-216.
153. Sherman F., Fink G.R., Hincks J.B. Methods in yeast genetics // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1986. V. . P. 367 p.
154. Shkundina I.S., Kushnirov V.V., Tuite M.F., Ter-Avanesyan M.D. The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast Sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants // Genetics. 2006. V. 172. P. 827-835.
155. Sikorslci R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1989. V. 122. P. 19-27.
156. Singh A., Helms C., Sherman F. Mutation of the non-mendelian suppressor, Psi, in yeast by hypertonic media // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1979. V. 76. P. 1952-1956.
157. Smith M.W., Meskauskas A., Wang P., Sergiev P.V., Dinman J.D. Saturation mutagenesis of 5S rRNA in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 8264-8275.
158. Sondheimer N., Lindquist S. Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast // Mol. Cell. 2000. V. 5. P. 163-172.
159. Song J.M., Liebman S.W. Allosuppressors that enhance the efficiency of omnipotent suppressors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1987. V. 115. P. 451-460.
160. Tarassov K., Messier V., Landry C.R., Radinovic S., Serna Molina M.M., Shames I., Malitskaya Y., Vogel J., Bussey H., Michnick S.W. An in vivo map of the yeast protein interactome // Science. 2008. V. 320. P. 14651470.
161. Ter-Avanesyan M.D., Zimmermann J., Inge-Vechtomov S.G., Sudarikov A.B., Smirnov V.N., Surguchov A.P. Ribosomal recessive suppressors cause a respiratory deficiency in yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Gen. Genet. 1982. V. 185. P. 319-323.
162. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from PSP. to [psf] in Saccharomyces cerevisiae II
163. Genetics. 1981. V. 98. P. 691-711.
164. Valente L,, Kinzy T.G. Yeast as a sensor of factors affecting the accuracy of protein synthesis // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 2115-2130.
165. Valouev I.A., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation // Cell Motil. Cytoskeleton. 2002. V. 52. P. 161173.
166. Velichutina I.V., Dresios J., Hong J.Y., Li C., Mankin A., Synetos D., Liebman S.W. Mutations in helix 27 of the yeast Saccharomyces cerevisiae 18S rRNA affect the function of the decoding center of the ribosome 11 RNA. 2000. V. 6. P. 1174-1184.
167. Velichutina I.V., Hong J.Y., Mesecar A.D., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic interaction between yeast Saccharomyces cerevisiae release factors and the decoding region of 18S rRNA// J. Mol. Biol. 2001. V. 305. P. 715727.
168. Venturi G.M., Bloecher A., Williams-Hart Т., Tatchell K. Genetic interactions between GLC7, PPZ1 and PPZ2 in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2000. V. 155. P. 69-83.
169. Vincent A., Newnam G., Liebman S.W The yeast translationalallosuppressor, SAL6: a new member of the PPl-like phosphatase family with a long serine-rich N-terminal extension // Genetics. 1994. V. 138. P. 597-608.
170. Volkov K., Osipov K., Valouev I., Inge-Vechtomov S., Mironova L. N-terminal extension of Saccharomyces cerevisiae translation termination factor eRF3 influences the suppression efficiency of sup35 mutations // FEMS Yeast Res. 2007. V. 7. P. 357-365.
171. Wach A., Brachat A., Pohlmann R., Philippsen P. New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae //Yeast. 1994. V. 10. P. 1793-1808.
172. Wang W., Cajigas I.J., Peltz S.W., Wilkinson M.F., Gonzalez C.I. Role for Upf2p phosphorylation in Saccharomyces cerevisiae nonsense-mediated mRNA decay //Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. P. 3390-3400.
173. Wang W, Czaplinski K., Rao Y., Peltz S.W. The role of Upf proteins in modulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts //EMBO J. 2001. V. 20. P. 880-890.
174. Weiss R.B. Molecular model of ribosome frameshifting // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984. V. 81. P. 5797-5801.
175. Wells S.E., Hillner P.E., Vale R.D., Sachs A.B. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors // Mol. Cell. 1998. V. 2. P. 135-140.
176. Weng Y., Czaplinski K., Peltz S.W. Identification and characterization of mutations in the Upfl gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex but not mRNA turnover // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 5491-5506.
177. Wickner R.B. Prions of yeast and heat-shock protein 104: 'coprion' and cure // Trends Microbiol. 1995. V. 3. P. 367-369.
178. Wickner R.B. UKE3. as an altered Ure2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae II Science. 1994. V. 264. P. 566-569.
179. Wickner R.B., Edskes H.K., Maddelein M.L., Taylor K.L., Moriyama H. Prions of yeast and fungi. Proteins as genetic material // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 555-558.
180. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K. PSI+. and [URE3] as yeast prions //Yeast. 1995. V. 11. P. 1671-1685.
181. Wilson P.G., Culbertson M.R. SUF12 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors // J. Mol. Biol. 1988. V. 199. P. 559-573.
182. Zeng G., Yu X., Cai M. Regulation of yeast actin cytoskeleton-regulatory complex Panlp/Slalp/End3p by serine/threonine kinase Prklp // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 3759-3772.
183. Zerfass K., Beier H. The leaky UGA termination codon of tobacco rattle virus RNA is suppressed by tobacco chloroplast and cytoplasmic tRNAsTrp with CMCA anticodon//EMBO J. 1992. V. 11. P. 4167-4173.
184. Zuk D., Belk J.P., Jacobson A. Temperature-sensitive mutations in the Saccharomyces cerevisiae MRT4, GRC5, SLA2 and THS1 genes result in defects in mRNA turnover // Genetics. 1999. V. 153. P. 35-47.
185. Мироновой и Анне Юрьевне Аксеновой за научное руководство и полезные советы. Также автор благодарит Элину Александровну Радченко за помощь в проведении экспериментов, а также весь коллектив лаборатории физиологической генетики за понимание и поддержку.
-
Иванов, Максим Сергеевич
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2009
-
ВАК 03.00.15
- Характеристика нового нехромосомного детерминанта [NSI+]дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Изучение регуляции синтеза фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Регуляция секреции внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей
